Summary
Burada, kornea epitelinin mekanik ve kimyasal hasarı için fare ve tavşana dayalı hayvan modelleri, yeni terapötikleri ve altta yatan mekanizmayı taramak için geliştirilmiştir.
Abstract
Kimyasal yanık ve travma da dahil olmak üzere oküler yüzeyde kornea hasarı, ciddi skarlaşma, simblefaron, kornea limbal kök hücre eksikliğine neden olabilir ve büyük, kalıcı bir kornea epitel defektine neden olabilir. Aşağıdaki kornea opaklığı ve periferik neovaskülarizasyon ile birlikte epitel defekti geri dönüşümsüz görme bozukluğuna neden olur ve başta keratoplasti olmak üzere gelecekteki tedaviyi engeller. Hayvan modeli etkili bir ilaç geliştirme platformu olarak kullanılabildiğinden, burada farede kornea yaralanması ve tavşan kornea epiteline alkali yanık modelleri geliştirilmiştir. Yeni Zelanda beyaz tavşanı alkali yanık modelinde kullanılır. Farklı konsantrasyonlarda sodyum hidroksit, korneanın merkezi dairesel bölgesine kas içi ve topikal anestezi altında 30 s boyunca uygulanabilir. Bol miktarda izotonik normal salin irrigasyonundan sonra, artık gevşek kornea epiteli, bu dairesel alan içinde Bowman tabakasının derinliklerine kadar kornea çapağı ile çıkarıldı. Yara iyileşmesi, Kobalt mavi ışığı altında floresein boyaması ile belgelenmiştir. C57BL/6 fareler murin kornea epitelinin travmatik modelinde kullanıldı. Murin merkezi kornea, 2 mm çapında bir cilt zımbası kullanılarak işaretlendi ve daha sonra stereomikroskop altında 0.5 mm'lik bir çapak ile kornea pas halkası sökücü ile debride edildi. Bu modeller, göz damlalarının veya potansiyel olarak kornea epitel rejenerasyonunu kolaylaştıran kök hücreler gibi karışık ajanların terapötik etkisini doğrulamak için prospektif olarak kullanılabilir. Stereomikroskop ve görüntüleme yazılımı ile kornea opaklığı, periferik neovaskülarizasyon ve konjonktiva tıkanıklığı gözlenerek bu hayvan modellerinde terapötik etkiler izlenebilir.
Introduction
İnsan korneası beş ana tabakadan oluşur ve göz içi dokuları korumak için görme keskinliğini ve yapısal bütünlüğü korumak için oküler refraksiyonda önemli bir rol oynar1. Korneanın en dış kısmı, bazal hücrelerden sırayla farklılaşan ve oküler yüzey1'den dökülmek üzere yukarı doğru hareket eden beş ila altı hücre katmanından oluşan kornea epitelidir. İnsanlarda ve Yeni Zelanda tavşanlarında kornea ile karşılaştırıldığında, fare korneası benzer bir kornea yapısına sahiptir, ancak epitel ve stroma2'deki kalınlığın azalması nedeniyle orta kısımdan daha ince bir çevreye sahiptir. Oküler optik sistemdeki benzersiz konumu nedeniyle, mekanik yaralanma, bakteriyel aşılama ve kimyasal ajanlar gibi birçok dış hakaret, epitel bütünlüğünü kolayca tehlikeye atabilir ve ayrıca görmeyi tehdit eden epitel defekti, enfeksiyöz keratit, kornea erimesi ve hatta kornea perforasyonuna yol açabilir.
Kayganlaştırıcılar, antibiyotikler, antienflamatuar ajanlar, oto-serum ürünleri ve amniyotik membran gibi çeşitli terapötik ajanlar yeniden epitelizasyonu iyileştirmek ve skarlaşmayı azaltmak için zaten kullanılmış olsa da, yara iyileşmesini sağlayabilecek, inflamasyonu azaltabilecek ve skar oluşumunu baskılayabilecek diğer potansiyel tedavi yöntemleri hala farklı platformlarda geliştirilmekte ve test edilmektedir. Diyabetik fare3'te kornea pas halkası sökücü ile kornea epitelinin çıkarılması, bakteriyel aşılama için steril 25 G iğne ile fare kornea epiteli üzerinde doğrusal çizikler 4, kornea pas halkası sökücü5 ile kornea epitelinin trefin yardımlı çıkarılması, korneanın yarısından fazlasında epitel koter ve limbus6 dahil olmak üzere kornea epitelinin yara iyileşmesiiçin çeşitli hayvan modelleri önerilmiştir , donuk bir neşter bıçağı7 ile trefin ile kolaylaştırılmış tavşan kornea aşınması ve sıvı azotta ani donma ile sığır kornea yaralanması8.
