Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Контролируемые полуавтоматизированные лазерно-индуцированные повреждения для изучения регенерации спинного мозга у личинок рыбок данио

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

ERRATUM NOTICE

Summary

Настоящий протокол описывает способ индуцирования тканеспецифических и высоковоспроизводимых повреждений у личинок рыбок данио с использованием лазерной системы поражения в сочетании с автоматизированной микрофлюидной платформой для обработки личинок.

Abstract

Личинки рыбок данио обладают полностью функциональной центральной нервной системой (ЦНС) с высокой регенеративной способностью всего через несколько дней после оплодотворения. Это делает эту животную модель очень полезной для изучения травм и регенерации спинного мозга. Стандартным протоколом индуцирования таких поражений является трансекция дорсальной части ствола вручную. Однако эта методика требует обширной подготовки и повреждает дополнительные ткани. Был разработан протокол для лазерно-индуцированных поражений, чтобы обойти эти ограничения, что обеспечивает высокую воспроизводимость и полноту трансекции спинного мозга у многих животных и между различными сеансами, даже для неподготовленного оператора. Кроме того, повреждение тканей в основном ограничивается самим спинным мозгом, уменьшая смешанные эффекты от повреждения различных тканей, например, кожи, мышц и ЦНС. Кроме того, возможны геми-поражения спинного мозга. Улучшенное сохранение целостности тканей после лазерного повреждения облегчает дальнейшие вскрытия, необходимые для дополнительных анализов, таких как электрофизиология. Следовательно, этот метод предлагает точный контроль степени травмы, которая недостижима вручную. Это позволяет создавать новые экспериментальные парадигмы в этой мощной модели в будущем.

Introduction

В отличие от млекопитающих, рыбки данио (Danio rerio) могут восстанавливать свою центральную нервную систему (ЦНС) после травмы1. Использование личинок рыбок данио в качестве модели регенерации спинного мозга относительно недавно. Оказалось полезным исследовать клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе репарации2. Это связано с простотой манипуляций, коротким экспериментальным циклом (новые личинки каждую неделю), оптической прозрачностью тканей и небольшим размером личинок, идеально подходящим для флуоресцентной микроскопии in vivo.

В случае регенерации спинного мозга двумя дополнительными преимуществами использования личинок являются скорость восстановления, несколько дней по сравнению с несколькими неделями для взрослых, и легкость индуцирования травм с использованием мануальных методов. Это было успешно использовано во многих исследованиях3,4,5, включая недавние исследования6,7. В целом, это приводит к увеличению значимого производства данных, высокой адаптивности экспериментальных протоколов и снижению экспериментальных затрат. Использование личинок моложе 5 дней после оплодотворения также снижает использование животных в соответствии с принципами 3R в исследованиях на животных8.

После травмы спинного мозга у личинок рыбок данио происходят многие биологические процессы, включая воспалительную реакцию, пролиферацию клеток, нейрогенез, миграцию выживших или вновь генерируемых клеток, реформирование функциональных аксонов и глобальное ремоделирование цепей нервных процессов и тканей позвоночника6,7,9,10 . Чтобы быть успешно организованными, эти процессы включают в себя тонко регулируемое взаимодействие между рядом типов клеток, компонентов внеклеточного матрикса и биохимических сигналов11,12. Разгадка деталей этой значительной реорганизации сложной ткани, такой как спинной мозг, требует использования и разработки точных и контролируемых экспериментальных подходов.

Основная экспериментальная парадигма, используемая для изучения регенерации спинного мозга у рыбок данио, заключается в использовании хирургических средств для индуцирования повреждения тканей путем резекции, колющего ранения или криоправмы3,13. Эти подходы имеют тот недостаток, что требуют специальной подготовки по навыкам микрохирургии, что отнимает много времени у любого нового оператора и может препятствовать их использованию в краткосрочных проектах. Кроме того, они обычно вызывают повреждение окружающих тканей, что может повлиять на регенерацию.

Другой подход заключается в том, чтобы вызвать повреждение клеток химическим путем14 или с помощью генетических манипуляций15. Последнее позволяет наносить целенаправленный урон. Однако такой метод требует длительной подготовительной работы по получению новой трансгенной рыбы перед проведением любого эксперимента, обновляемого каждый раз, когда нацеливается уникальный тип клеток.

Таким образом, существует необходимость в методе, позволяющем проводить целенаправленные, но универсальные поражения, подходящие для различных исследований в области регенерации. Решение состоит в том, чтобы использовать лазер для индуцирования локализованного повреждения в интересующей ткани16,17,18,19,20. Действительно, использование лазерно-индуцированного повреждения тканей представляет собой надежный подход к созданию поражений спинного мозга со многими преимуществами. Микроскопы, оснащенные такими модулями лазерной манипуляции, позволяют указать область индивидуальной формы, где будет происходить абляция клеток, с дополнительным преимуществом временного контроля. Таким образом, размер и положение поражения могут быть адаптированы для решения любых вопросов.

