Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

الإصابات شبه الآلية التي يسببها الليزر لدراسة تجديد الحبل الشوكي في يرقات أسماك الزرد

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

ERRATUM NOTICE

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة للحث على إصابات خاصة بالأنسجة وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة في يرقات أسماك الزرد باستخدام نظام آفة ليزر مقترن بمنصة ميكروفلويديك آلية للتعامل مع اليرقات.

Abstract

تمتلك يرقات الزرد جهازا عصبيا مركزيا يعمل بكامل طاقته (CNS) مع قدرة تجديدية عالية بعد أيام قليلة فقط من الإخصاب. هذا يجعل هذا النموذج الحيواني مفيدا جدا لدراسة إصابة الحبل الشوكي وتجديده. البروتوكول القياسي لتحفيز مثل هذه الآفات هو عبور الجزء الظهري من الجذع يدويا. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية تدريبا مكثفا وتلحق الضرر بأنسجة إضافية. تم تطوير بروتوكول للآفات الناجمة عن الليزر للتحايل على هذه القيود ، مما يسمح بقابلية عالية للتكاثر واكتمال انتقال الحبل الشوكي على العديد من الحيوانات وبين الجلسات المختلفة ، حتى بالنسبة لمشغل غير مدرب. علاوة على ذلك ، يقتصر تلف الأنسجة بشكل أساسي على الحبل الشوكي نفسه ، مما يقلل من الآثار المربكة الناجمة عن إصابة الأنسجة المختلفة ، على سبيل المثال ، الجلد والعضلات والجهاز العصبي المركزي. علاوة على ذلك ، من الممكن حدوث آفات نصف في الحبل الشوكي. إن تحسين الحفاظ على سلامة الأنسجة بعد إصابة الليزر يسهل إجراء المزيد من التشريحات اللازمة لإجراء تحليلات إضافية، مثل الفيزيولوجيا الكهربية. وبالتالي ، توفر هذه الطريقة تحكما دقيقا في مدى الإصابة الذي لا يمكن تحقيقه يدويا. وهذا يسمح بنماذج تجريبية جديدة في هذا النموذج القوي في المستقبل.

Introduction

على النقيض من الثدييات، يمكن لسمك الزرد (دانيو ريريو) إصلاح الجهاز العصبي المركزي (CNS) بعد الإصابة1. استخدام يرقات الزرد كنموذج لتجديد الحبل الشوكي حديث نسبيا. وقد ثبت أنه من المفيد التحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء الإصلاح2. ويرجع ذلك إلى سهولة التلاعب ، والدورة التجريبية القصيرة (يرقات جديدة كل أسبوع) ، والشفافية البصرية للأنسجة ، وصغر حجم اليرقات ، وهي مناسبة بشكل مثالي للفحص المجهري الفلوري في الجسم الحي .

في حالة تجديد الحبل الشوكي ، هناك ميزتان إضافيتان لاستخدام اليرقات هما سرعة الشفاء ، بضعة أيام مقارنة ببضعة أسابيع للبالغين ، وسهولة إحداث إصابات باستخدام التقنيات اليدوية. وقد استخدم هذا بنجاح في العديد من الدراسات3،4،5، بما في ذلك التحقيقات الأخيرة6،7. بشكل عام ، يؤدي هذا إلى زيادة إنتاج البيانات ذات المغزى ، والقدرة العالية على التكيف مع البروتوكولات التجريبية ، وانخفاض التكاليف التجريبية. كما أن استخدام اليرقات التي يقل عمرها عن 5 أيام بعد الإخصاب يقلل أيضا من استخدام الحيوانات التي تتبع مبادئ 3R في البحوث على الحيوانات8.

بعد إصابة الحبل الشوكي في يرقات الزرد ، تحدث العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك الاستجابة الالتهابية ، وانتشار الخلايا ، وتكوين الخلايا العصبية ، وهجرة الخلايا الباقية أو المتولدة حديثا ، وإصلاح المحاور الوظيفية ، وإعادة تشكيل عالمي لدوائر العمليات العصبية وأنسجة العمود الفقري6،7،9،10 . ولكي يتم تنسيق هذه العمليات بنجاح، فإنها تنطوي على تفاعل منظم بدقة بين مجموعة من أنواع الخلايا، ومكونات المصفوفة خارج الخلية، والإشارات الكيميائية الحيوية11،12. إن الكشف عن تفاصيل إعادة التنظيم الكبيرة هذه لنسيج معقد مثل الحبل الشوكي يتطلب استخدام وتطوير مناهج تجريبية دقيقة وخاضعة للرقابة.

النموذج التجريبي الأساسي المستخدم لدراسة تجديد الحبل الشوكي في أسماك الزرد هو استخدام الوسائل الجراحية للحث على تلف الأنسجة عن طريق الاستئصال أو الطعن أو الإصابة بالتبريد3,13. ومن عيوب هذه النهج أنها تتطلب تدريبا محددا على مهارات الجراحة المجهرية، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا لأي مشغل جديد وقد يمنع استخدامها في مشاريع قصيرة الأجل. علاوة على ذلك ، فإنها عادة ما تحفز تلف الأنسجة المحيطة ، مما قد يؤثر على التجديد.

وهناك نهج آخر يتمثل في الحث على تلف الخلايا كيميائيا14 أو عن طريق التلاعب الجيني15. هذا الأخير يسمح بأضرار مستهدفة للغاية. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية عملا تحضيريا طويلا لتوليد أسماك معدلة وراثيا جديدة قبل إجراء أي تجربة ، يتم تجديدها في كل مرة يتم فيها استهداف نوع خلية فريد.

