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Summary
본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.
Abstract
Zebrafish 유충은 수정 후 며칠 만에 높은 재생 능력을 가진 완전히 기능적인 중추 신경계 (CNS)를 가지고 있습니다. 이것은이 동물 모델을 척수 손상 및 재생을 연구하는 데 매우 유용합니다. 이러한 병변을 유도하기 위한 표준 프로토콜은 트렁크의 등쪽 부분을 수동으로 횡단하는 것이다. 그러나이 기술은 광범위한 훈련이 필요하며 추가 조직을 손상시킵니다. 레이저로 인한 병변이 이러한 한계를 우회하기 위해 프로토콜이 개발되어 훈련받지 않은 작업자에게도 많은 동물과 다른 세션 사이에 척수 횡단의 높은 재현성과 완전성을 허용했습니다. 또한, 조직 손상은 주로 척수 자체에 국한되어, 다른 조직, 예를 들어, 피부, 근육 및 CNS를 손상시키는 것으로부터 혼란스러운 효과를 감소시킨다. 또한, 척수의 헤미 병변이 가능합니다. 레이저 손상 후 조직 무결성의 향상된 보존은 전기 생리학과 같은 추가 분석에 필요한 추가 해부를 용이하게합니다. 따라서이 방법은 수동으로 달성 할 수없는 부상 정도를 정확하게 제어 할 수 있습니다. 이것은 미래에이 강력한 모델에서 새로운 실험 패러다임을 허용합니다.
Introduction
포유류와는 달리, 제브라피쉬(Danio rerio)는 부상 후 중추신경계(CNS)를 회복시킬 수 있습니다1. 척수 재생을위한 모델로 제브라 피쉬 유충을 사용하는 것은 비교적 최근입니다. 수리의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 것이 가치가 있음이 입증되었습니다2. 이것은 조작의 용이성, 짧은 실험주기 (매주 새로운 애벌레), 조직의 광학 투명성 및 유충의 작은 크기 때문에 생체 내 형광 현미경 검사에 이상적입니다.
척수 재생의 경우, 애벌레 사용의 두 가지 추가 이점은 회복 속도, 성인의 경우 몇 주에 비해 며칠, 수동 기술을 사용하여 부상을 유발할 수 있다는 것입니다. 이것은 최근의 조사6,7을 포함하여 많은 연구3,4,5에서 성공적으로 사용되었습니다. 전반적으로 이로 인해 의미 있는 데이터 생산이 증가하고 실험 프로토콜의 적응성이 높으며 실험 비용이 절감됩니다. 수정 후 5 일 미만의 유충을 사용하면 동물 연구에서 3R 원칙에 따라 동물의 사용이 줄어 듭니다.8.
제브라피쉬 유충의 척수 손상 후, 염증 반응, 세포 증식, 신경 발생, 생존 또는 새로 생성 된 세포의 이동, 기능성 축삭의 개혁, 신경 과정 회로 및 척추 조직의 글로벌 리모델링을 포함한 많은 생물학적 과정이 발생합니다6,7,9,10 . 성공적으로 조율되기 위해, 이러한 과정은 다양한 세포 유형, 세포외 매트릭스 성분 및 생화학적 신호들 사이의 미세하게 조절된 상호작용을 수반한다11,12. 척수와 같은 복잡한 조직의 이러한 중요한 재구성에 대한 세부 사항을 풀기 위해서는 정밀하고 통제 된 실험 접근법의 사용과 개발이 필요합니다.
제브라피쉬에서 척수 재생을 연구하는 데 사용되는 주요 실험 패러다임은 절제술, 찌르기 또는 냉동 손상에 의한 조직 손상을 유도하기 위해 외과 적 수단을 사용하는 것입니다3,13. 이러한 접근법은 미세 수술 기술에 대한 특정 교육이 필요하다는 단점이 있으며, 이는 새로운 운영자에게 시간이 많이 걸리고 단기 프로젝트에서 사용하지 못할 수 있습니다. 또한, 그들은 일반적으로 재생에 영향을 줄 수있는 주변 조직의 손상을 유도합니다.
또 다른 접근법은 화학적으로14 또는 유전자 조작에 의해 세포 손상을 유도하는 것이다15. 후자는 고도로 표적화 된 피해를 허용합니다. 그러나 이러한 기술은 실험을 수행하기 전에 새로운 트랜스제닉 물고기를 생성하기 위해 오랜 준비 작업이 필요하며 고유 한 세포 유형이 타겟팅 될 때마다 갱신됩니다.
따라서, 재생에 있어서의 다양한 연구에 적합한 표적화되지만 다재다능한 병변을 허용하는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 해결책은 레이저를 사용하여 관심있는 조직에서 국소 손상을 유도하는 것입니다.16,17,18,19,20. 실제로, 레이저-유도된 조직 손상의 사용은 많은 이점을 갖는 척수 병변을 생성하기 위한 강력한 접근법을 제시한다. 이러한 레이저 조작 모듈이 장착 된 현미경을 사용하면 세포 절제가 발생할 맞춤형 모양의 영역을 지정할 수 있으며 시간적 제어의 추가 이점이 있습니다. 따라서 병변의 크기와 위치는 모든 질문을 해결하기 위해 적응 될 수 있습니다.