Недостающей особенностью большинства лазерных систем поражения является возможность вызывать травмы высоко воспроизводимым способом для серии личинок. Здесь описан оригинальный протокол с использованием УФ-лазера для индуцирования полуавтоматических точных и контролируемых поражений у личинок рыбок данио на основе микрофлюидной платформы, предназначенной для автоматизированной обработки личинок21. Более того, в представленной здесь системе личинки вставляются в стеклянный капилляр, что позволяет свободно вращаться животному вокруг его рострокодальной оси. Пользователь может выбрать, какую сторону личинки представить лазеру, позволяя флуоресцентной визуализации точно нацеливаться на лазерный луч и оценивать повреждение после поражения.

Протокол, описанный здесь, используется с полуавтоматизированной системой визуализации личинок рыбок данио в сочетании со вращающимся диском, оснащенным ультрафиолетовым лазером (далее обозначенным как система VAST). Однако основные пункты протокола и большинство пунктов формулы техники справедливы для любой системы, оснащенной лазером, способным к абляции клеток, включая двухфотонные лазерные сканирующие микроскопы, вращающиеся дисковые микроскопы, снабженные УФ-лазером (модуль FRAP), или видеомикроскопы с лазерным модулем для фотоманипуляции. Одно из основных различий между системой VAST и обычной обработкой проб будет заключаться в том, что для последней потребуется установка личинок в агарозе с низкой температурой плавления на стеклянных крышках / чашках Петри со стеклянным дном вместо их загрузки в 96-луночную пластину.

Преимущества, предлагаемые этим методом, открывают возможности для инновационных исследований клеточных и молекулярных механизмов в процессе регенерации. Кроме того, высокое качество данных позволяет проводить количественные исследования в междисциплинарном контексте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования на животных проводились с одобрения Министерства внутренних дел Великобритании и в соответствии с его правилами, в соответствии с лицензией на проект PP8160052. Проект был одобрен Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Эдинбургского университета. Для экспериментальных анализов личинки рыбок данио до 5-дневного возраста обоих полов использовали следующие доступные трансгенные линии: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(бетаактин:утрофин-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) и Tg(mnx1:gfp) (см. Дополнительный файл 1 относительно генерации трансгенных линий рыбок данио). Схема протокола с использованием автоматизированной платформы обработки личинок рыбок данио показана на рисунке 1. Все пользовательское программное обеспечение, скрипты и подробные экспериментальные протоколы, используемые в этой работе, доступны на https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. Пробоподготовка

  1. Через 5 часов после оплодотворения отсортируйте эмбрионы для правильной стадии развития21. Выбросьте мертвые яйцеклетки и слаборазвитые и переразвитые эмбрионы.
  2. Через 3 дня после оплодотворения (dpf) обезболивают личинок, добавляя 2 мл 0,4% аминобензойной кислоты-этилметил-эфира к 50 мл рыбьей воды в чашке Петри 90 мм. Используйте животных, выращенных с фенилтиомочевиной (PTU) (см. Таблицу материалов), чтобы предотвратить пигментацию кожи, если это проблема, чего нет в случае травм спинного мозга на личинках 3 dpf, описанных в этом протоколе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта относительно высокая концентрация анестетика используется для предотвращения движений личинок после лазерного воздействия.
  3. Скрининг эмбрионов на флуоресцентную репортерную экспрессию (Дополнительный файл 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный репортер для спинного мозга (или другой структуры, представляющей интерес) часто требуется для оценки эффективности травмы. Применение tg(Xla.Tubb:DsRed) помогает идентифицировать спинной мозг.
  4. Перенесите выбранных личинок в 96-луночную пластину для использования в системе VAST (см. Таблицу материалов) с 300 мкл воды рыбного объекта на скважину. Используйте среду, содержащую анестетик из 90 мм чашки Петри напрямую. Убедитесь, что на лунку приходится только одна личинка. Подготовьте одну дополнительную пустую 96-луночную пластину, чтобы собрать пораженных личинок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании другой лазерной системы поражения установите личинки в 1% агарозный гель с низкой температурой плавления (LMP) в соответствующей камере наблюдения.