وبالتالي ، هناك حاجة إلى طريقة تسمح بالآفات المستهدفة ولكن متعددة الاستخدامات المناسبة لمجموعة متنوعة من الدراسات في التجديد. الحل هو استخدام الليزر للحث على تلف موضعي في الأنسجة ذات الاهتمام16،17،18،19،20. في الواقع ، يمثل استخدام تلف الأنسجة الناجم عن الليزر نهجا قويا لتوليد آفات الحبل الشوكي مع العديد من المزايا. تسمح المجاهر المجهزة بوحدات معالجة الليزر هذه بتحديد منطقة مخصصة الشكل حيث سيحدث استئصال الخلايا ، مع فائدة إضافية تتمثل في التحكم الزمني. وبالتالي يمكن تكييف حجم وموضع الآفة لمعالجة أي أسئلة.

السمة المفقودة لمعظم أنظمة آفات الليزر هي إمكانية إحداث إصابات بطريقة قابلة للتكرار بشكل كبير لسلسلة من اليرقات. هنا يتم وصف بروتوكول أصلي باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية للحث على آفات دقيقة ومضبوطة شبه آلية في يرقات أسماك الزرد استنادا إلى منصة ميكروفلويديك مصممة للتعامل الآلي مع اليرقات21. علاوة على ذلك ، في النظام المعروض هنا ، يتم إدخال اليرقات في الشعيرات الدموية الزجاجية ، مما يسمح بالدوران الحر للحيوان حول محوره الوردي. يمكن للمستخدم اختيار أي جانب من اليرقة لتقديمه إلى الليزر مع السماح للتصوير الفلوري باستهداف شعاع الليزر بدقة وتقييم الضرر بعد الآفة.

يستخدم البروتوكول الموصوف هنا مع نظام تصوير يرقات الزرد شبه الآلي جنبا إلى جنب مع قرص دوار مجهز بليزر الأشعة فوق البنفسجية (المسمى فيما يلي باسم نظام VAST ). ومع ذلك ، فإن النقاط الرئيسية للبروتوكول ومعظم ادعاءات هذه التقنية صالحة لأي نظام مجهز بالليزر قادر على استئصال الخلايا ، بما في ذلك المجاهر الضوئية بالليزر ثنائي الفوتون ، أو المجاهر ذات القرص الدوار المزودة بليزر الأشعة فوق البنفسجية (وحدة FRAP) ، أو مجاهر الفيديو مع وحدة ليزر لمعالجة الصور. سيكون أحد الاختلافات الرئيسية بين نظام VAST ومعالجة العينات التقليدية هو أنه بالنسبة لهذا الأخير ، ستكون هناك حاجة إلى تركيب يرقات في أغاروز منخفض درجة الانصهار على أغطية زجاجية / أطباق بتري ذات قاع زجاجي بدلا من تحميلها في طبق من 96 بئرا.

الفوائد التي توفرها هذه الطريقة تفتح فرصا للبحث المبتكر حول الآليات الخلوية والجزيئية أثناء عملية التجديد. علاوة على ذلك ، تسمح جودة البيانات العالية بإجراء تحقيقات كمية في سياق متعدد التخصصات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات بموافقة من وزارة الداخلية البريطانية ووفقا لوائحها ، بموجب ترخيص المشروع PP8160052. تمت الموافقة على المشروع من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة إدنبرة. ولأغراض التحليل التجريبي، استخدمت يرقات أسماك الزرد التي يصل عمرها إلى 5 أيام من أي من الجنسين من الخطوط المعدلة وراثيا المتاحة التالية: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)، Tg(Xla.Tubb:DsRed)، Tg(betaactin:utrophin-mCherry)، Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)، وTg(mnx1:gfp) (انظر الملف التكميلي 1 فيما يتعلق بتوليد خطوط الزرد المعدلة وراثيا). ويبين الشكل 1 مخططا للبروتوكول باستخدام المنصة الآلية لمناولة يرقات أسماك الزرد. تتوفر جميع البرامج المخصصة والبرامج النصية والبروتوكولات التجريبية التفصيلية المستخدمة في هذا العمل على https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. إعداد العينات

  1. في الساعة 5 بعد الإخصاب ، قم بفرز الأجنة لمرحلة النمو الصحيحة 21. تخلص من البيض الميت والأجنة ضعيفة النمو ومفرطة النمو.
  2. في 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، قم بتخدير اليرقات عن طريق إضافة 2 مل من 0.4٪ من ميثيل ميثيل إستر حمض أمينوبنزويك - إيثيل - استر إلى 50 مل من مياه منشأة الأسماك في طبق بتري 90 ملم. استخدم الحيوانات التي تربى مع الفينيل ثيوريا (PTU) (انظر جدول المواد) لمنع تصبغ الجلد إذا كانت مشكلة ، وهذا ليس هو الحال بالنسبة لإصابات الحبل الشوكي على يرقات 3 dpf الموصوفة في هذا البروتوكول.
    ملاحظة: يستخدم هذا التركيز المخدر العالي نسبيا لمنع حركات اليرقات بعد تأثير الليزر.
  3. فحص الأجنة بحثا عن تعبير مراسل الفلورسنت (الملف التكميلي 1).
    ملاحظة: غالبا ما يطلب من مراسل الفلورسنت للحبل الشوكي (أو أي هيكل آخر ذي أهمية) تقييم كفاءة الإصابة. يساعد استخدام tg(Xla.Tubb:DsRed) على تحديد الحبل الشوكي.
  4. انقل اليرقات المختارة إلى صفيحة من 96 بئرا لاستخدامها في نظام VAST (انظر جدول المواد) مع 300 ميكرولتر من مياه منشأة الأسماك لكل بئر. استخدم الوسط الذي يحتوي على مخدر من طبق بتري 90 مم مباشرة. تأكد من وجود يرقة واحدة فقط لكل بئر. قم بإعداد طبق واحد فارغ إضافي من 96 بئرا لجمع اليرقات المصابة.
    ملاحظة: في حالة استخدام نظام آفة ليزر آخر ، قم بتركيب اليرقات في هلام الأغاروز منخفض الانصهار (LMP) بنسبة 1٪ في غرفة مراقبة مناسبة.