Kornea epitelindeki mekanik yaralanma dışında, kimyasal ajanlar da oküler yüzeye, özellikle asidik ve alkali ajanlara yaygın olarak rastlanan hakaretlerdir. Sodyum hidroksit (NaOH, 30-60 s için 0.1-1 N), kornea kimyasal yanığı 9,10,11,12,13'ün murin ve tavşan modellerinde yaygın olarak kullanılan kimyasallardan biridir. Sıçan kimyasal yanık modelinde korneaya da %100 etanol uygulanmış, bunu cerrahi bıçak14 kullanılarak ek mekanik kazıma yapılmıştır. Sağlıklı bir oküler yüzeyin bakımı, göz kapakları, Meibomian bezleri, lakrimal sistem, konjonktiva ve kornea dahil olmak üzere fonksiyonel birimlere dayandığından, in vivo hayvan modellerinin ex vivo kültürlü kornea epitel hücreleri veya kornea dokuları üzerinde bazı yararları vardır. Bu makalede, kornea aşınma yarasının fare modeli ve kornea alkali yanığının tavşan modeli gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan çalışmalarındaki tüm deneysel prosedürler, Chang Gung Memorial Hastanesi'ndeki Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylandı ve hayvanların oftalmik ve görme araştırmalarında kullanılması için ARVO beyanına bağlı kaldı.
1. Fare kornea epitelinin Ex vivo yara iyileşme modeli
- Farelerin hazırlanması
- C57BL/6 farelere ketamin hidroklorür (80-100 mg/kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (5-10 mg/kg vücut ağırlığı) intraperitoneal olarak verilerek genel anestezi uygulanmalıdır.
- Farelerde zararlı bir uyarana karşı hareket kaybını ve doğru refleks kaybını doğrulayarak genel anestezinin çalıştığından emin olun.
- Farelerin kafasını elle sabitleyin ve her iki göze bir damla% 0.5 proparakain hidroklorür oftalmik çözeltisi ile topikal anestezi uygulayın (Şekil 1A). Oküler yüzeyi ve kapakları %5 betadin ile üç kez dezenfekte edin.
- Murin kornea epitelyal yara modelinin oluşturulması
NOT: Aşağıdaki prosedürleri stereomikroskop altında gerçekleştirin. Kornea yarası, göz küresini daha iyi manipüle etmek ve gerçek dünyadaki duruma yakın olmak için ex vivo değil, in vivo olarak yaratılmıştır. Bu bir terminal prosedürüdür; Bu nedenle, sadece temiz aletler (steril teknik değil) gereklidir.- Yaranın iyi sınırlandırılmış ve iyi ölçülebilir bir alanını doğrulamak için farenin merkezi korneasını bir cilt biyopsi yumruğu (2 mm çapında) kullanarak işaretleyin.
- Dairesel bir iz bırakmak için yumruğu merkezi korneanın üzerine hafifçe girintilendirin (Şekil 1B). 0,5 mm'lik çapaklı elde tutulan bir kornea pas halkası sökücü kullanarak, kornea epitelini Bowman'ın tabakasına kadar debride ederek Bowman'ın tabakasına zarar vermeyin (Şekil 1C). Kornea forsepsleri ile yara sınırının içindeki kalıntı, gevşek dokuları çıkarın.
- Debridman alanını floresein boyama ile onaylayın (Şekil 1D). Floresein boyama işlemini gerçekleştirmek için, floreseini çözmek için bir floresein kağıdına bir damla normal salin koyun ve ardından floresein içeren damlayı Kobalt mavi ışığı altında görselleştirmek için murin epitel defekti üzerine yerleştirin.
- Murin kornea aşınma yara modelinin ex vivo kültürü.
- Murin göz kürelerini toplamak için aşağıdaki gibi devam edin.
