Summary
Este protocolo descreve um método para extrair eficientemente nematoides vivos de substratos naturais no campo.
Abstract
Além de serem organismos modelos experimentais robustos, os caenorhabditis elegans e seus parentes também são animais reais que vivem na natureza. Estudos de nematoides selvagens em seus ambientes naturais são valiosos para entender muitos aspectos da biologia, incluindo os regimes seletivos em que personagens genômicos e fenotípicos distintos evoluem, a base genética para variação de traços complexos e a diversidade genética natural fundamental para todas as populações animais. Este manuscrito descreve um método simples e eficiente para extrair nematoides de seus substratos naturais, incluindo frutas podres, flores, fungos, lixo de folhas e solo. O método do funil baermann, uma técnica clássica de nematologia, isola seletivamente nematoides ativos de seus substratos. Por recuperar quase todos os vermes ativos da amostra, a técnica do funil baermann permite a recuperação de genótipos raros e de crescimento lento que coexistem com genótipos abundantes e de rápido crescimento, que podem ser perdidos em métodos de extração que envolvem várias gerações de reprodução. A técnica também é adequada para abordar questões metagenéticas, populacionais e ecológicas. Captura toda a população em uma amostra simultaneamente, permitindo uma visão imparcial da distribuição natural de idades, sexos e genótipos. O protocolo permite a implantação em escala no campo, convertendo rapidamente substratos em placas de vermes, e os autores validaram-no através do trabalho de campo em vários continentes.
Introduction
Valiosas percepções biológicas estão surgindo à medida que pesquisadores que estudam C. elegans no laboratório expandem seu foco para C. elegans e nematoides de rabditid relacionados na natureza. Estudos de nematoides selvagens colocam genes e genomas em seu contexto natural, revelando funções potencialmente obscurecidas por condições laboratoriais1,2,3,4,5. Esses estudos geram insights sobre o pré-requisito para a própria evolução, variação genética6,7,8,9,10. A variação genética natural capturada por amostras selvagens também fornece incursões na base genética de muitos traços complexos11,12,13.
Ao projetar estudos que requerem o isolamento de populações naturais de nematoides, particularmente na realização de trabalhos de campo remotos, considerações práticas vêm à tona. Este protocolo visa isolar limpamente populações inteiras de nematoides ativos que podem ser cultivadas em OP50 a partir de iscas ou substratos selvagens. O método é adequado para extrair nematoides de rhabditid e diplogasterid de vida livre, incluindo Caenorhabditis, Oscheius e Pristionchus.
Existem muitas técnicas para isolar nematoides de seus substratos14,15. A abordagem mais básica é colocar o substrato diretamente em uma placa nematoides-média, colhendo animais enquanto rastejam para fora8,15. Este método requer grandes quantidades de tempo e trabalho se o objetivo é isolar todos os nematoides de uma amostra. Técnicas mais sofisticadas aproveitam o peso, tamanho, mobilidade ou alguma combinação destes14. Cada método tem suas vantagens e desvantagens em termos de configuração e throughput. Eles também diferem em seus vieses amostrais e podem selecionar para certos nematoides se os animais da amostra variam ao longo do eixo do princípio de separação do método.
O método do funil baermann foi descrito pela primeira vez em 1917 pelo médico holandês G. K. T. F. Baermann, que inventou o dispositivo em Java enquanto estudava nematoides que habitam o solo, incluindo a minhoca parasita16. O funil baermann funciona com base no princípio da mobilidade. O substrato é colocado em um funil forrado com um pano ou filtro de papel (um "Kimwipe" é usado para este estudo, chamado de "limpeza sem fiapos" no protocolo atual) e fechado na parte inferior. O funil é então preenchido com água, submergindo a amostra enquanto o filtro a separa da tomada selada. Nematoides ativos na amostra liberam-se na água e nadam através do filtro, eventualmente se estabelecendo na parte inferior do funil. A saída do funil é aberta, e uma gota de nematoides é expelida em uma placa (Figura 1).