2. Подготовка микроскопа

  1. Включите все компоненты системы (VAST, микроскоп, лазер, ПК), включая лазер для абляции.
  2. Как только аппаратное обеспечение будет полностью инициализировано, запустите программное обеспечение микроскопа, ImageJ / Fiji, интегрированную среду разработки Python (IDE) и автоматизированное программное обеспечение для визуализации рыбок данио (система VAST) при использовании этой платформы (см. Таблицу материалов).
  3. Настройте программное обеспечение VAST, выполнив следующие действия.
    1. Когда программное обеспечение VAST запустится, выберите Plate в первом окне и нажмите кнопку Done (Done) (рисунок 2A). Появится еще одно маленькое окошко, спрашивающее, пуст ли капилляр и чист. Проверьте, посмотрев на изображение капилляра, есть ли внутри пузырьки воздуха. Если нет, нажмите Кнопка Да. Если есть какие-либо пузырьки, нажмите No и следуйте шагу 2.3.2-2.3.3 (рисунок 2B).
    2. В окне Пробоотборник крупных частиц (LP) нажмите на Prime , чтобы удалить пузырьки воздуха (рисунок 2C).
    3. Перейдите в главное окно программного обеспечения (с капиллярным изображением) и щелкните правой кнопкой мыши на изображении. Выберите Записать пустое капиллярное изображение во всплывающем меню (рисунок 2B).
    4. В окне LP Sampler перейдите в меню Файл и выберите опцию Открыть сценарий . Выберите файл, содержащий сценарий, соответствующий выполняемому эксперименту.
    5. В главном окне программного обеспечения VAST перейдите в файл и выберите Открыть эксперимент. Выберите файл эксперимента, соответствующий запланированному эксперименту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что флажки Автоматическая выгрузка и Массовый вывод в отходы НЕ установлены.
  4. Настройте программное обеспечение микроскопа для визуализации.
    1. Запустите программное обеспечение для визуализации микроскопа (см. Таблицу материалов) для инициализации оборудования. Это может занять несколько минут, в зависимости от системы.
    2. Зайдите в настройки сбора и настройте микроскоп для визуализации флуорофора, экспрессируемого в личинках. Используйте объектив для погружения в воду 10x NA 0,5, чтобы убедиться, что фокусный объем достаточно удлинен вдоль оптической оси, чтобы повредить всю глубину спинного мозга или целевой ткани.
  5. Настройка ImageJ/Fiji для лазерных поражений.
    1. Перейдите в меню Файл , выберите Создать/Сценарий , чтобы открыть окно скрипта.
    2. В окне Создать перейдите в меню Файл и выберите Открыть , чтобы загрузить сценарий лазерного поражения (Manual_MP_Operation.ijm).
  6. Настройте интегрированную среду разработки Python.
    1. Запустите интегрированную среду разработки Python.
    2. Перейдите в меню Файл и выберите Открыть файл , чтобы загрузить сценарий для управления лазером (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. Перейдите в меню «Выполнить» и выберите «Выполнить без отладки», чтобы запустить сценарий. Убедитесь, что последовательность сообщений на панели TERMINAL отображается вместе с некоторым шумом во время инициализации лазерного аттенюатора (рисунок 2D).