2. إعداد المجهر

  1. قم بتشغيل جميع مكونات النظام (VAST ، المجهر ، الليزر ، الكمبيوتر الشخصي) ، بما في ذلك الليزر للاستئصال.
  2. بمجرد تهيئة الأجهزة بالكامل ، قم بتشغيل برنامج المجهر ، ImageJ / Fiji ، وبيئة تطوير متكاملة (IDE) ، وبرنامج تصوير الزرد الآلي (VAST system) إذا كنت تستخدم هذه المنصة (انظر جدول المواد).
  3. قم بإعداد برنامج VAST باتباع الخطوات أدناه.
    1. عند تشغيل برنامج VAST ، اختر Plate في النافذة الأولى وانقر فوق الزر تم (الشكل 2A). ستظهر نافذة صغيرة أخرى تسأل عما إذا كانت الشعيرات الدموية فارغة ونظيفة. تحقق من خلال النظر إلى صورة الشعيرات الدموية إذا كان هناك أي فقاعات هواء في الداخل. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فانقر فوق نعم. إذا كانت هناك أي فقاعات ، فانقر فوق لا واتبع الخطوة 2.3.2-2.3.3 (الشكل 2B).
    2. في نافذة أخذ عينات الجسيمات الكبيرة (LP) ، انقر فوق Prime لإزالة فقاعات الهواء (الشكل 2C).
    3. انتقل إلى نافذة البرنامج الرئيسية (مع الصورة الشعرية) وانقر بزر الماوس الأيمن على الصورة. حدد تسجيل صورة شعرية فارغة في القائمة المنبثقة (الشكل 2B).
    4. في نافذة LP Sampler ، انتقل إلى القائمة ملف وحدد الخيار فتح البرنامج النصي . اختر ملفا يحتوي على البرنامج النصي المقابل للتجربة المراد تنفيذها.
    5. في نافذة برنامج VAST الرئيسية، انتقل إلى ملف واختر فتح تجربة. اختر ملف التجربة المقابل للتجربة المخطط لها.
      ملاحظة: تأكد من عدم تحديد مربعات التفريغ التلقائي والإخراج المجمع للنفايات.
  4. قم بإعداد برنامج المجهر للتصوير.
    1. قم بتشغيل برنامج التصوير المجهري (انظر جدول المواد) لتهيئة الأجهزة. قد يستغرق ذلك بضع دقائق ، اعتمادا على النظام.
    2. انتقل إلى إعدادات الاستحواذ وقم بإعداد المجهر لتصوير الفلوروفور المعبر عنه في اليرقات. استخدم هدف غمس الماء 10x NA 0.5 لضمان استطالة الحجم البؤري بما فيه الكفاية على طول المحور البصري لآفة عمق الحبل الشوكي بالكامل أو الأنسجة المستهدفة.
  5. قم بإعداد ImageJ / Fiji لآفات الليزر.
    1. انتقل إلى القائمة ملف ، واختر جديد/برنامج نصي لفتح نافذة البرنامج النصي.
    2. في النافذة جديد ، انتقل إلى القائمة ملف واختر فتح لتحميل البرنامج النصي لآفة الليزر (Manual_MP_Operation.ijm).
  6. قم بإعداد Python IDE.
    1. قم بتشغيل Python IDE.
    2. انتقل إلى القائمة ملف واختر فتح ملف لتحميل البرنامج النصي لإدارة الليزر (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. انتقل إلى القائمة تشغيل واختر تشغيل بدون تصحيح الأخطاء لتشغيل البرنامج النصي. تحقق للتأكد من ظهور سلسلة من الرسائل في لوحة TERMINAL مع بعض الضوضاء أثناء تهيئة مخفف الليزر (الشكل 2D).