대부분의 레이저 병변 시스템의 누락 된 특징은 일련의 유충에 대해 재현성이 높은 방식으로 부상을 유발할 수있는 가능성입니다. 여기서 원래의 프로토콜은 UV 레이저를 사용하여 자동화 된 유충 취급을 위해 설계된 미세 유체 플랫폼을 기반으로 제브라 피쉬 유충에서 반자동화된 정밀하고 통제 된 병변을 유도하기 위해 설명됩니다21. 또한, 여기에 제시된 시스템에서 유충은 유리 모세관에 삽입되어 로스트로 코달 축 주위의 동물의 자유로운 회전을 허용합니다. 사용자는 유충의 어느 쪽이 레이저에 제시할지 선택할 수 있으며 형광 이미징이 레이저 빔을 정확하게 타겟팅하고 병변 후 손상을 평가할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 UV 레이저 (이하 VAST 시스템으로 지정됨)가 장착 된 회전 디스크와 결합 된 반자동 제브라 피쉬 유충 이미징 시스템과 함께 사용됩니다. 그러나, 프로토콜의 주요 요점 및 기술의 대부분의 청구항은 이광자 레이저 스캐닝 현미경, UV 레이저(FRAP 모듈)와 함께 제공되는 방사-디스크 현미경, 또는 사진 조작을 위한 레이저 모듈을 갖는 비디오 현미경을 포함하는 세포 절제가 가능한 레이저를 장착한 임의의 시스템에 유효하다. VAST 시스템과 기존 샘플 처리의 주요 차이점 중 하나는 후자의 경우 96 웰 플레이트에 적재하는 대신 유리 커버 슬립 / 유리 바닥 페트리 접시에 저융점 아가로스에 유충을 장착해야한다는 것입니다.
이 방법이 제공하는 이점은 재생 과정에서 세포 및 분자 메커니즘에 대한 혁신적인 연구를위한 기회를 열어줍니다. 또한 높은 데이터 품질로 인해 여러 분야의 맥락에서 정량적 조사가 가능합니다.
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Protocol
모든 동물 연구는 영국 내무부의 승인과 규정에 따라 프로젝트 라이센스 PP8160052에 따라 수행되었습니다. 이 프로젝트는 University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 실험 분석을 위해, 어느 성별의 5 일까지의 제브라 피쉬 유충을 다음과 같은 사용 가능한 트랜스제닉 라인으로 사용했습니다 : Tg (Xla.Tubb : DsRed; mpeg1 : GFP), Tg (Xla.Tubb : DsRed), Tg (betaactin : utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb : GCaMP6s) 및 Tg (mnx1 : gfp) (트랜스 제브라 피쉬 라인의 생성에 관한 보충 파일 1 참조). 자동화된 제브라피쉬 유충 처리 플랫폼을 이용한 프로토콜의 개략도가 도 1에 도시되어 있다. 이 작업에 사용 된 모든 사용자 정의 소프트웨어, 스크립트 및 자세한 실험 프로토콜은 https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ 에서 사용할 수 있습니다.
1. 시료 준비
- 수정 후 5 시간에, 올바른 발달 단계를 위해 배아를 정렬하십시오21. 죽은 알과 저조한 발달과 과잉 발달 된 배아를 버리십시오.
- 수정 후 3 일 (dpf)에, 90 mm 페트리 접시에 물고기 시설 물 50 mL에 0.4 % 아미노 벤조산 에틸 메틸 에스테르 2 mL를 첨가하여 유충을 마취시킵니다. 페닐티오우레아(PTU)로 기른 동물( 물자 표 참조)을 사용하여 문제가 되는 경우 피부 색소침착을 방지하며, 이는 이 프로토콜에 설명된 3dpf 유충의 척수 손상의 경우에는 해당되지 않습니다.
참고 :이 비교적 높은 마취 농도는 레이저 충격 후 유충의 움직임을 예방하는 데 사용됩니다. - 형광 리포터 발현을 위해 배아를 스크리닝한다 (보충 파일 1).
참고 : 척수 (또는 관심있는 다른 구조)에 대한 형광 리포터는 종종 부상의 효율성을 평가하기 위해 필요합니다. tg (Xla.Tubb : DsRed)의 사용은 척수를 식별하는 데 도움이됩니다. - 선택한 유충을 VAST 시스템 ( 재료 표 참조)에 사용하기 위해 96 웰 플레이트로 옮기고 우물 당 300 μL의 어류 시설 물을 사용하십시오. 90 mm 페트리 접시에서 마취제를 함유 한 배지를 직접 사용하십시오. 우물 당 하나의 유충 만 있어야합니다. 병변 유충을 수집하기 위해 여분의 빈 96 웰 플레이트를 준비하십시오.
참고 : 다른 레이저 병변 시스템을 사용하는 경우 유충을 적절한 관찰 챔버의 1 % 저융점 (LMP) 아가로스 겔에 장착하십시오.
2. 현미경 준비
- 절제용 레이저를 포함한 모든 시스템 구성 요소(VAST, 현미경, 레이저, PC)를 켭니다.
