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Summary
Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.
Abstract
Le larve di zebrafish possiedono un sistema nervoso centrale (SNC) completamente funzionale con un'elevata capacità rigenerativa solo pochi giorni dopo la fecondazione. Questo rende questo modello animale molto utile per studiare le lesioni e la rigenerazione del midollo spinale. Il protocollo standard per indurre tali lesioni è quello di transettare manualmente la parte dorsale del tronco. Tuttavia, questa tecnica richiede un ampio allenamento e danneggia i tessuti aggiuntivi. È stato sviluppato un protocollo per le lesioni indotte dal laser per aggirare queste limitazioni, consentendo un'elevata riproducibilità e completezza della transezione del midollo spinale su molti animali e tra diverse sessioni, anche per un operatore non addestrato. Inoltre, il danno tissutale è principalmente limitato al midollo spinale stesso, riducendo gli effetti confondenti derivanti dalla lesione di diversi tessuti, ad esempio pelle, muscoli e SNC. Inoltre, sono possibili emi-lesioni del midollo spinale. Una migliore conservazione dell'integrità dei tessuti dopo una lesione laser facilita ulteriori dissezioni necessarie per ulteriori analisi, come l'elettrofisiologia. Quindi, questo metodo offre un controllo preciso dell'entità della lesione che è irraggiungibile manualmente. Ciò consente nuovi paradigmi sperimentali in questo potente modello in futuro.
Introduction
A differenza dei mammiferi, il pesce zebra (Danio rerio) può riparare il loro sistema nervoso centrale (SNC) dopo un infortunio1. L'uso di larve di zebrafish come modello per la rigenerazione del midollo spinale è relativamente recente. Si è dimostrato utile studiare i meccanismi cellulari e molecolari alla base della riparazione2. Ciò è dovuto alla facilità di manipolazione, al breve ciclo sperimentale (nuove larve ogni settimana), alla trasparenza ottica dei tessuti e alle piccole dimensioni delle larve, ideali per la microscopia a fluorescenza in vivo .
Nel caso della rigenerazione del midollo spinale, due ulteriori vantaggi dell'utilizzo delle larve sono la velocità di recupero, pochi giorni rispetto a poche settimane per gli adulti, e la facilità di indurre lesioni utilizzando tecniche manuali. Questo è stato utilizzato con successo in molti studi3,4,5, comprese recenti indagini6,7. Nel complesso, ciò porta a una maggiore produzione di dati significativi, un'elevata adattabilità dei protocolli sperimentali e una diminuzione dei costi sperimentali. L'uso di larve di età inferiore ai 5 giorni dopo la fecondazione riduce anche l'uso di animali seguendo i principi 3R nella ricerca sugli animali8.
Dopo una lesione del midollo spinale nelle larve di zebrafish, si verificano molti processi biologici, tra cui la risposta infiammatoria, la proliferazione cellulare, la neurogenesi, la migrazione delle cellule sopravvissute o di nuova generazione, la riforma degli assoni funzionali e un rimodellamento globale dei circuiti dei processi neurali e dei tessuti della colonna vertebrale6,7,9,10 . Per essere orchestrati con successo, questi processi comportano un'interazione finemente regolata tra una gamma di tipi di cellule, componenti della matrice extracellulare e segnali biochimici11,12. Svelare i dettagli di questa significativa riorganizzazione di un tessuto complesso come il midollo spinale richiede l'uso e lo sviluppo di approcci sperimentali precisi e controllati.
Il paradigma sperimentale primario utilizzato per studiare la rigenerazione del midollo spinale nel pesce zebra è quello di utilizzare mezzi chirurgici per indurre danni ai tessuti mediante resezione, pugnalata o crioigiura3,13. Questi approcci hanno lo svantaggio di richiedere una formazione specifica nelle competenze di microchirurgia, che richiede tempo per qualsiasi nuovo operatore e può impedirne l'uso in progetti a breve termine. Inoltre, di solito inducono danni ai tessuti circostanti, che possono influenzare la rigenerazione.
Un altro approccio consiste nell'indurre danni cellulari chimicamente14 o mediante manipolazioni genetiche15. Quest'ultimo consente danni altamente mirati. Tuttavia, tale tecnica richiede un lungo lavoro preparatorio per generare nuovi pesci transgenici prima di fare qualsiasi esperimento, rinnovato ogni volta che viene preso di mira un tipo di cellula unico.
C'è, quindi, la necessità di un metodo che consenta lesioni mirate ma versatili adatte a una varietà di studi sulla rigenerazione. Una soluzione consiste nell'utilizzare un laser per indurre danni localizzati nel tessuto di interesse16,17,18,19,20. In effetti, l'uso del danno tissutale indotto dal laser presenta un approccio robusto per generare lesioni del midollo spinale con molti vantaggi. I microscopi dotati di tali moduli di manipolazione laser consentono di specificare un'area sagomata personalizzata in cui si verificherà l'ablazione cellulare, con l'ulteriore vantaggio del controllo temporale. La dimensione e la posizione della lesione possono quindi essere adattate per rispondere a qualsiasi domanda.