- Bir indüksiyon odasında% 5 izofluran ile anestezi indükledikten sonra fareleri servikal çıkık ile kurban edin. Farelerde zararlı bir uyarana karşı hareket kaybını ve sağ refleks kaybını doğrulayarak anestezinin çalıştığından emin olun.
- Göz küresini dışarı itmek için üst ve alt orbital jantlardaki forseps ucuyla hafifçe bastırın. Kapalı kornea makaslarının ucunu, inferior orbital duvar boyunca retrobulbar boşluğa sokun ve göz küresine nüfuz etmemesini sağlayın.
- Göz küresini 0.3 mm kornea forsepsleri ile sabit tutun ve ardından göz küresini izole etmek için optik siniri ve periorbital yumuşak dokuyu kornea makası ile kesin.
- Murin göz kürelerinin ex vivo kültürü için, aşağıdaki gibi devam edin.
- Kuyunun içinde erimiş balmumu ile 48 delikli bir plaka hazırlayın ve katılaşmayı bekleyin. Konjonktiva forsepsin ucuyla, göz kürelerini yerleştirmek için katılaşmış balmumu yüzeyinde yuvarlak bir delik oluşturun.
- Hasat edilen göz kürelerini, stabilizasyonu sağlamak için balmumu kaplı tabanları ve yan duvarları olan 48 delikli plakaya (Şekil 1E) doğrudan yerleştirin (Şekil 1F).
- Dulbecco'nun modifiye kartal besiyeri (DMEM) ile göz kürelerini, çalışmanın amacına bağlı olarak, 37 ° C'de% 5 CO 2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde% 5 CO2 içeren çalışmanın amacına bağlı olarak kültürleyin.
NOT: Model kornea epitelyal yara iyileşmesini incelemek için kullanılıyorsa, enfeksiyonu önlemek için antibiyotikler gerekecektir. Bununla birlikte, bu model antibiyotiklerin veya karışık ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılırsa, profilaktik antibiyotikler gerekli olmayacaktır. - Göz küresinin yüzmesine neden olmadan oküler yüzeyi kültür ortamıyla daldırın.
- Floresein boyama (adım 1.2.3) ve Kobalt mavi ışığı altında bir dijital kamera ile fotoğraf toplama yoluyla yara iyileşmesinin seyrini belgeleyin.
NOT: Mekanik kornea yaralanmasının fare modelleri ile yapılan prospektif deneylerde, kornea aşınması alan ve terapötik ajanların etkinliği için daha fazla test edilenler bir deney grubu olarak görülür ve daha fazla tedavi olmaksızın kornea aşınması alanlar negatif kontrol grubu olarak kabul edilir.
2. Kornea alkali yaralanmasının in vivo tavşan modeli
NOT: Bu modelde, bir alkali yanık yaralanması indüklenir ve ardından kornea epitelinin mekanik debridmanı takip edilerek, sonraki nicelleştirme için iyi tanımlanmış ve hatta yara alanı oluşturulur. Kullanmadan önce tüm aletleri sterilize edin.
- Sistemik analjeziklerin ve topikal göz damlalarının kas içi enjeksiyonu da dahil olmak üzere ameliyat öncesi analjezi ile tavşanın hazırlanması.
- Yeni Zelanda beyaz tavşanlarına, arka bacakta ksilazin (5-10 mg / kg vücut ağırlığı) ile karıştırılmış kas içi ketamin hidroklorür (35-44 mg / kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu ile genel anestezi uygulayın.
- Tavşanı konumlandırdıktan ve bir havluyla örttükten sonra, stereomikroskop altında% 0.5 proparakain hidroklorür oftalmik çözeltisi (Şekil 2A) damla ile sağ göze topikal anestezi uygulayın. Oküler yüzeyi ve kapakları %5 betadin ile üç kez dezenfekte edin.
- Kornea üzerinde alkali yanık yaralanmasını indüklemek
- Bir Petri kabına 8 mm çapında dairesel filtre kağıtları yerleştirin (8 mm'lik bir zımba kullanılarak kesilmiş). Bir damlalık kullanarak, filtre kağıtlarını ıslatmak için Petri kabına 0,5 N sodyum hidroksit (NaOH) ekleyin. Fazla NaOH çözeltisini tavşan korneasına yerleştirmeden önce filtre kağıtlarından boşaltın.