- 하드웨어가 완전히 초기화되면 현미경 소프트웨어, ImageJ / Fiji, 파이썬 통합 개발 환경 (IDE) 및 자동화 된 제브라 피쉬 이미징 (VAST 시스템) 소프트웨어를 시작하십시오 ( 재료 표 참조).
- 아래 단계에 따라 VAST 소프트웨어를 설정합니다.
- VAST 소프트웨어가 시작되면 첫 번째 창에서 플레이트 를 선택하고 완료 단추를 클릭합니다(그림 2A). 모세관이 비어 있고 깨끗한지 묻는 또 다른 작은 창이 나타납니다. 내부에 기포가 있는지 모세관 이미지를보고 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 예를 클릭하십시오. 거품이 있으면 아니요 를 클릭하고 2.3.2-2.3.3단계를 수행합니다(그림 2B).
- 대형 파티클(LP) 샘플러 창에서 프라임( Prime )을 클릭하여 기포를 제거합니다(그림 2C).
- 기본 소프트웨어 창 (모세관 이미지 포함)으로 이동하여 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오. 팝업 메뉴에서 빈 모세관 이미지 녹화 를 선택합니다(그림 2B).
- LP 샘플러 창에서 파일 메뉴로 이동하여 스크립트 열기 옵션을 선택합니다. 수행할 실험에 해당하는 스크립트가 포함된 파일을 선택합니다.
- 기본 VAST 소프트웨어 창에서 파일로 이동하여 실험 열기를 선택합니다. 계획된 실험에 해당하는 실험 파일을 선택합니다.
주: 상자 자동 언로드 및 폐기물에 대한 대량 출력이 선택되어 있지 않은지 확인하십시오.
- 이미징을 위해 현미경 소프트웨어를 설정합니다.
- 현미경 이미징 소프트웨어( 자료 표 참조)를 실행하여 하드웨어를 초기화합니다. 시스템에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 획득 설정으로 이동하여 유충에서 발현 된 형광단을 이미징하기위한 현미경을 설정하십시오. 10x NA0.5 침지 목표를 사용하여 초점 부피가 척수 또는 표적 조직의 전체 깊이를 병변시키기 위해 광축을 따라 충분히 길쭉하게 되도록 하십시오.
- 레이저 병변에 대한 ImageJ / 피지를 설정하십시오.
- 파일 메뉴로 이동하여 새로 만들기/스크립트를 선택하여 스크립트 창을 엽니다.
- 새 창에서 파일 메뉴로 이동하여 열기를 선택하여 레이저 병변 스크립트(Manual_MP_Operation.ijm)를 로드합니다.
- 파이썬 IDE를 설정합니다.
- 파이썬 IDE를 시작하십시오.
- 파일 메뉴로 이동하여 파일 열기를 선택하여 레이저를 관리하는 스크립트를 로드합니다(Watch_for_ROIs_py3.py).
- 실행 메뉴로 이동하여 디버깅 없이 실행 을 선택하여 스크립트를 실행합니다. 레이저 감쇠기가 초기화되는 동안 TERMINAL 패널의 메시지 시퀀스가 일부 노이즈와 함께 나타나는지 확인합니다(그림 2D).
3. VAST 시스템에서 레이저 병변 수행
- VAST 소프트웨어의 주 창에 있는 화살표 버튼을 클릭하여 스테이지를 이동하여 현미경 목표물에 대한 모세관을 중앙에 맞춥니다(그림 2B).
- 아이피스를 통해 보고 현미경의 투과된 빛을 사용하여 모세관의 상단에 초점을 맞춥니다.
주의: 모세관은 매우 약하며 목표에 닿으면 부서질 수 있습니다. 초점을 맞추고 초점을 맞출 때 현미경 손잡이를 천천히 움직입니다. - 96웰 플레이트를 VAST 시스템의 LP 샘플러의 플레이트 홀더에 놓습니다. 유충이 들어있는 접시를 왼쪽 홀더에 놓고 수집을위한 접시를 오른쪽에 놓습니다. 플레이트의 방향이 올바른지 확인하십시오: A1 웰은 홀더의 왼쪽 앞면 모서리에 있어야 합니다.
- VAST 소프트웨어의 LP 샘플러 창에서 플레이트 템플릿 버튼을 클릭하고 애벌레가 들어있는 모든 우물을 선택하십시오. 확인 단추를 클릭하여 창의 유효성을 검사하고 닫습니다(그림 2C).
- LP 샘플러 창에서 플레이트 실행 버튼을 클릭하여 애벌레 로딩을 시작하십시오.
참고 : 잠시 후, 유충은 위치 (실험 정의 파일에 미리 정의되어 있음)의 모세관에서 볼 수족을 손상시킬 수 있어야합니다. VAST 트레이 조명은 현미경 목표를 향한 측면 측면으로 유충을 설정하기 위해 몇 번의 회전 후에 꺼집니다. - 현미경 소프트웨어로 이동하여 라이브 버튼을 클릭하여 애벌레를 이미지화하십시오.
- 척수 중앙 운하가 보일 때까지 현미경 초점 손잡이를 돌립니다.
