Summary
Qui, vengono sviluppati modelli animali basati su topo e coniglio per il danno meccanico e chimico dell'epitelio corneale per lo screening di nuove terapie e del meccanismo sottostante.
Abstract
Le lesioni corneali alla superficie oculare, comprese ustioni chimiche e traumi, possono causare gravi cicatrici, symblepharon, deficit di cellule staminali dell'apparato limbare corneale e provocare un difetto epiteliale corneale grande e persistente. Il difetto epiteliale con la seguente opacità corneale e la neovascolarizzazione periferica provocano una compromissione visiva irreversibile e ostacolano la gestione futura, in particolare la cheratoplastica. Poiché il modello animale può essere utilizzato come un'efficace piattaforma di sviluppo di farmaci, qui vengono sviluppati modelli di lesioni corneali al topo e bruciature alcaline all'epitelio corneale del coniglio. Il coniglio bianco della Nuova Zelanda viene utilizzato nel modello di bruciatura alcalina. Diverse concentrazioni di idrossido di sodio possono essere applicate sull'area circolare centrale della cornea per 30 s in anestesia intramuscolare e topica. Dopo abbondante irrigazione salina normale isotonica, l'epitelio corneale sciolto residuo è stato rimosso con bava corneale in profondità fino allo strato di Bowman all'interno di questa area circolare. La guarigione delle ferite è stata documentata dalla colorazione con fluoresceina sotto luce blu cobalto. I topi C57BL / 6 sono stati utilizzati nel modello traumatico dell'epitelio corneale murino. La cornea centrale murina è stata marcata usando un pugno di pelle, 2 mm di diametro, e poi sbrigliata da un dispositivo di rimozione dell'anello di ruggine corneale con una bava di 0,5 mm sotto uno stereomicroscopio. Questi modelli possono essere utilizzati prospetticamente per convalidare l'effetto terapeutico di colliri o agenti misti come le cellule staminali, che potenzialmente facilitano la rigenerazione epiteliale corneale. Osservando l'opacità corneale, la neovascolarizzazione periferica e la congestione congiuntivale con stereomicroscopio e software di imaging, è possibile monitorare gli effetti terapeutici in questi modelli animali.
Introduction
La cornea umana è costituita da cinque strati principali e svolge un ruolo fondamentale nella rifrazione oculare per mantenere l'acuità visiva e l'integrità strutturale per proteggere i tessuti intraoculari1. La parte più esterna della cornea è l'epitelio corneale, composto da cinque a sei strati di cellule che si differenziano sequenzialmente dalle cellule basali e si spostano verso l'alto per liberarsi dalla superficie oculare1. Rispetto alla cornea negli esseri umani e nei conigli neozelandesi, la cornea del topo ha una struttura corneale simile, ma una periferia più sottile rispetto alla parte centrale a causa di uno spessore ridotto nell'epitelio e nello stroma2. A causa della sua posizione unica nel sistema ottico oculare, molti insulti esterni come lesioni meccaniche, inoculazione batterica e agenti chimici possono facilmente mettere in pericolo l'integrità epiteliale e portare ulteriormente a difetti dell'epitelio che minacciano la vista, cheratite infettiva, fusione corneale e persino perforazione corneale.
Sebbene vari agenti terapeutici, come lubrificanti, antibiotici, agenti antinfiammatori, prodotti auto-sierici e membrana amniotica siano già stati utilizzati per migliorare la riepitelizzazione e ridurre le cicatrici, altre potenziali modalità di trattamento che possono consentire la guarigione delle ferite, ridurre l'infiammazione e sopprimere la formazione di cicatrici sono ancora in fase di sviluppo e test su piattaforme diverse. Sono stati proposti vari modelli animali per la guarigione delle ferite epiteliali corneali, tra cui la rimozione dell'epitelio corneale con un dispositivo di rimozione dell'anello di ruggine corneale nel topo diabetico3, graffi lineari sull'epitelio corneale del topo con un ago sterile da 25 G per l'inoculazione batterica4, rimozione assistita da trefina dell'epitelio corneale mediante rimozione dell'anello di ruggine corneale5, cauterizzazione epiteliale su metà della cornea e del limbus6 , l'abrasione corneale del coniglio facilitata da trephine da una lama di bisturi opaca7 e la lesione della cornea bovina mediante congelamento improvviso in azoto liquido8.