3. أداء آفات الليزر على نظام VAST

  1. قم بتوسيط الشعيرات الدموية بالنسبة لهدف المجهر عن طريق تحريك المرحلة بالنقر فوق أزرار الأسهم في النافذة الرئيسية لبرنامج VAST (الشكل 2B).
  2. ركز على الجزء العلوي من الشعيرات الدموية من خلال النظر من خلال النظارات واستخدام الضوء المنقول من المجهر.
    تحذير: الشعيرات الدموية هشة للغاية وقد تنكسر إذا لمسها الهدف. حرك مقبض المجهر ببطء عند التركيز للداخل والخارج.
  3. ضع لوحات 96 بئرا على حامل لوحة جهاز أخذ العينات LP لنظام VAST . ضع اللوحة التي تحتوي على يرقات على الحامل الأيسر واللوحة للجمع على اليمين. تأكد من توجيه الألواح بشكل صحيح: يجب أن يكون البئر A1 في الزاوية الأمامية اليسرى من الحامل.
  4. في برنامج VAST ، في نافذة LP Sampler ، انقر فوق الزر Plate Template وحدد جميع الآبار التي تحتوي على يرقات. انقر فوق الزر موافق ( OK ) للتحقق من صحة النافذة وإغلاقها (الشكل 2C).
  5. في نافذة LP Sampler ، انقر فوق الزر " تشغيل لوحة" لبدء تحميل يرقة.
    ملاحظة: بعد مرور بعض الوقت ، يجب أن تكون اليرقة مرئية في الشعيرات الدموية في موضعها (محددة مسبقا في ملف تعريف التجربة) ، مما يسمح بإصابة الحبل الشوكي. سيتم إيقاف تشغيل ضوء صينية VAST بعد بضع دورات لضبط اليرقة مع الجانب الجانبي الذي يواجه هدف المجهر.
  6. انتقل إلى برنامج المجهر وانقر على زر Live لتصوير اليرقات.
  7. أدر مقبض تركيز المجهر حتى تصبح القناة المركزية للحبل الشوكي مرئية.
    ملاحظة: قد يكون من الأسهل التركيز باستخدام الضوء المنقول أولا ، ثم تحسينه باستخدام التألق.
  8. التقط لقطة في التألق واحفظ الصورة في مجلد مخصص.
  9. افتح الصورة في ImageJ واضبط التباين إذا لزم الأمر (باستخدام قائمة Image/Adjust/Brightness/contrast... في ImageJ).
  10. انقر على أداة خط منطقة الاهتمام (ROI ) وارسم خطا قصيرا (20 ميكرومتر) يتمحور حول الحبل الشوكي (الشكل 3A).
  11. قم بتبديل المجهر إلى موضع المرآة العاكسة بنسبة 100٪.
  12. قم بتحميل البرنامج النصي ImageJ وانقر فوق الزر تشغيل . استخدم المعلمات التالية: التكرار - 2 ؛ عينة - 1 ؛ العرض - 40 ميكرون ؛ التوهين - 89 (طاقة الليزر الكاملة) (الشكل 3C).
  13. عند الانتهاء من تسلسل لقطات الليزر، قم بالتبديل إلى التصوير الفلوري على برنامج التصوير واضبط التركيز البؤري إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: غالبا ما يلاحظ تحول في التركيز بسبب إزاحة الذيل أثناء التعرض لليزر.
  14. التقط لقطة جديدة واحفظها.
  15. افتح هذه الصورة الجديدة في ImageJ وارسم خطا جديدا يجب أن يكون أكبر من الحبل الشوكي نفسه (~ 80 ميكرومتر) ، بدءا من أسفل الجانب البطني للحبل الشوكي في الجزء العلوي من notochord ويتجه نحو الجانب الظهري لينتهي في الفراغ بين الحبل الشوكي والجلد (الشكل 3B).
  16. قم بتبديل المجهر إلى موضع المرآة العاكسة بنسبة 100٪.
  17. انتقل إلى نافذة البرنامج النصي ImageJ وانقر فوق الزر تشغيل . استخدم المعلمات التالية: التكرار - 2 ؛ عينة - 1 ؛ العرض - 40 ميكرون ؛ التوهين - 89 (طاقة الليزر الكاملة).
  18. بعد الانتهاء من تسلسل لقطات الليزر (الأطول)، تحقق من جودة النقل عن طريق التصوير الفلوري والتركيز. تأكد من عدم بقاء أي خلية أو محاور سليمة في موقع الآفة ، والتي يجب أن تظهر كمنطقة مظلمة أو كمنطقة فلورسنت باهتة ومتجانسة (الشكل 3D ، اللوحة السفلية).
  19. اجمع اليرقات المصابة في صفيحة 96 بئرا فارغة (بنفس إحداثيات البئر مثل إحداثيات البئر الأصلية) عن طريق الانتقال إلى نافذة برنامج VAST الرئيسية والنقر على زر جمع .
  20. أعد تشغيل مصباح نظام VAST بالنقر فوق خانة الاختيار Tray Light في أسفل يسار النافذة.
  21. كرر الخطوة 3.3-3.17 لكل يرقة جديدة ستصاب.

4. التعامل مع ما بعد الآفة والتجارب الإضافية

  1. أخرج اليرقات من طبق البئر 96 في أقرب وقت ممكن وانقلها إلى طبق بتري نظيف مع مياه منشأة الأسماك العذبة لليرقات للتعافي بعد الآفة. ضع طبق بتري في حاضنة عند 28 درجة مئوية.
    ملاحظة: غالبا ما يستمر الضرر في الانتشار في الساعة الأولى بعد الآفة. وبالتالي ينبغي تقييم المدى الفعلي للآفة عن طريق التصوير الفلوري بعد تأخير يبلغ حوالي 1 ساعة.

5. استكشاف الأخطاء وإصلاحها

  1. إذا كانت فقاعات الهواء موجودة في الأنابيب والشعيرات الدموية لنظام VAST ، فانقر فوق الزر Prime في نافذة LP Sampler لإزالتها.
  2. النظر في الآفات غير الناجحة (كما تم تقييمها من التألق المتبقي في موقع الآفة ، بصرف النظر عن الخلفية المتبقية والمتجانسة المتوقعة) ، والتي يمكن أن تكون بسبب عدة أسباب مذكورة أدناه.
    1. طاقة ليزر منخفضة: عندما يحدث هذا ، حاول الحصول على قيمة أعلى.
      ملاحظة: تم تجهيز نظام VAST بليزر صبغة. هذا يعني أن تركيز محلول الصبغة المستخدم لتوليد ضوء الليزر يمكن أن يتغير مع مرور الوقت ، مما يؤدي إلى انخفاض في طاقة الليزر. عادة ما يؤدي الاستبدال بحل جديد إلى حل المشكلة22.
    2. ضعف المعايرة: عند حدوث ذلك، تحقق من معايرة وقوة نظام الليزر وفقا للخطوة 5.2.2.1-5.2.2.4. إذا لم تتم معايرته بشكل صحيح ، فلن يتم توجيه الليزر إلى الموقع المطلوب ، مما يؤدي إلى آفات غير ناجحة أو تلف غير مرغوب فيه في الأنسجة المجاورة.
      1. ضع شريحة مرآة أعلى الغرفة الشعرية. ركز على الجانب المطلي (يجب أن يواجه الهدف). استخدم الإعداد الافتراضي السابق في الشريحة للتركيز بسهولة أكبر.
      2. تطبيق نمط من الاستئصال بالليزر باستخدام برنامج نصي للمعايرة.
      3. تقييم جودة النمط. يجب أن تظهر البقع أو الخطوط حادة وغير ضبابية.
      4. استخدم منحدرا ذا طاقة متزايدة لتقييم ما إذا كانت طاقة الليزر قد تغيرت مقارنة بالجلسات السابقة.
    3. حركة اليرقات أثناء الآفات: تستجيب اليرقات بشكل مختلف للتخدير. وبالتالي ، قد تؤدي آفة الليزر إلى حركات الذيل أثناء العملية ، وبالتالي منع التحويل الناجح. عندما يحدث هذا ، خذ تكرارا إضافيا لخطوات آفة الليزر لإكمالها مع تجنب تلف الأنسجة المحيطة.
    4. التركيز السيئ: عندما يحدث هذا ، ركز على منتصف القناة المركزية للحصول على أفضل النتائج.
    5. رسم عائد الاستثمار وموضعه وحجمه: يعد موضع وحجم عائد الاستثمار أمرا بالغ الأهمية لعمليات النقل الناجحة. يجب أن يكون عائد الاستثمار أكبر من الحبل الشوكي ويتمركز في مركز الحبل الشوكي. لحل هذه المشكلة ، ابدأ في سحب عائد الاستثمار من الجانب البطني للحبل الشوكي والصعود نحو الجانب الظهري للحصول على نقل ناجح. من المحتمل أن يكون هذا بسبب حركات الذيل الناتجة عن تسلسل لقطات الليزر أثناء إجراء الاستئصال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التحقق من صحة نقل الحبل الشوكي
تم إجراء فحوصات هيكلية ووظيفية لتقييم ما إذا كان البروتوكول يسمح بنقل الحبل الشوكي بالكامل.