DİKKAT: 0.5 N NaOH insan dokularında ciddi eroziv yaralanmalara neden olabilir. Kullanım sırasında eldiven giyin. Cilt veya gözler NaOH damlacıkları ile temas ederse, daha fazla hasarı azaltmak için bol miktarda normal salin ve tıbbi yardım ile sulama gerekir. - Göz kapaklarını bir kapak spekulumu ile açtıktan ve tavşan niktitasyon zarının filtre kağıdının yerleştirilmesine müdahale etmediğini doğruladıktan sonra (Şekil 2B), 0.5 N NaOH'ye batırılmış dairesel filtre kağıdını 30 s boyunca merkezi korneanın üzerine yerleştirin ve ardından forseps ile çıkarın (Şekil 2C).
- Filtre kağıdını çıkardıktan sonra, alkali malzemeyi yıkamak için oküler yüzeyi 10 mL normal salin ile durulayın.
- Bir Petri kabına 8 mm çapında dairesel filtre kağıtları yerleştirin (8 mm'lik bir zımba kullanılarak kesilmiş). Bir damlalık kullanarak, filtre kağıtlarını ıslatmak için Petri kabına 0,5 N sodyum hidroksit (NaOH) ekleyin. Fazla NaOH çözeltisini tavşan korneasına yerleştirmeden önce filtre kağıtlarından boşaltın.
- Kornea epitel defektinin tamamlanması
- Opasifize edilmiş bölgedeki kornea epiteli, 0.5 mm'lik bir çapaklı kornea pas halkası sökücü kullanarak Bowman'ın zarına kadar sürün (Şekil 2D).
- Kobalt mavi ışığı altında floresein boyaması ile debridman alanını onaylayın ve kornea forsepsleri kullanarak artık kornea epitelini çıkarın (Şekil 2E).
- Tarsorrafi ile güvenli yara durumu
- Niktitasyon zarının oküler yüzeyi ve burun tarafındaki kornea epitel defektini düzgün bir şekilde kapladığını doğrulayın. Niktitasyon zarının, yara iyileşmesi sürecine ve deneye müdahale etmek için çok fazla katlanmadığından veya bozulmadığından emin olun.
- Oküler yüzeyi korumak ve tavşanın çizilmesini önlemek için 6-0 sütür kullanarak topikal ajanlarla veya topikal ajanlar olmadan geçici bir tarsorrafi uygulayın (Şekil 2F). Tavşanın dikişleri kırmasını önlemek için tarsorrafi sütürünün üst ve alt kapak kenar boşluklarından 4-5 bağ ve daha uzun düğümlerle 3-4 mm'de olduğundan emin olun.
NOT: Deney bir antibiyotik çalışmasına dahil değilse, antibiyotikli topikal ajanlar düşünülebilir. - Bu tavşan modelinde, alkali yanığı alanlar ve kornea epitelinin çıkarılması kontrol grubu olarak kabul edildi.
NOT: Prospektif deneylerde, alkali yanık kornea hasarı alan ve terapötik ajanlarla daha fazla tedavi edilen tavşanlar bir deney grubu olarak görülmektedir. Sadece alkali yanık tedavisi alan tavşanlar, daha fazla tedavi edilmeden, negatif bir kontrol grubu olarak kabul edilir.
- Postoperatif analjezi ve ağrı kontrolü
- İşlemden sonraki 7 gün boyunca fizyolojik durumu ve USDA ağrı seviyelerini, hayvanlardaki ağrı ve sıkıntıyı izleyerek değerlendirin. Değerlendirme sonucuna göre tobramisin merhem ve% 0.5 proparakain hidroklorür oftalmik çözeltisinin bir damla kullanımını düşünün. Buprenorfin HCl'yi (0.03 mg / kg) 3 gün boyunca her 6-8 saatte bir uygulayın.
NOT: Defekt alanının günlük ölçümü ve ameliyat sonrası gözlem için, prosedür USDA kategori D'ye aittir.