참고: 투과된 빛을 사용하여 먼저 초점을 맞춘 다음 형광으로 미세화하는 것이 더 쉬울 수 있습니다. - 형광에서 스냅 샷을 찍고 이미지를 전용 폴더에 저장하십시오.
- ImageJ에서 이미지를 열고 필요한 경우 대비를 조정합니다(ImageJ의 이미지/조정/밝기/대비... 메뉴 사용).
- 관심 영역(ROI) 선 도구를 클릭하고 척수 중앙에 짧은 선(20μm)을 그립니다(그림 3A).
- 현미경을 100% 반사 거울 위치로 전환합니다.
- ImageJ 스크립트를로드하고 실행 버튼을 클릭하십시오. 다음 매개 변수를 사용하십시오 : 반복 - 2; 샘플 - 1; 폭 - 40 미크론; 감쇠 - 89(전체 레이저 출력)(그림 3C).
- 레이저 샷 시퀀스가 완료되면 이미징 소프트웨어에서 형광 이미징으로 전환하고 필요한 경우 초점을 조정하십시오.
참고: 초점의 변화는 레이저 노출 중 꼬리 변위로 인해 종종 관찰됩니다. - 새 스냅숏을 만들어 저장합니다.
- ImageJ에서 이 새 이미지를 열고 척수 자체(~80μm)보다 커야 하는 새 선을 그립니다. 노토코드 위쪽에 있는 척수의 복부 쪽 아래에서 시작하여 등쪽을 향해 가면서 척수와 피부 사이의 공간에서 끝납니다(그림 3B).
- 현미경을 100% 반사 거울 위치로 전환합니다.
- ImageJ 스크립트 창으로 이동하여 실행 버튼을 클릭하십시오. 다음 매개 변수를 사용하십시오 : 반복 - 2; 샘플 - 1; 폭 - 40 미크론; 감쇠 - 89 (전체 레이저 출력).
- (더 긴) 레이저 샷 시퀀스가 완료된 후, 형광을 이미징하고 초점을 맞추어 트랜섹션 품질을 검증합니다. 병변 부위에 세포나 축삭돌기가 손상되지 않은 상태로 남아 있지 않은지 확인하십시오.이 부위는 어둡거나 희미하고 균질한 형광 영역으로 나타나야합니다 (그림 3D, 하단 패널).
- 병변 유충을 빈 96 웰 플레이트 (원래 우물과 동일한 우물 좌표가 있음)에 모아 메인 VAST 소프트웨어 창으로 이동하여 수집 버튼을 클릭하십시오.
- 창의 왼쪽 하단에 있는 트레이 표시등 확인란을 클릭하여 VAST 시스템 표시등을 다시 켭니다.
- 부상을 입을 각각의 새로운 유충에 대해 3.3-3.17 단계를 반복하십시오.
4. 병변 후 처리 및 추가 실험
- 가능한 한 빨리 96 웰 플레이트에서 유충을 꺼내어 신선한 생선 시설 물이 담긴 깨끗한 페트리 접시로 옮겨 유충이 병변 후 회복 할 수 있도록하십시오. 페트리 접시를 28°C의 인큐베이터에 넣는다.
참고: 손상은 종종 병변 후 첫 시간 동안 계속 전파됩니다. 따라서 병변의 실제 정도는 약 1 시간의 지연 후 형광 이미징에 의해 평가되어야한다.
5. 문제 해결
- VAST 시스템의 튜브와 모세관에 기포가 있으면 LP 샘플러 창에서 프라임 버튼을 클릭하여 제거하십시오.
- 실패한 병변 (예상되는 잔류 및 균질 배경과는 별개로 병변 부위의 나머지 형광으로부터 평가 된 바와 같이)을 고려하십시오.이 병변은 아래에 언급 된 몇 가지 이유로 인한 것일 수 있습니다.
- 낮은 레이저 출력 : 이런 일이 발생하면 더 높은 값으로 시도하십시오.
참고: VAST 시스템에는 염료 레이저가 장착되어 있습니다. 이것은 레이저 광 생성에 사용되는 염료 용액의 농도가 시간이 지남에 따라 변하여 레이저 전력의 감소로 이어질 수 있음을 의미합니다. 새로운 솔루션으로 대체하면 일반적으로 문제가 해결됩니다22. - 불량한 교정: 이 경우 5.2.2.1-5.2.2.4 단계에 따라 레이저 시스템의 교정 및 전력을 확인합니다. 올바르게 보정되지 않으면 레이저가 원하는 위치로 향하지 않아 인접한 조직에서 병변이 실패하거나 바람직하지 않은 손상이 발생합니다.
- 거울 슬라이드를 모세관 챔버 위에 놓습니다. 코팅 된면에 집중하십시오 (목표에 직면해야합니다). 슬라이드에서 이전 기본값을 사용하여 초점을 더 쉽게 맞출 수 있습니다.
- 교정 스크립트를 사용하여 레이저 절제 패턴을 적용합니다.
- 패턴의 품질을 평가합니다. 반점이나 선이 날카롭고 흐릿하지 않아야 합니다.
- 전력이 증가하는 램프를 사용하여 레이저 전력이 이전 세션과 비교하여 변경되었는지 여부를 평가합니다.
- 병변 중 애벌레 운동 : 유충은 마취에 다르게 반응합니다. 따라서, 레이저 병변은 과정 동안 꼬리의 움직임을 유발할 수 있으며, 따라서 성공적인 횡단을 예방할 수 있다. 이런 일이 발생하면 레이저 병변 단계를 추가로 반복하여 주변 조직의 손상을 피하면서 완료하십시오.
- 나쁜 초점 : 이것이 발생하면 최상의 결과를 얻기 위해 중앙 운하의 중앙에 집중하십시오.
- ROI 도면, 위치 및 크기: ROI의 위치와 크기는 성공적인 횡단을 위해 매우 중요합니다. ROI는 척수보다 커야하며 척수 중앙에 집중되어야합니다. 이 문제를 해결하려면 척수의 복부 쪽에서 ROI를 그리기 시작하고 등쪽쪽으로 올라가 성공적인 횡단을 얻으십시오. 이것은 절제 절차 중 레이저 샷의 시퀀스에 의해 유발 된 꼬리 움직임 때문일 수 있습니다.
- 낮은 레이저 출력 : 이런 일이 발생하면 더 높은 값으로 시도하십시오.
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Representative Results
척수 횡단 절제술의 유효성 검사
프로토콜이 완전한 척수 횡단을 허용하는지 여부를 평가하기 위해 구조적 및 기능적 조사가 수행되었다.
먼저, 병변 부위에서의 형광 손실이 레이저 조명으로부터 형광 광표백이 아닌 신경 조직 손상에 기인하였음을 확인하기 위해, 아세틸화된 튜불린에 대한 항체를 이용한 면역염색( 표 1 자료 및 보충 파일 1 참조)을 수행하였다. 병변의 인과측과 로스트랄 측면 사이의 축삭기의 완전한 파괴가 관찰되어 척수의 완전한 횡단을 확인했다(도 4B). 성공적인 척수 횡단 절제술은 병변 부위를 가로 질러 남아있는 신경 돌출부를 남겨 두어서는 안됩니다 (실패한 병변의 예는 그림 4C 참조). 이 기술을 사용하여 척수 레이저 병변의 성공률은 75 % (16 마리의 동물에서 4 개의 불완전한 횡단 절제술)로 추정되었습니다.
레이저 병변 후 기능성의 상실은 칼슘 이미징을 사용하여 조사되었다. 온전한 물고기에서, 자발적인 조정 된 신경 네트워크 활동은 전체 척수를 따라 형광 피크를 생성합니다. 성공적인 횡단은 병변의 양쪽 사이에서이 활동의 전파를 방해 할 것입니다. 척수 횡단의 품질을 조절하기 위해, 레이저 병변을 3 dpf에서 tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) 유충에 대해 수행하였다. 새로운 다중 웰 플레이트에서 수집 한 후, 유충을 경미하게 마취시켰다. 그들은 저융점 아가로스의 유리 커버슬립에 장착하여 부상 후 3 시간부터 공초점 현미경으로 형광 타임랩스 기록을 수행하였다. 병변 부위의 인과측에서 활성의 상실이 관찰되었다. 실제로, 형광의 정량화는 물고기의 자발적 활동으로 인한 스파이크가 부상 후 로스트랄 측에만 존재했지만 손상되지 않은 물고기의 동등한 로스트랄 및 인과적 위치에서 조율 된 방식으로 발생했음을 보여줍니다 (그림 4D, E). 손상 후 인과측의 낮은 잔류 신호는 로스트랄 측의 근육 수축에 의해 유도된 꼬리 운동에 대한 반응에서 감각 뉴런 (아마도 척수의 꼬리 측의 Rohon-Beard 감각 뉴런23)의 활동 때문일 가능성이 큽니다.
레이저 병변에 의해 유도되는 재생 과정
손상 후 24시간 후(hpi) 상처가 닫히기 시작하여 48시간 후에 척수의 초기 구조가 부분적으로 회복되었다(도 5D). 칼슘 이미징을 사용하여, 48 hpi 후에 부분적인 기능적 재연결을 확인하였다 (도 5E, F). 꼬리 영역의 스파이크의 진폭과 로스트랄 영역 (그림 5G) 사이의 비율 (저자에 의해 연결 복원 지수로 명명 됨)의 계산은 척수 재생 중에 예상대로 3, 24 및 48 hpi 사이의 증가를 보였다.
레이저 병변은 면역 반응을 유발합니다.
대식세포(mpeg1:GFP+ 세포) 모집은 tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 유충 레이저 병변을 사용하여 레이저 병변 후에 관찰되었다(도 5H, I). 이것은 제브라피쉬 유충에서 척수의 성공적인 재생을 위한 대식세포의 필수적인 역할을 보여주는 수동 병변을 사용한 저자들의 이전 연구와 일치한다6,24. 이 관찰은 레이저 손상 후 면역 반응을 연구 할 수 있음을 나타내며 조직 손상이 발생했음을 확증합니다.
레이저 병변과 수동 병변은 척수의 신경 생성 증가를 유발합니다.