Oltre alle lesioni meccaniche all'epitelio corneale, gli agenti chimici sono anche insulti comuni alla superficie oculare, in particolare agenti acidi e alcalini. L'idrossido di sodio (NaOH, 0,1-1 N per 30-60 s) è una delle sostanze chimiche comunemente usate nei modelli murini e di coniglio di ustione chimica corneale 9,10,11,12,13. L'etanolo al 100% era stato applicato anche alla cornea nel modello di ustione chimica del ratto, seguito da un'ulteriore rottamazione meccanica utilizzando una lama chirurgica14. Poiché il mantenimento di una superficie oculare sana si basa su unità funzionali, tra cui le palpebre, le ghiandole di Meibomio, il sistema lacrimale, la congiuntiva e la cornea, i modelli animali in vivo hanno alcuni meriti rispetto alle cellule epiteliali corneali in coltura ex vivo o ai tessuti corneali. In questo articolo vengono dimostrati il modello murino della ferita da abrasione corneale e il modello di coniglio dell'ustione alcalina corneale.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali negli studi sugli animali sono state approvate dal Comitato etico di ricerca presso il Chang Gung Memorial Hospital e hanno aderito alla dichiarazione ARVO per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.
1. Modello di guarigione ex vivo dell'epitelio corneale di topo
- Preparazione dei topi
- Somministrare l'anestesia generale ai topi C57BL/6 mediante somministrazione intraperitoneale di ketamina cloridrato (80-100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (5-10 mg/kg di peso corporeo).
- Assicurarsi che l'anestesia generale funzioni confermando la perdita di movimento a uno stimolo nocivo e la perdita del riflesso raddrizzante nei topi.
- Fissare la testa dei topi a mano e applicare l'anestesia topica su entrambi gli occhi con una goccia di soluzione oftalmica di proparacaina cloridrato allo 0,5% (Figura 1A). Disinfettare la superficie oculare e le palpebre tre volte con il 5% di betadine.
- Creazione di un modello di ferita epiteliale corneale murina
NOTA: eseguire le procedure riportate di seguito con uno stereomicroscopio. La ferita corneale è stata creata in vivo, non ex vivo, per manipolare meglio il bulbo oculare e avvicinarsi alla situazione del mondo reale. Questa è una procedura terminale; Pertanto, sono necessari solo strumenti puliti (non tecnica sterile).- Segnare la cornea centrale del topo usando un punzone per biopsia cutanea (2 mm di diametro) per confermare un'area ben circoscritta e ben misurabile della ferita.
- Indentare delicatamente il punzone sulla cornea centrale per lasciare un segno circolare (Figura 1B). Utilizzando un dispositivo di rimozione dell'anello antiruggine corneale portatile con una bava di 0,5 mm, sbrigliare l'epitelio corneale fino allo strato di Bowman assicurandosi di non danneggiare quest'ultimo (Figura 1C). Rimuovere i tessuti residui e sciolti all'interno del margine della ferita con una pinza corneale.
- Confermare l'area di sbrigliamento con colorazione con fluoresceina (Figura 1D). Per eseguire la colorazione con fluoresceina, mettere una goccia di soluzione salina normale su una carta di fluoresceina per sciogliere la fluoresceina, quindi posizionare la goccia contenente fluoresceina sul difetto epiteliale murino per visualizzarlo sotto la luce blu cobalto.
- Coltura ex vivo del modello murino di ferita da abrasione corneale.
- Per raccogliere i bulbi oculari murini, procedere come segue.