La caratteristica mancante della maggior parte dei sistemi di lesioni laser è la possibilità di indurre lesioni in modo altamente riproducibile per una serie di larve. Qui viene descritto un protocollo originale che utilizza un laser UV per indurre lesioni semi-automatizzate precise e controllate nelle larve di zebrafish basate su una piattaforma microfluidica progettata per la manipolazione automatizzata delle larve21. Inoltre, nel sistema qui presentato, le larve sono inserite in un capillare di vetro, che consente la libera rotazione dell'animale attorno al suo asse rostrocaudale. L'utente può scegliere quale lato della larva presentare al laser, consentendo al contempo l'imaging a fluorescenza per indirizzare con precisione il raggio laser e valutare il danno dopo la lesione.
Il protocollo qui descritto viene utilizzato con un sistema di imaging semi-automatizzato delle larve di zebrafish combinato con un disco rotante dotato di un laser UV (designato di seguito come sistema VAST). Tuttavia, i punti principali del protocollo e la maggior parte delle affermazioni della tecnica sono validi per qualsiasi sistema dotato di un laser in grado di ablazione cellulare, compresi microscopi a scansione laser a due fotoni, microscopi a disco rotante dotati di un laser UV (modulo FRAP) o videomicroscopi con un modulo laser per la manipolazione fotografica. Una delle principali differenze tra il sistema VAST e la gestione convenzionale dei campioni sarà che per quest'ultimo sarà necessario montare larve in agarosio a basso punto di fusione su coperture di vetro / piastre di Petri con fondo di vetro invece di caricarle in una piastra a 96 pozzetti.
I benefici offerti da questo metodo aprono opportunità di ricerca innovativa sui meccanismi cellulari e molecolari durante il processo di rigenerazione. Inoltre, l'elevata qualità dei dati consente indagini quantitative in un contesto multidisciplinare.
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Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti con l'approvazione del Ministero degli Interni del Regno Unito e secondo i suoi regolamenti, sotto la licenza di progetto PP8160052. Il progetto è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Edimburgo. Per le analisi sperimentali, sono state utilizzate larve di zebrafish fino a 5 giorni di entrambi i sessi delle seguenti linee transgeniche disponibili: Tg (Xla.Tubb: DsRed;mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaactin: utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) e Tg (mnx1: gfp) (vedi File supplementare 1 relativo alla generazione delle linee transgeniche di zebrafish). Uno schema del protocollo che utilizza la piattaforma automatizzata di gestione delle larve di zebrafish è mostrato nella Figura 1. Tutti i software personalizzati, gli script e i protocolli sperimentali dettagliati utilizzati in questo lavoro sono disponibili presso https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.
1. Preparazione del campione
- A 5 ore dopo la fecondazione, ordinare gli embrioni per il corretto stadio di sviluppo21. Scartare le uova morte e gli embrioni poco sviluppati e sovrasviluppati.
- A 3 giorni dopo la fecondazione (dpf), anestetizzare le larve aggiungendo 2 ml di 0,4% di amminobenzoico-acido-etilmetil-estere a 50 ml di acqua di impianto di pesce in una capsula di Petri da 90 mm. Utilizzare animali allevati con feniltiourea (PTU) (vedi Tabella del materiale) per prevenire la pigmentazione della pelle se si tratta di un problema, che non è il caso di lesioni del midollo spinale su 3 larve dpf descritte in questo protocollo.
NOTA: Questa concentrazione di anestetico relativamente elevata viene utilizzata per prevenire i movimenti delle larve dopo l'impatto laser. - Esaminare gli embrioni per l'espressione di reporter fluorescente (fascicolo supplementare 1).
NOTA: Un reporter fluorescente per il midollo spinale (o altra struttura di interesse) è spesso richiesto per valutare l'efficienza della lesione. L'uso di tg(Xla.Tubb:DsRed) aiuta a identificare il midollo spinale. - Trasferire le larve selezionate in una piastra a 96 pozzetti per l'uso nel sistema VAST (vedi Tabella dei materiali) con 300 μL di acqua di impianto per pesci per pozzetto. Utilizzare direttamente il mezzo contenente l'anestetico della capsula di Petri da 90 mm. Assicurati di avere solo una larva per pozzo. Preparare una piastra vuota extra da 96 pozzetti per raccogliere le larve lesionate.
NOTA: Se si utilizza un altro sistema di lesioni laser, montare le larve in gel di agarosio a basso punto di fusione (LMP) all'1% in una camera di osservazione appropriata.
2. Preparazione del microscopio
- Accendere tutti i componenti del sistema (VAST, microscopio, laser, PC), compreso il laser per l'ablazione.
