Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

ERRATUM NOTICE

Summary

Het huidige protocol beschrijft een methode om weefselspecifieke en zeer reproduceerbare verwondingen bij zebravislarven te induceren met behulp van een laserlaesiesysteem in combinatie met een geautomatiseerd microfluïdisch platform voor het hanteren van larven.

Abstract

Zebravislarven bezitten slechts enkele dagen na de bevruchting een volledig functioneel centraal zenuwstelsel (CZS) met een hoog regeneratief vermogen. Dit maakt dit diermodel zeer nuttig voor het bestuderen van dwarslaesie en regeneratie. Het standaardprotocol voor het induceren van dergelijke laesies is om het dorsale deel van de romp handmatig te transecteren. Deze techniek vereist echter uitgebreide training en beschadigt extra weefsels. Er werd een protocol ontwikkeld voor lasergeïnduceerde laesies om deze beperkingen te omzeilen, waardoor een hoge reproduceerbaarheid en volledigheid van de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg over veel dieren en tussen verschillende sessies mogelijk is, zelfs voor een ongetrainde operator. Bovendien is weefselschade voornamelijk beperkt tot het ruggenmerg zelf, waardoor verstorende effecten van het verwonden van verschillende weefsels, bijvoorbeeld huid, spieren en CZS, worden verminderd. Bovendien zijn hemi-laesies van het ruggenmerg mogelijk. Verbeterd behoud van weefselintegriteit na laserletsel vergemakkelijkt verdere dissecties die nodig zijn voor aanvullende analyses, zoals elektrofysiologie. Daarom biedt deze methode een nauwkeurige controle van de letselomvang die handmatig onhaalbaar is. Dit maakt nieuwe experimentele paradigma's in dit krachtige model in de toekomst mogelijk.

Introduction

In tegenstelling tot zoogdieren kunnen zebravissen (Danio rerio) hun centrale zenuwstelsel (CZS) herstellen na een verwonding1. Het gebruik van zebravislarven als model voor regeneratie van het ruggenmerg is relatief recent. Het is waardevol gebleken om de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan reparatie2 te onderzoeken. Dit komt door het gemak van manipulatie, de korte experimentele cyclus (elke week nieuwe larven), de optische transparantie van de weefsels en de kleine omvang van de larven, bij uitstek geschikt voor in vivo fluorescentiemicroscopie.

In het geval van regeneratie van het ruggenmerg zijn twee extra voordelen van het gebruik van larven de snelheid van herstel, een paar dagen in vergelijking met een paar weken voor volwassenen, en het gemak van het induceren van verwondingen met behulp van handmatige technieken. Dit is met succes gebruikt in vele studies3,4,5, waaronder recente onderzoeken6,7. Over het algemeen leidt dit tot een verhoogde zinvolle gegevensproductie, een hoog aanpassingsvermogen van experimentele protocollen en lagere experimentele kosten. Het gebruik van larven jonger dan 5 dagen na de bevruchting vermindert ook het gebruik van dieren volgens de 3R-principes in dieronderzoek8.

Na een dwarslaesie bij zebravislarven treden veel biologische processen op, waaronder ontstekingsreactie, celproliferatie, neurogenese, migratie van overlevende of nieuw gegenereerde cellen, reformatie van functionele axonen en een wereldwijde remodellering van neurale processen circuits en wervelkolomweefsels6,7,9,10 . Om met succes te worden georkestreerd, omvatten deze processen een fijn gereguleerde interactie tussen een reeks celtypen, extracellulaire matrixcomponenten en biochemische signalen11,12. Het ontrafelen van de details van deze belangrijke reorganisatie van een complex weefsel zoals het ruggenmerg vereist het gebruik en de ontwikkeling van nauwkeurige en gecontroleerde experimentele benaderingen.

Het primaire experimentele paradigma dat wordt gebruikt om spinale regeneratie bij zebravissen te bestuderen, is het gebruik van chirurgische middelen om weefselschade te induceren door resectie, steken of cryo-letsel3,13. Deze benaderingen hebben het nadeel dat specifieke training in microchirurgische vaardigheden vereist is, wat tijdrovend is voor elke nieuwe operator en het gebruik ervan in kortetermijnprojecten kan voorkomen. Bovendien veroorzaken ze meestal schade aan de omliggende weefsels, wat de regeneratie kan beïnvloeden.

Een andere benadering is om celbeschadiging chemisch te induceren14 of door genetische manipulaties15. Dit laatste zorgt voor zeer gerichte schade. Een dergelijke techniek vereist echter lang voorbereidend werk om nieuwe transgene vissen te genereren voordat een experiment wordt uitgevoerd, vernieuwd telkens wanneer een uniek celtype wordt gericht.

Er is dus behoefte aan een methode die gerichte maar veelzijdige laesies mogelijk maakt die geschikt zijn voor een verscheidenheid aan onderzoeken naar regeneratie. Een oplossing is om een laser te gebruiken om gelokaliseerde schade in het weefsel van belang te induceren16,17,18,19,20. Inderdaad, het gebruik van laser-geïnduceerde weefselschade biedt een robuuste aanpak voor het genereren van ruggenmerglaesies met veel voordelen. De microscopen uitgerust met dergelijke lasermanipulatiemodules maken het mogelijk om een aangepast gevormd gebied te specificeren waar celablatie zal plaatsvinden, met het extra voordeel van temporele controle. De grootte en positie van de laesie kunnen zo worden aangepast om eventuele vragen te beantwoorden.