- İşlemden sonraki 7 gün boyunca fizyolojik durumu ve USDA ağrı seviyelerini, hayvanlardaki ağrı ve sıkıntıyı izleyerek değerlendirin. Değerlendirme sonucuna göre tobramisin merhem ve% 0.5 proparakain hidroklorür oftalmik çözeltisinin bir damla kullanımını düşünün. Buprenorfin HCl'yi (0.03 mg / kg) 3 gün boyunca her 6-8 saatte bir uygulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare kornea epitelinin Ex vivo yara iyileşme modeli:
Fare kornea epitelinin elde tutulan kornea pas halkası sökücü ile in vivo debridmanından sonra, merkezi 2 mm'lik alanda pozitif floresein lekesi ile hafif depresif bir merkezi kornea alanı bulunabilir (Şekil 3A-B). Fare göz küresini topladıktan sonra, önemli bir dönüş yapmadan balmumu kaplı 48 delikli bir kültür plakasına kolayca sabitlendi. Protokolü takiben, murin göz kürelerinin ex vivo kültürü, stereomikroskop altında 48 delikli bir kültür plakası içinde günlük olarak incelenebilir ve belgelenebilir (Şekil 3C). Murin kornea epitelinin sökülmesinden bir gün sonra, Kobalt mavisi ışığı altında elde edilen dijital fotoğraflarda çapı 2 mm ölçülen dairesel floresein boyalı bir epitel defekti ortaya çıkarılabilir (Şekil 3D). Başlangıçtaki düzensiz boyanmış yara marjı veya negatif floresein boyaması, kornea epitelinin eksik veya başarısız çıkarılması anlamına gelir. Normal yara iyileşmesi sürecinde, kornea epitel defekti 2-3 gün içinde floresein boyalı alanın azalmasıyla iyileşir.
Kornea alkali hasarının in vivo tavşan modeli:
Herhangi bir işlemden önce, sağlam tavşan kornea epiteli floresein boyaması ile boyanamaz. Tavşan kornea epitelinde alkali hasar oluştuktan sonra, merkezi kornea üzerinde Kobalt mavi ışığı olsun veya olmasın, net ve tam dairesel bir kenar boşluğu ile pozitif floresein boyanması gözlenebilir (Şekil 4A-B ve Şekil 5B). Dolgusuz alana sahip eksik leke, kalıntı kornea epitel dokularını veya başarısız boyamayı temsil eder. Düzenli takip sırasında, kornea epitel yarası, limbustan pannus büyümesi ve ardından lekeli alanın azalması ile yeniden epitelalize olur (Şekil 5C). Epitel defekti 3-4 hafta içinde iyileşir. Kornea ülseri, dellen, büyük epitel defekti veya masif beyazımsı veya mukoza akıntısı aniden gelişirse, güvensiz tarsorrafi, açıkta kalan dikişler, yanlış konumlandırılmış niktitasyon zarı veya palpebral konjonktiva içinde yabancı cisim düşünülmelidir.
Şekil 1: Kornea mekanik yaralanmasının fare modelini kurma prosedürleri . (A) İşlemden önce topikal anestezi uygulanır. (B) Merkezi kornea üzerinde 2 mm'lik deri biyopsisi trefini ile nazik girinti yapılır. (C) Kornea pas halkası sökücü, merkezi kornea epitelini çıkarmak için kullanılır. (D) Bir epitel defekti, kusur alanını doğrulamak ve B ile işaretlenmiş bölgeyle karşılaştırmak için floresein ile boyanır. (E,F) Fare göz küresi hasat edilir ve önceden balmumu ile kaplı 48 delikli bir plakaya aktarılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Alkali kornea yaralanmasının tavşan modelini oluşturma adımları . (A) Oküler yüzeye topikal anestezi uygulanır. (B) Üst ve alt göz kapaklarını, niktitasyon zarını katlamadan veya sıkmadan açmak için bir kapak spekulumu kullanılır. (C) Merkezi korneanın üzerine NaOH ile ıslatılmış bir trephinize filtre kağıdı (8 mm çapında) yerleştirilir. (D) Kornea pas halkası sökücü, 8 mm'lik merkezi epiteli Bowman'ın tabakasına kadar debride etmek için kullanılır. (E) Epitel defekti floresein ile boyanır. (F) İşlemden sonra, yarayı çiziklerden korumak için tarsorrafi yapılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kornea mekanik yaralanmasının fare modelinde pozitif ve negatif sonuçlar . (A) İşlemden önce herhangi bir lekelenme olmadan bozulmamış fare kornea epiteli. (B) Kobalt mavisi ışığı olmadan murin kornea yarası üzerinde floresein ile in vivo pozitif boyama. (C) Kültür ortamı eklemeden önce floresein lekesi eklemeden fare göz küresinin Ex vivo kültürü. (D) Ex vivo fare modelinde kornea epitel defekti üzerinde floresein ile pozitif boyama. 