- Una volta che l'hardware è completamente inizializzato, avviare il software del microscopio, ImageJ / Fiji, un ambiente di sviluppo integrato python (IDE) e il software di imaging zebrafish automatizzato (sistema VAST) se si utilizza questa piattaforma (vedere Tabella dei materiali).
- Configurare il software VAST seguendo i passaggi seguenti.
- All'avvio del software VAST, scegliere Piastra nella prima finestra e fare clic sul pulsante Fine (Figura 2A). Un'altra piccola finestra apparirà chiedendo se il capillare è vuoto e pulito. Verificare guardando l'immagine del capillare se ci sono bolle d'aria all'interno. In caso contrario, fare clic su Sì. Se ci sono bolle, fare clic su No e seguire i passaggi 2.3.2-2.3.3 (Figura 2B).
- Nella finestra Campionatore di particelle grandi (LP), fare clic su Prime per rimuovere le bolle d'aria (Figura 2C).
- Vai alla finestra principale del software (con l'immagine capillare) e fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine. Selezionare Registra immagine capillare vuota nel menu a comparsa (Figura 2B).
- Nella finestra LP Sampler , vai al menu File e seleziona l'opzione Apri script . Scegli un file contenente lo script corrispondente all'esperimento da eseguire.
- Nella finestra principale del software VAST, vai su File e scegli Apri esperimento. Scegliere il file dell'esperimento corrispondente all'esperimento pianificato.
NOTA: assicurarsi che le caselle Scarico automatico e Uscita in blocco per rifiuti NON siano selezionate.
- Impostare il software del microscopio per l'imaging.
- Avviare il software di imaging del microscopio (vedere Tabella dei materiali) per inizializzare l'hardware. Questa operazione potrebbe richiedere alcuni minuti, a seconda del sistema.
- Vai alle impostazioni di acquisizione e imposta il microscopio per l'imaging del fluoroforo espresso nelle larve. Utilizzare un obiettivo a immersione in acqua NA 0,5 10x per garantire che il volume focale sia abbastanza allungato lungo l'asse ottico da lesionare l'intera profondità del midollo spinale o del tessuto bersaglio.
- Impostare ImageJ/Fiji per le lesioni laser.
- Vai al menu File , scegli Nuovo/Script per aprire la finestra dello script.
- Nella finestra Nuovo , vai al menu File e scegli Apri per caricare lo script della lesione laser (Manual_MP_Operation.ijm).
- Configurare l'IDE Python.
- Avviare l'IDE Python.
- Vai al menu File e scegli Apri file per caricare lo script per gestire il laser (Watch_for_ROIs_py3.py).
- Vai al menu Esegui e scegli Esegui senza debug per eseguire lo script. Verificare che venga visualizzata una sequenza di messaggi nel pannello TERMINALE insieme a un po' di rumore durante l'inizializzazione dell'attenuatore laser (Figura 2D).
3. Esecuzione di lesioni laser sul sistema VAST
- Centrare il capillare rispetto all'obiettivo del microscopio spostando il palco facendo clic sui pulsanti freccia nella finestra principale del software VAST (Figura 2B).
- Concentrati sulla parte superiore del capillare guardando attraverso gli oculari e usando la luce trasmessa dal microscopio.
ATTENZIONE: Il capillare è molto fragile e può rompersi se toccato dall'obiettivo. Spostare lentamente la manopola del microscopio quando si mette a fuoco dentro e fuori. - Posizionare le piastre a 96 pozzetti sul portatarga del campionatore LP del sistema VAST. Posizionare il piatto contenente larve sul supporto sinistro e il piatto per la raccolta a destra. Assicurarsi che le piastre siano orientate correttamente: il pozzetto A1 deve trovarsi nell'angolo anteriore sinistro del supporto.
- Nel software VAST, nella finestra LP Sampler, fare clic sul pulsante Modello di piastra e selezionare tutti i pozzetti contenenti larve. Fare clic sul pulsante OK per convalidare e chiudere la finestra (Figura 2C).
- Nella finestra LP Sampler, fai clic sul pulsante Esegui piastra per iniziare a caricare una larva.
NOTA: Dopo un po 'di tempo, la larva dovrebbe essere visibile nel capillare in posizione (predefinita nel file di definizione dell'esperimento), consentendo di ferire il midollo spinale. La luce del vassoio VAST si spegnerà dopo alcune rotazioni per impostare la larva con il lato laterale rivolto verso l'obiettivo del microscopio. - Vai al software del microscopio e fai clic sul pulsante Live per visualizzare la larva.
- Ruotare la manopola di messa a fuoco del microscopio fino a quando il canale centrale del midollo spinale è visibile.
NOTA: può essere più facile mettere a fuoco prima la luce trasmessa e poi perfezionarla con la fluorescenza. - Scatta un'istantanea in fluorescenza e salva l'immagine in una cartella dedicata.