Het ontbrekende kenmerk van de meeste laserlaesiesystemen is de mogelijkheid om verwondingen op een zeer reproduceerbare manier te induceren voor een reeks larven. Hier wordt een origineel protocol beschreven met behulp van een UV-laser om semi-geautomatiseerde precieze en gecontroleerde laesies in zebravislarven te induceren op basis van een microfluïdisch platform dat is ontworpen voor geautomatiseerde larvenverwerking21. Bovendien worden larven in het hier gepresenteerde systeem ingebracht in een glazen capillair, waardoor het dier vrij rond zijn rostrocaudale as kan draaien. De gebruiker kan kiezen welke kant van de larve aan de laser wordt gepresenteerd, terwijl fluorescentiebeeldvorming de laserstraal nauwkeurig kan richten en de schade na de laesie kan beoordelen.

Het hier beschreven protocol wordt gebruikt met een semi-geautomatiseerd zebravislarve beeldvormingssysteem in combinatie met een draaiende schijf uitgerust met een UV-laser (hierna aangeduid als het VAST-systeem). De belangrijkste punten van het protocol en de meeste claims van de techniek zijn echter geldig voor elk systeem dat is uitgerust met een laser die in staat is tot celablatie, inclusief laserscanmicroscopen met twee fotonen, spinning-disk microscopen voorzien van een UV-laser (FRAP-module) of videomicroscopen met een lasermodule voor fotomanipulatie. Een van de belangrijkste verschillen tussen het VAST-systeem en de conventionele monsterbehandeling zal zijn dat voor de laatste, het monteren van larven in agarose met een laag smeltpunt op glazen afdekkingsplaten / petrischalen met glazen bodem in plaats van ze in een 96-putplaat te laden, vereist is.

De voordelen van deze methode bieden kansen voor innovatief onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen tijdens het regeneratieproces. Bovendien maakt de hoge datakwaliteit kwantitatief onderzoek in een multidisciplinaire context mogelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierstudies werden uitgevoerd met goedkeuring van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en volgens zijn voorschriften, onder projectlicentie PP8160052. Het project werd goedgekeurd door de University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Voor experimentele analyses werden zebravislarven tot 5 dagen oud van beide geslachten gebruikt van de volgende beschikbare transgene lijnen: Tg (Xla.Tubb: DsRed;mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaactin: utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) en Tg (mnx1: gfp) (zie aanvullend bestand 1 met betrekking tot het genereren van de transgene zebravislijnen). Een schema van het protocol met behulp van het geautomatiseerde zebravislarvenverwerkingsplatform is weergegeven in figuur 1. Alle aangepaste software, scripts en gedetailleerde experimentele protocollen die in dit werk worden gebruikt, zijn beschikbaar op https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. Monstervoorbereiding

  1. Sorteer de embryo's 5 uur na de bevruchting voor het juiste ontwikkelingsstadium21. Gooi dode eieren en slecht ontwikkelde en overontwikkelde embryo's weg.
  2. Verdoof de larven 3 dagen na de bevruchting (dpf) door 2 ml 0,4% aminobenzoëzuur-ethylmethylester toe te voegen aan 50 ml visfaciliteitswater in een petrischaaltje van 90 mm. Gebruik dieren die zijn grootgebracht met fenylethiourea (PTU) (zie tabel met materiaal) om huidpigmentatie te voorkomen als dit een probleem is, wat niet het geval is voor ruggenmergletsels op 3 dpf-larven die in dit protocol worden beschreven.
    OPMERKING: Deze relatief hoge verdovingsconcentratie wordt gebruikt om bewegingen van de larven na de laserinslag te voorkomen.
  3. Screen de embryo's op fluorescerende reporterexpressie (Aanvullend dossier 1).
    OPMERKING: Een fluorescerende verslaggever voor het ruggenmerg (of een andere structuur van belang) is vaak nodig om de efficiëntie van het letsel te beoordelen. Het gebruik van tg (Xla.Tubb: DsRed) helpt bij het identificeren van het ruggenmerg.
  4. Breng de geselecteerde larven over in een plaat met 96 putten voor gebruik in het VAST-systeem (zie Tabel met materialen) met 300 μL visfaciliteitswater per put. Gebruik het medium met het verdovingsmiddel uit de 90 mm petrischaal direct. Zorg ervoor dat je maar één larve per put hebt. Maak een extra lege 96-well plaat om de laesielarven te verzamelen.
    OPMERKING: Als u een ander laserlaesiesysteem gebruikt, monteer de larven dan in 1% low-melting point (LMP) agarose-gel in een geschikte observatiekamer.