Figura 1: Resumo da técnica do funil Baermann. (A) Coletar uma amostra rica em bactérias de um local de interesse. (B) Submergir a amostra em um funil Baermann e esperar que os vermes se contorcessem e afundassem. (C) Liberando uma única gota do funil. (D) Mover hermafroditas solteiras ou fêmeas acasaladas para separar placas. Ilustração criada por Ramin Rahni. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O funil Baermann não funcionará para todos os tipos de nematoide (ver seção discussão para alternativas específicas) e é mais adequado àqueles que são formas ativas na faixa de tamanho de Caenorhabditis ou menor14. No entanto, se um estudo pode usar o funil Baermann, há muitas vantagens. O método é prático no campo, exigindo configuração limitada, tempo prático e custo. O pesquisador fica com uma amostra limpa sem a obstrução do substrato na placa, o que facilita a colheita. O uso de um filtro também evita a contaminação da placa por larvas de insetos ou ácaros, que mastigam placas ou presas em nematoides na amostra. Mais importante, o funil Baermann extrai eficientemente quase toda a população do substrato14, o que pode ser necessário dependendo do desenho do estudo. Por exemplo, pesquisadores interessados em contar o estágio ou distribuição sexual de populações selvagens, encontrar genótipos de crescimento lento ou raro, ou amostrar nematoides não atraídos pelo OP50 podem se beneficiar desse método. Isso é apropriado para pesquisadores que estudam questões ecológicas17, genética populacional18 ou metagenética19 , pois o esquema amostral tira um instantâneo da população no momento da amostragem.
O presente manuscrito descreve um protocolo completo para isolar populações de nematoides usando o funil baermann e estabelecer linhas isofemale e isohermafrodita no campo, utilizando equipamentos escolhidos para fácil transporte. Para pesquisadores que realizam trabalhos de campo perto de seus laboratórios, muitas dessas etapas podem ser omitidas ou simplificadas.
Protocol
1. Preparação de placas de GNM semeadas no campo
- Antes da viagem, pese 23,005 g de Nematode Growth Medium (NGM) (ver Tabela de Materiais) em pó e pré-embalar em um saco plástico vedado. Faça um saco para cada litro de mídia desejada.
NOTA: A pré-embalagem antes da viagem contorna a necessidade de um equilíbrio funcional no campo. - Antes de viajar, prepare 1 mL de 1M MgSO4, 1 mL de 1M CaCl2 e 25 mL de tampão fosfato de potássio de 1M para cada litro de mídia desejada. Para fazer 1 L de tampão fosfato de potássio, dissolva 108,3 g de KH2PO4 e 35,6 g de K2HPO4 na água, conforme descrito no WormBook20.
- Antes da viagem, faça uma cultura noturna de OP50 (ver Tabela de Materiais) cultivada em LB a 37 °C, como descrito no WormBook20. Aliquot a cultura em tubos cônicos de 50 mL e enrole os topos com filme de parafina para evitar vazamentos.
- No campo, dissolva o conteúdo do pacote NGM em 973 mL de água dupla destilada (ddH20) ou a água mais pura e estéril disponível em um frasco ou garrafa de 1 L.
- Coloque o frasco de mídia ou garrafa, com uma tampa de folha solta ou alumínio, em um banho de água quente fervente em um prato quente ou fogão. Mexa ocasionalmente até que todo o pó seja dissolvido e esteja claro (isso leva ~30 min).
NOTA: Se uma placa magnética estiver disponível, uma barra de mexida é uma excelente opção para limitar a quantidade de agitação manual. - Retire a mídia do banho de água e esfrie para ~58 °C com agitação ocasional ou com uma barra de mexida. Uma vez que a mídia seja resfriada a 58° C, use pipetas sorológicas ou padrão para adicionar 25 mL de tampão fosfato de potássio de 1M, 1 mL de 1M MgSO4 e 1 mL de 1M CaCl2, misturando-se bem entre cada passo.
- No ambiente mais estéril disponível, pipeta ou despeje a mídia em placas do tamanho desejado e deixe esfriar e solidificar durante a noite. Despeje uma placa de 60 mm (~10 mL) para cada amostra de substrato. Despeje uma placa de 35 mm (~3,5 mL) para cada linha isofemale; o número de pequenas placas necessárias é difícil de prever com antecedência.
- Pipeta 50 μL de cultura OP50 em cada placa e permitir que ela seque e cresça durante a noite antes do uso.
2. Coleção dos substratos nematoides
- Identifique um substrato rico em bactérias no campo. Alguns exemplos incluem frutas podres, flores, fungos e caules de plantas herbáceas. O solo e o lixo das folhas também são adequados, embora raramente contenham Caenorhabditis.
- Com uma mão enluvada, coloque uma amostra deste substrato (1-15 cm3) em um saco plástico vedável (ver Tabela de Materiais) rotulado com um ID de amostra único (Figura 1A).