- Aprire l'immagine in ImageJ e regolare il contrasto se necessario (utilizzando il menu Immagine/Regolazione/Luminosità/contrasto... in ImageJ).
- Fare clic sullo strumento linea Regione di interesse (ROI) e disegnare una linea corta (20 μm) centrata sul midollo spinale (Figura 3A).
- Impostare il microscopio nella posizione dello specchio riflettente al 100%.
- Caricare lo script ImageJ e fare clic sul pulsante Esegui . Utilizzare i seguenti parametri: Ripetizione - 2; Campione - 1; Larghezza - 40 micron; Attenuazione - 89 (potenza laser completa) (Figura 3C).
- Al termine della sequenza di riprese laser, passare all'imaging a fluorescenza sul software di imaging e, se necessario, regolare la messa a fuoco.
NOTA: si osserva spesso uno spostamento della messa a fuoco a causa dello spostamento della coda durante l'esposizione laser. - Scatta una nuova istantanea e salvala.
- Apri questa nuova immagine in ImageJ e disegna una nuova linea che dovrebbe essere più grande del midollo spinale stesso (~ 80 μm), iniziando sotto il lato ventrale del midollo spinale nella parte superiore della notocorda e andando verso il lato dorsale per terminare nello spazio tra il midollo spinale e la pelle (Figura 3B).
- Impostare il microscopio nella posizione dello specchio riflettente al 100%.
- Vai alla finestra dello script ImageJ e fai clic sul pulsante Esegui . Utilizzare i seguenti parametri: Ripetizione - 2; Campione - 1; Larghezza - 40 micron; Attenuazione - 89 (potenza laser completa).
- Al termine della sequenza di riprese laser (più lunghe), verificare la qualità della trasezione mediante fluorescenza e messa a fuoco dell'immagine. Assicurarsi che nessuna cellula o assone rimanga intatto nel sito della lesione, che dovrebbe apparire come un'area fluorescente scura o come un'area fluorescente debole e omogenea (Figura 3D, pannello inferiore).
- Raccogli le larve lesionate nella piastra vuota a 96 pozzetti (con le stesse coordinate del pozzo originale) andando alla finestra principale del software VAST e facendo clic sul pulsante Raccogli .
- Riaccendi la spia del sistema VAST facendo clic sulla casella di controllo Luce vassoio in basso a sinistra della finestra.
- Ripeti i passaggi 3.3-3.17 per ogni nuova larva da ferire.
4. Gestione post-lesione ed esperimenti aggiuntivi
- Estrarre le larve dal piatto a 96 pozzetti il prima possibile e trasferirle in una capsula di Petri pulita con acqua fresca per le larve per recuperare la post-lesione. Mettere la capsula di Petri in un'incubatrice a 28 °C.
NOTA: Il danno spesso continua a propagarsi nella prima ora dopo la lesione. L'effettiva estensione della lesione deve quindi essere valutata mediante imaging a fluorescenza dopo un ritardo di circa 1 ora.
5. Risoluzione dei problemi
- Se le bolle d'aria sono presenti nei tubi e nei capillari del sistema VAST, fare clic sul pulsante Prime nella finestra LP Sampler per rimuoverle.
- Considerare le lesioni non riuscite (valutate dalla fluorescenza rimanente nel sito della lesione, a parte il residuo atteso e lo sfondo omogeneo), che possono essere dovute a diversi motivi menzionati di seguito.
- Bassa potenza laser: quando ciò accade, prova con un valore più alto.
NOTA: Il sistema VAST è dotato di un laser colorante. Ciò implica che la concentrazione della soluzione colorante utilizzata per la generazione di luce laser può cambiare nel tempo, portando a una diminuzione della potenza del laser. La sostituzione con una nuova soluzione di solito risolve il problema22. - Calibrazione scadente: quando ciò accade, verificare la calibrazione e la potenza del sistema laser come da passaggio 5.2.2.1-5.2.2.4. Se non calibrato correttamente, il laser non sarà diretto verso la posizione desiderata, portando così a lesioni infruttuose o danni indesiderati nei tessuti adiacenti.
- Posizionare una diapositiva a specchio sopra la camera capillare. Concentrati sul lato rivestito (dovrebbe essere rivolto verso l'obiettivo). Utilizzare un valore predefinito precedente nella diapositiva per mettere a fuoco più facilmente.
- Applicare un modello di ablazione laser utilizzando uno script di calibrazione.
- Valutare la qualità del modello. Le macchie o le linee dovrebbero apparire nitide e non sfocate.
- Utilizzare una rampa con potenza crescente per valutare se la potenza del laser è cambiata rispetto alle sessioni precedenti.
- Movimento larvale durante le lesioni: le larve rispondono in modo diverso all'anestesia; pertanto, la lesione laser può innescare movimenti della coda durante il processo, impedendo così una trasezione di successo. Quando ciò accade, eseguire un'ulteriore iterazione delle fasi della lesione laser per completarla evitando comunque danni ai tessuti circostanti.
- Cattiva messa a fuoco: quando ciò si verifica, concentrati sul centro del canale centrale per ottenere i migliori risultati.
- Disegno, posizione e dimensione del ROI: la posizione e le dimensioni del ROI sono fondamentali per il successo delle transezioni. Il ROI dovrebbe essere maggiore del midollo spinale e centrato sul centro del midollo spinale. Per risolvere questo problema, inizia a disegnare il ROI dal lato ventrale del midollo spinale e sali verso il lato dorsale per ottenere una trasezione di successo. Ciò è probabilmente dovuto ai movimenti della coda innescati dalla sequenza di colpi laser durante la procedura di ablazione.
- Bassa potenza laser: quando ciò accade, prova con un valore più alto.
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Representative Results
Validazione della transezione del midollo spinale
Sono state eseguite indagini strutturali e funzionali per valutare se il protocollo consente una completa traslazione del midollo spinale.
In primo luogo, per verificare che la perdita di fluorescenza nel sito della lesione fosse dovuta al danno del tessuto neuronale e non alla fotosbiancamento a fluorescenza dall'illuminazione laser, è stata eseguita l'immunocolorazione utilizzando un anticorpo contro la tubulina acetilata (vedere Tabella dei materiali e File supplementare 1). È stata osservata una completa interruzione degli assoni tra i lati caudale e rostrale della lesione, confermando la completa trasezione del midollo spinale (Figura 4B). Una trasduzione del midollo spinale riuscita non deve lasciare alcuna proiezione neuronale residua attraverso il sito della lesione (vedere la Figura 4C per un esempio di lesione non riuscita). Utilizzando questa tecnica, il tasso di successo delle lesioni laser del midollo spinale è stato stimato al 75% (quattro transezioni incomplete in 16 animali).
La perdita di funzionalità dopo la lesione laser è stata studiata utilizzando l'imaging del calcio. Sui pesci intatti, l'attività spontanea della rete neuronale coordinata genera picchi di fluorescenza lungo l'intero midollo spinale. Una traslazione riuscita interromperebbe la propagazione di questa attività tra i due lati della lesione. Per controllare la qualità della transezione del midollo spinale, sono state eseguite lesioni laser su larve tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) a 3 dpf. Dopo la raccolta in una nuova piastra multi-pozzo, le larve sono state leggermente anestetizzate. Sono stati montati su un coperchio di vetro in agarosio a basso punto di fusione per eseguire registrazioni time-lapse a fluorescenza su un microscopio confocale da 3 ore dopo l'infortunio. È stata osservata una perdita di attività sul lato caudale del sito della lesione. In effetti, la quantificazione della fluorescenza mostra che i picchi dovuti all'attività spontanea del pesce erano presenti solo sul lato rostrale dopo la lesione, ma si sono verificati in modo coordinato nelle posizioni rostrali e caudali equivalenti nei pesci intatti (Figura 4D, E). Il basso segnale residuo sul lato caudale dopo la lesione era probabilmente dovuto all'attività dei neuroni sensoriali (probabilmente i neuroni sensoriali Rohon-Beard sul lato caudale del midollo spinale23) in reazione al movimento della coda indotto dalla contrazione muscolare sul lato rostrale.
Processi di rigenerazione indotti da lesioni laser
Dopo 24 ore dopo l'infortunio (hpi), la ferita ha iniziato a chiudersi, portando a un parziale ripristino della struttura iniziale del midollo spinale dopo 48 ore (Figura 5D). Utilizzando l'imaging del calcio, è stata confermata una riconnessione funzionale parziale (Figura 5E, F) dopo 48 hpi. Il calcolo del rapporto (denominato Connectivity Restoration Index dagli autori) tra l'ampiezza dei picchi nell'area caudale e l'area rostrale (Figura 5G), ha mostrato un aumento tra 3, 24 e 48 hpi, come previsto durante la rigenerazione del midollo spinale.
Le lesioni laser innescano una risposta immunitaria
Il reclutamento di macrofagi (cellule mpeg1:GFP +) è stato osservato dopo lesioni laser utilizzando lesioni laser di larve tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) (Figura 5H,I). Ciò è coerente con precedenti studi degli autori che utilizzano lesioni manuali che dimostrano il ruolo essenziale dei macrofagi per una rigenerazione efficace del midollo spinale nelle larve di zebrafish6,24. Questa osservazione indica che le reazioni immunitarie possono essere studiate dopo una lesione laser e conferma che si è verificato un danno tissutale.