2. Microscoop voorbereiding

  1. Schakel alle systeemcomponenten in (VAST, microscoop, laser, pc), inclusief de laser voor ablatie.
  2. Zodra de hardware volledig is geïnitialiseerd, start u de microscoopsoftware, ImageJ / Fiji, een python integrated development environment (IDE) en de software voor geautomatiseerde zebravisbeeldvorming (VAST-systeem) als u dit platform gebruikt (zie Tabel met materialen).
  3. Stel de VAST-software in volgens de onderstaande stappen.
    1. Wanneer de VAST-software wordt gestart, kiest u Plate in het eerste venster en klikt u op de knop Gereed (Figuur 2A). Er verschijnt nog een klein venster met de vraag of het capillair leeg en schoon is. Controleer door naar de afbeelding van het capillair te kijken of er luchtbellen in zitten. Zo niet, klik dan op Ja. Als er bubbels zijn, klikt u op Nee en volgt u stap 2.3.2-2.3.3 (figuur 2B).
    2. Klik in het venster Large Particle (LP) Sampler op Prime om luchtbellen te verwijderen (Figuur 2C).
    3. Ga naar het hoofdvenster van de software (met de capillaire afbeelding) en klik met de rechtermuisknop op de afbeelding. Selecteer Lege capillaire afbeelding opnemen in het pop-upmenu (Afbeelding 2B).
    4. Ga in het venster LP Sampler naar het menu Bestand en selecteer de optie Script openen . Kies een bestand met het script dat overeenkomt met het uit te voeren experiment.
    5. Ga in het hoofdvenster van de VAST-software naar Bestand en kies Experiment openen. Kies het experimentbestand dat overeenkomt met het geplande experiment.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de vakjes Automatisch lossen en Bulkuitvoer naar afval NIET zijn aangevinkt.
  4. Stel de microscoopsoftware in voor beeldvorming.
    1. Start de microscoopbeeldvormingssoftware (zie Tabel met materialen) om de hardware te initialiseren. Dit kan enkele minuten duren, afhankelijk van het systeem.
    2. Ga naar de acquisitie-instellingen en stel de microscoop in voor het afbeelden van de fluorofoor die in de larven tot expressie komt. Gebruik een 10x NA 0,5 waterdipobjectief om ervoor te zorgen dat het brandpuntsvolume lang genoeg langs de optische as is om de hele diepte van het ruggenmerg of het beoogde weefsel te laeseren.
  5. Stel ImageJ/Fiji in voor laserlaesies.
    1. Ga naar het menu Bestand , kies Nieuw/Script om het scriptvenster te openen.
    2. Ga in het venster Nieuw naar het menu Bestand en kies Openen om het laserlaesiescript (Manual_MP_Operation.ijm) te laden.
  6. Stel de Python IDE in.
    1. Start de Python IDE.
    2. Ga naar het menu Bestand en kies Bestand openen om het script te laden om de laser te beheren (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. Ga naar het menu Uitvoeren en kies Uitvoeren zonder foutopsporing om het script uit te voeren. Controleer of er een reeks berichten in het terminalpaneel wordt weergegeven, samen met wat ruis terwijl de laserverzwakker wordt geïnitialiseerd (afbeelding 2D).