2 mm'lik epitel defekti genellikle 2-3 gün içinde iyileşir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kornea alkali hasarının tavşan modelinde floresein boyamasının sonuçları . (A) Kobalt mavisi ışığı altında pozitif floresein boyaması. Fotoğraf mekanik kornea yaralanmasından hemen sonra çekildi. (B) Kobalt mavisi ışığı olmadan tavşan oküler yüzeyinde floresein boyası ile pozitif boyama da gözlenebilir. (C) İyileşmiş oküler yüzeyde negatif lekelenme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kornea alkali hasarının tavşan modelinde yara iyileşmesinin zaman seyri ve yeniden epitelizasyonun ortaya çıkması . (A) Fare ve tavşan modellerinde yeniden epitelizasyon sırasıyla 2-3 gün ve 3-4 hafta sürer. (B) Bir tavşan modelinde alkali yanıktan sonra floresein ile boyanmış 8 mm'lik bir epitel defekti. Işık kaynağı olarak kobalt mavisi ışık kullanılmıştır. Fotoğraf alkali yaralanmasından hemen sonra çekildi. (C) Alkali yaralanmasından 3 hafta sonra tavşan gözünde iyileşmiş bir epitel defekti, azalmış leke alanı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kornea yaralanmasının fare ve tavşan modelleri, yara iyileşmesini izlemek, yeni terapötikleri test etmek ve yara iyileşmesi ve tedavi yollarının altında yatan mekanizmaları incelemek için yararlı bir ex vivo ve in vivo platform sağlar. Araştırmanın amacına bağlı olarak kısa süreli veya uzun vadeli bir deney için farklı hayvan modelleri kullanılabilir. Örneğin, in vivo fare korneasında bir epitel defekti oluşturulduktan sonra, sıvı terapötik ajanları küçük bir hacimde izlemek için sınırlı bir epitel defekti kullanılabilir. Aynı zamanda, göz kapakları, lakrimal sistem ve konjonktiva gibi çevredeki fonksiyonel birimler, hücre kültürü veya ex vivo kültür koşullarının aksine, invivo koşullar altında değerlendirilebilir. Farelerin hareketleri deneysel durumu etkileyebilirse, bu durumda Tarsorrhaphy hala gerekli olabilir. Dairesel bir yarayı gözlemlemek ve ölçmek basit bir doğrusal çizik yarasından daha kolaydır4. Bununla birlikte, kornea üzerinde bir sınır çizgisi oluşturmak için cilt zımbası, Bowman'ın zarını kesmeden dikkatlice yapılmalıdır, aksi takdirde derin bir kornea yaralanması veya nüfuz eden bir yara bırakacaktır. Mekanik kornea yarası, 8 mm'lik bir kornea trefin ve bir tavşan modeli15'teki bir neşter bıçağı ile de oluşturulabilir, burada kornea epiteli yerine anterior stromaya kadar daha derin bir yara sunulmuştur.
Kornea pas halkasının giderilmesi, bahsetmeye değer bir başka önemli konudur. Fare göz küresi küçük olduğundan, kornea epitelinin aşırı çıkarılması veya eksik çıkarılması meydana gelebilir, böylece araştırmanın doğruluğunu etkiler. Korneanın cilt biyopsisi punch ve floresein rehberliğinde yapılan operasyonla işaretlenmesi bu hataların azaltılmasına yardımcı olacaktır. Her ne kadar koter ve neşter bıçakları hayvan modellerinde kornea epiteli çıkarmak için araçlar olarak önerilmiş olsa da6,7, oküler yüzey üzerindeki hasar kolayca kontrol edilemeyebilir ve aynı şekilde çoğaltılamayabilir, bu da potansiyel olarak daha sonraki deneylerde tutarsız sonuçlara yol açabilir.