- Registo o ID amostral, latitude, longitude, data, descrição do substrato, e quaisquer outras medidas ambientais locais relevantes para o experimento, incluindo temperatura ambiente e substrato, tempo de coleta, condição de substrato, presença de macroinvertebrados associados a substratos, e assim por diante. Um aplicativo para smartphone está disponível para agilizar esse processo21.
3. Preparação de uma matriz de funis Baermann
- Para cada funil, use uma tesoura para cortar um segmento de tubos de borracha (ver Tabela de Materiais) ~3 cm de comprimento.
- Coloque o segmento de tubulação sobre a extremidade de um funil plástico (ver Tabela de Materiais). Isso pode levar algum esforço, pois o ajuste é muito apertado.
- Deslize um grampo de tubo sobre o tubo de borracha e aperte-o fechado.
- Para fazer um suporte de funil, use um bisturi para cortar orifícios circulares de 35 mm de diâmetro na parte inferior de uma bandeja de papelão fly-vial (ver Tabela de Materiais) que não foi dobrada a partir de sua orientação de transporte plano. Uma bandeja padrão pode acomodar 12 desses orifícios em uma matriz 3 x 4.
- Inverta o papelão, dobre as laterais uma vez (não duas vezes, como seria fazer uma bandeja de frasco de mosca), e tape os lados juntos para elevar a bandeja de papelão invertida (Figura 2).
- Coloque funis nos orifícios, primeiro certificando-se de que os grampos de tubulação estão na posição fechada.
Figura 2: Bandejas de frasco de papelão reaproveitado, dobradas e cortadas para suportar 12 funis Baermann cada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Transferência de amostras para os funis
- Despeje água (tão estéril quanto disponível) em cada funil, preenchendo-a cerca de 3 cm abaixo da borda. Se as bolhas de ar estiverem presas na tubulação, toque no funil para soltá-las.
- Com as mãos enluvadas, coloque um lenço sem fiapos ou especificamente um Kimwipe (dobrado ao meio para fazer um quadrado) sobre o funil, e pressione para baixo no centro para que ele fique submerso na água.
- Quebrar manualmente grandes pedaços sólidos de substratos naturais (frutas, flores, solo, lixo de folhas, etc.) em fragmentos menores para minimizar a distância que os vermes devem viajar para cair do substrato.
NOTA: Lixo de folha e amostras desajeitadamente moldadas podem ser pré-processadas em um processador de alimentos ou liquidificador. - Coloque suavemente uma amostra do substrato natural (1-15 cm3) sobre o lenço sem tecido/fiapos em um funil sem perfurar o tecido e sem a amostra saliente acima da borda.
- Rotule o funil, ou o papelão ao lado do funil, com o ID da amostra correspondente às notas de coleta de campo.
- Dobre os cantos do lenço sem tecido/fiapos sobre a amostra (Figura 1B). Tenha cuidado para manter a amostra contida no lenço sem tecido/fiapos para que nenhum solo ou detrito possa passar para o fundo do funil.
NOTA: Este passo é para evitar que os cantos draping sobre a borda do funil, onde eles iriam pavio a água do funil sobre os lados. - Com as mãos, uma espátula, ou uma ponta de pipeta, escolha quaisquer insetos ativos, milípedes ou outros animais que possam viajar do funil ao funil, contaminando amostras cruzadas. Enrole a limpeza sem tecido/fiapos inteiramente ao redor da amostra ou coloque um segundo tecido no topo da amostra para evitar a contaminação cruzada.
- Adicione mais água aos funis para que toda a amostra fique submersa (Figura 3).
Figura 3: Funis Baermann montados. Cada amostra é embrulhada em lenço sem tecido/fiapos e submersa sob a água no funil, que está preso. Durante um período de ~12 h, os nematoides migrarão através do tecido e para o fundo do funil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Extração de nematoides dos funis
- Aguarde ~12 h ou durante a noite. Durante este tempo, os vermes ativos se contorcerão para fora do substrato, através da limpeza sem tecido/fiato e até a parte inferior do funil preso.
NOTA: Esperar muito mais do que 12h corre o risco de mortalidade por hipoxia ou infecção patogênica, o que também pode ser um risco em durações mais curtas para amostras que estão particularmente cheias de vermes e bactérias. - Escreva o ID amostra de um funil na parte inferior de uma placa de verme NGM de 60 mm semeada com uma mancha de bactérias OP50 E. coli . Retire a tampa da placa.