Le lesioni laser e le lesioni manuali innescano un aumento della neurogenesi nel midollo spinale
Studi precedenti hanno utilizzato lesioni manuali per studiare la neurogenesi che si verifica a seguito di una lesione del midollo spinale6,15. Le lesioni laser potrebbero essere uno strumento prezioso per studiare questo fenomeno. Un esperimento pubblicato in precedenza ha mostrato un aumento della neurogenesi a seguito di una lesione manuale del midollo spinale rispetto ai controlli non menzionati15. Qui i pesci tg (mnx1: gfp) sono stati usati come motoneuroni e sono stati etichettati in modo fluorescente. La colorazione anticorpale anti-GFP è stata utilizzata per migliorare la visibilità della GFP nelle larve. Questo è stato combinato con la colorazione EdU25 (vedi File supplementare 1), che etichetta i neuroni appena generati. EdU è stato aggiunto immediatamente dopo una lesione a 3 dpf, il che significa che tutte le cellule etichettate con EdU sono state generate dopo la lesione. Pertanto, le cellule che mostrano colorazione colocalizzata rappresentano nuovi motoneuroni che nascono dopo una lesione del midollo spinale. Il numero di cellule colocalizzate su entrambi i lati del sito della lesione, o in un'area corrispondente alla posizione e alle dimensioni del sito della lesione in controlli non selezionati (catturati in due finestre da 50 μm) sono stati contati e la differenza nel numero medio di cellule colocalizzate è stata analizzata utilizzando un ANOVA26 unidirezionale.
Questo protocollo è stato utilizzato su larve lesioni manuali e laser per confrontare gli effetti di ciascun metodo di lesione sulla neurogenesi (Figura 6). Non è stata osservata alcuna differenza nel numero di cellule marcate tra lesioni manuali e laser. I pesci non menzionati hanno mostrato meno cellule a doppia marcatura rispetto ai pesci lesionati in entrambe le condizioni di lesione (Figura 6D). Ciò è coerente con i risultati precedenti che mostrano un aumento della neurogenesi nei pesci lesionati manualmente rispetto ai pesci non menzionati15.
Questi risultati supportano i risultati dell'imaging del calcio e della colorazione della tubulina acetilata, poiché la lesione laser provoca una risposta di rigenerazione paragonabile a una lesione manuale. Ciò indica che la lesione laser non sta semplicemente sbiancando la fluorescenza nelle cellule, ma provoca una lesione che innesca le stesse risposte cellulari di una lesione manuale.
Le lesioni laser provocano meno danni alla pelle e ai muscoli rispetto alle lesioni manuali
Le lesioni manuali spesso provocano grandi quantità di danni muscolari e cutanei. Al contrario, le lesioni laser possono essere mirate più specificamente al midollo spinale, riducendo il danno ad altri tessuti. Per illustrare questo, le larve di Tg (beta-actina: utrofina-mCh) sono state utilizzate per eseguire lesioni manuali e laser. Questa linea etichetta in modo fluorescente una proteina legante la F-actina, consentendo la visualizzazione delle cellule del midollo spinale e delle fibre muscolari. Le larve sono state poi montate e fotografate dal vivo (Figura 7A,B). La Figura 7A mostra il danno al midollo spinale. La mancanza di utrofina nel sito della lesione sia in condizioni di lesione laser che manuale suggerisce che entrambi i metodi di lesione hanno danneggiato le cellule del midollo spinale. La Figura 7B mostra il danno muscolare. C'è una chiara struttura chevron-like ai miotomi nella condizione non accennata, e fasci di fibre di actina sono visibili. C'è un'interruzione visibile della forma del miotomo nella condizione di lesione manuale e sono presenti meno fibre di actina. Ciò dimostra un danno muscolare significativo. Tuttavia, nella condizione di lesione laser, viene mantenuta la struttura chevron del miotomo. C'è qualche danno alle fibre muscolari, ma questo è contenuto all'interno di uno o due miotomi rispetto a quattro nella condizione di lesione manuale. Inoltre, vi è un danno cutaneo minore nella condizione di lesione laser rispetto alla condizione di lesione manuale, come mostrato nelle immagini scattate su uno stereomicroscopio nella Figura 7C.
Complessivamente, questi risultati dimostrano che le lesioni laser riproducibili e semi-automatizzate hanno il potenziale per essere un potente strumento per studiare la rigenerazione neurale nel pesce zebra.
Figura 1: Schema del flusso di lavoro semiautomatico delle lesioni laser. Tre giorni dopo la fecondazione (dpf), le larve vengono caricate in una piastra a 96 pozzetti e posizionate sulla piattaforma automatizzata di movimentazione delle larve. Quindi, ogni larva viene caricata in un capillare posto sotto una lente NA 0,5 10x su un microscopio verticale per l'imaging e la lesione laser. Dopo le lesioni, le larve vengono scaricate in una nuova piastra a 96 pozzetti per la raccolta e ulteriori esperimenti. Nella parte superiore, immagini trasmesse e in fluorescenza di tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 larve dpf prima e dopo la lesione laser (barra di scala = 50 μm). Le larve sono orientate rostrale sinistra e dorsale verso l'alto (per tutte le figure). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Avvio del software per il sistema di imaging semiautomatico delle larve di zebrafish e il sistema di controllo laser. (A) Software VAST all'avvio. (B) La finestra principale del software VAST mostra il capillare vuoto. (C) Finestra del campionatore LP con un modello di piastra vuota. (D) La visualizzazione dell'IDE python con lo script Watch_for_ROIs_py3.py in esecuzione. Il rettangolo arancione indica la scheda del terminale con i messaggi visualizzati durante l'inizializzazione dell'attenuatore laser. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempio di sequenza di lesioni laser su larve tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf. (A) Il primo passo della lesione laser utilizzando una linea di 20 μm dopo aver selezionato lo strumento ROI della linea dalla barra degli strumenti ImageJ. (B) Seconda fase con una linea di 80 μm per la completa traslazione del midollo spinale. (C) Vista dello script utilizzato per controllare il laser da ImageJ. (D) La sequenza di immagini durante le lesioni laser. Top: prima della lesione; Al centro: subito dopo il primo passo; In basso: subito dopo il secondo passaggio (barra della scala = 50 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'immunocolorazione acetilata della tubulina (A-C) e l'imaging del calcio (D,E) indicano che la lesione laser interrompe completamente la continuità del tessuto spinale. (A) Midollo spinale intatto. (B) Trasezione completa della colonna vertebrale che mostra una completa interruzione del tessuto del midollo spinale lungo entrambi gli assi dorsale-ventrale e mediale-laterale. (C) Trasezione incompleta. (barra della scala = 50 μm). (D) Midollo spinale transetto su una larva tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) 3 dpf. I rettangoli mostrano i ROI utilizzati per quantificare l'intensità della fluorescenza nei lati rostrale (blu) e caudale (arancione) della lesione. (E) Grafico delle variazioni di intensità della fluorescenza nel tempo nei ROI dell'analisi rostrale e caudale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: La lesione laser provoca una risposta immunitaria e porta a un recupero anatomico e funzionale di successo. (A-D) Le immagini di fluorescenza di proiezione di massima intensità di una larva tg(Xla.Tubb:DsRed) 3dpf prima (A) e in momenti diversi dopo la lesione laser: dopo 3 h (B), dopo 24 h (C) e dopo 48 h (D). (E-G) L'uso dell'imaging del calcio per valutare il ripristino della funzione. (E) Larva di tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) lesionata con ROI di analisi. (F) Grafico delle variazioni di intensità della fluorescenza nel tempo nei ROI dell'analisi rostrale e caudale. (G) Quantificazione del rapporto tra ampiezze del picco caudale e rostrale (Connectivity Restoration Index) a 3, 24, 48 h post-lesione (N = 3). (H-I) Caratterizzazione della risposta immunitaria dopo lesione. (H) Immagini di fluorescenza di larve non menzionate (a sinistra) e lesionate (a destra) tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 dfp che mostrano l'accumulo di macrofagi (cellula mpeg1+, verde) a 6 hpi. (I) Quantificazione del numero di macrofagi a 6 ore post-lesione in larve ferite e intatte (N = 3) (barre di scala = 50 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: La generazione di motoneuroni indotta da lesioni è paragonabile tra laser e lesione manuale. (A-C) Immagini dal microscopio ApoTome di larve tg(mnx1:gfp) 5 dpf con colorazione EdU, in condizioni di lesione laser (A), lesione manuale (B) e non femminile (C). Le punte di freccia denotano celle con doppia etichetta per entrambi i marcatori. Barra della scala = 100 μm. (A'-C') Ingrandimento più elevato delle celle a doppia etichetta indicate da caselle bianche. (D) Quantificazione del conteggio cellulare per il numero di cellule colocalizzate in ciascuna larva. Finestre da 50 μm sono state posizionate su entrambi i lati del sito della lesione e le cellule colocalizzate sono state contate in tutte le immagini Z-stack. ANOVA unidirezionale è stato eseguito con il test post-hoc di Tukey27. Nessuna differenza significativa tra lesioni laser e manuali (p = 0,909). Significativamente meno cellule mnx1:gfp+/EdU+ nei controlli non menzionati rispetto alla lesione laser (variazione di 2,4 volte, p = 0,011) e alla lesione manuale (2,3 volte il cambiamento, p = 0,018). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: La lesione laser induce meno danni muscolari e cutanei rispetto alla lesione manuale. (A-B) Immagini singole Z-stack di tg(beta-actina:utrofina-mCherry) 3 larve dpf nelle condizioni di lesione manuale e lesione laser non accennate, prese al microscopio confocale con ingrandimento 20x. Le frecce bianche denotano il sito della lesione. Barra della scala = 50 μm. (A) indica le pile Z in cui sono visibili il midollo spinale e la notocorda. SC etichetta il midollo spinale e NC etichetta la notocorda. (B) denota Z-stack in cui sono visibili le fibre muscolari. (C) Le immagini sono state scattate allo stereomicroscopio di 3 larve dpf nelle condizioni di lesione manuale e laser non accennate. Le larve sono state appuntate su una piattaforma usando perni di filo di tungsteno (visibili nell'immagine della lesione laser). La scatola nera indica il sito della lesione. Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: I dettagli sperimentali del protocollo. Vengono descritte la generazione delle linee transgeniche di zebrafish, le lesioni manuali del midollo spinale, l'immunoistochimica acetilata-tubulina, la colorazione Hb9 / EdU, l'imaging e l'elaborazione e l'analisi delle immagini. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
C'è un urgente bisogno di una comprensione più profonda dei processi in gioco durante la rigenerazione nel pesce zebra. Questo modello animale offre molti vantaggi per la ricerca biomedica, in particolare per le lesioni del midollo spinale1. La maggior parte degli studi riguarda lesioni manuali che richiedono un operatore ben addestrato e inducono danni multi-tessuto. Qui viene presentato un protocollo di lesione laser, che consente il controllo delle caratteristiche della lesione e la riduzione dei danni ai tessuti circostanti. Inoltre, questa tecnica è abbastanza facile da essere utilizzata con successo da sperimentatori relativamente poco addestrati.
I passaggi critici nel protocollo sono la calibrazione del laser e la definizione dei ROI. In pratica, la calibrazione è molto stabile (anche per mesi), e una volta determinata la giusta dimensione e posizione del ROI, l'uso di questa tecnica è semplice. Sebbene il protocollo descrivesse come eseguire le lesioni su apparecchiature specifiche, la maggior parte dei vantaggi delle lesioni laser sono disponibili per diversi sistemi, come un microscopio a disco rotante.
I principali limiti di questo protocollo sono la necessità di utilizzare un reporter di fluorescenza del midollo spinale e il tempo necessario per eseguire le lesioni (~ 5 min / pesce). Quest'ultimo è compensato da un'elevata riproducibilità che richiede meno animali. Tuttavia, le lesioni manuali sono ancora praticabili per applicazioni come i test antidroga, dove sono necessari molti animali lesionati. Come mostrato qui, l'estensione della neurogenesi indotta da lesioni è paragonabile tra lesioni laser e manuali.
Tuttavia, la lesione laser ha enormi potenziali applicazioni, alcune delle quali legate ai vantaggi unici offerti. Ad esempio, un capillare rotante consente di eseguire lesioni in una grande varietà di posizioni in modo controllato. Ad esempio, potrebbe essere usato per indurre l'assotomia di un singolo neurone nelle cellule di Mauthner (dati non mostrati), come è stato dimostrato anche nel lavoro di Bhatt et al.15. Ciò non sarebbe possibile utilizzando lesioni manuali.
I risultati dimostrano anche che il danno è contenuto principalmente nel midollo spinale, con danni minimi ai tessuti circostanti. Ciò potrebbe significare che le risposte cellulari osservate a seguito di una lesione laser hanno maggiori probabilità di essere attribuite al midollo spinale in particolare piuttosto che alla segnalazione da altri tessuti danneggiati. Potrebbe anche significare che le larve sionate dal laser sono più in grado di resistere a ulteriori preparativi per gli esperimenti. Ad esempio, la dissezione per l'elettrofisiologia comporta la rimozione della pelle del tronco utilizzando una pinza28,29,30, che comporterebbe un'elevata pressione meccanica posta sul sito di lesione già delicato e rischierebbe che eventuali connessioni assonali vengano nuovamente rotte. L'integrità della pelle e del tessuto muscolare osservata nelle larve lesioni laser potrebbe proteggere il sito della lesione da ulteriori danni e risultare in una rappresentazione più accurata del livello di rigenerazione raggiunto.
Inoltre, la migliore localizzazione del danno dopo la lesione laser limita l'estensione dell'accoppiamento tra diversi processi di rigenerazione, che possono mascherare processi più sottili quando si utilizzano lesioni manuali. L'approccio al danno sperimentale nel pesce zebra larvale qui descritto può aprire una serie di nuove indagini nel contesto della biologia quantitativa, della fisica biologica e della biologia computazionale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dal BBSRC (BB/S0001778/1). CR è finanziato dal Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Ringraziamo David Greenald (CRH, Università di Edimburgo) e Katy Reid (CDBS, Università di Edimburgo) per il gentile dono del pesce transgenico (Vedi file supplementare). Ringraziamo Daniel Soong (CRH, Università di Edimburgo) per il gentile accesso alla confocale a disco rotante 3i.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
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Medicina Numero 177Erratum
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022.
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Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