- Sacrificare i topi mediante lussazione cervicale dopo aver indotto l'anestesia con isoflurano al 5% in una camera di induzione. Assicurarsi che l'anestesia funzioni confermando la perdita di movimento a uno stimolo nocivo e la perdita del riflesso raddrizzante nei topi.
- Premere delicatamente con la punta della pinza sui bordi orbitali superiori e inferiori per spingere fuori il bulbo oculare. Introdurre la punta delle forbici corneali chiuse nello spazio retrobulbare lungo la parete orbitale inferiore, assicurandosi di non penetrare nel bulbo oculare.
- Tenere fermo il bulbo oculare con una pinza corneale da 0,3 mm, quindi tagliare il nervo ottico e il tessuto molle periorbitale con forbici corneali per isolare il bulbo oculare.
- Per la coltura ex vivo dei bulbi oculari murini, procedere come segue.
- Preparare una piastra a 48 pozzetti con cera fusa all'interno del pozzetto e attendere la solidificazione. Con la punta della pinza congiuntiva, creare un foro rotondo sulla superficie di cera solidificata per accogliere i bulbi oculari.
- Posizionare i bulbi oculari raccolti direttamente sulla piastra a 48 pozzetti (Figura 1E) con fondi e pareti laterali ricoperti di cera per stabilire la stabilizzazione (Figura 1F).
- Coltura dei bulbi oculari con il terreno di aquila modificato (DMEM) di Dulbecco contenente l'1% di siero bovino fetale (FBS) in atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 37 °C con o senza antibiotici, a seconda dello scopo dello studio.
NOTA: Se il modello viene utilizzato per studiare la guarigione delle ferite epiteliali corneali, sarebbero necessari antibiotici per prevenire l'infezione. Tuttavia, se questo modello viene utilizzato per valutare l'efficacia di antibiotici o agenti misti, gli antibiotici profilattici non sarebbero necessari. - Immergere la superficie oculare con il terreno di coltura senza far galleggiare il bulbo oculare.
- Documentare il corso della guarigione delle ferite mediante colorazione con fluoresceina (fase 1.2.3) e raccolta di fotografie con una fotocamera digitale sotto luce blu cobalto.
NOTA: Negli esperimenti prospettici con modelli di topi di danno corneale meccanico, quelli che ricevono abrasione corneale e testati ulteriormente per l'efficacia degli agenti terapeutici sono visti come un gruppo sperimentale e quelli che ricevono abrasione corneale senza ulteriore trattamento sono considerati un gruppo di controllo negativo.
2. Modello di coniglio in vivo di danno alcalino corneale
NOTA: In questo modello, viene indotta una lesione da ustione alcalina seguita da sbrigliamento meccanico dell'epitelio corneale per generare un'area della ferita ben definita e uniforme per la successiva quantificazione. Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell'uso.
- Preparazione del coniglio con analgesia preoperatoria, compresa l'iniezione intramuscolare di analgesici sistemici e colliri topici.
- Somministrare l'anestesia generale ai conigli bianchi neozelandesi mediante iniezione intramuscolare di ketamina cloridrato (35-44 mg/kg di peso corporeo), miscelata con xilazina (5-10 mg/kg di peso corporeo) sulla zampa posteriore.
- Dopo aver posizionato il coniglio e averlo coperto con un asciugamano, applicare l'anestesia topica sull'occhio destro con una goccia di soluzione oftalmica proparacaina cloridrato allo 0,5% (Figura 2A) sotto uno stereomicroscopio. Disinfettare la superficie oculare e le palpebre tre volte con il 5% di betadine.
- Indurre lesioni da ustione alcalina sopra la cornea
- Posizionare le carte da filtro circolari con un diametro di 8 mm (tagliate con un punzone da 8 mm) in una capsula di Petri. Utilizzando un contagocce, aggiungere 0,5 N idrossido di sodio (NaOH) nella capsula di Petri per immergere la carta da filtro. Drenare la soluzione di NaOH in eccesso dalle carte da filtro prima di posizionarle sulla cornea del coniglio.