- Remova o funil que contém essa amostra do suporte do funil. Usando uma mão para segurar o funil ereta acima da placa de verme aberta, use a outra mão para liberar pressão sobre o grampo de tubulação, permitindo que uma gota de água caia da tubulação sobre a placa de verme (Figura 1C). Assim que a água cair do funil, aperte-a rapidamente novamente para evitar inundar a placa NGM.
NOTA: Para selecionar vermes atraídos pelo OP50, incluindo espécies de Caenorhabditis , solte a gota longe do gramado bacteriano. Quando a água mergulha na placa ou evapora, os nematoides de Caenorhabditis rastejarão para o gramado bacteriano. - Limpeza: Jogue fora o conteúdo dos funis. Lave os funis com água quente para posterior reutilização.
6. Estabelecer as culturas
- Observe os nematoides isolados sob o estereóscópio em uma ampliação de 5x-50x. As placas devem incluir nematoides, e em frequências muito mais baixas, pequenos annelids oligochaete, tardigrades, rotifers e pequenos crustáceos (Figura 4).
NOTA: Se o funil tiver sido configurado corretamente, nenhum ácaro, insetos ou material visível não vivo terá feito isso através do funil.
Figura 4: Conteúdo da primeira gotícula liberada de um funil Baermann em uma placa NGM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Para estabelecer linhas isoherma afrodite ou isofemale, use uma picareta de vermes para transferir cada hermafrodita L4 ou fêmea adulta acasalada (reconhecível pelo seu tamanho maior do corpo e falta da cauda masculina distinta22) para uma placa NGM separada de 35 mm semeada com OP50 (Figura 1D). Use um isqueiro para esterilizar a picareta de vermes antes e depois de transferir vermes.
- Use filme de parafina para embrulhar cuidadosamente as placas para viajar.
Representative Results
Este protocolo foi usado para isolar nematoides de frutas, flores, fungos, solo e caules na Ilha Do Barro Colorado, Panamá, na estação de campo do Instituto smithsoniano de pesquisa tropical em agosto de 2018. Dos 131 substratos processados por um único investigador ao longo de quatro dias, 130 substratos (99,2%) renderam nematoides. Quarenta e quatro dos substratos (33,6%) produziram nematoides caenorhabdite (Figura 5). Análises posteriores das culturas estabelecidas a partir desses quarenta e quatro substratos, por PCR e testes de acasalamento23, revelaram a presença de seis espécies diferentes de Caenorhabditis – C. becei, C. tropicalis, C. briggsae, C. sp. 24, C. sp. sp. 57 e C. panamensis.
Este protocolo foi usado novamente para isolar nematoides de vários substratos na Zona de Exclusão de Chernobyl, ucrânia, durante quatro dias em agosto de 2019. Vermes vivos foram recuperados de 62 das 63 amostras de solo, 1 em cada 17 amostras de invertebrados, 31 de 75 amostras de frutas, 1 em cada 12 amostras de isca (ver seção Discussão) e nenhum verme foi recuperado de amostras de cogumelos, canas de rio ou fezes de lobo (uma amostra coletada de cada). O sequenciamento subsequente do DNA ribossômico 18S15 identificou esses nematoides como Oscheius, Panagrolaimus, Acrobeloides, Mesorhabditis, Panagrellus, Pristionchus e Pelodera, mas nenhuma Caenorhabditis foi identificada (Figura 5).
Figura 5: Taxas de sucesso de duas viagens de coleta. Panamá em 2018 (esquerda) e Ucrânia em 2019 (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O princípio central deste método é que os nematoides passarão pelo tecido submerso na água, enquanto seus contaminantes de substrato e invertebrados maiores não passarão. As etapas críticas do protocolo são (1) a coleta de um substrato apropriado, (2) submergir o substrato, envolto em um material filtrante, em água, (3) coletando vermes que passaram pelo filtro e afundaram até o fundo da água, e (4) isolando vermes individuais para criar linhas isofemale ou isohermafrodita. Todas as outras partes do método são favoráveis à modificação conforme necessário de acordo com os recursos disponíveis, a natureza dos substratos ou as metas de trabalho de campo. Algumas modificações que valem a pena considerar são as seguintes.
Isca dos vermes plantando frutas
Se não houver um amplo suprimento de material podre rico em bactérias para ser encontrado no local do campo, pode-se querer trazer uma amostra, como um pedaço de maçã ou tomate, para deixar apodrecer. Fixe a isca bem com algumas estacas para que animais maiores não os removam e assim ele possa ser facilmente encontrado mais tarde para coleta. Evite a luz solar direta, onde a isca pode secar antes de apodrecer.
Construindo aparelhos de funil a partir de qualquer material disponível
Qualquer estrutura com orifícios grandes o suficiente para acomodar o grampo de tubulação e estável o suficiente para suportar um funil pesado funcionará. Para um único funil, um copo de bebida é um suporte adequado. Qualquer tipo de tecido – tecido facial, papel higiênico ou toalhas de papel – pode ser usado.
Colocar menos material em funis, ou ajustar o tempo de espera, para prevenir hipóxia ou infecção
Se a amostra tiver uma concentração muito alta de vermes ou bactérias, nematoides podem começar a morrer de hipóxia ou infecção antes que a incubação de 12 h esteja completa. Se isso for uma preocupação, o pesquisador pode verificar funis mais cedo ou preparar um funil adicional com uma subamostra muito pequena do substrato altamente povoado.
Ajustando a preparação da placa NGM às necessidades e restrições experimentais
As placas de NGM podem ser preparadas com qualquer mídia e fonte de alimento apropriada para o experimento. O protocolo de campo descrito acima foi projetado para minimizar o peso da bagagem. Dependendo das limitações da bagagem e do tempo de trabalho de campo, trazer placas de GNM já derramadas – preparadas em laboratório ou compradas comercialmente – pode ser preferível ao invés de derramar placas no campo.
Realizando os isolamentos do funil no laboratório
O protocolo descreve a realização do procedimento completo em condições de campo para capturar a população de nematoides como ocorre na natureza. Para alguns objetivos de pesquisa, pode ser suficiente para isolar nematoides mais tarde, depois de viajar de volta ao laboratório com amostras em sacos lacrados. Mesmo assim, o método do funil Baermann fornece uma amostra mais limpa e completa dos nematoides sobreviventes do que outros métodos de isolamento. No entanto, amostras em sacos lacrados podem experimentar seleção durante a viagem, pois estão expostas a potenciais extremos de temperatura e hipóxia. Isso pode ser minimizado realizando isolamentos o mais rápido possível após a coleta da amostra.
Um método alternativo comum ao funil Baermann envolve colocar o substrato diretamente em uma placa de NGM e esperar que os vermes se arrastem para fora, o que é altamente trabalhoso ou resulta na coleta incompleta da população. Também produz placas contaminadas com ácaros e larvas de insetos. O método do funil Baermann é uma estratégia de baixa tecnologia e baixa mão-de-obra para separar rapidamente toda a população de vermes ativos de seu substrato.
O método do funil baermann não é universalmente aplicável para coletar todos os tipos de nematoides selvagens. Alguns nematoides que habitam plantas levam muito mais de 12h para emergir de seu substrato e estarão ausentes de uma gotícula liberada muito cedo, enquanto alguns parasitas de insetos rastejarão até o topo do funil em vez da parte inferior, também fugindo da coleta14. Alternativas ao funil Baermann ou exigem equipamentos mais especializados ou mais mão-de-obra para recuperar os vermes. No entanto, eles ainda podem ser preferidos se as ressalvas acima forem um problema para o experimento. Opções alternativas, revisadas por van Bezooijen14, incluem o método de pulverização de funil, que fornece uma névoa constante de água aos funis, adicionando oxigênio e permitindo o transbordamento de bactérias em suspensão. Isso permite um período de extração mais prolongado de nematoides das plantas. O método de flutuação centrífugas do liquidificador recupera nematoides lentos, inativos ou para cima, separando-os por sua gravidade específica, o elutriador de oostenbrink aplica uma corrente para separar sedimentos de nematoides suspensos, e o Método cobb usa uma série de peneiras para isolar nematoides pelo seu tamanho, forma e taxa de sedimentação14. Para coletar rabditids, porém, o funil Baermann produz efetivamente amostras limpas rapidamente e com o mínimo esforço.
Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R35GM141906 e R21ES031364 e Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 - vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 - worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 - part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 - worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 - part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 - a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 - worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 - for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 - to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 - to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 - filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 - for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 - sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 - worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 - worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 - pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 - worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 - cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 - cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 - tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 - part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 - for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 - to bag a substrate sample |
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