3. Выполнение лазерных поражений на системе VAST

  1. Центрируйте капилляр относительно объектива микроскопа, перемещая сцену, нажимая на кнопки со стрелками в главном окне программного обеспечения VAST (рисунок 2B).
  2. Сосредоточьтесь на верхней части капилляра, глядя через окуляры и используя проходящий свет микроскопа.
    ВНИМАНИЕ: Капилляр очень хрупкий и может сломаться при прикосновении к цели. Медленно перемещайте ручку микроскопа при фокусировке внутрь и наружу.
  3. Поместите пластины с 96 лунками на держатель пластин пробоотборника LP системы VAST. Поместите пластину, содержащую личинки, на левый держатель и пластину для сбора справа. Убедитесь, что пластины правильно ориентированы: колодец А1 должен находиться в переднем левом углу держателя.
  4. В программном обеспечении VAST в окне LP Sampler нажмите кнопку Шаблон пластины и выберите все колодцы, содержащие личинки. Нажмите кнопку OK для проверки и закрытия окна (рисунок 2C).
  5. В окне LP Sampler нажмите на кнопку Run Plate , чтобы начать загрузку личинки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через некоторое время личинка должна быть видна в капилляре в положении (предопределенном в файле определения эксперимента), позволяющем травмировать спинной мозг. Свет лотка VAST погаснет после нескольких вращений, чтобы установить личинку боковой стороной, обращенной к объективу микроскопа.
  6. Перейдите к программному обеспечению микроскопа и нажмите кнопку Live , чтобы сфотографировать личинку.
  7. Поверните ручку фокусировки микроскопа до тех пор, пока не будет виден центральный канал спинного мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть легче сфокусироваться, используя сначала проходящий свет, а затем уточнить с помощью флуоресценции.
  8. Сделайте снимок во флуоресценции и сохраните изображение в выделенной папке.
  9. Откройте изображение в ImageJ и при необходимости отрегулируйте контрастность (с помощью меню Image/Adjust/Brightness/contrast... в ImageJ).
  10. Нажмите на инструмент «Область интереса» (ROI) и нарисуйте короткую линию (20 мкм), центрированную на спинном мозге (рисунок 3A).
  11. Переключите микроскоп в положение 100% отражающего зеркала.
  12. Загрузите скрипт ImageJ и нажмите кнопку Выполнить . Используйте следующие параметры: Повторение - 2; Образец - 1; Ширина - 40-микрон; Затухание - 89 (полная мощность лазера) (рисунок 3С).
  13. Когда последовательность лазерного снимка будет завершена, переключитесь на флуоресцентную визуализацию в программном обеспечении для визуализации и при необходимости отрегулируйте фокус.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смещение фокуса часто наблюдается из-за смещения хвоста во время лазерного воздействия.
  14. Сделайте новый снимок и сохраните его.
  15. Откройте это новое изображение в ImageJ и нарисуйте новую линию, которая должна быть больше, чем сам спинной мозг (~ 80 мкм), начиная с вентральной стороны спинного мозга в верхней части нотохорды и идущей к спинной стороне, чтобы закончиться в пространстве между спинным мозгом и кожей (рисунок 3B).
  16. Переключите микроскоп в положение 100% отражающего зеркала.
  17. Перейдите в окно скрипта ImageJ и нажмите кнопку Выполнить . Используйте следующие параметры: Повторение - 2; Образец - 1; Ширина - 40 мкм; Затухание - 89 (Полная мощность лазера).
  18. После завершения (более длинной) последовательности лазерного снимка проверьте качество трансэкции путем визуализации флуоресценции и фокусировки. Убедитесь, что ни одна клетка или аксоны не остались нетронутыми в месте поражения, которое должно выглядеть как темная или как слабая и однородная флуоресцентная область (рисунок 3D, нижняя панель).
  19. Соберите пораженных личинок в пустую 96-луночную пластину (с теми же координатами скважины, что и у оригинальной скважины), перейдя в главное окно программного обеспечения VAST и нажав на кнопку Собрать .
  20. Снова включите системный индикатор VAST, нажав на флажок Tray Light в левом нижнем углу окна.
  21. Повторите этап 3.3-3.17 для каждой новой личинки, подлежащей травме.

4. Обработка после поражения и дополнительные эксперименты

  1. Выньте личинок из 96-луночной пластины как можно скорее и перенесите их в чистую чашку Петри со свежей рыбной водой, чтобы личинки могли восстановиться после поражения. Поместите чашку Петри в инкубатор при температуре 28 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повреждение часто продолжает распространяться в первый час после поражения. Таким образом, фактическая степень поражения должна быть оценена с помощью флуоресцентной визуализации после задержки примерно в 1 ч.

5. Устранение неполадок

  1. Если пузырьки воздуха присутствуют в трубках и капиллярах системы VAST, нажмите кнопку Prime в окне LP Sampler, чтобы удалить их.
  2. Рассмотрим неудачные поражения (оцениваемые по оставшейся флуоресценции в месте поражения, за исключением ожидаемого остаточного и однородного фона), которые могут быть обусловлены несколькими причинами, упомянутыми ниже.
    1. Низкая мощность лазера: когда это произойдет, попробуйте с более высоким значением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система VAST оснащена лазером красителя. Это означает, что концентрация раствора красителя, используемого для генерации лазерного света, может меняться со временем, что приводит к снижению мощности лазера. Замена на свежий раствор обычно решает проблему22.
    2. Плохая калибровка: Когда это происходит, проверьте калибровку и мощность лазерной системы в соответствии с шагом 5.2.2.1-5.2.2.4. При неправильной калибровке лазер не будет направлен в нужное место, что приведет к неудачным поражениям или нежелательным повреждениям в соседних тканях.
      1. Поместите зеркальную горку поверх капиллярной камеры. Сосредоточьтесь на покрытой стороне (она должна быть обращена к цели). Используйте предыдущее значение по умолчанию на слайде, чтобы было легче фокусироваться.
      2. Примените схему лазерной абляции с помощью калибровочного скрипта.
      3. Оцените качество шаблона. Пятна или линии должны быть четкими, а не размытыми.
      4. Используйте рампу с увеличивающейся мощностью, чтобы оценить, изменилась ли мощность лазера по сравнению с предыдущими сеансами.
    3. Движение личинок во время поражений: Личинки по-разному реагируют на анестезию; таким образом, лазерное поражение может вызвать движения хвоста во время процесса, тем самым препятствуя успешной трансекции. Когда это произойдет, сделайте дополнительную итерацию шагов лазерного поражения, чтобы завершить его, избегая при этом повреждения окружающих тканей.
    4. Плохая фокусировка: когда это происходит, сосредоточьтесь на середине центрального канала, чтобы получить наилучшие результаты.
    5. Рисование, положение и размер ROI: положение и размер ROI имеют решающее значение для успешного выполнения. ROI должен быть больше, чем спинной мозг, и сосредоточен в центре спинного мозга. Чтобы решить эту проблему, начните рисовать ROI с вентральной стороны спинного мозга и поднимитесь к дорсальной стороне, чтобы получить успешную трансекцию. Вероятно, это связано с движениями хвоста, вызванными последовательностью лазерных выстрелов во время процедуры абляции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Валидация трансекции спинного мозга
Структурные и функциональные исследования были проведены, чтобы оценить, допускает ли протокол полную трансекцию спинного мозга.