3. Het uitvoeren van laserlaesies op het VAST-systeem

  1. Centreer het capillair ten opzichte van het microscoopobjectief door het podium te verplaatsen door op de pijlknoppen in het hoofdvenster van de VAST-software te klikken (figuur 2B).
  2. Focus op de bovenkant van het capillair door door de oculairs te kijken en het doorgelaten licht van de microscoop te gebruiken.
    LET OP: Het capillair is erg fragiel en kan breken als het door het doel wordt aangeraakt. Beweeg de microscoopknop langzaam bij het in- en uitstellen.
  3. Plaats de 96-putplaten op de plaathouder van de LP Sampler van het VAST systeem. Plaats de plaat met larven op de linker houder en de plaat voor verzameling aan de rechterkant. Zorg ervoor dat de platen correct zijn georiënteerd: de A1-put moet zich in de linkervoorhoek van de houder bevinden.
  4. Klik in de VAST-software in het LP Sampler-venster op de knop Plaatsjabloon en selecteer alle putten met larven. Klik op de knop OK om het venster te valideren en te sluiten (afbeelding 2C).
  5. Klik in het LP Sampler-venster op de knop Plaat uitvoeren om te beginnen met het laden van een larve.
    OPMERKING: Na enige tijd moet de larve zichtbaar zijn in de capillaire positie (vooraf gedefinieerd in het experimentdefinitiebestand), waardoor het ruggenmerg kan worden verwond. Het VAST-baklampje gaat na een paar rotaties uit om de larve in te stellen met de zijdelingse zijde naar het microscoopobjectief gericht.
  6. Ga naar de microscoopsoftware en klik op de live-knop om de larve in beeld te brengen.
  7. Draai aan de focusknop van de microscoop totdat het centrale kanaal van het ruggenmerg zichtbaar is.
    OPMERKING: Het kan gemakkelijker zijn om eerst scherp te stellen met behulp van doorgelaten licht en vervolgens te verfijnen met fluorescentie.
  8. Maak een momentopname in fluorescentie en sla de afbeelding op in een speciale map.
  9. Open de afbeelding in ImageJ en pas indien nodig het contrast aan (met behulp van het menu Afbeelding/Aanpassen/Helderheid/contrast... in AfbeeldingJ).
  10. Klik op het regelgereedschap Region of Interest (ROI) en teken een korte lijn (20 μm) gecentreerd op het ruggenmerg (figuur 3A).
  11. Zet de microscoop in de 100% reflecterende spiegelstand.
  12. Laad het ImageJ-script en klik op de knop Uitvoeren . Gebruik de volgende parameters: Herhaling - 2; Voorbeeld - 1; Breedte - 40-micron; Demping - 89 (volledig laservermogen) (figuur 3C).
  13. Wanneer de laseropnamesequentie is voltooid, schakelt u over naar fluorescentiebeeldvorming op de beeldvormingssoftware en past u de focus indien nodig aan.
    OPMERKING: Een verschuiving in focus wordt vaak waargenomen als gevolg van staartverplaatsing tijdens laserblootstelling.
  14. Maak een nieuwe momentopname en sla deze op.
  15. Open deze nieuwe afbeelding in ImageJ en teken een nieuwe lijn die groter moet zijn dan het ruggenmerg zelf (~ 80 μm), beginnend onder de ventrale kant van het ruggenmerg in het bovenste deel van het notochord en naar de dorsale kant om te eindigen in de ruimte tussen het ruggenmerg en de huid (figuur 3B).
  16. Zet de microscoop in de 100% reflecterende spiegelstand.
  17. Ga naar het ImageJ-scriptvenster en klik op de knop Uitvoeren . Gebruik de volgende parameters: Herhaling - 2; Voorbeeld - 1; Breedte - 40 micron; Demping - 89 (Volledig laservermogen).
  18. Nadat de (langere) laseropnamesequentie is voltooid, controleert u de transsectiekwaliteit door fluorescentie en scherpstelling in beeld te brengen. Zorg ervoor dat er geen cel of axonen intact blijven op de plaats van de laesie, die moet verschijnen als een donker of als een zwak en homogeen fluorescerend gebied (figuur 3D, onderste paneel).
  19. Verzamel de laesielarven in de lege 96-putplaat (met dezelfde putcoördinaties als die van de oorspronkelijke put) door naar het hoofdvenster van de VAST-software te gaan en op de knop Verzamelen te klikken.
  20. Schakel het VAST-systeemlampje weer in door op het selectievakje Ladelampje linksonder in het venster te klikken.
  21. Herhaal stap 3.3-3.17 voor elke nieuwe larve die gewond raakt.

4. Behandeling na laesie en aanvullende experimenten

  1. Haal larven zo snel mogelijk uit de 96-putplaat en breng ze over naar een schone petrischaal met vers viswater zodat de larven zich na de laesie kunnen herstellen. Doe de petrischaal in een couveuse op 28 °C.
    OPMERKING: De schade blijft zich vaak voortplanten in het eerste uur na de laesie. De werkelijke omvang van de laesie moet dus worden beoordeeld door fluorescentiebeeldvorming na een vertraging van ongeveer 1 uur.

5. Problemen oplossen

  1. Als er luchtbellen aanwezig zijn in de buizen en het capillair van het VAST-systeem, klikt u op de prime-knop in het LP Sampler-venster om ze te verwijderen.
  2. Overweeg de mislukte laesies (zoals beoordeeld op basis van de resterende fluorescentie op de laesieplaats, afgezien van de verwachte resterende en homogene achtergrond), die te wijten kunnen zijn aan verschillende redenen die hieronder worden genoemd.
    1. Laag laservermogen: Wanneer dit gebeurt, probeer het dan met een hogere waarde.
      OPMERKING: Het VAST-systeem is uitgerust met een verflaser. Dit impliceert dat de concentratie van de kleurstofoplossing die wordt gebruikt voor het genereren van laserlicht in de loop van de tijd kan veranderen, wat leidt tot een afname van het laservermogen. Vervangen door een nieuwe oplossing lost het probleem meestal op22.
    2. Slechte kalibratie: Controleer in dit geval de kalibratie en het vermogen van het lasersysteem volgens stap 5.2.2.1-5.2.2.4. Indien niet correct gekalibreerd, wordt de laser niet naar de gewenste locatie geleid, wat leidt tot mislukte laesies of ongewenste schade in aangrenzende weefsels.
      1. Plaats een spiegelschuif bovenop de capillaire kamer. Focus op de gecoate kant (het moet het doel onder ogen zien). Gebruik een eerdere standaardinstelling in de dia om gemakkelijker scherp te stellen.
      2. Pas een patroon van laserablatie toe met behulp van een kalibratiescript.
      3. Beoordeel de kwaliteit van het patroon. De vlekken of lijnen moeten scherp lijken en niet wazig.
      4. Gebruik een helling met toenemend vermogen om te evalueren of het laservermogen is veranderd in vergelijking met de vorige sessies.
    3. Larvale beweging tijdens laesies: Larven reageren anders op anesthesie; de laserlaesie kan dus tijdens het proces bewegingen van de staart veroorzaken, waardoor een succesvolle transsectie wordt voorkomen. Wanneer dit gebeurt, neemt u een extra iteratie van de laserlaesiestappen om het te voltooien terwijl u nog steeds schade aan de omliggende weefsels voorkomt.
    4. Slechte focus: Wanneer dit gebeurt, concentreer je dan op het midden van het centrale kanaal om de beste resultaten te krijgen.
    5. ROI-tekening, positie en grootte: de positie en grootte van de ROI zijn van cruciaal belang voor succesvolle transsecties. De ROI moet groter zijn dan het ruggenmerg en gecentreerd op het midden van het ruggenmerg. Om dit op te lossen, begin je de ROI van de ventrale kant van het ruggenmerg te trekken en ga je omhoog naar de dorsale kant om een succesvolle transsectie te verkrijgen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan staartbewegingen veroorzaakt door de opeenvolging van laserschoten tijdens de ablatieprocedure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validatie van ruggenmergtranssectie
Structurele en functionele onderzoeken werden uitgevoerd om te beoordelen of het protocol een volledige ruggenmergtranssectie mogelijk maakt.