이전의 연구들은 수동 병변을 사용하여 척수 손상 후 발생하는 신경 발생을 연구했습니다6,15. 레이저 병변은이 현상을 연구하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 이전에 발표된 실험은 병변이 없는 대조군에 비해 수동 척수 손상 후 신경발생이 증가한 것으로 나타났다15. 여기서 tg(mnx1:gfp) 물고기는 운동 뉴런으로 사용되었고 형광 표지되었다. 항-GFP 항체 염색은 유충에서 GFP의 가시성을 향상시키기 위해 사용되었다. 이것은 새로 생성 된 뉴런을 라벨링하는 EdU staining25 (보충 파일 1 참조)와 결합되었습니다. EdU는 3dpf에서 부상 직후에 추가되었으며, 이는 EdU로 표지 된 모든 세포가 부상 후 생성되었음을 의미합니다. 따라서, 공동국소화된 염색을 표시하는 세포는 척수 손상 후에 태어난 새로운 운동 뉴런을 나타낸다. 손상 부위의 양쪽 또는 병변이 없는 대조군(두 개의 50 μm 윈도우에서 포획됨)에서 손상 부위의 위치 및 크기에 대응하는 영역에서 공동국소화된 세포의 수를 계수하고, 공동국소화된 세포의 평균 수의 차이를 단방향 ANOVA26을 사용하여 분석하였다.
이 프로토콜은 신경 발생에 대한 각 병변 방법의 효과를 비교하기 위해 수동 및 레이저 병변 유충에 사용되었습니다 (그림 6). 수동 병변과 레이저 병변 사이의 표지된 세포의 수에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 병변이 없는 물고기는 두 병변 조건 모두에서 병변이 있는 물고기보다 이중 표지된 세포가 더 적게 나타났다(도 6D). 이것은 병변이없는 물고기에 비해 수동으로 병변 된 물고기에서 신경 발생이 증가했음을 보여주는 이전의 발견과 일치합니다15.
이러한 결과는 레이저 손상이 수동 병변에 필적하는 재생 반응을 유도하기 때문에 칼슘 이미징 및 아세틸화 튜불린 염색 결과를 뒷받침합니다. 이것은 레이저 병변이 단순히 세포의 형광을 표백하는 것이 아니라 수동 병변이하는 것과 동일한 세포 반응을 유발하는 부상을 초래한다는 것을 나타냅니다.
레이저 병변은 수동 병변보다 피부와 근육 손상이 적습니다.
수동 병변은 종종 많은 양의 근육과 피부 손상을 초래합니다. 대조적으로, 레이저 병변은 척수에보다 구체적으로 표적화 될 수있어 다른 조직의 손상을 줄일 수 있습니다. 이를 설명하기 위해 Tg (beta-actin : utrophin-mCh) 유충을 사용하여 수동 및 레이저 병변을 수행했습니다. 이 라인은 F-액틴 결합 단백질을 형광 표지하여 척수 세포와 근육 섬유를 시각화 할 수 있습니다. 그런 다음 유충을 생중계 장착하고 이미지화하였다 (도 7A,B). 도 7A는 척수의 손상을 나타낸다. 레이저 및 수동 병변 조건 모두에서 부상 부위에 유트로피핀이 없다는 것은 두 병변 방법 모두 척수의 세포를 손상시켰다는 것을 암시합니다. 도 7B는 근육 손상을 나타낸다. 병변이없는 상태에서 myotomes에 명확한 쉐브론 모양의 구조가 있으며 액틴 섬유 다발이 보입니다. 수동 병변 상태에서 근톰 모양에 눈에 띄는 파괴가 있으며 액틴 섬유가 더 적게 존재합니다. 이것은 심각한 근육 손상을 보여줍니다. 그러나, 레이저 병변 상태에서, 근톰의 쉐브론 구조는 유지된다. 근육 섬유에는 약간의 손상이 있지만, 이것은 수동 병변 상태에서 네 개 이내와 비교하여 하나 또는 두 개의 근 내에는 포함되어 있습니다. 또한, 도 7C의 스테레오 현미경으로 촬영한 이미지에서 보는 바와 같이 수동 병변 상태에 비해 레이저 병변 상태에서 경미한 피부 손상이 존재한다.
전체적으로 이러한 결과는 재현 가능한 반자동 레이저 병변이 제브라 피쉬의 신경 재생을 연구하는 강력한 도구가 될 가능성이 있음을 보여줍니다.
그림 1: 반자동 레이저 부상 워크플로우의 회로도. 수정 후 사흘 (dpf), 유충은 96 웰 플레이트에로드되어 자동화 된 유충 처리 플랫폼에 배치됩니다. 이어서, 각 유충은 이미징 및 레이저 병변을 위해 직립 현미경 상의 10x NA 0.5 렌즈 아래에 놓인 모세관에 로딩된다. 병변 후, 유충은 수집 및 추가 실험을 위해 새로운 96 웰 플레이트로 언로드됩니다. 상단에는 레이저 병변 전후의 tg (Xla.Tubb : DsRed) 3 dpf 유충의 투과 및 형광 이미지 (스케일 바 = 50 μm). 유충은 왼쪽 및 등쪽 위로 향하게합니다 (모든 인물에 대해). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 반자동 제브라피쉬 유충 이미징 시스템 및 레이저 제어 시스템을 위한 소프트웨어 시동. (A) 시동 시 VAST 소프트웨어. (B) VAST 소프트웨어의 메인 창은 빈 모세관을 보여줍니다. (C) 빈 플레이트 템플릿이있는 LP 샘플러 창. (D) Watch_for_ROIs_py3.py 스크립트가 실행되는 파이썬 IDE의보기. 주황색 사각형은 레이저 감쇠기를 초기화하는 동안 메시지가 표시된 터미널 탭을 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: tg(Xla.Tubb:DsRed) 3dpf 유충에 대한 레이저 병변 시퀀스의 예. (A) ImageJ 툴바에서 ROI 툴 라인을 선택한 후 20 μm 라인을 이용한 레이저 병변의 첫 번째 단계. (b) 척수의 완전한 횡단을 위한 80 μm 라인을 갖는 두 번째 단계. (C) ImageJ에서 레이저를 제어하는 데 사용되는 스크립트의 보기. (D) 레이저 병변 동안의 이미지 시퀀스. 상단: 병변 전에; 중간: 첫 번째 단계 직후; 하단: 두 번째 단계 직후(스케일 바 = 50 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 아세틸화 튜불린 면역염색(A-C) 및 칼슘 이미징(D,E)은 레이저 병변이 척추 조직의 연속성을 완전히 방해한다는 것을 나타냅니다. (A) 온전한 척수. (B) 등쪽 - 복부 및 내측 축을 따라 척수 조직의 완전한 파괴를 보여주는 척추의 완전한 횡단. (C) 불완전한 횡단. (스케일 바 = 50 μm). (D) tg (Xla.Tubb : GCaMP6s) 3 dpf 유충에 횡단 척수. 사각형은 병변의 rostral (파란색) 및 caudal (주황색) 측면에서 형광 강도를 정량화하는 데 사용되는 ROI를 보여줍니다. (e) ROIs의 로스트랄 및 인과관계 분석에서 시간에 따른 형광 강도 변화의 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 레이저 손상은 면역 반응을 유도하고 성공적인 해부학 및 기능적 회복으로 이어집니다. (A-D) tg(Xla.Tubb:DsRed) 3dpf 유충의 최대 강도 투영 형광 이미지(A) 전과 레이저 병변 후 다른 시간: 3시간 후(B), 24시간 후(C) 및 48시간 후(D). (E-G) 기능 복원을 평가하기 위해 칼슘 이미징을 사용합니다. (E) 분석 ROI를 가진 Lesioned tg (Xla.Tubb : GCaMP6s) 유충. (f) ROIs의 로스트랄 및 인과관계 분석에서 시간에 따른 형광 강도 변화의 그래프. (g) 병변 후 3, 24, 48 h에서의 인과성 및 로스트랄 스파이크 진폭 사이의 비율의 정량화 (연결성 복원 지수) (N = 3). (H-I) 병변 후 면역 반응의 특성화. (H) 병변이 없는 (왼쪽) 및 병변 (오른쪽) tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 6 hpi에서 대식세포 (mpeg1+ 세포, 녹색)의 축적을 보여주는 3 dfp 유충의 형광 이미지. (i) 손상되고 손상되지 않은 유충에서 병변 후 6 h에서의 대식세포의 수의 정량화 (N = 3) (스케일 바 = 50 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 레션-유도된 운동 뉴런의 생성은 레이저와 수동 병변 사이에서 필적할 만하다. (A-C) EdU 염색을 사용한 tg(mnx1:gfp) 5 dpf 유충의 ApoTome 현미경으로부터의 이미지, 레이저 병변(A), 수동 병변(B) 및 병변되지 않은(C) 조건에서. 화살촉은 두 마커 모두에 대해 이중 레이블이 붙은 세포를 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. (A'-C') 흰색 상자로 표시된 이중 표지된 세포의 배율이 더 높음. (D) 각 유충에서 공동국소화된 세포의 수에 대한 세포 계수의 정량화. 50 μm 윈도우를 손상 부위의 양쪽에 배치하고, 공동국소화된 세포를 모든 Z-스택 이미지에서 계수하였다. 단방향 ANOVA는 Tukey의 사후 테스트27로 수행되었습니다. 레이저와 수동 병변 사이에 유의한 차이가 없다(p = 0.909). 병변이 없는 대조군에서 mnx1:gfp+/EdU+ 세포는 레이저 병변(2.4배 변화, p = 0.011) 및 수동 병변(2.3배 변화, p = 0.018)에 비해 현저히 적다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 레이저 병변은 수동 병변보다 근육과 피부 손상을 덜 유도합니다. (A-B) 병변이 없는 수동 병변 및 레이저 병변 조건에서 tg(베타-액틴:유트로피핀-mCherry) 3dpf 유충의 단일 Z-스택 이미지를 20x 배율로 공초점 현미경으로 촬영했습니다. 흰색 화살표는 부상 부위를 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. (A)는 척수와 노토초드가 보이는 Z-스택을 나타냅니다. SC는 척수를 라벨링하고, NC는 노토코드를 라벨링합니다. (B)는 근섬유가 보이는 Z-스택을 나타낸다. (c) 이미지는 병변이 없는, 수동 병변 및 레이저 병변 조건에서 3 dpf 유충의 입체 현미경으로 촬영되었다. 유충은 텅스텐 와이어 핀 (레이저 병변 이미지에서 볼 수 있음)을 사용하여 플랫폼에 고정되었습니다. 블랙 박스는 병변 부위를 나타낸다. 배율 막대 = 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 프로토콜의 실험 세부 사항. 형질전환 제브라피쉬 라인의 생성, 수동 척수 손상, 아세틸화-튜불린 면역조직화학, Hb9/EdU 염색, 이미징 및 이미지 처리 및 분석이 기술된다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제브라 피쉬에서 재생하는 동안 재생되는 과정에 대한 더 깊은 이해가 시급히 필요합니다. 이 동물 모델은 생물 의학 연구, 특히 척수 손상에 많은 이점을 제공합니다1. 대부분의 연구는 잘 훈련 된 작업자를 필요로하고 다중 조직 손상을 유도하는 수동 병변을 포함합니다. 레이저 병변 프로토콜이 여기에 제시되어 병변 특성을 제어하고 주변 조직의 손상을 줄일 수 있습니다. 또한이 기술은 상대적으로 훈련받지 않은 실험자가 성공적으로 사용할 수있을만큼 쉽습니다.
프로토콜의 중요한 단계는 레이저의 교정과 ROI의 정의입니다. 실제로 교정은 매우 안정적이며 (심지어 몇 달 동안도) ROI의 올바른 크기와 위치가 결정되면이 기술의 사용은 간단합니다. 프로토콜이 특정 장비에서 병변을 수행하는 방법을 설명했지만, 레이저 병변의 이점의 대부분은 스핀 디스크 현미경과 같은 다른 시스템에 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 제한 사항은 척수의 형광 리포터를 사용할 필요와 병변을 수행하는 데 필요한 시간 (~ 5 분 / 물고기)입니다. 후자는 더 적은 수의 동물을 필요로하는 높은 재현성으로 보상됩니다. 그러나 수동 병변은 많은 병변 동물이 필요한 약물 검사와 같은 응용 분야에서 여전히 실행 가능합니다. 여기에서 보여지는 바와 같이, 병변-유도된 신경발생의 정도는 레이저와 수동 병변 사이에서 필적할 만하다.
그러나 레이저 부상은 엄청난 잠재적 인 응용 프로그램을 가지고 있으며, 그 중 일부는 제공되는 고유 한 이점과 관련이 있습니다. 예를 들어, 회전하는 모세관은 제어된 방식으로 매우 다양한 위치에서 병변을 수행할 수 있게 한다. 예를 들어, Bhatt et al.15의 연구에서도 입증된 바와 같이, Mauthner 세포에서 단일 뉴런 축삭법을 유도하는데 사용될 수 있다(데이터는 나타내지 않음). 수동 병변으로는 불가능합니다.
결과는 또한 손상이 주로 척수에 포함되어 있으며 주변 조직에 대한 손상을 최소화한다는 것을 보여줍니다. 이것은 레이저 병변 이후에 나타나는 세포 반응이 다른 손상된 조직의 신호보다는 척수에 특히 기인 할 가능성이 더 높다는 것을 의미 할 수 있습니다. 또한 레이저 병변 유충이 실험을위한 추가 준비를 견딜 수 있음을 의미 할 수 있습니다. 예를 들어, 전기 생리학을위한 해 부에는 forceps28,29,30을 사용하여 트렁크 피부를 제거하는 것이 포함되며, 이로 인해 이미 섬세한 부상 부위에 높은 기계적 압력이 가해지고 축삭 연결이 다시 파손 될 위험이 있습니다. 레이저 병변 유충에서 볼 수있는 피부 및 근육 조직의 완전성은 병변 부위를 추가 손상으로부터 보호하고 달성 된 재생 수준을보다 정확하게 나타낼 수 있습니다.
또한, 레이저 손상 후 손상의 향상된 국소화는 서로 다른 재생 프로세스 간의 결합의 확장을 제한하며, 이는 수동 병변을 사용할 때보다 미묘한 과정을 가릴 수 있습니다. 여기에 설명 된 유충 제브라 피쉬의 실험 손상에 대한 접근법은 양적 생물학, 생물 물리학 및 전산 생물학의 맥락에서 다양한 새로운 조사를 열 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 BBSRC (BB/S0001778/1)에 의해 지원되었다. CR은 Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program의 지원을 받습니다. 우리는 데이비드 그린 알드 (CRH, 에딘버러 대학)와 케이티 리드 (CDBS, 에딘버러 대학)에게 트랜스제닉 물고기의 친절한 선물에 감사드립니다 ( 보충 파일 참조). 우리는 Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh)에게 3i 회전 디스크 공초점에 대한 친절한 접근에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
- Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
- National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
- Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
- Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
- Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
- Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
- Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
- Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
- Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
- Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
- Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
- Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
- Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
- Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
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의학 문제 177Erratum
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022.
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An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.
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Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