Во-первых, чтобы убедиться, что потеря флуоресценции в месте поражения была вызвана повреждением нейрональной ткани, а не флуоресцентным фотоотбеливанием от лазерного освещения, было выполнено иммуноокрашивание с использованием антитела против ацетилированного тубулина (см. Таблицу материалов и Дополнительный файл 1). Наблюдалось полное нарушение аксонов между каудальной и ростральной сторонами поражения, подтверждающее полную трансекцию спинного мозга (рисунок 4В). Успешная трансекция спинного мозга не должна оставлять оставшуюся нейронную проекцию через место поражения (см. Рисунок 4C для примера неудачного поражения). Используя этот метод, частота успеха лазерных поражений спинного мозга оценивалась в 75% (четыре неполные трансекции у 16 животных).

Потеря функциональности после лазерного поражения исследовалась с помощью кальциевой визуализации. На интактных рыбах спонтанная скоординированная активность нейронной сети генерирует пики флуоресценции вдоль всего спинного мозга. Успешная трансекция прервет распространение этой активности между обеими сторонами поражения. Для контроля качества трансекции спинного мозга лазерные поражения проводили на личинках tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) при 3 dpf. После сбора в новую многолуночную пластину личинок слегка обезболивали. Они были установлены на стеклянном покровном листе в агарозе с низкой температурой плавления для выполнения флуоресцентных покадровых записей на конфокальном микроскопе с 3 часов после травмы. Наблюдалась потеря активности на каудальной стороне места поражения. Действительно, количественная оценка флуоресценции показывает, что всплески из-за спонтанной активности рыбы присутствовали только на ростральной стороне после травмы, но происходили скоординированным образом в эквивалентных ростральных и каудальных положениях у неповрежденных рыб (рисунок 4D, E). Низкий остаточный сигнал на каудальной стороне после травмы, вероятно, был обусловлен активностью сенсорных нейронов (вероятно, сенсорных нейронов Рохона-Бирда на каудальной стороне спинного мозга23) в ответ на движение хвоста, вызванное сокращением мышц на ростральной стороне.

Процессы регенерации, вызванные лазерными поражениями
Через 24 часа после травмы рана начала закрываться, что привело к частичному восстановлению первоначальной структуры спинного мозга через 48 ч (рисунок 5D). С помощью кальциевой визуализации было подтверждено частичное функциональное пересоединение (рисунок 5E, F) после 48 hpi. Расчет соотношения (названного авторами Connectivity Restoration Index) между амплитудой шипов в каудальной области и ростральной областью (рисунок 5G) показал увеличение между 3, 24 и 48 hpi, как и ожидалось во время регенерации спинного мозга.

Лазерные поражения вызывают иммунный ответ
Набор макрофагов (mpeg1:GFP + клетки) наблюдался после лазерных поражений с использованием tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) лазерных поражений личинок (рисунок 5H,I). Это согласуется с предыдущими исследованиями авторов с использованием ручных поражений, демонстрирующих существенную роль макрофагов для успешной регенерации спинного мозга у личинок рыбок данио6,24. Это наблюдение указывает на то, что иммунные реакции могут быть изучены после лазерного повреждения и подтверждает, что повреждение тканей произошло.