ATTENZIONE: 0,5 N NaOH può causare gravi lesioni erosive ai tessuti umani. Indossare guanti durante la manipolazione. Se la pelle o gli occhi entrano in contatto con goccioline di NaOH, sono necessarie l'irrigazione con abbondanti quantità di soluzione salina normale e l'aiuto medico per ridurre ulteriori danni. - Dopo aver aperto le palpebre con uno speculum palpebrale e aver confermato che la membrana nittitante del coniglio non interferisce con l'inserimento della carta da filtro (Figura 2B), posizionare la carta da filtro circolare imbevuta di 0,5 N NaOH sulla cornea centrale per 30 s, quindi rimuoverla con una pinza (Figura 2C).
- Dopo aver rimosso la carta da filtro, sciacquare la superficie oculare con 10 ml di soluzione salina normale per lavare il materiale alcalino.
- Posizionare le carte da filtro circolari con un diametro di 8 mm (tagliate con un punzone da 8 mm) in una capsula di Petri. Utilizzando un contagocce, aggiungere 0,5 N idrossido di sodio (NaOH) nella capsula di Petri per immergere la carta da filtro. Drenare la soluzione di NaOH in eccesso dalle carte da filtro prima di posizionarle sulla cornea del coniglio.
- Completamento del difetto epiteliale corneale
- Debride l'epitelio corneale all'interno dell'area opacizzata fino alla membrana di Bowman utilizzando un dispositivo di rimozione dell'anello di ruggine corneale con una bava di 0,5 mm (Figura 2D).
- Confermare l'area di sbrigliamento con colorazione con fluoresceina sotto la luce blu di cobalto e rimuovere l'epitelio corneale residuo utilizzando una pinza corneale (Figura 2E).
- Condizione sicura della ferita con tarsorrafia
- Confermare che la membrana nittitante copra uniformemente la superficie oculare e il difetto epiteliale corneale sul lato nasale. Assicurarsi che la membrana nittitante non sia piegata o distorta troppo per interferire con il processo di guarigione delle ferite e l'esperimento.
- Eseguire una tarsorbia temporanea con o senza agenti topici utilizzando una sutura 6-0 per proteggere la superficie oculare e impedire al coniglio di graffiarla (Figura 2F). Assicurarsi che la sutura per la tarsorrafia sia a 3-4 mm dai margini superiori e inferiori della palpebra con 4-5 lacci e nodi più lunghi per evitare che il coniglio rompa le suture.
NOTA: Se l'esperimento non è coinvolto in uno studio sugli antibiotici, potrebbero essere presi in considerazione agenti topici con antibiotici. - In questo modello di coniglio, quelli che ricevevano ustione alcalina e rimozione dell'epitelio corneale erano considerati il gruppo di controllo.
NOTA: Negli esperimenti prospettici, i conigli che ricevono lesioni corneali alcaline bruciano e ulteriormente trattati con agenti terapeutici sono visti come un gruppo sperimentale. I conigli che ricevono solo un trattamento per ustioni alcaline, senza ulteriore trattamento, sono considerati un gruppo di controllo negativo.
- Analgesia post-operatoria e controllo del dolore
- Valutare la condizione fisiologica e i livelli di dolore USDA per 7 giorni dopo la procedura, monitorando il dolore e l'angoscia negli animali. Considerare l'uso di unguento alla tobramicina e una goccia di soluzione oftalmica di proparacaina cloridrato allo 0,5% in base al risultato della valutazione. Somministrare Buprenorfina HCl (0,03 mg/kg) ogni 6-8 ore per 3 giorni.
NOTA: Per la misurazione giornaliera dell'area del difetto e l'osservazione dopo l'intervento chirurgico, la procedura appartiene alla categoria D USDA.
- Valutare la condizione fisiologica e i livelli di dolore USDA per 7 giorni dopo la procedura, monitorando il dolore e l'angoscia negli animali. Considerare l'uso di unguento alla tobramicina e una goccia di soluzione oftalmica di proparacaina cloridrato allo 0,5% in base al risultato della valutazione. Somministrare Buprenorfina HCl (0,03 mg/kg) ogni 6-8 ore per 3 giorni.
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Representative Results
Modello di guarigione ex vivo dell'epitelio corneale del topo:
Dopo lo sbrigliamento in vivo dell'epitelio corneale di topo con rimozione dell'anello antiruggine corneale portatile, nell'area centrale di 2 mm si trova un'area corneale centrale leggermente depressa con colorazione di fluoresceina (Figura 3A-B). Dopo aver raccolto il bulbo oculare del topo, è stato facilmente fissato su una piastra di coltura a 48 pozzetti rivestita di cera senza una rotazione significativa. Seguendo il protocollo, la coltura ex vivo dei bulbi oculari murini può essere esaminata e documentata quotidianamente all'interno di una piastra di coltura a 48 pozzetti sotto uno stereomicroscopio (Figura 3C). Un giorno dopo aver discusso l'epitelio corneale murino, un difetto epiteliale circolare colorato con fluoresceina misurato 2 mm di diametro può essere rivelato in fotografie digitali ottenute sotto luce blu cobalto (Figura 3D). Il margine iniziale della ferita colorato in modo irregolare o la colorazione negativa con fluoresceina significano rimozione incompleta o fallita dell'epitelio corneale. Nel normale processo di guarigione della ferita, il difetto epiteliale corneale guarirà con una ridotta area colorata di fluoresceina in 2-3 giorni.
Modello di coniglio in vivo di danno alcalino corneale:
Prima di qualsiasi procedura, l'epitelio corneale di coniglio intatto non può essere colorato con colorazione con fluoresceina. Dopo aver creato lesioni alcaline all'epitelio corneale del coniglio, è possibile osservare una colorazione positiva con fluoresceina con o senza luce blu cobalto sulla cornea centrale con un margine circolare chiaro e completo (Figura 4A-B e Figura 5B). La colorazione incompleta con area non riempita rappresenta tessuti epiteliali corneali residui o colorazione fallita. Durante il follow-up regolare, la ferita epiteliale corneale si riepitelizza con la crescita di pannus dal limbus, seguita da una ridotta area colorata (Figura 5C). Il difetto epiteliale guarisce entro 3-4 settimane. Se l'ulcera corneale, l'ulcera, il difetto epiteliale di grandi dimensioni o la massiccia secrezione biancastra o mucosa si sviluppano bruscamente, devono essere prese in considerazione tarsorrafia insicure, suture esposte, una membrana nittitante mal posizionata o un corpo estraneo all'interno della congiuntiva palpebrale.
Figura 1: Procedure per impostare un modello murino di lesione meccanica corneale . (A) L'anestesia topica viene applicata prima della procedura. (B) L'indentazione delicata viene eseguita sulla cornea centrale con una trefina bioptica cutanea di 2 mm. (C) Il dispositivo di rimozione dell'anello di ruggine corneale viene utilizzato per rimuovere l'epitelio corneale centrale. (D) Un difetto epiteliale è colorato con fluoresceina per confermare l'area difettosa e confrontarla con la regione contrassegnata in B. (E,F) Il bulbo oculare del topo viene raccolto e trasferito su una piastra a 48 pozzetti coperta di cera in anticipo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Passi per costruire un modello di coniglio di danno corneale alcalino . (A) L'anestesia topica viene applicata alla superficie oculare. (B) Uno speculum del coperchio viene utilizzato per aprire le palpebre superiori e inferiori, senza piegare o schiacciare la membrana nittitante. (C) Una carta da filtro trephined imbevuta di NaOH (8 mm di diametro) viene posta sulla cornea centrale. (D) Il dispositivo di rimozione dell'anello di ruggine corneale viene utilizzato per sbrigliare l'epitelio centrale di 8 mm fino allo strato di Bowman. (E) Il difetto dell'epitelio è macchiato con fluoresceina. (F) Dopo la procedura, viene eseguita la tarsorbafia per proteggere la ferita dai graffi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Risultati positivi e negativi in un modello murino di danno meccanico corneale . (A) Epitelio corneale di topo intatto senza alcuna colorazione prima della procedura. (B) Colorazione positiva in vivo con fluoresceina sulla ferita corneale murina senza luce blu cobalto. (C) Coltura ex vivo del bulbo oculare del topo senza aggiunta di colorante di fluoresceina prima di aggiungere terreno di coltura. (D) Colorazione positiva con fluoresceina su difetto epiteliale corneale in modello murino ex vivo . Il difetto epiteliale di 2 mm generalmente guarisce entro 2-3 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Risultati della colorazione con fluoresceina in un modello di coniglio di danno alcalino corneale. (A) Colorazione positiva con fluoresceina sotto luce blu cobalto. La fotografia è stata scattata subito dopo la lesione corneale meccanica. (B) Colorazione positiva con colorante fluoresceina potrebbe anche essere osservata sulla superficie oculare del coniglio senza luce blu cobalto. (C) Colorazione negativa sulla superficie oculare guarita. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Andamento temporale della guarigione delle ferite e comparsa della riepitelizzazione in un modello di coniglio di lesione alcalina corneale . (A) La riepitelizzazione nei modelli murino e coniglio richiede rispettivamente 2-3 giorni e 3-4 settimane. (B) Un difetto epiteliale di 8 mm colorato con fluoresceina dopo ustione alcalina in un modello di coniglio. La luce blu cobalto è stata utilizzata come fonte di luce. La fotografia è stata scattata subito dopo la lesione alcalina. (C) Un difetto epiteliale guarito nell'occhio di coniglio 3 settimane dopo la lesione alcalina, che mostra una ridotta area di colorazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
I modelli murini e di coniglio di lesioni corneali forniscono un'utile piattaforma ex vivo e in vivo per monitorare la guarigione delle ferite, testare nuove terapie e studiare i meccanismi sottostanti alla guarigione delle ferite e ai percorsi di trattamento. Diversi modelli animali possono essere utilizzati per un esperimento a breve o lungo termine, a seconda dello scopo della ricerca. Ad esempio, dopo aver creato un difetto epiteliale sulla cornea del topo in vivo, un difetto epiteliale confinato potrebbe essere utilizzato per monitorare agenti terapeutici liquidi in un piccolo volume. Allo stesso tempo, le unità funzionali circostanti, come le palpebre, il sistema lacrimale e la congiuntiva, possono essere valutate in condizioni in vivo, al contrario della coltura cellulare odelle condizioni di coltura ex vivo . La tarsorrafia può essere ancora necessaria in questa situazione se i movimenti dei topi possono influenzare la condizione sperimentale. È più facile osservare e quantificare una ferita circolare rispetto a una semplice ferita da graffio lineare4. Tuttavia, il pugno della pelle per creare una linea di demarcazione sulla cornea dovrebbe essere fatto con attenzione senza tagliare la membrana di Bowman, che altrimenti lascerà una lesione corneale profonda o una ferita penetrante. La ferita corneale meccanica potrebbe anche essere creata da un trephine corneale di 8 mm e da una lama di bisturi in un coniglio modello15, in cui è stata presentata una ferita più profonda fino allo stroma anteriore piuttosto che all'epitelio corneale.
La rimozione dell'anello di ruggine corneale è un altro problema cruciale che vale la pena menzionare. Poiché il bulbo oculare del topo è piccolo, può verificarsi una rimozione eccessiva o insufficiente dell'epitelio corneale, influenzando così l'accuratezza della ricerca. Marcare la cornea con un punch bioptico cutaneo e un'operazione guidata da fluoresceina contribuirà a ridurre questi errori. Sebbene il cauterizzazione e le lame di bisturi siano stati proposti come strumenti per rimuovere l'epitelio corneale nei modelli animali6,7, il danno sulla superficie oculare potrebbe non essere facilmente controllato e riprodotto allo stesso modo, il che potenzialmente porta a risultati incoerenti in ulteriori esperimenti.
Rispetto alla condizione in vivo, i bulbi oculari di topo coltivati ex vivo in piastre a 48 pozzetti sono più facili da manipolare grazie a uno spazio di lavoro più ampio sulle piastre e possono essere utilizzati per testare agenti complessi in vari terreni di coltura contemporaneamente, come lenti a contatto a rilascio di farmaco e terapie cellulari. Quando i bulbi oculari del topo vengono raccolti e trasferiti su una piastra a 48 pozzetti, è importante una protezione meticolosa della cornea per evitare ulteriori danni artificiali alla superficie oculare e la rottura dei bulbi oculari. Per lo studio successivo, il bulbo oculare può essere fissato all'interno del pozzetto rivestito di paraffina con la cornea rivolta verso l'alto e immersa all'interno di un terreno di coltura. Bulbi oculari fluttuanti o rotanti o cornea disidratata ostacoleranno i risultati. Poiché questo modello murino ex vivo si concentra sui cambiamenti sulla superficie oculare, altre unità funzionali, come la ghiandola lacrimale e le palpebre, non sono discusse in questo modello ex vivo. Il modello murino ex vivo riduce anche il costo dell'allevamento e dell'alloggiamento dei topi e consente di risparmiare spazio sperimentale, rispetto al modello animale in vivo. Questo modello è adatto per uno studio a breve termine, piuttosto che a lungo termine, poiché potenziali infezioni tissutali e insufficienza d'organo possono svilupparsi a lungo termine.
Sebbene il modello murino costi meno e possa essere scalato in laboratorio, una piccola superficie limita potenzialmente l'osservazione di cambiamenti dettagliati della cornea come la deposizione di lipidi e la neovascolarizzazione da parte di stereomicroscopi. Invece, un modello di coniglio di lesione corneale con un diametro maggiore del bulbo oculare può generalmente compensare questo svantaggio. Regolando la concentrazione di NaOH e il tempo di ammollo, è possibile creare diverse entità della gravità dell'ustione alcalina corneale. Nei modelli di ustione chimica nei ratti, 1 N NaOH è stato utilizzato per immergere la cornea con carta da filtro da 3 mm per 40 s e carta da filtro da 4 mm per 20 s, fornendo un'area simile ma più piccola per l'osservazione16,17. Per mantenere la bruciatura alcalina costante in termini di dimensioni e concentrazione, si suggerisce un punzone nuovo e affilato nella preparazione di carta da filtro da 8 mm per evitare qualsiasi fibra o angolo non riempito sul margine della carta. È necessaria un'irrigazione sufficiente per eliminare gli agenti chimici dalla superficie oculare e dal sacco congiuntivale per ridurre i danni continui al di fuori della ferita. Poiché la membrana nittitante del coniglio può interferire con la procedura sperimentale e indurre dolore quando corrosa da agenti alcalini, deve essere accuratamente protetta e rimessa in posizione fisiologica dopo la procedura per ridurre l'infiammazione aggiuntiva sulla superficie oculare. Dopo la procedura di ustione alcalina, la ferita corneale del coniglio può essere protetta dalla tarsorrafia o da altro materiale come le lenti a contatto per garantire la qualità e la coerenza degli esperimenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Lo studio è stato finanziato dal Consiglio per l'energia atomica di Taiwan (sovvenzione n. A-IE-01-03-02-02), dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (sovvenzione n. NMRPG3E6202-3) e dal Chang Gung Medical Research Project (sovvenzione n. CMRPG3H1281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Ma, X., et al. Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis. Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).
- Chan, M. F., Werb, Z.
- Lan, Y., et al. Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).
- Watanabe, M., et al. Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).
- Murataeva, N., et al. Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing. Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).
- Carter, K., et al. Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).
- Sanie-Jahromi, F., et al. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model. Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).
- Sun, M. M., et al. Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).
- Yang, Y., et al. Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Oh, J. Y., et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).
- Wang, T., et al. Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).
- Gong, Y., et al. Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model. International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).
- Yao, L., et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn. PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).