İn vivo durumla karşılaştırıldığında, 48 delikli plakalardaki ex vivo kültürlü fare göz kürelerinin, plakalar üzerindeki daha geniş bir çalışma alanı nedeniyle manipüle edilmesi daha kolaydır ve ilaç salınımlı kontakt lensler ve hücre terapileri gibi çeşitli kültür ortamlarındaki karmaşık ajanları aynı anda test etmek için kullanılabilir. Fare göz küreleri toplanırken ve 48 delikli bir plakaya aktarılırken, korneanın titizlikle korunması, oküler yüzeye ek yapay hasarı ve göz kürelerinin yırtılmasını önlemek için önemlidir. Bir sonraki çalışma için, göz küresi, kornea yukarı bakacak şekilde parafin kaplı kuyu içine sabitlenebilir ve bir kültür ortamına daldırılabilir. Yüzen veya dönen göz küreleri veya susuz kornea sonuçları engelleyecektir. Bu ex vivo fare modeli, oküler yüzey üzerindeki değişikliklere odaklandığından, lakrimal bez ve göz kapakları gibi diğer fonksiyonel birimler bu ex vivo modelde tartışılmamıştır. Ex vivo fare modeli ayrıca farelerin üreme ve barındırma maliyetini düşürür ve in vivo hayvan modeline kıyasla deneysel alandan tasarruf sağlar. Bu model, uzun vadede potansiyel doku enfeksiyonu ve organ yetmezliği gelişebileceğinden, uzun vadeli bir çalışma yerine kısa vadeli bir çalışma için uygundur.
Fare modeli daha az maliyetli olmasına ve laboratuvarda ölçeklendirilebilmesine rağmen, küçük bir yüzey alanı, stereomikroskoplarla lipit birikimi ve neovaskülarizasyon gibi korneadaki ayrıntılı değişikliklerin gözlemlenmesini potansiyel olarak sınırlar. Bunun yerine, göz küresinin daha büyük bir çapına sahip bir tavşan kornea yaralanması modeli genellikle bu dezavantajı telafi edebilir. NaOH konsantrasyonunu ve ıslatma süresini ayarlayarak, kornea alkali yanığının ciddiyetinin farklı boyutları oluşturulabilir. Sıçan kimyasal yanık modellerinde, korneayı 40 s için 3 mm filtre kağıdı ve 20 s için 4 mm filtre kağıdı ile ıslatmak için 1 N NaOH kullanıldı ve gözlem için benzer ancak daha küçük bir alan sağladı16,17. Alkali yanığını boyut ve konsantrasyonda tutarlı tutmak için, kağıt kenar boşluğunda herhangi bir lif veya doldurulmamış köşeyi önlemek için 8 mm'lik filtre kağıdının hazırlanmasında yepyeni ve keskin bir zımba önerilir. Yara dışındaki sürekli hasarı azaltmak için kimyasal ajanları oküler yüzeyden ve konjonktiva kesesinden yıkamak için yeterli sulama gereklidir. Tavşan niktitasyon zarı deneysel prosedüre müdahale edebileceğinden ve alkali ajanlar tarafından aşındırıldığında ağrıya neden olabileceğinden, oküler yüzey üzerindeki ek inflamasyonu azaltmak için prosedürden sonra dikkatlice korunmalı ve fizyolojik pozisyona geri getirilmelidir. Alkali yanık prosedüründen sonra, tavşan kornea yarası, deneylerin kalitesini ve tutarlılığını sağlamak için tarsorrafi veya kontakt lens gibi diğer materyallerle korunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların birbiriyle çelişen finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Çalışma, Tayvan Atom Enerjisi Konseyi (Hibe No. A-IE-01-03-02-02), Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (Hibe No. NMRPG3E6202-3) ve Chang Gung Tıbbi Araştırma Projesi (Hibe No. CMRPG3H1281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Ma, X., et al. Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis. Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).
- Chan, M. F., Werb, Z.
- Lan, Y., et al. Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).
- Watanabe, M., et al. Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).
- Murataeva, N., et al. Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing. Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).
- Carter, K., et al. Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).
- Sanie-Jahromi, F., et al. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model. Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).
- Sun, M. M., et al. Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).
- Yang, Y., et al. Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Oh, J. Y., et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).
- Wang, T., et al. Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).
- Gong, Y., et al. Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model. International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).
- Yao, L., et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn. PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).