أولا ، للتحقق من أن الخسارة في التألق في موقع الآفة كانت بسبب تلف الأنسجة العصبية وليس التبييض الضوئي الفلوري من إضاءة الليزر ، تم إجراء تلطيخ مناعي باستخدام جسم مضاد ضد توبولين أسيتيل (انظر جدول المواد والملف التكميلي 1). لوحظ اضطراب كامل في المحاور بين الجانبين الذيلي والسطحي للآفة ، مما يؤكد الانتقال الكامل للحبل الشوكي (الشكل 4B). يجب ألا يترك نقل الحبل الشوكي الناجح أي إسقاط عصبي متبقي عبر موقع الآفة (انظر الشكل 4C للحصول على مثال على آفة غير ناجحة). باستخدام هذه التقنية ، قدر معدل نجاح آفات ليزر الحبل الشوكي بنسبة 75٪ (أربعة عمليات نقل غير مكتملة في 16 حيوانا).

تم التحقيق في فقدان الوظائف بعد آفة الليزر باستخدام تصوير الكالسيوم. على الأسماك السليمة ، يولد نشاط الشبكة العصبية المنسقة تلقائيا قمم التألق على طول الحبل الشوكي بأكمله. ومن شأن التحويل الناجح أن يقطع انتشار هذا النشاط بين جانبي الآفة. للتحكم في جودة نقل الحبل الشوكي ، تم إجراء آفات الليزر على يرقات tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) عند 3 dpf. بعد جمعها في صفيحة جديدة متعددة الآبار ، تم تخدير اليرقات بشكل معتدل. تم تركيبها على غطاء زجاجي في أغاروز منخفض الانصهار لإجراء تسجيلات الفاصل الزمني الفلوري على المجهر البؤري من 3 ساعات بعد الإصابة. لوحظ فقدان النشاط على الجانب الذيلي من موقع الآفة. وفي الواقع، يظهر القياس الكمي للتألق أن المسامير الناجمة عن النشاط التلقائي للأسماك لم تكن موجودة إلا على جانب السطح بعد الإصابة ولكنها حدثت بطريقة منسقة في المواضع المكافئة للسطح والذيلية في الأسماك السليمة (الشكل 4D، E). من المحتمل أن تكون الإشارة المتبقية المنخفضة على الجانب الذيلي بعد الإصابة بسبب نشاط الخلايا العصبية الحسية (ربما الخلايا العصبية الحسية Rohon-Beard على الجانب الذيلي من الحبل الشوكي23) كرد فعل على حركة الذيل الناجمة عن تقلص العضلات على الجانب المستقيمي.

عمليات التجديد الناجمة عن آفات الليزر
بعد 24 ساعة بعد الإصابة (hpi) ، بدأ الجرح في الإغلاق ، مما أدى إلى استعادة جزئية للبنية الأولية للحبل الشوكي بعد 48 ساعة (الشكل 5D). باستخدام تصوير الكالسيوم ، تم تأكيد إعادة اتصال وظيفية جزئية (الشكل 5E ، F) بعد 48 hpi. أظهر حساب النسبة (التي أطلق عليها المؤلفون مؤشر استعادة الاتصال) بين سعة المسامير في المنطقة الذيلية ومنطقة السطح (الشكل 5G) زيادة بين 3 و 24 و 48 hpi ، كما هو متوقع أثناء تجديد الحبل الشوكي.

آفات الليزر تؤدي إلى استجابة مناعية
لوحظ تجنيد البلاعم (mpeg1: GFP + الخلايا) بعد آفات الليزر باستخدام tg (Xla.Tubb: DsRed ؛ mpeg1: GFP) آفات ليزر اليرقات (الشكل 5H ، I). وهذا يتفق مع الدراسات السابقة التي أجراها المؤلفون باستخدام الآفات اليدوية التي توضح الدور الأساسي للبلاعم في التجديد الناجح للحبل الشوكي في يرقات أسماك الزرد6,24. تشير هذه الملاحظة إلى أنه يمكن دراسة ردود الفعل المناعية بعد إصابة الليزر وتؤكد حدوث تلف في الأنسجة.

تؤدي آفات الليزر والآفات اليدوية إلى زيادة تكوين الخلايا العصبية في الحبل الشوكي
استخدمت الدراسات السابقة الآفات اليدوية لدراسة تكوين الخلايا العصبية التي تحدث بعد إصابة الحبل الشوكي6,15. يمكن أن تكون آفات الليزر أداة قيمة لدراسة هذه الظاهرة. أظهرت تجربة نشرت سابقا زيادة في تكوين الخلايا العصبية بعد إصابة الحبل الشوكي اليدوية مقارنة بالضوابط غير المتضررة15. هنا تم استخدام أسماك tg (mnx1: gfp) كخلايا عصبية حركية وتم تصنيفها بشكل فلوري. تم استخدام تلطيخ الأجسام المضادة المضادة ل GFP لتحسين رؤية GFP في اليرقات. تم دمج هذا مع تلطيخ EdU25 (انظر الملف التكميلي 1) ، الذي يصنف الخلايا العصبية التي تم إنشاؤها حديثا. تمت إضافة EdU مباشرة بعد الإصابة عند 3 dpf ، مما يعني أن أي خلايا تحمل علامة EdU تم إنشاؤها بعد الإصابة. لذلك ، تمثل الخلايا التي تعرض تلطيخا موضعيا خلايا عصبية حركية جديدة تولد بعد إصابة الحبل الشوكي. تم حساب عدد الخلايا المتمركزة على جانبي موقع الإصابة ، أو في منطقة مقابلة لموقع وحجم موقع الإصابة في عناصر تحكم غير آفة (تم التقاطها في نافذتين بطول 50 ميكرومتر) ، وتم تحليل الفرق في متوسط أعداد الخلايا المتمركزة باستخدام ANOVA26 أحادي الاتجاه.

تم استخدام هذا البروتوكول على اليرقات المصابة يدويا وبالليزر لمقارنة آثار كل طريقة آفة على تكوين الخلايا العصبية (الشكل 6). لم يلاحظ أي فرق في عدد الخلايا المصنفة بين الآفات اليدوية والليزر. وأظهرت الأسماك غير المنكوبة عددا أقل من الخلايا ذات العلامات المزدوجة مقارنة بالأسماك المصابة في كلتا الحالتين الآفتين (الشكل 6D). وهذا يتفق مع النتائج السابقة التي أظهرت زيادة تكوين الخلايا العصبية في الأسماك المصابة يدويا مقارنة بالأسماك غير المتضررة15.

تدعم هذه النتائج تصوير الكالسيوم ونتائج تلطيخ التوبولين الأسيتيلات، حيث تثير إصابة الليزر استجابة تجديد مماثلة للآفة اليدوية. هذا يشير إلى أن آفة الليزر لا تقوم ببساطة بتبييض التألق في الخلايا ولكنها تؤدي إلى إصابة تؤدي إلى نفس الاستجابات الخلوية التي تقوم بها الآفة اليدوية.

آفات الليزر تؤدي إلى تلف أقل في الجلد والعضلات من الآفات اليدوية
غالبا ما تؤدي الآفات اليدوية إلى كميات كبيرة من تلف العضلات والجلد. في المقابل ، يمكن استهداف آفات الليزر بشكل أكثر تحديدا إلى الحبل الشوكي ، مما يقلل من الأضرار التي لحقت الأنسجة الأخرى. لتوضيح ذلك ، تم استخدام يرقات Tg (beta-actin: utrophin-mCh) لإجراء الآفات اليدوية والليزر. يصنف هذا الخط بشكل فلوري بروتينا ملزما ب F-actin ، مما يسمح بتصور خلايا الحبل الشوكي وألياف العضلات. ثم تم تركيب اليرقات وتصويرها مباشرة (الشكل 7A و B). يوضح الشكل 7A الأضرار التي لحقت بالحبل الشوكي. يشير نقص الأوتروفين في موقع الإصابة في كل من ظروف الآفات الليزرية واليدوية إلى أن كلتا الطريقتين قد أتلفتا الخلايا في الحبل الشوكي. يوضح الشكل 7B تلف العضلات. هناك بنية واضحة تشبه شيفرون للعضلات في الحالة غير المتضررة ، وحزم من ألياف الأكتين مرئية. هناك اضطراب واضح في شكل عضلي في حالة الآفة اليدوية ، وهناك عدد أقل من ألياف الأكتين. هذا يدل على تلف كبير في العضلات. ومع ذلك ، في حالة آفة الليزر ، يتم الحفاظ على بنية شيفرون من myotome. هناك بعض الضرر الذي يلحق بألياف العضلات ، ولكن هذا موجود داخل واحد أو اثنين من myotomes مقارنة بأربعة في حالة الآفة اليدوية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تلف طفيف في الجلد في حالة آفة الليزر مقارنة بحالة الآفة اليدوية ، كما هو موضح في الصور الملتقطة على مجهر ستيريو في الشكل 7C.

وإجمالا، تظهر هذه النتائج أن آفات الليزر شبه الآلية القابلة للتكرار لديها القدرة على أن تكون أداة قوية لدراسة التجديد العصبي في أسماك الزرد.

Figure 1
الشكل 1: مخطط سير عمل إصابة الليزر شبه التلقائي. بعد ثلاثة أيام من الإخصاب (dpf) ، يتم تحميل اليرقات في صفيحة 96 بئرا ووضعها على منصة مناولة اليرقات الآلية. بعد ذلك ، يتم تحميل كل يرقة في شعيرة يسارية موضوعة تحت عدسة 10x NA 0.5 على مجهر مستقيم للتصوير وآفة الليزر. بعد الآفات ، يتم تفريغ اليرقات إلى لوحة جديدة من 96 بئرا للجمع والمزيد من التجارب. في الجزء العلوي ، صور منقولة وفلورية ل tg (Xla.Tubb: DsRed) 3 dpf يرقات قبل وبعد آفة الليزر (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). يتم توجيه اليرقات إلى اليسار والظهرية لأعلى (لجميع الأرقام). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: بدء تشغيل البرمجيات لنظام تصوير يرقات أسماك الزرد شبه الآلي ونظام التحكم بالليزر . (أ) برنامج VAST عند بدء التشغيل. (ب) تظهر النافذة الرئيسية لبرنامج VAST الشعيرات الدموية الفارغة. (C) نافذة LP Sampler مع قالب لوحة فارغة. (D) طريقة عرض python IDE مع تشغيل البرنامج النصي Watch_for_ROIs_py3.py. يشير المستطيل البرتقالي إلى علامة التبويب الطرفية مع عرض الرسائل أثناء تهيئة مخفف الليزر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مثال على تسلسل آفة الليزر على يرقات tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf. (A) الخطوة الأولى من آفة الليزر باستخدام خط 20 ميكرومتر بعد تحديد أداة عائد الاستثمار على الخط من شريط أدوات ImageJ. (ب) الخطوة الثانية بخط 80 ميكرومتر للانتقال الكامل للحبل الشوكي. (ج) عرض البرنامج النصي المستخدم للتحكم في الليزر من ImageJ. (د) تسلسل الصور أثناء آفات الليزر. أعلى: قبل الآفة. الوسط: مباشرة بعد الخطوة الأولى ؛ أسفل: مباشرة بعد الخطوة الثانية (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: يشير التلطيخ المناعي للتوبولين الأستيل (A-C) وتصوير الكالسيوم (D ، E) إلى أن آفة الليزر تعطل تماما استمرارية الأنسجة الشوكية. (ب) الامتداد الكامل للعمود الفقري الذي يظهر اضطرابا كاملا في أنسجة الحبل الشوكي على طول كل من المحاور الظهرية البطنية والإنسية الجانبية. (ج) التحويل غير المكتمل. (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). (د) الحبل الشوكي العابر على tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) 3 dpf يرقات. تظهر المستطيلات عائد الاستثمار المستخدم لقياس شدة التألق في جانبي الآفة (الأزرق) والذيلية (البرتقالية). (ه) رسم بياني لتغيرات شدة التألق بمرور الوقت في عائد الاستثمار في التحليل السطحي والذيلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تثير إصابة الليزر استجابة مناعية وتؤدي إلى التعافي التشريحي والوظيفي الناجح. (A-D) الحد الأقصى لصور التألق الإسقاط القصوى ليرقة tg (Xla.Tubb: DsRed) 3dpf قبل (A) وفي أوقات مختلفة بعد آفة الليزر: بعد 3 ساعات (B) ، وبعد 24 ساعة (C) ، وبعد 48 ساعة (D). (ه-ز) استخدام تصوير الكالسيوم لتقييم استعادة الوظيفة. (ه) يرقة tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) المصابة بالتحليل ROIs. (و) رسم بياني لشدة التألق يتغير بمرور الوقت في عائد الاستثمار للتحليل السطحي والذيلي. (ز) التقدير الكمي للنسبة بين سعات الارتفاع الذيلية والسطحية (مؤشر استعادة التوصيلية) عند 3 و 24 و 48 ساعة بعد الآفة (N = 3). (H-I) توصيف الاستجابة المناعية بعد الآفة. (H) صور التألق لليرقة غير المتضررة (يسار) والآفات (يمين) tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 dfp تظهر تراكم البلاعم (mpeg1+ cell, green) عند 6 hpi. (I) تحديد كمية عدد البلاعم عند 6 ساعات بعد الآفة في اليرقات المصابة والسليمة (N = 3) (قضبان المقياس = 50 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: توليد الخلايا العصبية الحركية الناجم عن الآفة قابل للمقارنة بين الليزر والآفة اليدوية. (A-C) صور من مجهر ApoTome ليرقات tg (mnx1: gfp) 5 dpf مع تلطيخ EdU ، في آفة الليزر (A) ، الآفة اليدوية (B) ، والظروف غير المتضررة (C). تشير رؤوس الأسهم إلى الخلايا ذات التصنيف المزدوج لكلا العلامتين. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (A'-C') تكبير أعلى للخلايا ذات العلامات المزدوجة التي يشار إليها بمربعات بيضاء. (د) التحديد الكمي لعدد الخلايا لعدد الخلايا المتداخلة في كل يرقة. تم وضع نوافذ 50 ميكرومتر على جانبي موقع الإصابة ، وتم حساب الخلايا الموضعية في جميع صور Z-stack. تم إجراء ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار Tukey اللاحق 27. لا يوجد فرق كبير بين الليزر والآفات اليدوية (p = 0.909). عدد أقل بكثير من خلايا mnx1: gfp + / EdU + في عناصر التحكم غير المتضررة مقارنة بآفة الليزر (تغيير 2.4 أضعاف ، p = 0.011) والآفة اليدوية (تغيير 2.3 أضعاف ، p = 0.018). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تحفز آفة الليزر تلفا أقل للعضلات والجلد من الآفة اليدوية. (أ-ب) صور Z-stack مفردة ل tg(beta-actin:utrophin-mCherry) يرقات 3 dpf في ظروف الآفة اليدوية غير المتضررة وآفة الليزر ، مأخوذة على المجهر البؤري عند تكبير 20x. تشير الأسهم البيضاء إلى موقع الإصابة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (A) يشير إلى مكدسات Z حيث يكون الحبل الشوكي و notochord مرئيين. تقوم SC بتسمية الحبل الشوكي ، و NC تسميات notochord. (B) يشير إلى مكدسات Z حيث تكون ألياف العضلات مرئية. (ج) التقطت صور على المجهر الاستريو ليرقات 3 dpf في ظروف الآفة اليدوية وآفة الليزر. تم تثبيت اليرقات على منصة باستخدام دبابيس سلك التنغستن (مرئية في صورة آفة الليزر). يشير الصندوق الأسود إلى موقع الآفة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: التفاصيل التجريبية للبروتوكول. يتم وصف جيل خطوط الزرد المعدلة وراثيا ، وإصابات الحبل الشوكي اليدوية ، والكيمياء المناعية الهيستولوجية الأسيتيلاتيد توبولين ، وتلطيخ Hb9 / EdU ، والتصوير ، ومعالجة الصور وتحليلها. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك حاجة ملحة لفهم أعمق للعمليات التي تلعب دورا أثناء التجديد في أسماك الزرد. يقدم هذا النموذج الحيواني العديد من الفوائد للبحوث الطبية الحيوية، وخاصة لإصابات الحبل الشوكي1. تتضمن معظم الدراسات آفات يدوية تتطلب مشغلا مدربا تدريبا جيدا وتحفز على تلف الأنسجة المتعددة. يتم تقديم بروتوكول آفة الليزر هنا ، مما يسمح بالتحكم في خصائص الآفة وتقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة المحيطة. علاوة على ذلك ، هذه التقنية سهلة بما يكفي لاستخدامها بنجاح من قبل المجربين غير المدربين نسبيا.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي معايرة الليزر وتعريف عائد الاستثمار. في الممارسة العملية ، تكون المعايرة مستقرة للغاية (حتى لعدة أشهر) ، وبمجرد تحديد الحجم والموضع المناسبين لعائد الاستثمار ، يكون استخدام هذه التقنية واضحا. على الرغم من أن البروتوكول وصف كيفية إجراء الآفات على معدات محددة ، إلا أن معظم فوائد آفات الليزر متاحة لأنظمة مختلفة ، مثل مجهر القرص الغزل.

القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هي الحاجة إلى استخدام مراسل التألق للحبل الشوكي والوقت اللازم لأداء الآفات (~ 5 دقائق / الأسماك). يتم تعويض هذا الأخير عن طريق قابلية عالية للتكاثر تتطلب عددا أقل من الحيوانات. ومع ذلك ، لا تزال الآفات اليدوية قابلة للتطبيق لتطبيقات مثل اختبار المخدرات ، حيث هناك حاجة إلى العديد من الحيوانات المصابة. كما هو موضح هنا ، فإن مدى تكوين الخلايا العصبية الناجم عن الآفات قابل للمقارنة بين الليزر والآفات اليدوية.

ومع ذلك ، فإن إصابة الليزر لها تطبيقات محتملة هائلة ، بعضها يتعلق بالفوائد الفريدة المقدمة. على سبيل المثال ، تسمح الشعيرات الدموية الدوارة بإجراء الآفات في مجموعة كبيرة ومتنوعة من المواقف بطريقة خاضعة للرقابة. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه للحث على استئصال أكسوتومي خلية عصبية واحدة في خلايا Mauthner (البيانات غير معروضة) ، كما ثبت أيضا في عمل Bhatt et al.15. لن يكون هذا ممكنا باستخدام الآفات اليدوية.

تظهر النتائج أيضا أن الضرر موجود بشكل رئيسي في الحبل الشوكي ، مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة المحيطة. قد يعني هذا أن الاستجابات الخلوية التي شوهدت بعد آفة الليزر من المرجح أن تعزى إلى الحبل الشوكي على وجه التحديد بدلا من الإشارات من الأنسجة التالفة الأخرى. وقد يعني ذلك أيضا أن اليرقات المصابة بآفة الليزر أكثر قدرة على تحمل المزيد من الاستعدادات للتجارب. على سبيل المثال ، يتضمن تشريح الفيزيولوجيا الكهربية إزالة جلد الجذع باستخدام الملقط 28،29،30 ، مما يؤدي إلى ارتفاع الضغط الميكانيكي على موقع الإصابة الحساس بالفعل وخطر انقطاع أي اتصالات محورية مرة أخرى. يمكن لسلامة الجلد والأنسجة العضلية التي شوهدت في اليرقات التي تعاني من آفة الليزر أن تحمي موقع الآفة من المزيد من الضرر وتؤدي إلى تمثيل أكثر دقة لمستوى التجديد الذي تم تحقيقه.

علاوة على ذلك ، فإن تحسين توطين الضرر بعد إصابة الليزر يحد من امتداد الاقتران بين عمليات التجديد المختلفة ، والتي قد تخفي عمليات أكثر دقة عند استخدام الآفات اليدوية. قد يفتح نهج الإصابة التجريبية في الزرد اليرقي الموصوف هنا مجموعة من التحقيقات الجديدة في سياق البيولوجيا الكمية والفيزياء البيولوجية والبيولوجيا الحسابية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل BBSRC (BB / S0001778/1). يتم تمويل CR من قبل برنامج الأميرة رويال تينوفوس اسكتلندا للمنح الدراسية للبحوث الطبية. نشكر ديفيد غرينالد (CRH ، جامعة إدنبرة) وكاتي ريد (CDBS ، جامعة إدنبرة) على الهدية اللطيفة للأسماك المعدلة وراثيا (انظر الملف التكميلي). نشكر دانيال سونغ (CRH ، جامعة إدنبرة) على الوصول الكريم إلى قرص الغزل 3i confocal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0 Carl Zeiss
ImageJ/FIJI Open-Source
Visual Studio Code Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880 Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1 Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1 Carl Zeiss
UV laser Micropoint
VAST BioImager Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish Thermo-Fisher 101R20
96-well plate Corning 3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit Invitrogen C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) Sigma-Aldrich A5040
phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 Jackson 703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson 715-165-150
Mouse anti-GFP Abcam AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody Sigma T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp) N/A First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed) N/A First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) N/A Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

Tags

الطب، العدد 177،

Erratum

Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

The title was updated from:

Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

to:

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

الإصابات شبه الآلية التي يسببها الليزر لدراسة تجديد الحبل الشوكي في يرقات أسماك الزرد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El-Daher, F., Early, J. J.,… More

El-Daher, F., Early, J. J., Richmond, C. E., Jamieson, R., Becker, T., Becker, C. G. Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (177), e63259, doi:10.3791/63259 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter