ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att inducera vävnad-specifika och mycket reproducerbara skador i zebrafish larver med hjälp av en laser lesion system i kombination med en automatiserad microfluidic plattform för larver hantering.
Abstract
Zebrafisk larver har ett fullt fungerande centrala nervsystem (CNS) med hög regenerativ kapacitet bara några dagar efter befruktning. Detta gör denna djurmodell mycket användbar för att studera ryggmärgsskada och regenerering. Standardprotokollet för att inducera sådana skador är att transect den dorsala delen av stammen manuellt. Denna teknik kräver dock omfattande träning och skadar ytterligare vävnader. Ett protokoll utvecklades för laser-inducerade skador för att kringgå dessa begränsningar, vilket möjliggör hög reproducerbarhet och fullständighet av ryggmärgstransection över många djur och mellan olika sessioner, även för en otränad operatör. Dessutom är vävnadsskador främst begränsade till ryggmärgen själv, vilket minskar förvirrande effekter från att skada olika vävnader, t.ex. hud, muskler och CNS. Dessutom är hemi-lesioner i ryggmärgen möjliga. Förbättrad bevarande av vävnad integritet efter laser skada underlättar ytterligare dissekeringar som behövs för ytterligare analyser, såsom elektrofysiologi. Därför erbjuder denna metod exakt kontroll av den skada som är ouppnåelig manuellt. Detta möjliggör nya experimentella paradigm i denna kraftfulla modell i framtiden.
Introduction
I motsats till däggdjur kan zebrafisk (Danio rerio) reparera sitt centrala nervsystem (CNS) efter skada1. Användningen av zebrafisklarver som modell för ryggmärgsregenerering är relativt ny. Det har visat sig värdefullt att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som ligger till grund för reparation2. Detta beror på hur lätt manipulering, den korta experimentella cykeln (nya larver varje vecka), vävnadernas optiska transparens och larvernas lilla storlek, idealisk för in vivo fluorescensmikroskopi.
Vid ryggmärgsregenerering är två ytterligare fördelar med att använda larver återhämtningshastigheten, några dagar jämfört med några veckor för vuxna och hur lätt det är att inducera skador med hjälp av manuella tekniker. Detta har framgångsrikt använts i många studier3,4,5, inklusive nyligen genomförda undersökningar6,7. Sammantaget leder detta till ökad meningsfull dataproduktion, hög anpassningsförmåga för experimentella protokoll och minskade experimentella kostnader. Användningen av larver yngre än 5 dagar efter befruktning minskar också användningen av djur enligt 3R-principerna i djurforskning8.
Efter en ryggmärgsskada i zebrafisklarver uppstår många biologiska processer, inklusive inflammatoriskt svar, cellproliferation, neurogenes, migrering av överlevande eller nygenererade celler, reformation av funktionella axoner och en global ombyggnad av neurala processer kretsar och ryggradsvävnader6,7,9,10 . För att framgångsrikt orkestreras innebär dessa processer en fint reglerad interaktion mellan en rad celltyper, extracellulära matriskomponenter och biokemiska signaler11,12. Att reda ut detaljerna i denna betydande omorganisation av en komplex vävnad som ryggmärgen kräver användning och utveckling av exakta och kontrollerade experimentella metoder.
Det primära experimentella paradigmet som används för att studera ryggmärgsregenerering hos zebrafisk är att använda kirurgiska medel för att inducera vävnadsskador genom samband, stickning eller kryoinjury3,13. Dessa metoder har nackdelen att kräva särskild utbildning i mikrokirurgifärdigheter, vilket är tidskrävande för alla nya aktörer och kan förhindra att de används i kortsiktiga projekt. Dessutom inducerar de vanligtvis skador på de omgivande vävnaderna, vilket kan påverka regenerering.
Ett annat tillvägagångssätt är att inducera cellskador kemiskt14 eller genom genetiska manipuleringar15. Den senare möjliggör mycket riktade skador. En sådan teknik kräver dock långt förberedande arbete för att generera ny transgen fisk innan du gör något experiment, förnyas varje gång en unik celltyp är riktad.
Det finns således behovet av en metod som möjliggör riktade men mångsidiga skador som är lämpliga för en mängd olika studier i regenerering. En lösning är att använda en laser för att inducera lokaliserade skador i vävnaden av intresse16,17,18,19,20. Användningen av laser-inducerad vävnad skador utgör en robust strategi för att generera ryggmärg organskador med många fördelar. Mikroskopen utrustade med sådana lasermanipulationsmoduler gör det möjligt att specificera ett anpassat format område där cellablation kommer att uppstå, med den extra fördelen med temporal kontroll. Storleken och positionen för lesionen kan således anpassas för att ta itu med eventuella frågor.
Den saknade funktionen hos de flesta laser lesion system är möjligheten att inducera skador på ett mycket reproducerbart sätt för en serie larver. Här beskrivs ett ursprungligt protokoll med hjälp av en UV-laser för att inducera halvautomatiska exakta och kontrollerade skador i zebrafisklarver baserade på en mikrofluidisk plattform utformad för automatiserad larverhantering21. Dessutom sätts larver i ett glaskapillär i det system som presenteras här i en glaskapillär, vilket tillåter fri rotation av djuret runt sin rostrocaudalaxel. Användaren kan välja vilken sida av larven som ska presenteras för lasern samtidigt som fluorescensavbildningen exakt kan rikta laserstrålen och bedöma skadan efter lesionen.
Protokollet som beskrivs här används med ett halvautomatiskt zebrafisk larver imaging system kombinerat med en snurrande skiva utrustad med en UV-laser (betecknas nedan som VAST-systemet). Protokollets huvudpunkter och de flesta påståendena om tekniken är dock giltiga för alla system som är utrustade med en laser som kan cellablation, inklusive två fotonlaserskanningsmikroskop, spinndiskmikroskop som är försedda med en UV-laser (FRAP-modul) eller videomikroskop med en lasermodul för fotomanipulation. En av de största skillnaderna mellan VAST-systemet och konventionell provhantering kommer att vara att för den senare kommer montering av larver i lågsmältpunktsagaros på glasöverdrag/petriskål med glasbotten i stället för lastning av dem i en 96-brunnsplatta att krävas.
Fördelarna med denna metod öppnar möjligheter för innovativ forskning om cellulära och molekylära mekanismer under regenereringsprocessen. Dessutom möjliggör den höga datakvaliteten kvantitativa undersökningar i ett tvärvetenskapligt sammanhang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier utfördes med godkännande från det brittiska inrikesministeriet och enligt dess regler, under projektlicens PP8160052. Projektet godkändes av University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee. För experimentella analyser användes zebrafisklarver upp till 5-dagarsgamla av båda könen av följande tillgängliga transgena linjer: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg (betaactin:utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) och Tg(mnx1:gfp) (se Kompletterande fil 1: gfp) (se Kompletterande fil 1 ). Ett schema över protokollet med hjälp av den automatiserade zebrafisklarverhanteringsplattformen visas i figur 1. All anpassad programvara, skript och detaljerade experimentella protokoll som används i det här arbetet finns tillgängliga på https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.
1. Provberedning
- Vid 5 h efter befruktning, sortera embryona för rätt utvecklingsstadium21. Kassera döda ägg och dåligt utvecklade och överutvecklade embryon.
- Vid 3 dagar efter befruktning (dpf), bedöva larver genom att tillsätta 2 ml 0,4% aminobensosyra-etylmetylester till 50 ml fiskanläggningsvatten i en 90 mm Petriskål. Använd djur som föds upp med fenyltiourea (PTU) (se Tabell över material) för att förhindra hudpigmentering om det är ett problem, vilket inte är fallet för ryggmärgsskador på 3 dpf larver som beskrivs i detta protokoll.
OBS: Denna relativt höga anestesikoncentration används för att förhindra larvernas rörelser efter laserpåverkan. - Screena embryona för fluorescerande reporteruttryck (Kompletterande fil 1).
OBS: En fluorescerande reporter för ryggmärgen (eller annan struktur av intresse) krävs ofta för att bedöma skadans effektivitet. Användningen av tg (Xla.Tubb:DsRed) hjälper till att identifiera ryggmärgen. - Överför de utvalda larverna till en 96-brunnsplatta för användning i VAST-systemet (se Materialtabell) med 300 μL fiskanläggningsvatten per brunn. Använd mediet som innehåller bedövningen från 90 mm Petriskålen direkt. Se till att bara ha en larva per brunn. Förbered en extra tom 96-brunnsplatta för att samla de lesionerade larverna.
OBS: Om du använder ett annat laser lesionssystem, montera larverna i 1% Lågsmältpunkt (LMP) agarose gel i en lämplig observationskammare.
2. Mikroskopberedning
- Slå på alla systemkomponenter (VAST, mikroskop, laser, PC), inklusive lasern för ablation.
- När hårdvaran är helt initierad, starta mikroskopprogramvaran, ImageJ / Fiji, en python integrerad utvecklingsmiljö (IDE) och den automatiserade zebrafiskavbildningsprogramvaran (VAST-systemet) om du använder denna plattform (se Tabell över material).
- Ställ in VAST-programvaran enligt stegen nedan.
- När VAST-programvaran lanseras väljer du Plate i det första fönstret och klickar på knappen Klar (bild 2A). Ett annat litet fönster dyker upp och frågar om kapillären är tom och ren. Kontrollera genom att titta på bilden av kapillären om det finns några luftbubblor inuti. Om inte, klicka på Ja. Om det finns några bubblor klickar du på Nej och följer steg 2.3.2-2.3.3 (bild 2B).
- I fönstret Stor partikel (LP) Sampler klickar du på Prime för att ta bort luftbubblor (bild 2C).
- Gå till huvudprogramfönstret (med kapillärbilden) och högerklicka på bilden. Välj Spela in tom kapillärbild på popup-menyn (bild 2B).
- Gå till Arkiv-menyn i LP Sampler-fönstret och välj alternativet Öppna skript. Välj en fil som innehåller skriptet som motsvarar experimentet som ska utföras.
- I huvudfönstret FÖR VAST-programvara går du till Arkiv och väljer Öppet experiment. Välj den experimentfil som motsvarar det planerade experimentet.
OBS: Se till att rutorna Automatisk lossning och Bulkutgång till avfall INTE är kontrollerade.
- Ställ in mikroskopprogramvaran för avbildning.
- Starta mikroskopavbildningsprogramvaran (se Tabell över material) för att initiera maskinvaran. Detta kan ta några minuter, beroende på systemet.
- Gå till förvärvsinställningarna och ställ in mikroskopet för att avbilda fluoroforen uttryckt i larverna. Använd ett 10x NA 0,5 vattendoppningsmål för att säkerställa att brännvolymen är tillräckligt långsträckt längs den optiska axeln för att skada hela djupet av ryggmärgen eller den riktade vävnaden.
- Ställ in ImageJ/Fiji för laserskador.
- Gå till Arkiv-menyn och välj Nytt/Skript för att öppna skriptfönstret.
- I fönstret Nytt går du till Arkiv-menyn och väljer Öppna för att läsa in laserinseringsskriptet (Manual_MP_Operation.ijm).
- Konfigurera Python IDE.
- Starta Python IDE.
- Gå till Arkiv-menyn och välj Öppna fil för att läsa in skriptet för att hantera lasern (Watch_for_ROIs_py3.py).
- Gå till Kör-menyn och välj Kör utan felsökning för att köra skriptet. Kontrollera att en sekvens av meddelanden på TERMINAL-panelen visas tillsammans med visst brus medan laserdämpningen initieras (bild 2D).
3. Utföra laserskador på VAST-systemet
- Centrera kapillären i förhållande till mikroskopmålet genom att flytta scenen genom att klicka på pilknapparna i huvudfönstret i VAST-programvaran (bild 2B).
- Fokusera på toppen av kapillären genom att titta genom okularen och använda mikroskopets överförda ljus.
VARNING: Kapillären är mycket ömtålig och kan gå sönder om den vidrörs av målet. Flytta mikroskopknoppen långsamt när du fokuserar in och ut. - Placera 96-brunnsplattorna på platthållaren på LP Sampler i VAST-systemet. Placera plattan som innehåller larver på vänster hållare och plattan för uppsamling till höger. Se till att plattorna är korrekt orienterade: A1-brunnen måste vara i hållarens främre vänstra hörn.
- I VAST-programvaran, i LP Sampler-fönstret, klicka på knappen Plåtmall och välj alla brunnar som innehåller larver. Klicka på ok-knappen för att validera och stänga fönstret (bild 2C).
- I LP Sampler-fönstret klickar du på knappen Körplatta för att börja ladda en larva.
OBS: Efter en tid bör larven vara synlig i kapillären på plats (fördefinierad i experimentdefinitionsfilen), vilket gör det möjligt att skada ryggmärgen. VAST-bricklampan släcks efter några rotationer för att ställa in larven med sidosidan vänd mot mikroskopmålet. - Gå till mikroskopprogramvaran och klicka på Live-knappen för att avbilda larven.
- Vrid mikroskopets fokusknopp tills ryggmärgens centrala kanal är synlig.
OBS: Det kan vara lättare att fokusera med överfört ljus först och sedan förfina med fluorescens. - Ta en ögonblicksbild i fluorescens och spara bilden i en dedikerad mapp.
- Öppna bilden i ImageJ och justera kontrasten om det behövs (med hjälp av menyn Bild/Justera/Ljusstyrka/kontrast... i ImageJ).
- Klicka på linjeverktyget Region of Interest (ROI) och rita en kort linje (20 μm) centrerad på ryggmärgen (figur 3A).
- Byt mikroskopet till 100% reflekterande spegelposition.
- Ladda ImageJ-skriptet och klicka på knappen Kör . Använd följande parametrar: Repetition - 2; Prov - 1; Bredd - 40-mikron; Dämpning - 89 (Full lasereffekt) (bild 3C).
- När laserskottsekvensen är klar byter du till fluorescensavbildning på bildbehandlingsprogramvaran och justerar fokus vid behov.
OBS: En förskjutning i fokus observeras ofta på grund av svansförskjutning under laserexponering. - Ta en ny ögonblicksbild och spara den.
- Öppna denna nya bild i ImageJ och rita en ny linje som ska vara större än själva ryggmärgen (~ 80 μm), med början under ryggmärgens ventrala sida i den övre delen av notochord och gå mot ryggsidan för att sluta i utrymmet mellan ryggmärgen och huden (figur 3B).
- Byt mikroskopet till 100% reflekterande spegelposition.
- Gå till ImageJ-skriptfönstret och klicka på knappen Kör . Använd följande parametrar: Repetition - 2; Prov - 1; Bredd - 40 mikron; Dämpning - 89 (Full lasereffekt).
- När den (längre) laserskottsekvensen är klar kontrollerar du omsektionskvaliteten genom att avbilda fluorescens och fokusering. Se till att inga celler eller axoner förblir intakta på lesionsstället, som ska visas som ett mörkt eller som ett svagt och homogent fluorescerande område (figur 3D, nedre panelen).
- Samla de lesionerade larverna i den tomma 96-brunnsplattan (med samma välkoordinater som den ursprungliga brunnen) genom att gå till huvudFÖNSTRET I VAST-programvaran och klicka på collect-knappen .
- Slå tillbaka vast-systemlampan genom att klicka på kryssrutan Facklampa längst ned till vänster i fönstret.
- Upprepa steg 3.3-3.17 för varje ny larva som ska skadas.
4. Hantering efter lesion och ytterligare experiment
- Ta ut larver från 96-brunnsplattan så snart som möjligt och överför dem till en ren Petri-maträtt med färskt fiskanläggningsvatten för larverna att återhämta sig efter lesion. Lägg Petri-skålen i en inkubator vid 28 °C.
OBS: Skadan fortsätter ofta att spridas under den första timmen efter lesionen. Den faktiska omfattningen av lesionen bör därför bedömas genom fluorescens imaging efter en fördröjning på cirka 1 h.
5. Felsökning
- Om luftbubblor finns i rören och kapillären i VAST-systemet, klicka på Prime-knappen i LP Sampler-fönstret för att ta bort dem.
- Tänk på de misslyckade skador (som bedömts från den återstående fluorescence i lesion webbplats, bortsett från den förväntade kvarvarande och homogena bakgrunden), som kan bero på flera skäl som nämns nedan.
- Låg lasereffekt: När detta händer, försök med ett högre värde.
OBS: VAST-systemet är utrustat med en färglaser. Detta innebär att koncentrationen av färglösningen som används för laserljusgenerering kan förändras med tiden, vilket leder till en minskning av laserkraften. Att ersätta med en ny lösning löser vanligtvis problemet22. - Dålig kalibrering: Kontrollera lasersystemets kalibrering och effekt enligt steg 5.2.2.1-5.2.2.4. Om den inte kalibreras korrekt kommer lasern inte att riktas till önskad plats, vilket leder till misslyckade skador eller oönskade skador i angränsande vävnader.
- Placera en spegelbild ovanpå kapillärkammaren. Fokusera på den belagda sidan (den ska möta målet). Använd en tidigare standard i bilden för att lättare fokusera.
- Använd ett mönster av laserablation med hjälp av ett kalibreringsskript.
- Utvärdera mönstrets kvalitet. Fläckarna eller linjerna ska se skarpa ut och inte suddiga.
- Använd en ramp med ökande kraft för att utvärdera om lasereffekten har ändrats jämfört med tidigare sessioner.
- Larvrörelse under lesioner: Larver svarar annorlunda på anestesi; Således kan laser lesion utlösa rörelser av svansen under processen, vilket förhindrar en framgångsrik omsektion. När detta händer, ta en extra iteration av laser lesion steg för att slutföra det samtidigt undvika skador på de omgivande vävnaderna.
- Dåligt fokus: När detta inträffar, fokusera på mitten av den centrala kanalen för att få bästa resultat.
- ROI-ritning, position och storlek: Roi-positionen och storleken är avgörande för lyckade omval. ROI bör vara större än ryggmärgen och centrerad på mitten av ryggmärgen. För att lösa detta, börja dra ROI från den ventrala sidan av ryggmärgen och gå upp mot ryggsidan för att få framgångsrik omsektion. Detta beror sannolikt på svansrörelser som utlöses av sekvensen av laserskott under ablationsförfarandet.
- Låg lasereffekt: När detta händer, försök med ett högre värde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering av ryggmärgstransection
Strukturella och funktionella undersökningar utfördes för att bedöma om protokollet tillåter en komplett ryggmärgstransection.
För det första, för att verifiera att förlusten av fluorescens på lesionsplatsen berodde på neuronal vävnadsskada och inte fluorescens fotobleaching från laserbelysningen, immunostaining med hjälp av en antikropp mot acetyated tubulin (se tabell över material och kompletterande fil 1). En fullständig störning av axons mellan caudal och rostral sidor av lesion observerades, bekräftar fullständig omsektion av ryggmärgen (figur 4B). En framgångsrik ryggmärgstransection bör inte lämna någon återstående neuronal projektion över lesion webbplats (se figur 4C för ett exempel på en misslyckad lesion). Med hjälp av denna teknik uppskattades framgångsgraden för ryggmärg laser organskador att vara 75% (fyra ofullständiga omkastningar i 16 djur).
Förlusten av funktionalitet efter laser lesion undersöktes med kalcium imaging. På intakt fisk genererar den spontana koordinerade neuronala nätverksaktiviteten fluorescenstoppar längs hela ryggmärgen. En framgångsrik omsektion skulle avbryta spridningen av denna verksamhet mellan båda sidor av lesion. För att kontrollera kvaliteten på ryggmärgstransection utfördes laser skador på tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) larver vid 3 dpf. Efter insamling i en ny multi-well tallrik, larver var milt sövda. De monterades på ett glas coverslip i lågsmälta punkt agarose för att utföra fluorescens tidsfördröjning inspelningar på ett confocal mikroskop från 3 h efter skada. En förlust av aktivitet på den kaudala sidan av lesion webbplats observerades. Kvantifieringen av fluorescens visar att toppar på grund av fiskens spontana aktivitet endast fanns på rostralsidan efter skada, men inträffade på ett samordnat sätt i motsvarande rostala och kaudala positioner i intakt fisk (figur 4D,E). Den låga kvarvarande signalen på den kaudala sidan efter skada berodde sannolikt på aktiviteten hos sensoriska nervceller (förmodligen Rohon-Beard sensoriska nervceller på den kaudala sidan av ryggmärgen23) som reaktion på svansrörelsen inducerad av muskelkontraktion på rostral sidan.
Regenereringsprocesser inducerade av laserskador
Efter 24 timmar efter skadan (hpi) började såret stängas, vilket ledde till en partiell restaurering av ryggmärgens ursprungliga struktur efter 48 h (figur 5D). Med hjälp av kalcium imaging bekräftades en partiell funktionell återanslutning (figur 5E, F) efter 48 hpi. Beräkningen av förhållandet (som heter Connectivity Restoration Index av författarna) mellan amplituden av spikarna i caudal området och rostral området (figur 5G), visade en ökning mellan 3, 24 och 48 hpi, som förväntat under ryggmärgsregenerering.
Laserskador utlöser ett immunsvar
Macrophage (mpeg1:GFP + celler) rekrytering observerades efter laser organskador med tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) larver laser organskador (figur 5H,I). Detta överensstämmer med tidigare studier av författarna med hjälp av manuella skador som visar makrofagernas väsentliga roll för framgångsrik regenerering av ryggmärgen i zebrafisk larver6,24. Denna observation indikerar att immunreaktioner kan studeras efter laserskada och bekräftar att vävnadsskador inträffade.
Laserskador och manuella lesioner utlöser ökad neurogenes i ryggmärgen
Tidigare studier har använt manuella lesioner för att studera den neurogenes som uppstår efter en ryggmärgsskada6,15. Laser skador kan vara ett värdefullt verktyg för att studera detta fenomen. Ett tidigare publicerat experiment visade ökad neurogenes efter en manuell ryggmärgsskada jämfört med unlesioned kontroller15. Här användes tg(mnx1:gfp) fisk som motoriska nervceller och var fluorescerande märkta. Anti-GFP antikropp färgning användes för att förbättra synligheten av GFP i larverna. Detta kombinerades med EdU färgning25 (se Kompletterande fil 1), som etiketter nyligen genererade nervceller. EdU lades till omedelbart efter en skada vid 3 dpf, vilket innebär att alla celler märkta med EdU genererades efter skada. Därför representerar celler som visar colocalized färgning nya motoriska nervceller som är födda efter ryggmärgsskada. Antalet colocalized celler på vardera sidan av skadeplatsen, eller i ett område som motsvarar platsen och storleken på skadeplatsen i unlesioned kontroller (fångas i två 50 μm fönster) räknades, och skillnaden i medelvärdet av colocalized celler analyserades med hjälp av en enkelriktad ANOVA26.
Detta protokoll användes på manuellt och laser lesionerade larver för att jämföra effekterna av varje lesion metod på neurogenes (figur 6). Ingen skillnad observerades i antalet märkta celler mellan manuella och laser organskador. Unlesioned fisk visade färre dubbelmärkta celler än lesionerad fisk i båda lesion villkor (figur 6D). Detta överensstämmer med tidigare resultat visar ökad neurogenesis i manuellt lesionerad fisk jämfört med unlesioned fisk15.
Dessa resultat stöder kalcium imaging och acetylated tubulin färgning resultat, som laser skada framkallar en regenerering svar jämförbar med en manuell lesion. Detta indikerar att laser lesion inte bara bleker fluorescensen i cellerna utan resulterar i en skada som utlöser samma cellulära svar som en manuell lesion gör.
Laserskador resulterar i mindre hud- och muskelskador än manuella skador
Manuella skador resulterar ofta i stora mängder muskel- och hudskador. Däremot kan laserskador riktas mer specifikt mot ryggmärgen, vilket minskar skadorna på andra vävnader. För att illustrera detta användes Tg (beta-actin:utrophin-mCh) larver för att utföra manuella och laser skador. Denna linje märker fluorescerande ett F-aktinbindande protein, vilket möjliggör visualisering av ryggmärgsceller och muskelfibrer. Larverna var sedan levande monterade och avbildade (figur 7A, B). Figur 7A visar skadorna på ryggmärgen. Bristen på utrophin i skadeplatsen i både laser och manuella lesion villkor tyder på att båda lesion metoder har skadat cellerna i ryggmärgen. Figur 7B visar muskelskadan. Det finns en tydlig chevronliknande struktur till myotomerna i det olejonerade tillståndet, och buntar av aktinfibrer är synliga. Det finns en synlig störning av myotomen form i den manuella lesion villkor, och färre aktin fibrer är närvarande. Detta visar betydande muskelskador. I laser lesion villkoret upprätthålls dock chevron strukturen i myotomet. Det finns vissa skador på muskelfibrer, men detta finns inom en eller två myotomer jämfört med inom fyra i det manuella lesion villkoret. Dessutom finns det mindre hudskador i laser lesion villkoret jämfört med den manuella lesion villkor, som visas i bilder tagna på en stereo mikroskop i figur 7C.
Sammantaget visar dessa resultat att reproducerbara, halvautomatiska laserskador har potential att vara ett kraftfullt verktyg för att studera neural regenerering i zebrafisk.
Bild 1: Schematisk av det halvautomatiska laserskadearbetsflödet. Tre dagar efter befruktning (dpf), larver laddas i en 96-brunnsplatta och placeras på den automatiserade larverhanteringsplattformen. Sedan laddas varje larva i en kapillär placerad under en 10x NA 0,5-lins på ett upprätt mikroskop för avbildning och laserskada. Efter skador lossas larver till en ny 96-brunnsplatta för insamling och ytterligare experiment. På toppen, överförda och fluorescens bilder av tg (Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larver före och efter laser lesion (skala bar = 50 μm). Larver är orienterade rostral vänster och dorsal upp (för alla siffror). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Uppstart av programvara för det halvautomatiska bildsystemet för zebrafisklarver och laserkontrollsystem. (A) VAST-programvara vid uppstart. (B) Huvudfönstret i VAST-programvaran visar den tomma kapillären. C) LP Sampler-fönster med en tom plåtmall. (D) Vyn för python IDE med det Watch_for_ROIs_py3.py skriptet igång. Den orange rektangeln pekar ut terminalfliken med meddelanden som visas under initieringen av laserdämpningen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Exempel på laser lesion sekvens på tg (Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larver. (A) Det första steget i laser lesion med hjälp av en 20 μm linje efter att ha valt linjen ROI verktyg från ImageJ verktygsfältet. B) Andra steget med en 80 μm linje för fullständig omsektion av ryggmärgen. (C) Vy över skriptet som används för att styra lasern från ImageJ. (D) Sekvensen av bilder under laserskador. Överst: före lesion; Mitten: omedelbart efter det första steget; Botten: omedelbart efter det andra steget (skalstång = 50 μm). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Acetylserade tubulin immunostaining (A-C) och kalcium imaging (D,E) indikerar att laser lesion helt stör kontinuiteten i ryggmärgsvävnad. (A) Intakt ryggmärg. B) Fullständig omsektion av ryggraden som visar en fullständig störning av ryggmärgsvävnaden längs både dorsala ventrala och mediala-laterala axlar. C) Ofullständig omktion. (skalstång = 50 μm). D) Transected ryggmärg på en tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) 3 dpf larva. Rektanglarna visar de ROIs som används för att kvantifiera fluorescensintensiteten i lesionens rostral (blå) och kaudala (orange) sidor. (E) Diagram över fluorescensintensiteten förändras med tiden i romerna för rostral- och kaudala analyser. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Laserskada framkallar ett immunsvar och leder till framgångsrik anatomisk och funktionell återhämtning. (A-D) Den maximala intensiteten projektionsfluorescensbilder av en tg (Xla.Tubb:DsRed) 3dpf larva före (A) och vid olika tidpunkter efter laser lesion: efter 3 h (B), efter 24 h (C), och efter 48 h (D). (E-G) Användning av kalciumavbildning för att bedöma funktionsåterställningen. (E) Lesionerad tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) larva med analys ROIs. F) Grafen över fluorescensintensiteten ändras med tiden i rom-skivorna och kaudala analys-RUB: erna. (G) Kvantifiering av förhållandet mellan kaudala och rostral spike amplituder (Connectivity Restoration Index) vid 3, 24, 48 h efter lesion (N = 3). (H-I) Karakterisering av immunsvaret efter lesion. (H) Fluorescensbilder av olesionerad (vänster) och lesionerad (höger) tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 dfp larva som visar ackumulering av makrofager (mpeg1 + cell, grön) vid 6 hpi. (I) Kvantifiering av antalet makrofager vid 6 h efter lesion hos skadade och intakta larver (N = 3) (skalstänger = 50 μm). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Lesion-inducerad generering av motor nervceller är jämförbar mellan laser och manuell lesion. (A-C) Bilder från ApoTome mikroskopet av tg(mnx1:gfp) 5 dpf larver med EdU färgning, i laser lesion (A), manuell lesion (B) och unlesioned (C) villkor. Pilspetsar betecknar celler som är dubbelmärkta för båda markörer. Skalstång = 100 μm. (A'-C) Högre förstoring av dubbelmärkta celler som betecknas med vita lådor. D) Kvantifiering av cellantal för antalet colocalized celler i varje larva. 50 μm fönster placerades på vardera sidan av skadeplatsen, och colocalized celler räknades i alla Z-stack bilder. Enkelriktad ANOVA utfördes med Tukeys posthoc test27. Ingen signifikant skillnad mellan laser och manuella lesioner (p = 0,909). Betydligt färre mnx1:gfp+/EdU+-celler i olesionerade kontroller jämfört med laserskada (2,4 gånger förändring, p = 0,011) och manuell lesion (2,3 vikförändring, p = 0,018). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Laserskada inducerar mindre muskel- och hudskador än den manuella lesionen. (A-B) Single Z-stack bilder av tg (beta-aktin:utrophin-mCherry) 3 dpf larver i unlesioned, manuell lesion och laser lesion villkor, tas på confocal mikroskopet vid 20x förstoring. Vita pilar anger skadeplatsen. Skalstång = 50 μm. (A) betecknar Z-staplar där ryggmärgen och notokorden är synliga. SC märker ryggmärgen och NC märker notochordet. B) betecknar Z-staplar där muskelfibrerna är synliga. (C) Bilder togs på stereo mikroskop av 3 dpf larver i unlesioned, manuell lesion och laser lesion villkor. Larver var fäst på en plattform med volfram tråd stift (synlig i laser lesion bild). Den svarta rutan betecknar lesion webbplats. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande akt 1: Protokollets experimentella detaljer. Generering av transgena zebrafish linjer, manuella ryggmärg skador, acetylated-tubulin immunohistochemistry, Hb9/EdU färgning, imaging och bild bearbetning och analys beskrivs. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns ett trängande behov av en djupare förståelse för de processer som står på spel under regenerering hos zebrafisk. Denna djurmodell erbjuder många fördelar för biomedicinsk forskning, särskilt för ryggmärgsskador1. De flesta av studierna involverar manuella lesioner som kräver en välutbildad operatör och inducerar skador i flera vävnader. En laser lesion protokoll presenteras här, tillåter kontroll över lesion egenskaper och minskade skador på de omgivande vävnaderna. Dessutom är denna teknik tillräckligt lätt för att framgångsrikt användas av relativt otränade experimenterare.
Kritiska steg i protokollet är kalibreringen av lasern och definitionen av ROI. I praktiken är kalibreringen mycket stabil (även i månader), och när rätt storlek och position för ROI har fastställts är användningen av denna teknik enkel. Även om protokollet beskrev hur man utför skador på specifik utrustning, är de flesta fördelarna med laser skador tillgängliga för olika system, såsom en spinning-disk mikroskop.
De viktigaste begränsningarna i detta protokoll är behovet av att använda en fluorescensreporter i ryggmärgen och den tid som krävs för att utföra skadorna (~ 5 min / fisk). Det senare kompenseras av hög reproducerbarhet som kräver färre djur. Manuella skador är dock fortfarande livskraftiga för applikationer som drogtestning, där många lesionerade djur behövs. Som visas här är omfattningen av lesion-inducerad neurogenesis jämförbar mellan laser och manuella skador.
Laserskador har dock enorma potentiella tillämpningar, några av dem relaterade till de unika fördelarna som erbjuds. Till exempel tillåter en roterande kapillär att utföra skador i en mängd olika positioner på ett kontrollerat sätt. Det kan till exempel användas för att inducera enstaka neuronaxotomi i Mauthner-celler (data som inte visas), vilket också har visats i bhatt et al.15. Detta skulle inte vara möjligt med hjälp av manuella skador.
Resultaten visar också att skadan huvudsakligen är innesluten i ryggmärgen, med minimal skada på omgivande vävnader. Detta kan innebära att cellulära svar som ses efter en laser lesion är mer benägna att tillskrivas ryggmärgen specifikt snarare än signalering från andra skadade vävnader. Det kan också innebära att laserskadade larver är mer kapabla att motstå ytterligare förberedelser för experiment. Dissekering för elektrofysiologi innebär till exempel att man tar bort bålhuden med tång28,29,30, vilket skulle resultera i högt mekaniskt tryck som placeras på det redan känsliga skadestället och riskera att eventuella axonalanslutningar bryts igen. Integriteten hos huden och muskel vävnad sett i laser-lesioned larver kan skydda lesion webbplats från ytterligare skador och resultera i en mer exakt representation av nivån av regenerering uppnås.
Dessutom begränsar den förbättrade lokaliseringen av skador efter laser skada förlängningen av koppling mellan olika regenereringsprocesser, som kan maskera mer subtila processer vid användning av manuella skador. Metoden till experimentell skada i larv zebrafisk beskrivs här kan öppna en rad nya undersökningar i samband med kvantitativ biologi, biologisk fysik och beräkningsbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av BBSRC (BB/S0001778/1). CR finansieras av Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Vi tackar David Greenald (CRH, University of Edinburgh) och Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) för den typ av transgen fisk (se kompletterande fil). Vi tackar Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) för den vänliga tillgången till 3i spinning-disk confocal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
- Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
- National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
- Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
- Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
- Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
- Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
- Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
- Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
- Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
- Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
- Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
- Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
- Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
- Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
Tags
Medicin nummer 177Erratum
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