Лазерные и ручные поражения вызывают повышенный нейрогенез в спинном мозге
Предыдущие исследования использовали ручные поражения для изучения нейрогенеза, который возникает после травмы спинного мозга6,15. Лазерные поражения могут быть ценным инструментом для изучения этого явления. Ранее опубликованный эксперимент показал повышенный нейрогенез после мануальной травмы спинного мозга по сравнению с контрольной группой15. Здесь tg(mnx1:gfp) рыбы использовались в качестве двигательных нейронов и были флуоресцентно помечены. Окрашивание антител анти-GFP использовалось для улучшения видимости GFP в личинках. Это было объединено с окрашиванием EdU25 (см. Дополнительный файл 1), которое маркирует вновь генерируемые нейроны. EdU был добавлен сразу после травмы при 3 dpf, что означает, что любые клетки, помеченные EdU, были сгенерированы после травмы. Таким образом, клетки, которые демонстрируют колокализованное окрашивание, представляют собой новые двигательные нейроны, которые рождаются после травмы спинного мозга. Было подсчитано количество колокализованных клеток по обе стороны от места повреждения или в области, соответствующей расположению и размеру места повреждения в контрольных группах (захваченных в двух окнах по 50 мкм), и разница в среднем количестве колокализованных клеток была проанализирована с использованием одностороннего ANOVA26.

Этот протокол использовался на личинках, пораженных вручную и лазером, для сравнения влияния каждого метода поражения на нейрогенез (рисунок 6). Не наблюдалось никакой разницы в количестве меченых клеток между ручными и лазерными поражениями. Разве что рыбы показали меньше двойных меченых клеток, чем пораженные рыбы в обоих условиях поражения (рисунок 6D). Это согласуется с предыдущими результатами, показывающими повышенный нейрогенез у рыб, пораженных вручную, по сравнению с рыбой, пораженной без вмешательства15.

Эти результаты подтверждают результаты визуализации кальция и окрашивания ацетилированным тубулином, поскольку лазерная травма вызывает реакцию регенерации, сравнимую с ручным поражением. Это указывает на то, что лазерное поражение не просто отбеливает флуоресценцию в клетках, но приводит к травме, которая вызывает те же клеточные реакции, что и ручное поражение.

Лазерные поражения приводят к меньшему повреждению кожи и мышц, чем ручные поражения
Ручные поражения часто приводят к большому количеству повреждений мышц и кожи. Напротив, лазерные поражения могут быть направлены более конкретно на спинной мозг, уменьшая повреждение других тканей. Чтобы проиллюстрировать это, личинки Tg(бета-актин: утрофин-мЧ) использовались для выполнения ручных и лазерных поражений. Эта линия флуоресцентно маркирует F-актин-связывающий белок, что позволяет визуализировать клетки спинного мозга и мышечные волокна. Затем личинки были смонтированы вживую и сфотографированы (рисунок 7A, B). На рисунке 7А показано повреждение спинного мозга. Отсутствие утрофина в месте повреждения как при лазерном, так и при ручном поражении предполагает, что оба метода поражения повредили клетки спинного мозга. На рисунке 7B показано повреждение мышц. Существует четкая шевроноподобная структура миотом в невключенном состоянии, и видны пучки актиновых волокон. Наблюдается видимое нарушение миотомной формы в состоянии ручного поражения, и присутствует меньшее количество актиновых волокон. Это демонстрирует значительные повреждения мышц. Однако в состоянии лазерного поражения шевронная структура миотомы сохраняется. Существует некоторое повреждение мышечных волокон, но оно содержится в одном или двух миотомах по сравнению с четырьмя в состоянии ручного поражения. Кроме того, существует незначительное повреждение кожи в состоянии лазерного поражения по сравнению с состоянием ручного поражения, как показано на изображениях, сделанных на стереомикроскопе на рисунке 7C.

В целом, эти результаты демонстрируют, что воспроизводимые, полуавтоматические лазерные поражения могут стать мощным инструментом для изучения нейронной регенерации у рыбок данио.

Figure 1
Рисунок 1: Схема полуавтоматического рабочего процесса лазерной травмы. Через три дня после оплодотворения (dpf) личинки загружаются в 96-луночную пластину и помещаются на автоматизированную платформу обработки личинок. Затем каждая личинка загружается в капилляр, помещенный под линзу 10x NA 0,5 на вертикальном микроскопе для визуализации и лазерного поражения. После поражений личинок выгружают на новую 96-луночную пластину для сбора и дальнейших экспериментов. Сверху передаются и флуоресцентные изображения tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf личинок до и после лазерного поражения (шкала бар = 50 мкм). Личинки ориентированы рострально влево и спинно вверх (для всех фигур). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Запуск программного обеспечения для полуавтоматизированной системы визуализации личинок рыбок данио и системы лазерного управления. (A) Программное обеспечение VAST при запуске. (B) В главном окне программного обеспечения VAST показан пустой капилляр. (C) Окно LP Sampler с шаблоном пустой пластины. (D) Представление среды IDE Python с запущенным сценарием Watch_for_ROIs_py3.py. Оранжевый прямоугольник указывает на терминальную вкладку с сообщениями, отображаемыми во время инициализации лазерного аттенюатора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Пример последовательности лазерного поражения на tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larvae. (A) Первый шаг лазерного поражения с использованием линии 20 мкм после выбора инструмента ROI линии на панели инструментов ImageJ. (B) Вторая стадия с линией 80 мкм для полной трансекции спинного мозга. (C) Вид скрипта, используемого для управления лазером из ImageJ. (D) Последовательность изображений во время лазерных поражений. Верх: до поражения; Средний: сразу после первого шага; Нижняя часть: сразу после второго шага (шкала бар = 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Иммуноокрашивание ацетилированного тубулина (A-C) и кальциевая визуализация (D,E) указывают на то, что лазерное поражение полностью нарушает непрерывность спинномозговой ткани. (A) Интактный спинной мозг. (B) Полная трансекция позвоночника, показывающая полное разрушение ткани спинного мозга вдоль как дорсально-вентральной, так и медиалально-латеральной осей. (C) Неполная трансекция. (шкала = 50 мкм). (D) Трансецированный спинной мозг на tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) 3 dpf личинки. Прямоугольники показывают ROI, используемые для количественной оценки интенсивности флуоресценции в ростральной (синей) и каудальной (оранжевой) сторонах поражения. (E) График изменений интенсивности флуоресценции с течением времени в ROI рострального и каудального анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Лазерное повреждение вызывает иммунный ответ и приводит к успешному анатомическому и функциональному восстановлению. (A-D) Максимальная интенсивность проекции флуоресцентных изображений tg(Xla.Tubb:DsRed) 3dpf личинки до (A) и в разное время после лазерного поражения: через 3 ч (B), через 24 ч (C) и через 48 ч (D). (Е-Г) Использование кальциевой визуализации для оценки восстановления функции. (E) Пораженная личинка tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) с анализом ROI. (F) График изменений интенсивности флуоресценции с течением времени в ROI рострального и каудального анализа. (G) Количественная оценка соотношения между амплитудами каудальных и ростральных шипов (индекс восстановления связности) на уровне 3, 24, 48 ч после поражения (N = 3). (Н-И) Характеристика иммунного ответа после поражения. (H) Флуоресцентные изображения личинки 3 dfp(слева) и пораженной (справа) tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 dfp, показывающие накопление макрофагов (mpeg1+ клетка, зеленый) при 6 hpi. I) Количественная оценка числа макрофагов через 6 ч после поражения у поврежденных и интактных личинок (N = 3) (шкала баров = 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Генерация двигательных нейронов, индуцированная поражением, сопоставима между лазерным и ручным поражением. (A-C) Изображения из микроскопа ApoTome личинок tg(mnx1:gfp) 5 dpf с окрашиванием EdU, в условиях лазерного поражения (A), ручного поражения (B) и без (C). Наконечники стрел обозначают ячейки, дважды помеченные для обоих маркеров. Шкала = 100 мкм. (A'-C') Более высокое увеличение двухмаркированных ячеек, обозначаемых белыми прямоугольниками. D) Количественная оценка количества клеток для числа колокализованных клеток в каждой личинке. 50 мкм окон были размещены по обе стороны от места повреждения, и колокализованные клетки были подсчитаны во всех изображениях Z-стека. Односторонняя ANOVA была выполнена с помощью постхок-теста Туки27. Нет существенной разницы между лазерными и ручными поражениями (p = 0,909). Значительно меньше клеток mnx1:gfp+/EdU+ в контрольной группе по сравнению с лазерным поражением (изменение в 2,4 раза, p = 0,011) и ручным поражением (изменение в 2,3 раза, p = 0,018). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Лазерное поражение вызывает меньше повреждений мышц и кожи, чем ручное поражение. (А-Б) Одиночные Z-стековые изображения tg(бета-актин:утрофин-mCherry) 3 личинок dpf в условиях невезионного, ручного поражения и лазерного поражения, сделанные на конфокальном микроскопе при 20-кратном увеличении. Белые стрелки обозначают место травмы. Шкала бар = 50 мкм. (А) обозначает Z-стеки, где видны спинной мозг и нотохорда. SC маркирует спинной мозг, а NC маркирует нотохорд. (B) обозначает Z-стеки, где видны мышечные волокна. (C) Изображения были сделаны на стереомикроскопе личинок 3 dpf в условиях рассеянного, ручного поражения и лазерного поражения. Личинки были прикреплены к платформе с помощью вольфрамовых проволочных штифтов (видимых на лазерном изображении поражения). Черный ящик обозначает место поражения. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Экспериментальные детали протокола. Описана генерация трансгенных линий рыбок данио, мануальные повреждения спинного мозга, иммуногистохимия ацетилированных тубулинов, окрашивание Hb9/EdU, визуализация, обработка и анализ изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существует острая необходимость в более глубоком понимании процессов, происходящих во время регенерации у рыбок данио. Эта модель на животных предлагает много преимуществ для биомедицинских исследований, в частности для травм спинного мозга1. Большинство исследований включают ручные поражения, которые требуют хорошо обученного оператора и вызывают повреждение нескольких тканей. Здесь представлен протокол лазерного поражения, позволяющий контролировать характеристики поражения и уменьшать повреждение окружающих тканей. Кроме того, этот метод достаточно прост, чтобы быть успешно использованным относительно неподготовленными экспериментаторами.