Ten eerste, om te verifiëren dat het verlies in fluorescentie op de laesieplaats te wijten was aan neuronale weefselbeschadiging en niet aan fluorescentiefotobleaching door de laserverlichting, werd immunostaining uitgevoerd met behulp van een antilichaam tegen geacetyleerde tubuline (zie Tabel met materialen en aanvullend dossier 1). Een volledige verstoring van de axonen tussen de caudale en rostrale zijden van de laesie werd waargenomen, wat de volledige transsectie van het ruggenmerg bevestigde (figuur 4B). Een succesvolle dwarslaesie mag geen resterende neuronale projectie over de laesieplaats achterlaten (zie figuur 4C voor een voorbeeld van een mislukte laesie). Met behulp van deze techniek werd het slagingspercentage van ruggenmerlaesies geschat op 75% (vier onvolledige transsecties bij 16 dieren).

Het verlies van functionaliteit na laserlaesie werd onderzocht met behulp van calciumbeeldvorming. Bij intacte vissen genereert de spontane gecoördineerde neuronale netwerkactiviteit fluorescentiepieken langs het hele ruggenmerg. Een succesvolle transsectie zou de voortplanting van deze activiteit tussen beide zijden van de laesie onderbreken. Om de kwaliteit van de dwarslaesie van het ruggenmerg te controleren, werden laserlaesies uitgevoerd op tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) larven bij 3 dpf. Na verzameling in een nieuwe multi-well plaat werden larven licht verdoofd. Ze werden gemonteerd op een glazen afdekplaat in laagsmeltpunt agarose om fluorescentie time-lapse opnames uit te voeren op een confocale microscoop vanaf 3 uur na het letsel. Een verlies van activiteit aan de caudale kant van de laesieplaats werd waargenomen. De kwantificering van fluorescentie toont inderdaad aan dat pieken als gevolg van de spontane activiteit van de vis alleen aanwezig waren aan de rostrale kant na verwonding, maar op gecoördineerde wijze optraden in de equivalente rostrale en caudale posities bij intacte vissen (figuur 4D,E). Het lage restsignaal aan de caudale kant na letsel was waarschijnlijk te wijten aan de activiteit van sensorische neuronen (waarschijnlijk Rohon-Beard sensorische neuronen aan de caudale kant van het ruggenmerg23) in reactie op de staartbeweging geïnduceerd door spiercontractie aan de rostrale kant.

Regeneratieprocessen geïnduceerd door laserlaesies
Na 24 uur na het letsel (hpi) begon de wond te sluiten, wat leidde tot een gedeeltelijk herstel van de oorspronkelijke structuur van het ruggenmerg na 48 uur (figuur 5D). Met behulp van calciumbeeldvorming werd een gedeeltelijke functionele herverbinding bevestigd (figuur 5E,F) na 48 pki. De berekening van de verhouding (door de auteurs Connectivity Restoration Index genoemd) tussen de amplitude van de pieken in het caudale gebied en het rostrale gebied (figuur 5G), toonde een toename tussen 3, 24 en 48 hpi, zoals verwacht tijdens spinale regeneratie.

Laserlaesies veroorzaken een immuunrespons
Macrofaag (mpeg1:GFP + cellen) rekrutering werd waargenomen na laserlaesies met behulp van tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) larven laserlaesies (Figuur 5H,I). Dit komt overeen met eerdere studies van de auteurs met behulp van handmatige laesies die de essentiële rol van macrofagen aantonen voor een succesvolle regeneratie van het ruggenmerg bij zebravislarven6,24. Deze observatie geeft aan dat immuunreacties kunnen worden bestudeerd na laserletsel en bevestigt dat weefselschade is opgetreden.

Laserlaesies en handmatige laesies veroorzaken verhoogde neurogenese in het ruggenmerg
Eerdere studies hebben handmatige laesies gebruikt om de neurogenese te bestuderen die optreedt na een dwarslaesie6,15. Laserlaesies kunnen een waardevol hulpmiddel zijn om dit fenomeen te bestuderen. Een eerder gepubliceerd experiment toonde verhoogde neurogenese na een manuele dwarslaesie in vergelijking met tenzij controles15. Hier werden tg(mnx1:gfp) vissen gebruikt als motorneuronen en fluorescerend gelabeld. Anti-GFP antilichaamkleuring werd gebruikt om de zichtbaarheid van GFP in de larven te verbeteren. Dit werd gecombineerd met EdU-kleuring25 (zie Aanvullend bestand 1), dat nieuw gegenereerde neuronen labelt. EdU werd onmiddellijk na een verwonding met 3 dpf toegevoegd, wat betekent dat alle cellen die met EdU waren gelabeld, na het letsel werden gegenereerd. Daarom vertegenwoordigen cellen die gecolokaliseerde kleuring vertonen nieuwe motorneuronen die worden geboren na een dwarslaesie. Het aantal gecolokaliseerde cellen aan weerszijden van de verwondingsplaats, of in een gebied dat overeenkomt met de locatie en grootte van de verwondingsplaats in niet-geïlokaliseerde controles (vastgelegd in twee vensters van 50 μm) werden geteld en het verschil in het gemiddelde aantal gecolokaliseerde cellen werd geanalyseerd met behulp van een eenrichtings-ANOVA26.

Dit protocol werd gebruikt op handmatige en laserlaesielarven om de effecten van elke laesiemethode op neurogenese te vergelijken (figuur 6). Er werd geen verschil waargenomen in het aantal gelabelde cellen tussen handmatige en laserlaesies. Tenzij vis minder dubbel gelabelde cellen vertoonde dan laesievissen in beide laesieomstandigheden (figuur 6D). Dit komt overeen met eerdere bevindingen die een verhoogde neurogenese aantonen bij handmatig laesievissen in vergelijking met vis15.

Deze resultaten ondersteunen de calciumbeeldvorming en geacetyleerde tubulinekleuringsresultaten, omdat het laserletsel een regeneratierespons oproept die vergelijkbaar is met een handmatige laesie. Dit geeft aan dat de laserlaesie niet alleen de fluorescentie in de cellen bleekt, maar resulteert in een verwonding die dezelfde cellulaire reacties veroorzaakt als een handmatige laesie.

Laserlaesies resulteren in minder huid- en spierschade dan handmatige laesies
Handmatige laesies resulteren vaak in grote hoeveelheden spier- en huidbeschadiging. Laserlaesies kunnen daarentegen specifieker op het ruggenmerg worden gericht, waardoor de schade aan andere weefsels wordt verminderd. Om dit te illustreren, werden Tg(beta-actine:utrophin-mCh) larven gebruikt om handmatige en laserlaesies uit te voeren. Deze lijn labelt fluorescerend een F-actine-bindend eiwit, waardoor de visualisatie van ruggenmergcellen en spiervezels mogelijk is. De larven werden vervolgens levend gemonteerd en in beeld gebracht (figuur 7A,B). Figuur 7A toont de schade aan het ruggenmerg. Het gebrek aan utrofine op de plaats van de verwonding in zowel laser- als handmatige laesieomstandigheden suggereert dat beide laesiemethoden de cellen in het ruggenmerg hebben beschadigd. Figuur 7B toont de spierschade. Er is een duidelijke chevron-achtige structuur aan de myotomen in de geïsoleerde toestand en bundels actinevezels zijn zichtbaar. Er is een zichtbare verstoring van de myotoomvorm in de manuele laesieconditie en er zijn minder actinevezels aanwezig. Dit toont aanzienlijke spierschade aan. In de toestand van de laserlaesie blijft de chevronstructuur van het myotoom echter behouden. Er is enige schade aan spiervezels, maar dit is beperkt tot een of twee myotomen in vergelijking met binnen vier in de manuele laesieconditie. Bovendien is er lichte huidbeschadiging in de laserlaesieconditie in vergelijking met de handmatige laesieconditie, zoals te zien is op afbeeldingen gemaakt met een stereomicroscoop in figuur 7C.

Al met al tonen deze resultaten aan dat reproduceerbare, semi-geautomatiseerde laserlaesies het potentieel hebben om een krachtig hulpmiddel te zijn om neurale regeneratie bij zebravissen te bestuderen.

Figure 1
Figuur 1: Schema van de semi-automatische laser-letsel workflow. Drie dagen na de bevruchting (dpf) worden larven in een 96-well plaat geladen en op het geautomatiseerde larvenbehandelingsplatform geplaatst. Vervolgens wordt elke larve geladen in een capillair dat onder een 10x NA 0.5-lens op een rechtopstaande microscoop wordt geplaatst voor beeldvorming en laserlaesie. Na laesies worden larven gelost op een nieuwe 96-well plaat voor verzameling en verdere experimenten. Bovenaan, overgedragen en fluorescentiebeelden van tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larven voor en na laserlaesie (schaalbalk = 50 μm). Larven zijn georiënteerd rostral links en dorsaal omhoog (voor alle figuren). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Software start-up voor het semi-geautomatiseerde zebravislarve beeldvormingssysteem en lasercontrolesysteem. (A) VAST software bij inbedrijfstelling. (B) Het hoofdvenster van de VAST-software toont het lege capillair. (C) LP Sampler venster met een lege plaat sjabloon. (D) De weergave van python IDE met de Watch_for_ROIs_py3.py script uitgevoerd. De oranje rechthoek wijst op het terminaltabblad met berichten die worden weergegeven tijdens de initialisatie van de laserverzwakker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Voorbeeld van laserlaesiesequentie op tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larven. (A) De eerste stap van laserlaesie met behulp van een 20 μm lijn na het selecteren van de lijn ROI tool van de ImageJ werkbalk. (B) Tweede stap met een lijn van 80 μm voor volledige transsectie van het ruggenmerg. (C) Weergave van het script dat wordt gebruikt voor het besturen van de laser vanuit ImageJ. (D) De volgorde van beelden tijdens laserlaesies. Boven: vóór laesie; Midden: direct na de eerste stap; Onder: direct na de tweede stap (schaalbalk = 50 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Geacetyleerde tubuline-immunostaining (A-C) en calciumbeeldvorming (D,E) geven aan dat laserlaesie de continuïteit van ruggenmergweefsel volledig verstoort. (A) Intact ruggenmerg. (B) Volledige transsectie van de wervelkolom met een volledige verstoring van het ruggenmergweefsel langs zowel de dorsale ventrale als de mediaal-laterale as. (C) Onvolledige transsectie. (schaalbalk = 50 μm). (D) Getranscteerd ruggenmerg op een tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) 3 dpf larve. De rechthoeken tonen de ROIs die worden gebruikt om de fluorescentie-intensiteit in de rostrale (blauwe) en caudale (oranje) zijden van de laesie te kwantificeren. (E) Grafiek van de fluorescentie-intensiteitsveranderingen in de loop van de tijd in de rostrale en caudale analyse-RIA's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Laserletsel lokt een immuunrespons uit en leidt tot succesvol anatomisch en functioneel herstel. (A-D) De maximale intensiteitsprojectiefluorescentiebeelden van een tg(Xla.Tubb:DsRed) 3dpf larve vóór (A) en op verschillende tijdstippen na de laserlaesie: na 3 uur (B), na 24 uur (C) en na 48 uur (D). (E-G) Het gebruik van calciumbeeldvorming om het functieherstel te beoordelen. (E) Laesie tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) larve met analyse-ROI's. (F) Grafiek van de veranderingen in de fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd in de rostrale en caudale analyse-ROIs. (G) Kwantificering van de verhouding tussen caudale en rostrale spike amplitudes (Connectivity Restoration Index) op 3, 24, 48 h post-laesie (N = 3). (H-I) Karakterisering van de immuunrespons na laesie. (H) Fluorescentiebeelden van geassisteerde (links) en laesie (rechts) tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 dfp larve die de accumulatie van macrofagen (mpeg1+ cel, groen) bij 6 hpi laat zien. (I) Kwantificering van het aantal macrofagen 6 h na de laesie bij gewonde en intacte larven (N = 3) (schaalstaven = 50 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Laesie-geïnduceerde generatie van motorneuronen is vergelijkbaar tussen laser en handmatige laesie. (A-C) Beelden van de ApoTome-microscoop van tg (mnx1: gfp) 5 dpf-larven met EdU-kleuring, in laserlaesie (A), handmatige laesie (B) en tenzij (C) omstandigheden. Pijlpunten geven cellen aan die dubbel zijn gelabeld voor beide markeringen. Schaalbalk = 100 μm. (A'-C') Hogere vergroting van dubbel gelabelde cellen aangeduid met witte vakken. (D) Kwantificering van het aantal celtellingen voor het aantal gecolokaliseerde cellen in elke larve. 50 μm-vensters werden aan weerszijden van de verwondingsplaats geplaatst en geglokaliseerde cellen werden geteld in alle Z-stack-afbeeldingen. One-way ANOVA werd uitgevoerd met Tukey's posthoc test27. Geen significant verschil tussen laser- en manuele laesies (p = 0,909). Aanzienlijk minder mnx1:gfp+/EdU+ cellen in uitzonderingsgecontroleerde controles in vergelijking met laserlaesie (2,4-voudige verandering, p = 0,011) en handmatige laesie (2,3-voudige verandering, p = 0,018). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Laserlaesie induceert minder spier- en huidbeschadiging dan de handmatige laesie. (A-B) Enkele Z-stack beelden van tg(beta-actine:utrophin-mCherry) 3 dpf larven in de geassisteerde, handmatige laesie en laser laesie condities, genomen op de confocale microscoop bij 20x vergroting. Witte pijlen geven de plaats van de verwonding aan. Schaalbalk = 50 μm. (A) geeft Z-stapels aan waar het ruggenmerg en notochord zichtbaar zijn. SC labelt het ruggenmerg en NC labelt het notochord. (B) duidt op Z-stacks waar de spiervezels zichtbaar zijn. (C) Er werden beelden gemaakt op de stereomicroscoop van 3 dpf-larven in de ongeboorte, handmatige laesie en laserlaesie. Larven werden vastgepind op een platform met behulp van wolfraamdraadpennen (zichtbaar in laserlaesiebeeld). De zwarte doos geeft de plaats van de laesie aan. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: De experimentele details van het protocol. De generatie van de transgene zebravislijnen, manuele ruggenmergletsels, geacetyleerde tubuline immunohistochemie, Hb9/EdU-kleuring, beeldvorming en beeldverwerking en -analyse worden beschreven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er is dringend behoefte aan een dieper begrip van de processen die spelen tijdens regeneratie bij zebravissen. Dit diermodel biedt veel voordelen voor biomedisch onderzoek, in het bijzonder voor ruggenmergletsels1. De meeste studies hebben betrekking op handmatige laesies die een goed opgeleide operator vereisen en schade aan meerdere weefsels veroorzaken. Een laserlaesieprotocol wordt hier gepresenteerd, waardoor controle over de laesiekenmerken en verminderde schade aan de omliggende weefsels mogelijk is. Bovendien is deze techniek eenvoudig genoeg om met succes te worden gebruikt door relatief ongetrainde experimentatoren.

Kritische stappen in het protocol zijn de kalibratie van de laser en de definitie van ROI's. In de praktijk is de kalibratie zeer stabiel (zelfs maandenlang) en zodra de juiste grootte en positie van de ROI zijn bepaald, is het gebruik van deze techniek eenvoudig. Hoewel het protocol beschreef hoe de laesies op specifieke apparatuur moesten worden uitgevoerd, zijn de meeste voordelen van laserlaesies beschikbaar voor verschillende systemen, zoals een draaiende schijfmicroscoop.

De belangrijkste beperkingen van dit protocol zijn de noodzaak om een fluorescentieverslaggever van het ruggenmerg te gebruiken en de tijd die nodig is om de laesies uit te voeren (~ 5 min / vis). Dit laatste wordt gecompenseerd door een hoge reproduceerbaarheid waarvoor minder dieren nodig zijn. Handmatige laesies zijn echter nog steeds levensvatbaar voor toepassingen zoals het testen van geneesmiddelen, waar veel laesiedieren nodig zijn. Zoals hier getoond, is de mate van laesie-geïnduceerde neurogenese vergelijkbaar tussen laser- en handmatige laesies.

Laserletsel heeft echter enorme potentiële toepassingen, waarvan sommige verband houden met de unieke voordelen die worden aangeboden. Een roterend capillair maakt het bijvoorbeeld mogelijk om laesies in een grote verscheidenheid aan posities op een gecontroleerde manier uit te voeren. Het kan bijvoorbeeld worden gebruikt om axotomie van één neuron in Mauthner-cellen te induceren (gegevens worden niet getoond), zoals ook is aangetoond in het werk van Bhatt et al.15. Dit zou niet mogelijk zijn met behulp van handmatige laesies.

De resultaten tonen ook aan dat de schade voornamelijk beperkt is tot het ruggenmerg, met minimale schade aan omliggende weefsels. Dit zou kunnen betekenen dat cellulaire reacties die worden gezien na een laserlaesie eerder specifiek aan het ruggenmerg worden toegeschreven dan aan signalering van andere beschadigde weefsels. Het zou ook kunnen betekenen dat laserlaesielarven beter bestand zijn tegen verdere voorbereidingen voor experimenten. Dissectie voor elektrofysiologie omvat bijvoorbeeld het verwijderen van de romphuid met behulp van een tang28,29,30, wat zou resulteren in een hoge mechanische druk op de toch al delicate verwondingsplaats en het risico zou lopen dat eventuele axonale verbindingen opnieuw worden verbroken. De integriteit van huid- en spierweefsel die wordt gezien in larven met laserlaesie kan de laesieplaats beschermen tegen verdere schade en resulteren in een nauwkeurigere weergave van het bereikte regeneratieniveau.

Bovendien beperkt de verbeterde lokalisatie van schade na laserletsel de uitbreiding van de koppeling tussen verschillende regeneratieprocessen, die subtielere processen kunnen maskeren bij het gebruik van handmatige laesies. De hier beschreven benadering van experimenteel letsel bij de larvale zebravis kan een reeks nieuwe onderzoeken openen in de context van kwantitatieve biologie, biologische fysica en computationele biologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de BBSRC (BB/S0001778/1). CR wordt gefinancierd door het Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. We danken David Greenald (CRH, University of Edinburgh) en Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) voor het vriendelijke geschenk van transgene vis (zie aanvullend bestand). We bedanken Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) voor de vriendelijke toegang tot de 3i spinning-disk confocal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0 Carl Zeiss
ImageJ/FIJI Open-Source
Visual Studio Code Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880 Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1 Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1 Carl Zeiss
UV laser Micropoint
VAST BioImager Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish Thermo-Fisher 101R20
96-well plate Corning 3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit Invitrogen C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) Sigma-Aldrich A5040
phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 Jackson 703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson 715-165-150
Mouse anti-GFP Abcam AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody Sigma T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp) N/A First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed) N/A First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) N/A Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

Tags

Geneeskunde Nummer 177

Erratum

Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

The title was updated from:

Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

to:

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El-Daher, F., Early, J. J.,… More

El-Daher, F., Early, J. J., Richmond, C. E., Jamieson, R., Becker, T., Becker, C. G. Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (177), e63259, doi:10.3791/63259 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter