Summary
このプロトコルは、単一細胞消化の有無にかかわらず食道腺癌オルガノイドの継代培養および凍結保存の方法を記述し、研究者が実験計画に基づいて適切な戦略を選択できるようにする。
Abstract
腫瘍形成および治療戦略を探求するための原疾患を反映する適切なトランスレーショナルリサーチモデルの欠如は、食道腺癌(EAC)における大きな障害である。患者由来のオルガノイド(PDO)は、最近、様々な癌における顕著な前臨床モデルとして浮上している。ただし、EAC PDO の開発に使用できるプロトコルはまだ限られています。PDO が確立されると、伝播と凍結保存は、さらに下流の解析に不可欠です。ここでは、EAC PDOの継代培養および凍結保存のために、すなわち、単一細胞消化の有無にかかわらず、2つの異なる方法が標準化されている。どちらの方法も、適切な細胞生存率を確実に得ることができ、多様な実験セットアップに適用可能である。現在の研究は、単一細胞消化によるEAC PDOの継代培養が、細胞数制御、均一な密度、およびサイズ追跡を容易にする中空構造を必要とするほとんどの実験に適していることを実証した。しかしながら、単一細胞ベースの方法は、培養中および凍結ストックからの再培養後に遅い成長を示す。また、単一細胞消化による継代培養は、中空コアで中空構造を形成することを特徴とする。対照的に、単一細胞消化なしでEAC PDOを処理することは、凍結保存、拡張、および組織学的特徴付けに有利である。このプロトコルでは、単一細胞消化の有無にかかわらずEAC PDOの継代培養および凍結保存の長所と短所が説明されており、研究者はオルガノイドを処理および調査するための適切な方法を選択できます。
Introduction
食道がん(EC)は、世界のがんによる死亡原因の第10位および第6位の死因1位です。食道腺癌(EAC)は、ECの主要な組織学的サブタイプの1つであり、主に西洋諸国で発生する2。ここ10年間で、EACの発生率はドイツを含む多くの先進国で大幅に増加しています3。がんの攻撃性および腫瘍発生の初期段階における症状の欠如のために、EAC患者の全体的な予後は悪く、約20%の5年生存率を示す2、4、5。
20世紀後半以来、EACの生物医学研究のためにいくつかのモデルが確立されてきました。1990年代に確立された古典的なヒトEAC細胞株6は、EAC腫瘍生物学、腫瘍遺伝学、抗腫瘍戦略に関する知識を拡張し、EAC研究で一般的に使用されています。その上、いくつかの研究グループは、外科的または炎症的アプローチを介して胃食道逆流などの既知の危険因子に動物を曝露することによって、EACまたはバレット食道の動物モデルの開発に成功している7,8,9。加えて、EAC原発性癌組織を皮下または同所性に免疫不全マウスに生着させる患者由来異種移植片(PDX)モデルが、ヒトEAC腫瘍の生物学的挙動および腫瘍環境をシミュレートするために開発された10、11、12。しかし、これらのモデルが臨床応用を改善し、EACの腫瘍形成と進行の背後にある分子メカニズムの理解を向上させているにもかかわらず、これらの研究モデルからヒトに結果を推定することは依然として大きな課題があります。
患者由来の腫瘍オルガノイド(PDO)は、インビトロでヒトの発達および臓器再生を模倣する3D培養系で増殖される。患者の原発組織から生成されるPDOは、ヒト腫瘍の分子的および表現型的特徴を再現し、医薬品開発および個別化がん治療における有望な用途を示している13,14。EAC PDOの10例を対になった腫瘍組織と比較することにより、EAC PDOは原発腫瘍と同様の組織病理学的特徴およびゲノムランドスケープを共有し、腫瘍内の不均一性を保持し、インビトロでの効率的な薬物スクリーニングを促進することが報告されている15。EAC PDOは、EAC腫瘍細胞と患者由来の癌関連線維芽細胞(CAF)との相互作用の研究にも使用され、腫瘍微小環境研究の分野における強力な応用を示している16。残念ながら、EAC PDO の開発と伝達に使用できるプロトコルは限られていました。ここでは、EAC PDOの継代培養と保存について、単一細胞消化の有無にかかわらず、2つの異なる方法を詳細に説明します。EAC PDOとそのアプリケーションのメンテナンスのための標準化された方法は、研究者がEAC PDO研究におけるさまざまな目的に適した方法を選択するのを支援することができます。
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Protocol
確立され、よく成長しているPDO培養は、このプロトコルに記載されている継代培養と凍結保存を成功させるための基礎を表しています。ここで、EAC PDOは、Karakasheva T. A. et al17によって記載されたプロトコールを用いて、EAC患者の原発性腫瘍組織から生成された。EAC組織は、BioMaSOTA(ケルン大学倫理委員会、ID:13-091によって承認)の承認の下でバイオバンクから収集された。
注:EAC PDOは、PDO培養培地を用いて37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内で培養された(表1)。以下の工程では、継代培養の2つの方法が詳細に説明される。12ウェルプレートは、各ウェルの柔軟な使用と異なる目的のために適切な量のPDOを可能にするため、ウェルあたり3つの細胞外マトリックス(ECM)ゲルドームの播種密度でPDOを再培養するために推奨されます。PDOを取り扱う間は、無菌技術が必須です。
1. 事前の準備
- 継代培養前に一晩37°CのCO2インキュベーターに入れて12穴プレートを予備加温し、プレートの完全な加温を確実にした。利用可能な場合は、現在のPDO培養物を含むプレートの空のウェルを使用します。
注:柔軟な継代培養計画には、37°Cで1〜2枚の新鮮なプレートを連続保存することをお勧めします。 - 1,000 μL および 200 μL チップを -20 °C で広いオリフィスで予冷します (連続保存を推奨)。4°Cで予冷遠心分離機。
- 回転インキュベーターの温度を37°Cに設定します(単一細胞消化が行われる場合)。
- 適量のECMゲルを氷上で1時間インキュベートして液化させる。細胞回収溶液を氷の上に置きます。
2. オルガノイドの収穫
- 成長中のPDOを含むプレートをCO2インキュベーターから取り外します。
- 真空ポンプを用いて古い媒体を吸引する。
メモ: ドームには触れないでください。 - 適切な量の氷冷細胞回収溶液(500 μL/ドーム)をウェルに加えます。
- ECMゲルを数回上下にピペッティングして崩壊させ、広いオリフィスを備えた1,000 μLの先端を使用してECMゲルドームを小片に断片化します。
- 最大2つのウェル(6つのドーム)からPDO、ECMゲル、および細胞回収溶液の混合物を結合し、それを5mLの低結合チューブに移す(継代培養により多くのウェルを使用する場合は、2番目のチューブを使用する)。
注: オプションで、ECM ゲルが完全に溶解していない場合は、PDO、ECM ゲル、および細胞回収溶液の混合物にさらに 1.5 mL の細胞回収溶液を追加します。 - ステップ2.5で混合物を含むチューブを氷上で20分間インキュベートし、チューブを5回反転させて5分ごとに混合し、ECMゲルの液化を確実にした。
- 500 x g で4°Cで4分間遠心分離する。
- 遠心分離後に目に見える安定したペレットがある場合は、ステップ2.10に進みます。それ以外の場合は、ステップ 2.9 に進みます。
- 目に見えるペレットがなく、PDOがまだゲル相に詰まっているように見える場合は、ECMゲル-PDO-溶液を含む相に達するまで真空ポンプで上清を慎重に除去し、3mLの氷冷細胞回収溶液を加える。
- チューブを数回反転させ、さらに10分間氷上でインキュベートする。チューブを時々反転させて混ぜる。
- 500 x g で 4 °C で 4 分間遠心分離し、ステップ 2.10 に進みます。
- 上清は真空ポンプまたは1,000 μLのピペットを使用して慎重に廃棄してください。上澄み液はできるだけ取り除くようにしてください。
注:チューブの結合面が低いため、ペレットは通常ほど安定しません。 - PDOペレットを氷上に保管し、目的に応じてステップ3(消化なし)またはステップ4(単一細胞消化)に進みます。
3. 消化せずに継代培養する
注: この方法は、PDO のサイズと密度を高めることを目的としています。より大きなサイズとより高い密度は、埋め込みプロセス、組織学的特徴付け、およびPDO拡張を容易にする。PDO分割比(PDOの密度に基づいて、1:3〜1:6の比が推奨されます)に応じて、ステップ2.8からのペレットを適切な量の液体ECMゲルに再懸濁する。
- -20°Cの冷凍庫から、事前に冷却した200 μLと1,000 μLの先端を幅の広いオリフィスで取り出し、クリーンベンチに置きます。
- ステップ 2.11 のペレットを、予冷した 1,000 μL チップを使用して ECM ゲルに再懸濁します。PDOが凝集しておらず、ECMゲル中に均等に分布していることを確認するために、約10回上下にピペッティングして混合します。
注: 50 μL の ECM ゲル/ドームを使用してください。常に必要以上に1つのドーム(例えば、9つのドーム(すなわち、3つのウェル)について計算し、ペレットを500μLの液体ECMゲル(450 + 50μL余分な)に再懸濁する。再懸濁中に泡が発生しないようにしてください! - ドームを播種する直前に、予め温めた12ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。
- 50μL ECMゲルを含むシードドームを温かいプレート(3つのドーム/ウェル)に入れる。気泡をECMゲルドームにピペッティングしないでください。
- プレートを37°Cおよび5%CO2インキュベーターに戻し、ECMゲルを固化させるために20〜30分間インキュベートする。
- 予め加温したPDO培地(表1)をドームを乱さずに慎重に加える。
- 必要な密度および形態が生じるまでPDOを7〜14日間培養する。
4. 単一細胞消化による継代培養
注: 次の手順は、ドームあたりの PDO の数を増やすことを目的としています。単一細胞消化は、細胞数制御およびPDO拡大を容易にする。
- 2 mLの0.25%トリプシン-EDTAと20 μL DNase I(3つのドームの消化用)を混合して消化培地を調製する。
- ステップ2.11のペレットを、予め加温した0.25%トリプシン-EDTA+DNase Iの適量で再懸濁し、1,000 μLピペット(通常の1,000 μLチップを使用)を使用して上下にピペッティングして約10回混合する。
- 最低28rpmの回転速度を有する回転インキュベーター中で37°Cで10分間インキュベートする。
- 6 mLの大豆トリプシン阻害剤(STI、表2)溶液( 0.25%トリプシン-EDTAの2 mLあたり)を含む15 mLチューブを調製する。
- 消化後、消化したPDOを1,000μLのピペットで数回十分に混合してPDOを破砕します。
- 消化されたPDOをSTI溶液を含む15mLチューブに移し、消化プロセスを停止する。
- 500 x g で4°Cで4分間遠心分離する。 上清は真空ポンプまたは1,000 μLのピペットを使用して慎重に廃棄してください。ペレットを1mLの基礎培地に再懸濁する(表3)。
- 自動細胞カウンターまたは血球計数器を使用して細胞濃度と生存率を決定します。
- 種子はPDOを1ドームあたり2 x104 細胞を有する12ウェルプレートに消化した。
- 播種用に計画されたドームに従って細胞数を計算し、それらを新鮮な1.5mL低結合チューブに移す。
注:さらに1つのドームを計算します(+ 2 x 104セル追加)。たとえば、3つのドームを1つのウェルに播種するには、8 x 104(2 x 104 * 3 + 2 x104 余分な)細胞を取ります。 - 500 x g で4°Cで4分間遠心分離する。
- 目に見えるペレットがない場合は、遠心分離機内のチューブの向きを覚えて、ペレットがどこにあるかを確認してください。
- 上清を1,000 μLのピペットを使用して慎重に廃棄します。ペレットを乱すことなく上澄み液をできるだけ取り除く。
- 予備冷却された1,000 μL幅のオリフィスチップ(50 μL/ドーム+ 50 μL追加)を備えた1,000 μLピペットを使用して、適切な量のECMゲルをペレットに加えます。
- 手順 3.3-3.7 に従います。
- 播種用に計画されたドームに従って細胞数を計算し、それらを新鮮な1.5mL低結合チューブに移す。
5. 消化されたPDOと未消化のPDOの凍結保存
注: 単一細胞消化および未消化の PDO は、凍結バックアップストックの調製に適しています。単一細胞凍結ストックから再培養されたPDOは、回復し、一定のサイズに達するまでに長い時間を必要とすることに注意してください。
- 未消化のPDOの凍結保存。
- ステップ2.8からペレットで凍結保存プロセスを開始します。500 μLの低温凍結培地を使用してペレットを再懸濁し、極低温バイアルに移します。
注:バイアルごとに2つのドームを保管してください。 - 適切な細胞凍結容器を用いてPDOを-80°Cの冷凍庫で一晩凍結する。
- ステップ2.8からペレットで凍結保存プロセスを開始します。500 μLの低温凍結培地を使用してペレットを再懸濁し、極低温バイアルに移します。
- 単一細胞消化PDOの凍結保存
- PDO を収穫して消化した後、ステップ 4.8 から凍結保存を開始します。
- 1つの極低温バイアルを保存するために、4〜5 x105 個の細胞を新鮮な1.5mL低結合チューブに移す。
注:3つのドーム/バイアルを保管してください。 - 500 x g で4°Cで4分間遠心分離する。 上清を1,000 μLのピペットを用いて慎重に廃棄する。ペレットを乱すことなく上澄み液をできるだけ取り除く。
- ペレットを適量の凍結培地(500μL/バイアル)に再懸濁し、極低温バイアルに移す。
- 適切な細胞凍結容器を使用してPDOを-80°Cの冷凍庫で一晩凍結し、-150°Cの冷凍庫または液体窒素に移して長期保存する。
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Representative Results
このプロトコルは、単一細胞消化の有無にかかわらず、EAC PDOの継代培養および凍結保存を含む手順を提示する。
図1は 、2つの異なる継代培養戦略の代表的な位相差写真を示す。EAC PDOは継代培養に適した密度に達しました(図1、左)。単一細胞消化なしで継代培養すると、同等の密度に達するまでの時間が短縮され、主にコンパクトな構造になります(図1、上段)。対照的に、単一細胞消化PDOは、中空コアを有する中空構造を示す(図1、下段)。 図2は、コンパクトで中空な構造を有するパラフィン包埋EAC PDOのヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色および免疫組織化学(IHC)染色を示す。この汎サイトケラチン(Pan−CK)は、上皮腫瘍細胞18の同定を可能にする。サイトケラチン7(CK7)は、腺分化腫瘍細胞19を強調表示する。コンパクトな構造(上の行)は主に未消化の培養物に存在し、中空の構造(下の行)は単一細胞消化を受けた培養物に支配的です。
図3 は、コンパクトな構造と中空構造を持つ対になったEAC組織とPDOの免疫蛍光(IHC)染色を示しています。Ki67は、より高い細胞増殖を有する細胞集団を強調する20。Ki67(赤)およびPan-CK(緑)は、EAC一次組織、EAC PDOコンパクト構造、およびEAC PDO中空構造の間に同様に分布していた。 図4は、単一細胞ベースの凍結保存(左)および未消化PDOベースの凍結保存(右)による凍結ストックからの回収初日におけるEAC PDOの形態学的特徴を示す。
図5は 、単一細胞消化の有無にかかわらずEAC PDOの継代培養プロセスのフローチャートを要約する。簡単に言えば、よく成長しているEAC PDOは、通過する準備ができています。EAC PDOを収穫し、ペレット化した。単一細胞消化の場合、PDOを酵素的に5〜10分間消化して単一細胞を得、細胞数制御、均一な密度、およびサイズ追跡を必要とする実験を容易にする中空構造に成長する可能性があった。未消化の継代培養では、PDOは酵素的に破壊することなくより多くの成長スペースを得るために分割され、組織学的分析、迅速な拡大、および凍結保存からの迅速な回復を容易にするコンパクトな構造に成長する可能性が高い。
図1:位相差顕微鏡下での単一細胞消化の有無にかかわらず、EAC PDO継代培養の形態学的特徴。 EAC PDOは、継代培養の前に一定の密度に成長します(左)。単一細胞消化を行わずにEAC PDOを継代培養すると、PDOは中空構造からコンパクトな構造に徐々に成長し(右、上段)、単一細胞から増殖したPDOは主に中空構造を示す(右、下段)。写真は、5倍の対物レンズを用いて倒立光顕微鏡で撮影した。スケール バー: 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:EAC PDOのコンパクト構造と中空構造の組織学的特徴コンパクト構造(上段)と中空構造(下段)のH&E染色(左)、パンCK染色(中央)、CK7染色(右)。写真は20倍の対物レンズを使用して倒立光顕微鏡で撮影しました。スケール バー: 50 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:対をなすEAC組織およびPDOの免疫組織化学染色。対になったEAC組織(上段)、コンパクト構造(中段)、中空構造(下段)の免疫蛍光(IF)染色を、Pan-CK(緑)、Ki67(赤)、DAPI(青)で染色した。写真は、20倍の対物レンズを用いて倒立自動蛍光顕微鏡で撮影した。スケール バー: 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:凍結ストックからの回収初日におけるEAC PDOの形態学的特徴。 回収初日の単一細胞ベースの凍結保存(左)と未消化のPDOベースの凍結保存(右)からの再培養の位相差写真。写真は、5倍の対物レンズを用いて倒立光顕微鏡で撮影した。スケール バー: 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 単一細胞消化の有無にかかわらず、EAC PDO の継代培養プロセスのフローチャート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 株式 | 最終濃度 | 50ミリリットル | |||
| 基礎培地(表3参照) | 24キロリットル | ||||
| Wnt-3A馴化培地 | 12キロリットル | ||||
| カルトレックスR-スポンジン細胞由来のR-スポンディン1馴化培地 | 12キロリットル | ||||
| N-2. | 100倍速 | 1倍速 | 500 μL | ||
| B-27. | 50倍速 | 1倍速 | 1キロリットル | ||
| N-アセチルシステイン | 0.5メートル | 1 ミリオン | 100 μL | ||
| チール-99021 | 5ミリオン | 0.5 μM | 5 μL | ||
| 組換えヒト上皮成長因子(EGF) | 100 μg/mL | 250 ng/mL | 125 μL | ||
| A83-01 · | 25ミリオンメートル | 0.5 μM | 1 μL | ||
| SB202190 · | 10ミリオンメートル | 1 μM | 5 μL | ||
| ガストリン | 100 μM | 0.1 μM | 50 μL | ||
| ニコチンアミド | 1 M | 20 μM | 1キロリットル | ||
| ゲンタマイシン | 50 ミリグラム/ミリリットル | 10 μM | 5 μL | ||
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 100倍速 | 1倍速 | 500 μL | ||
| アムホテリシンB | 250 μg/mL | 0.60% | 300 μL | ||
| ウェルに新しく追加する: | |||||
| 頭 | 100 μg/mL | 50 μL | |||
| Y-27632 | 10.5ミリオンメートル | 50 μL | |||
| 一次組織から新しいPDOを確立するとき、または凍結ストックから回復するときに追加する | |||||
| FGF-10a | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 50 μL | ||
表1:EAC PDO培養液の調製。
| 大豆トリプシン阻害剤(STI) | 12.5 ミリグラム |
| DPBSで50 mLに調整する | |
| 0.2 μmの滅菌フィルターを通してろ過する |
表2:大豆トリプシン阻害剤(STI)溶液の調製。
| 試薬 | 容積 | 最終濃度 |
| アドバンスト DMEM/F-12 | 48.2ミリリットル | |
| ヘップス (1 M) | 500 μL | 10ミリオンメートル |
| L-グルタミン (100X) | 500 μL | 1倍速 |
| ペニシリン - ストレプトマイシン(100X) | 500 μL | 1倍速 |
| アムホテリシンB | 300 μL | 0.60% |
| ゲンタマイシン (50 ミリグラム/mL) | 5 μL | 5 μg/mL |
表3:基礎培地の調製。
| 単一細胞消化 | |
| 長所 | 短所 |
| セル番号コントロール | 埋め込み中に壊れやすい |
| 生存率チェック | 通路間の所要時間が長くなる |
| 例えば、薬物スクリーニング、フローサイトメトリーに適用可能 | 冷凍ストックからの回収時間の延長 |
| 単一細胞消化なし | |
| 長所 | 短所 |
| 形態学は組織学的分析に有益である | PDOの数よりもサイズが大きいPDOの拡張 |
| 埋め込みプロセスにおけるより高い安定性 | 単一細胞懸濁が必須の分析には適用されません。 |
| 冷凍在庫からの迅速な回収 | セル番号制御とサイズ追跡の欠如 |
表4:単一細胞消化の有無にかかわらずEAC PDOを継代培養することの長所と短所。
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Discussion
このプロトコルでは、EAC PDOの2つの異なる継代培養および凍結保存方法、すなわち単一細胞消化の有無にかかわらず記載されている。いくつかの研究では、単一細胞消化15,17によるEAC PDOの継代を推奨しており、これは細胞数制御、均一な密度、およびサイズ追跡を容易にする中空構造を必要とするほとんどの実験にとって有益である。しかしながら、単一細胞ベースの方法は、凍結ストックからの再培養後の増殖が遅く、培養期間中の形態がコンパクトでないという特徴がある。経験上、単一細胞ベースの再培養が継代培養プロセスに適用可能な密度に達するまでに2〜3週間かかることが示されています。対照的に、単一細胞消化のない凍結EAC PDOは、再培養後、より短い期間(約1週間)で同じサイズに達することができる。1つの理由は、比較的長い時間(10分)のトリプシン消化からの余分なストレスである可能性があります。したがって、未消化のEAC PDOを1:1.5の比率で保存することをお勧めします(未消化のEAC PDOの2つのドームを凍結し、再栽培のために3つのドームに播種します)。さらに、コンパクトな構造のため、未消化のEAC PDOを使用することが、IHCまたはIF染色による迅速な拡張および組織学的特性評価のために推奨されます。2つの継代培養方法の長所と短所を表4にまとめた。
このプロトコルでは、いくつかの重要な手順に注意が必要です。まず、PDO培養用のプレートを37°Cのインキュベーターで一晩予温して、新たに播種したECMゲルドームの固化プロセスを確実にする必要があります。播種期間の延長に対処しながら、プレートを37°Cに保つためにホットプレートを使用することをお勧めします。第二に、継代培養プロセス中に、重大なPDO損失を避けるために低結合チューブが必要である。ECMゲルの損失を防ぐために、広いボア開口部を備えたチップは、使用前に-20°Cの冷凍庫で予冷することができます。ここで、先端の広い開口部は、収穫工程中のPDO構造の損傷を回避する。次に、ECMゲルの完全な液化を確実にするために、最初の遠心分離ステップの前にPDOを氷上で20分間インキュベートすることが推奨される。なお、遠心分離機は、残留ECMゲルを液体状態に保つために遠心分離工程中に4°Cに設定する必要がある。さらに、単一細胞法では、細胞損失を避けるために、細胞懸濁液を細胞ストレーナーで直接濾過するのではなく、通常の1,000μLチップを使用してトリプシンインキュベーション後にPDOを徹底的に混合し、STIを添加する前に細胞凝集塊を破壊することが推奨される。
このプロトコルでは、いくつかの変更を加えることができます。細胞回収溶液は、回収工程においてECMゲルを溶解するための氷冷DPBSで置き換えることができる。しかしながら、経験は、細胞回収溶液を用いてECMゲルを溶解するより良い能力を示した。したがって、氷のように冷たいDPBSは、代替バックアップ方法としてのみ推奨されます。実験室に回転インキュベーターが装備されていない場合は、EAC PDOを37°Cの水浴中でトリプシンとともにインキュベートし、2〜3分ごとにチューブを反転させて混合することができます凍結PDOストックを調製するための凍結培地の代替として10%DMSOを使用することができます。しかしながら、より低いまたは血清を含まない市販の凍結培地は、PDO回収率が優れているため好ましい。
このプロトコルでは、いくつかの制限に対処する必要があります。これらのメソッドは EAC PDO でのみテストされているため、このプロトコルを他の種類の PDO に適用するかどうかは明確ではありません。単一細胞消化の有無にかかわらずPDOを継代する手順は、ほとんどのオルガノイドタイプで標準化されている21,22が、再現性を確保するために、他のがんタイプで現在のプロトコルを試みる必要がある。さらに、10分間の0.25%トリプシンインキュベーションは、消化中に細胞にストレスを与える可能性があります。したがって、インキュベーション時間は、継代培養前のPDO条件および個々のPDOの多様性に基づいて変化し得る。初期の試みの間、EAC PDOごとに異なるトリプシンインキュベーション時間を設定することが推奨される。
結論として、これは、単一細胞消化の有無にかかわらず、EAC PDOの継代培養および凍結保存を記述および議論する最初のプロトコルである。単一細胞消化によるEAC PDOの継代培養は、グループ間の比較実験に適用できますが、未消化のEAC PDOは、組織学的特性評価、凍結保存、および迅速な拡張に有益です。ここでは、EAC PDOの定期的なメンテナンスが標準化されており、研究者がEACオルガノイド生成のための適切な方法を選択するためのガイドを提供しています。
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Disclosures
著者は、この作品に利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究はケルン大学ケルン・フォーチュン・プログラム/医学部の支援を受けた。Susanne Neiss、Michaela Heitmann、Anke Wienand-Dorweilerの技術支援に感謝します。寧波ファンは広州エリート奨学金評議会(GESC)から財政的支援を受けました。著者らは、言語編集におけるジョシュア・ドロザリオ博士の協力に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
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