Критическими шагами в протоколе являются калибровка лазера и определение ROI. На практике калибровка очень стабильна (даже в течение нескольких месяцев), и как только правильный размер и положение ROI были определены, использование этого метода является простым. Хотя в протоколе описано, как выполнять поражения на конкретном оборудовании, большинство преимуществ лазерных поражений доступны для различных систем, таких как вращающийся дисковый микроскоп.

Основными ограничениями этого протокола являются необходимость использования флуоресцентного репортера спинного мозга и время, необходимое для выполнения поражений (~ 5 мин / рыба). Последнее компенсируется высокой воспроизводимостью, требующей меньшего количества животных. Тем не менее, ручные поражения по-прежнему жизнеспособны для таких применений, как тестирование на наркотики, где требуется много пораженных животных. Как показано здесь, степень нейрогенеза, вызванного поражением, сопоставима между лазерными и ручными поражениями.

Тем не менее, лазерная травма имеет огромное потенциальное применение, некоторые из них связаны с уникальными предлагаемыми преимуществами. Например, вращающийся капилляр позволяет выполнять поражения в самых разных положениях контролируемым образом. Например, он может быть использован для индуцирования аксотомии одиночных нейронов в клетках Маутнера (данные не показаны), что также было продемонстрировано в работе Bhatt et al.15. Это было бы невозможно при использовании ручных поражений.

Результаты также демонстрируют, что повреждение в основном содержится в спинном мозге, с минимальным повреждением окружающих тканей. Это может означать, что клеточные реакции, наблюдаемые после лазерного поражения, с большей вероятностью будут отнесены именно к спинному мозгу, а не к передаче сигналов от других поврежденных тканей. Это также может означать, что пораженные лазером личинки более способны противостоять дальнейшим приготовлениям к экспериментам. Например, рассечение для электрофизиологии включает в себя удаление кожи туловища с помощью щипцов 28,29,30, что приведет к высокому механическому давлению на и без того деликатное место травмы и рискует снова разорвать любые аксональные соединения. Целостность кожи и мышечной ткани, наблюдаемая у личинок, пораженных лазером, может защитить место поражения от дальнейшего повреждения и привести к более точному представлению достигнутого уровня регенерации.

Кроме того, улучшенная локализация повреждений после лазерной травмы ограничивает расширение связи между различными процессами регенерации, которые могут маскировать более тонкие процессы при использовании ручных поражений. Описанный здесь подход к экспериментальному повреждению личинок рыбок данио может открыть ряд новых исследований в контексте количественной биологии, биологической физики и вычислительной биологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано BBSRC (BB/S0001778/1). CR финансируется Программой стипендий Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program. Мы благодарим Дэвида Гринальда (CRH, Эдинбургский университет) и Кэти Рид (CDBS, Эдинбургский университет) за добрый подарок трансгенной рыбы (см. Дополнительный файл). Мы благодарим Даниэля Сунга (CRH, Эдинбургский университет) за добрый доступ к конфокальному 3i-вращающемуся диску.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0 Carl Zeiss
ImageJ/FIJI Open-Source
Visual Studio Code Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880 Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1 Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1 Carl Zeiss
UV laser Micropoint
VAST BioImager Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish Thermo-Fisher 101R20
96-well plate Corning 3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit Invitrogen C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) Sigma-Aldrich A5040
phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 Jackson 703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson 715-165-150
Mouse anti-GFP Abcam AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody Sigma T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp) N/A First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed) N/A First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) N/A Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

Tags

Медицина выпуск 177

Erratum

Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

The title was updated from:

Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

to:

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Контролируемые полуавтоматизированные лазерно-индуцированные повреждения для изучения регенерации спинного мозга у личинок рыбок данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El-Daher, F., Early, J. J.,… More

El-Daher, F., Early, J. J., Richmond, C. E., Jamieson, R., Becker, T., Becker, C. G. Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (177), e63259, doi:10.3791/63259 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter