Summary
Detta är en steg-för-steg-guide för att använda ett kommersiellt tillgängligt roterande cellodlingssystem för att odla lymfocyter i simulerad mikrogravitation med hjälp av specialiserade engångsodlingskärl. Denna odlingsmetod kan tillämpas på vilken cellodling som helst av suspensionstyp.
Abstract
Med tanke på de nuvarande begränsningarna för att bedriva biologisk forskning i rymden finns det några alternativ för att utsätta cellodling för simulerad mikrogravitation (SMG) på jorden. Dessa alternativ varierar i sina metoder, principer och lämplighet för användning med suspensionscellodling. Här beskrivs en cellodlingsmetod för att utsätta lymfocyter för simulerad mikrogravitation med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt roterande cellodlingssystem, även känt som en 2D-klinostat eller en roterande väggkärl (RWV) -anordning. Denna cellodlingsmetod använder principen om tidsmedelvärde gravitationsvektor nullifiering för att simulera mikrogravity genom att rotera cellerna på en horisontell axel. Cellerna odlade i detta system kan skördas och användas i många olika experimentella analyser för att bedöma effekterna av simulerad mikrogravitation på cellulär funktion och fysiologi. Odlingstekniken kan variera något beroende på vilken celltyp eller linje som används, men den metod som beskrivs här kan tillämpas på vilken cellodling som helst av suspensionstyp.
Introduction
Rymdfärder har visat sig påverka många aspekter av mänsklig fysiologi, inklusive immunsystemet. Många studier har visat bevis på immundysregulering som ett resultat av rymdfärder in vivo och exponering för simulerad mikrogravitation (SMG) in vitro 1,2,3,4. En viktig aspekt av rymdmiljön som påverkar människans fysiologi är mikrogravitation. Mikrogravitation avser den "viktlöshet" som upplevs på grund av låga gravitationskrafter i rymdmiljön5. När mänskligheten förbereder sig för längre rymduppdrag till månen och Mars måste mer forskning genomföras för att mildra allvarliga hälsorisker hos astronauter.
Verkliga mikrogravitationsförhållanden för vetenskaplig forskning kan uppnås i rymden ombord på den internationella rymdstationen (ISS) eller i nanosatelliter som skjuts upp i omloppsbana. Dessa alternativ kan dock vara otroligt kostsamma och komplexa att orkestrera. Med tanke på de nuvarande begränsningarna för att bedriva biologisk forskning i rymden finns det flera alternativ för att inducera verklig mikrogravitation och SMG på jorden. Storskaliga operationer finns som kan producera korta perioder av verklig mikrogravitation på jorden, inklusive dropptorn, parabolisk flygning och sondraketer. Dessa metoder är dock inte alltför lämpliga för att studera effekterna av mikrogravitation på biologiska system, till stor del på grund av deras korta perioder av mikrogravitationsbehandling (dvs. sekunder till 20 minuter). Dessa metoder diskuteras närmare på annan plats 5,6. Alternativ som är lämpliga för biologisk cellodling inkluderar småskaliga enheter såsom 2D-klinostater eller roterande väggkärl (RWV) enheter och 3D-klinostater eller slumpmässiga positioneringsmaskiner (RPM). Dessa enheter kan placeras inuti cellodlingsinkubatorer som hålls vid 37 °C och 5%CO2, och de roterar cellkulturen antingen på en horisontell axel (2D) eller på två vinkelräta axlar (3D)5. Det är dock viktigt att betona att dessa odlingsmetoder producerar SMG i motsats till verklig mikrogravitation, som mest genomförbart uppnås i rymden för biologiska forskningssammanhang.
Målet med det aktuella papperet är att beskriva stegen för att utsätta lymfocyter för SMG med hjälp av en kommersiellt tillgänglig RWV-enhet (Table of Materials), som faller under 2D-klinostatklassificeringen. Även om det finns ett allmänt protokoll tillgängligt från tillverkaren för att använda den här enheten, syftar den aktuella artikeln till att täcka felsöknings- och optimeringsstegen mer detaljerat. Denna artikel täcker också teorin bakom hur denna enhet fungerar för att producera SMG i suspensionscellodling, speciellt med lymfocyter. Med suspensionscellodling avses i detta sammanhang celler som växer fritt i kompletterade odlingssubstrat, utan att vidhäfta vid någon ytterligare byggnadsställning. Många celltyper odlas i suspensionscellodling, inklusive lymfocyter. Lymfocyter är celler i immunsystemet, inklusive T, B och Natural Killer (NK) celler, som finns i lymfoida organ och blodomloppet7.
RWV 2D-klinostaten som beskrivs här fungerar enligt principen om tidsmedelvärde av gravitationsvektorns nollifiering 5,6,8,9, varigenom gravitationsvektorn randomiseras genom rotation av cellkulturen på en horisontell axel. Detta uppnås genom att matcha odlingskärlets rotationshastighet med cellernas sedimenteringshastighet. Så länge odlingskärlets rotationshastighet matchas väl med cellernas sedimenteringshastighet, hålls cellerna i fritt fall och kan inte sedimentera, vilket upplevs i rymdmiljön. Efter en inledande påskyndningsfas når mediet i odlingskärlet så småningom "fast kroppsrotation" över tiden. Denna horisontella rotation inducerar också laminärt flöde i cellodlingskärlet. Detta skapar en "låg skjuvning" -miljö, med tanke på att skjuvspänningen som induceras på cellerna av laminärt flöde är mycket mindre än för turbulent flöde. Men med tanke på att klinostaten inte är ett perfekt system, finns det några små, laminära vätskerörelser införda, vilket medför minimal skjuvspänning på cellerna. Som sådan dras cellerna suspenderade i media med av detta flöde under rotation. Under horisontell rotation verkar tyngdkraftsvektorn på cellerna och för dem in i en oscillerande bana, som visualiseras i figur 1. En annan liten källa till skjuvspänning orsakas av att cellerna "faller" genom mediet, vilket orsakar laminärt flöde runt cellerna. När odlingskärlet roterar på en horisontell axel roterar också gravitationsvektorn som cellerna upplever. Med tiden närmar sig denna roterande gravitationsvektor i genomsnitt noll; detta fenomen kallas tidsmedelvärde gravitationsvektor nullifiering och inducerar ett tillstånd av SMG 5,6,8,9. Denna enhet har använts för att studera effekterna av SMG på många typer av celler, av vilka några omfattas av referenserna10,11,12. Fler exempel finns på enhetstillverkarens webbplats.
Denna RWV-enhet använder specialiserade "högbildskärl" (HARV) som är tillgängliga via enhetstillverkaren. Dessa HARVs innehåller 10 ml cellkultur vardera; dock finns 50 ml HARVs också tillgängliga. Antingen 10 ml eller 50 ml HARV kan användas beroende på hur många celler som behövs för att slutföra eventuella nedströms experimentella analyser, vilket beskrivs vidare i diskussionsavsnittet. HARVs är gjorda av polykarbonat och inkluderar ett silikonsyresättningsmembran för att möjliggöra gasutbyte under cellodling. Detta upprätthåller pH i cellmediet och möjliggör effektiv cellulär andning. Det finns en huvudöppning och två täckta sprutportar på fartygets yta (figur 2A). Efter att cellkulturen har laddats genom huvudpåfyllningsporten laddas två sprutor på kärlet för att hjälpa till med bubbelavlägsnande. Vid användning av 10 ml kärl fungerar två 3 ml sprutor bra. En spruta är ansluten till enheten tom, med sprutan helt nedtryckt och den andra är fäst fylld med 3 ml cellkultur (figur 2E). Dessa används i kombination för att avlägsna bubblor från kärlet, vilket är viktigt för att upprätthålla SMG-behandlingen. I allmänhet rekommenderas det att ställa in två negativa kontroller, som kan kallas "Flask" -kontrollen och "1G" -kontrollen. Kolvkontrollen motsvarar celler som odlas i en standardcellodlingskolv med T25-suspension. 1G-kontrollen motsvarar celler som odlas i det specialiserade 10 ml odlingskärlet, som helt enkelt placeras i inkubatorn (dvs utan att utsättas för SMG-behandlingen). Se avsnittet Diskussion för mer information om kontroller.
Metoden som beskrivs här är lämplig för alla forskare som vill studera effekterna av SMG på lymfocyter, med ett specifikt fokus på NK-celler med hjälp av NK92-cellinjen13. Resultaten från dessa studier kan hjälpa oss att bättre förstå och mildra de negativa effekterna av rymdfärder på det mänskliga immunsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Följande steg ska utföras inuti ett sterilt biologiskt säkerhetsskåp.
1. Beredning av kärl för cellodling
- Ta ut kulturkärlen ur plastförpackningen. Märk varje kärl på kanten beroende på vilken celltyp/linje som används, om det är kontroll (1G) eller behandling (SMG) och annan relevant information.
- Stabilisera kärlet och öppna påfyllningsporten försiktigt, utan att vidröra påfyllningsportens lockpinne/O-ring. Placera locket på en etanoldyna, med pinnen/O-ringen uppåt, medan kärlet fylls. Ta inte bort locken från sprutportarna.
OBS: Om pinnen / O-ringen av misstag berörs, spraya lockpinnen med 70% etanol och låt den sitta (uppåt) några ögonblick medan du fyller kärlet. När du är redo att stänga påfyllningsporten igen, plocka upp locket med en ny pappersduk för att torka locket noggrant innan du lägger tillbaka det på fartyget. - Fyll kärlet med 10 ml lämpligt komplett medium för cellkulturen med en steril serologisk pipett och sätt försiktigt tillbaka locket på påfyllningsporten.
OBS: Här användes NK92 NK-cellinjen, som odlades i GM1-media, vilket tidigare validerats i en klinisk studie med NK92-celler som cellterapi14. Vilket odlingsmedium som används beror på vilken cellinje eller celltyp som odlas. Kontrollera leverantörens webbplats för rätt medierecept för cellinjen eller celltypen som används. - Se till att sprutportens lock och påfyllningsporten är ordentligt stängda och placera de fyllda kärlen i en 37 °C, 5% CO2-inkubator medan du utför de efterföljande stegen för att förbereda kärlen för cellodling.
OBS: Detta grundningssteg hjälper till att minimera stor bubbelbildning för att göra det enklare att driva ut bubblor senare i steg 6.
2. Beredning av stamcellsodling för SMG-behandlingsupplägget
- När de inte används, förvara cellerna av intresse vid en temperatur lägre än -130 °C eller, helst, i en flytande kväveångfas.
- Minst 1 vecka innan den planerade behandlingen inrättas, tina cellerna och odla dem med hjälp av lämpligt recept för cellodlingsmedia som finns på leverantörens webbplats. Planera hur många celler som behövs för att ställa in behandlingen (detaljer nedan i de efterföljande stegen) och se till att starta kulturerna tillräckligt tidigt för att möjliggöra tillräcklig spridning och anpassning till odling.
- Förvara cellkulturen i en 37 °C, 5% CO2-inkubator . Ytterligare detaljer om standardpraxis för cellodling behandlas på annan plats15.
- På dagen för den planerade SMG-behandlingsuppställningen, bestäm startkoncentrationen och livskraften hos den initiala cellkulturen.
- Använd den föredragna metoden för att bestämma koncentrationen av den initiala cellkulturen (t.ex. hemocytometer, ViCell, flödescytometri, etc.). Notera cellkoncentrationen (celler per ml) och livskraften (%) hos cellerna, vilket säkerställer att livskraften är idealiskt större än 85%. Ett protokoll för användning av en hemocytometer finns någon annanstans16.
- Bestäm lämplig cellsådddensitet / koncentration av cellkulturen för SMG-behandling genom att överväga det optimala cellkoncentrationsområdet för den specifika celltypen / linjen, deras fördubblingstid och längden på SMG-behandlingen. Se avsnittet Diskussion för vidare utveckling.
OBS: Av erfarenhet är det optimala koncentrationsområdet för NK92-celler mellan 0,3 x 106- 1,2 x 106 celler / ml. I allmänhet har dessa celler en fördubblingstid på 48-72 h och matas var 2-3: e dag som sådan. Med tanke på att behandlingslängden var 72 timmar såddes cellerna i den nedre änden av sitt optimala intervall vid 0,4-0,5 x 106 celler / ml. Leverantören rekommenderar också denna sådddensitet vid start av den initiala cellkulturen från en ny injektionsflaska med NK92-celler. - Bestäm volymen stamcellsodling som behövs för att ställa in behandlingen och kontrollerna.
OBS: 10 ml cellodling behövs per experimentgrupp. Om tre försöksgrupper inrättas (dvs. en behandling: "SMG" och två negativa kontroller: "Kolv" och "1G") är ytterligare 10 ml cellodling tillräcklig för alikvot i ett 15 ml rör som används för att fylla på HARV-sprutorna. Detta är totalt 40 ml, vilket kan variera beroende på den specifika experimentella designen. - Bestäm antalet celler som behövs för att ställa in behandlingen.
- Beräkna det totala antalet celler som behövs genom att multiplicera den valda sådddensiteten (celler / ml) med den totala volymen som behövs (ml).
OBS: Från erfarenhet av NK92 bereds 40 ml stamcellsodling enligt beskrivningen ovan vid en såddkoncentration av 0,4-0,5 x 106 celler / ml. Som sådan behövs 16-20 x 106 NK92-celler för att slutföra den typiska behandlingsinställningen. För NK92-cellinjen är det bättre att använda något fler celler än något färre celler för att bibehålla hög livskraft under hela behandlingen.
- Beräkna det totala antalet celler som behövs genom att multiplicera den valda sådddensiteten (celler / ml) med den totala volymen som behövs (ml).
- Bestäm volymen av initial cellodling som ska snurra ner.
- Med tanke på att cellkoncentrationen representeras som celler / ml, dela det totala antalet celler (celler) som behövs för experimentet med den uppmätta startkoncentrationen av cellkulturen (celler / ml).
OBS: Till exempel, om 16 x 10 6 celler behövs och startkoncentrationen av kulturen är 0,8 x 106 celler / ml, bör 20 ml av kulturen spinnas ner.
- Med tanke på att cellkoncentrationen representeras som celler / ml, dela det totala antalet celler (celler) som behövs för experimentet med den uppmätta startkoncentrationen av cellkulturen (celler / ml).
- Gör den slutliga stamcellskulturen.
- Centrifugera lämpligt antal celler vid 300 x g i 8 minuter i ett 50 ml koniskt rör.
- Häll försiktigt av supernatanten i en avfallsbehållare och vrid försiktigt röret för att återsuspendera pelleten i den lilla kvarvarande volymen.
- Återsuspendera cellerna i lämplig volym uppvärmda (37 °C) kompletta medier för att bringa kulturen till önskad sådddensitet. Denna volym beräknades i steg 2.6.
- Täck 50 ml röret ordentligt och vänd det försiktigt några gånger för att blanda cellsuspensionen noggrant.
OBS: Om mer än 50 ml behövs för att ställa in hela experimentet är det bäst att centrifugera det totala antalet celler som behövs i ett 50 ml koniskt rör och resuspendera detta i hälften av den volym som behövs. Blanda sedan väl och gör en 1: 2 utspädning i ett separat 50 ml koniskt rör. Till exempel, om 100 ml behövs vid 0,4 x 10 6 celler / ml, snurra ner 40 x 106 celler i ett 50 ml rör, resuspendera i 50 ml media, överför 25 ml till ett annat 50 ml rör och fyll sedan på båda med 25 ml färskt media.
3. Lastning av fartyg med stamcellsodling
- Hämta de mediagrundade kärlen från inkubatorn.
- Om en kolvkontroll används, fyll på en T25-suspensionsodlingskolv med 10 ml cellkultur från den ovan beredda stammen. Tillsätt också 10 ml stamcellsodling till ett separat 15 ml koniskt rör, som kommer att användas för att ladda sprutorna.
- Skruva av sprutportens lock för att ta bort dem från kärlet och se till att kranarna är i öppet läge (figur 2C).
- Stabilisera kärlet och öppna påfyllningsporten försiktigt, utan att vidröra påfyllningsportens lockpinne/O-ring. Placera locket på en etanoldyna, med pinnen/O-ringen uppåt, medan kärlet fylls. Skruva försiktigt av locken från sprutportarna.
- Se till att kranarna är i öppet läge (figur 2C). Häll försiktigt ut mediet från kärlet i en avfallsbehållare, ta bort mediet med en serologisk pipett eller aspirera det med en steril glaspasteurpipett fäst vid vakuumsystemet utan att vidröra syresättningsmembranet.
- Stäng det 50 ml koniska röret som innehåller stamcellskulturen tätt och vänd det försiktigt några gånger för att blanda innehållet noggrant.
- Dra upp 10 ml cellodlingsmaterial från 50 ml röret med en färsk steril serologisk pipett. Ta upp kärlet och luta det så att påfyllningsporten är mot toppen och fördela sedan försiktigt cellodlingsmaterialet i kärlet genom påfyllningsporten.
OBS: Var försiktig och titta på volymen så att kulturen inte spills genom sprutportarna medan du lutar kärlet. - Sikta på att fylla kärlet direkt till toppen av påfyllningsportens läpp utan att spilla; Luta kärlet nedåt när det fylls för att undvika spill. Var försiktig så att du inte vidrör syresättningsmembranet med pipetten eftersom det är mycket ömtåligt.
OBS: Kärlfyllningsprocessen kan ta lite övning; Var tålmodig och gå långsamt. Om en bubbelfilm bildas vid öppningen av påfyllningsporten kommer detta att störa lastningen av fartyget. Om detta händer, slå försiktigt på kärlet för att bryta tätningen som skapas av bubbelfilmen. - När kärlet är lastat, sätt försiktigt tillbaka påfyllningsportens lock och se till att inte vidröra pinnen/O-ringen.
- Placera på sprutorna.
OBS: Det finns två sprutportar på fartygets yta (figur 2A). En kommer att hålla en tom spruta, och den andra kommer att hålla en spruta full av cellkultur (figur 2E).- Fäst först den tomma sprutan på 3 ml på en av sprutportarna och se till att sprutan är helt nedtryckt.
OBS: Pumpa sprutorna några gånger innan du fäster dem på kärlet eftersom de är lite täta först. Gör detta inuti det biologiska säkerhetsskåpet för att upprätthålla steriliteten. - Stäng det 15 ml koniska röret tätt med 10 ml alikvoterad cellkultur och vänd det försiktigt några gånger för att blanda innehållet noggrant.
- Därefter försiktigt halvt nedsänk den andra 3 ml sprutan i cellkulturen och utarbeta lite kultur. För att minimera luftbubblan i toppen av sprutan, fördela detta helt tillbaka i röret och dra sedan upp 3 ml av kulturen.
- Fäst den fyllda sprutan på den återstående sprutporten och desinficera försiktigt sprutorna och runt påfyllningsporten med en etanoldyna. Få inte etanol på syresättningsmembranet. Nu är fartyget redo att bli av med bubblor.
OBS: Den andra fyllda sprutan för det andra kärlet är svårare att ladda med tanke på djupet på 15 ml röret. Det hjälper till att luta röret medan du fyller sprutan för att upprätthålla tätningen mellan sprutan som fylls och cellkulturen. - Upprepa steg 3.3-3.10 för de återstående kärlen. Om det finns en något otillräcklig mängd cellkultur kvar i 50 ml koniska röret för det sista kärlet (t.ex. 9,5 ml istället för 10 ml), återvinn den återstående mängden från det 15 ml koniska röret som används för att ladda sprutorna.
OBS: Följande steg behöver inte ske i ett sterilt biologiskt säkerhetsskåp, eftersom kärlet nu är ett slutet, sterilt system.
- Fäst först den tomma sprutan på 3 ml på en av sprutportarna och se till att sprutan är helt nedtryckt.
4. Ta bort bubblor från kärlen
OBS: Bubblor är oundvikliga inom denna inställning och måste konsekvent avlägsnas under hela behandlingen (figur 3). Se avsnittet Diskussion för mer information om detta.
- Se till att sprutportens kranar är i stängt läge (figur 2D) för att begränsa migrationen av celler och bubblor från sprutorna in i kärlen. Detta är särskilt viktigt senare under behandlingen (diskuteras nedan). För att samla de första bubblorna, vänd kärlet upp och ner och slå på sidan av det några gånger.
- Vänd snabbt kärlet bakåt för att vända uppåt och sedan i en liten vinkel uppåt så att bubblorna flyter uppåt på kärlets sida (figur 3B).
- Manövrera bubblorna under porten med den tomma sprutan och se dem börja komma in i hamnen. Öppna båda stoppkranarna i sprutporten (figur 2C).
- Slå försiktigt på kärlet för att uppmuntra bubblorna att flyta upp i den tomma sprutan. Sug långsamt upp de större bubblorna med den tomma sprutan, medan du försiktigt trycker in hela sprutan, för att bibehålla trycket i kärlet så att syresättningsmembranet inte spricker.
OBS: Större bubblor måste sugas upp, medan små bubblor och mikrobubblor kan uppmuntras att flyta upp i sprutan genom att manövrera dem in i sprutportarna och försiktigt träffa kärlet. Efter några timmars behandling är det mycket viktigt att minimera "korskontaminering" mellan cellerna i sprutorna och cellerna i odlingskärlet. Detta beror på att cellerna i sprutorna inte får samma mängd syresättning eller exponering för SMG som cellerna i kärlet gör. - Upprepa steg 4.2-4.4 några gånger för att säkerställa att alla bubblor tas bort. Ta bort alla bubblor inklusive mikrobubblor från kärlen.
OBS: Bubblorna kan lätt ses genom syresättningsmembranet (baksidan av kärlet) när kärlet är riktat mot en ljuskälla (fönster, ljus, etc.). När du utför steg 4.2 och 4.3, titta på bubblorna som rör sig från baksidan av kärlet för att visualisera de svårare att se bubblorna. - När bubblorna har avlägsnats effektivt, stäng sprutportens stoppkranar. Behåll sprutorna på under behandlingen för att möjliggöra efterföljande bubbelavlägsnande, vilket säkerställer att volymen i båda sprutorna är ungefär lika.
5. Fäst kärlet på den roterande basen
- Torka försiktigt av ytan på den roterande basen och bandkabeln med 70% etanol.
- Se till att den medföljande bandkabeln är ansluten till strömförsörjningen. Placera den roterande basen i inkubatorn och fäst bandkabeln på basen. Se till att strömförsörjningen hålls nära men utanför inkubatorn. Figur 4 visar den roterande basen och strömförsörjningen för sammanhang.
- Fäst SMG-behandlingskärlet genom att rikta in kärltrådarna på den roterande pinnen och vrid försiktigt den roterande pinnen på basen moturs. Se till att fartyget är ordentligt fastsatt. Se till att inkubatorn håller nära 100% fuktighet genom att fylla vattenbrickan med tillräckligt med autoklaverat, omvänd osmos (RO) vatten.
- Välj en lämplig rotationshastighet (rpm). Justera rotationshastigheten för att matcha cellernas sedimenteringshastighet, så att cellerna inte "faller genom mediet" alls utan slutar rotera i en liten omloppsbana. Detta fenomen visualiseras som ett schematiskt diagram i figur 1.
OBS: Företaget rekommenderar att rotationen startas vid 8-10 rpm för lymfocyter. I detta fall roterades NK92-celler vid 11 rpm, vilket visats i en tidigare artikel17. Beroende på cellstorleken bör varvtalet ökas för större celler och minskas för mindre celler. Samma mönster gäller om cellerna som används tenderar att klumpa ihop sig under odlingen. Se avsnittet Diskussion för mer information om detta.
6. Behandlingar
- Välj en lämplig behandlingslängd för forskningsansökan, vilket kan bero på vilka parametrar för cellfunktion/fysiologi som analyseras. Se avsnittet Diskussion för mer information om detta.
OBS: I detta fall utsattes NK92-celler för en 72 h SMG-behandling, baserat på resultat från tidigare studier18,19. Bubblor kommer oundvikligen att bildas under hela behandlingen och måste tas bort. Rotationen kan stoppas kort och startas om för att underlätta detta. Se steg 7.1 för hur du tar bort SMG-kärlet på ett säkert sätt. - På den första dagen av inrättning av behandlingen, kontrollera bubbelbildning med några timmars mellanrum genom att upprepa steg 4.2-4.6. Efter den första dagen, kontrollera kärlen vid behov (minst en gång per dag), upprepa steg 4.2-4.6, tills slutet av behandlingen.
7. Skörda celler från kärlen
- När den planerade behandlingslängden har förflutit, stoppa rotationen och demontera apparaten. Ta bort SMG-behandlingskärlet genom att försiktigt hålla kärlet stillastående medan du vrider enhetens roterande pinne medurs.
- Ta kontrollkolven, kontrollkärlet 1G och det behandlade SMG-kärlet i ett sterilt biologiskt säkerhetsskåp.
- Ta varje kärl (endast 1G och SMG, inte kolven) och vänd det upp och ner så att det vetter nedåt och slå försiktigt på det för att få alla celler i suspension. Vänd sedan kärlet på sidan med påfyllningsporten mot botten och slå fartyget igen för att uppmuntra cellerna mot påfyllningsporten för effektiv aspiration.
- Hantera varje kärl individuellt. Skruva loss sprutorna från de två portarna och kasta dem i det biologiska avfallet. Öppna kranarna på sprutportarna.
- Ta försiktigt bort locket till påfyllningsporten och dra upp innehållet med en steril 10 ml serologisk pipett och luta kärlet när det töms. Fördela innehållet i grupperna "Flask", "1G" och "SMG" i individuellt märkta 15 ml koniska rör.
- Stäng varje rör och vänd dem försiktigt några gånger för att säkerställa att de blandas ordentligt. Använd den föredragna metoden för att bestämma koncentrationen och viabiliteten hos den resulterande cellkulturen för att förbereda för användning i efterföljande experimentella analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna odlingsmetod anses framgångsrik om 1) cellernas proliferation är ungefär konsekvent över kontrollgrupperna (och helst alla experimentgrupper), 2) proliferationen är lämplig med tanke på sådddensiteten, behandlingens längd och fördubblingstiden för celltypen / linjen och 3) livskraften hos de skördade cellerna är 85% eller högre (tabell 1 ). Helst bör de resulterande cellerna vara lika friska som de skulle vara i standardcellodling, speciellt för användning i efterföljande experiment och analyser (dvs livskraft 85% eller högre). Denna odlingsmetod anses vara misslyckad om motsatsen är sant, varigenom de resulterande cellerna antingen dör, skiljer sig väsentligt i proliferation mellan kontrollgrupperna eller har suboptimal viabilitet runt 70% eller lägre (tabell 1). Spridning i SMG-behandlingsgruppen kan eller inte kan skilja sig jämfört med kontrollerna, beroende på hur SMG-behandlingen påverkar cellfysiologin. Detta har dock inte varit ett problem hittills, och cellproliferationen var ungefär lika stor i kontroll- och behandlingsgrupperna (tabell 1). Som tidigare nämnts är dessa parametrar viktiga för framgången med nedströmsanalyser och experiment, och de resulterande cellerna från de två kontrollgrupperna bör prestera relativt lika.
Figur 1: Schematiskt diagram över den lokaliserade omloppsbanan för cellerna odlade i det simulerade mikrogravitationskärlet (SMG) under drift. RWV 2D-klinostaten som beskrivs här fungerar enligt principen om tidsmedelvärde av gravitationsvektorns nollifiering 5,6,8,9, varigenom gravitationsvektorn randomiseras genom rotation av cellkulturen på en horisontell axel. Detta uppnås genom att matcha odlingskärlets rotationshastighet med cellernas sedimenteringshastighet. Efter en inledande påskyndningsfas når mediet i odlingskärlet så småningom "fast kroppsrotation" över tiden. Denna horisontella rotation inducerar också laminärt flöde i cellodlingskärlet. Detta skapar en "låg skjuvning" -miljö, med tanke på att skjuvspänningen som induceras på cellerna av laminärt flöde är mycket mindre än för turbulent flöde. Men med tanke på att klinostaten inte är ett perfekt system, finns det några små, laminära vätskerörelser införda, vilket medför minimal skjuvspänning på cellerna. Som sådan dras cellerna suspenderade i media med av detta flöde under rotation. Under horisontell rotation verkar tyngdkraftsvektorn på cellerna och leder dem in i en oscillerande bana, som visualiseras här. När odlingskärlet roterar på en horisontell axel roterar också gravitationsvektorn som cellerna upplever. Med tiden närmar sig denna roterande gravitationsvektor i genomsnitt noll; detta fenomen kallas "tidsmedelvärde gravitationsvektor nullifiering" och inducerar ett tillstånd av SMG 5,6,8,9. Denna siffra har modifierats från Castro et al., 201120. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: 10 ml kärl med högt bildförhållande ( HARV). a) Fågelperspektiv över HARV, som visar huvudfyllningsporten och två sprutportar. (B) Baksidan av HARV som visar skruvporten för anslutning av HARV till den roterande basen och syresättningsmembranet. (C) Sidovy av HARV som visar öppna sprutportar (lockade). (D) Sidovy av HARV som visar stängda sprutportar (lockade). E) Sidovy av HARV som visar de två 3 ml sprutor som är fastsatta. Den vänstra sprutan är fylld med cellodling och den högra sprutan är tom. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bubblor i HARV. a) Fågelperspektiv av HARV, som visar bubblor som ska elimineras från cellkulturen. (B) Sidovy av HARV, som visar samma bubblor. Observera hur bubblorna varierar i storlek; Mikrobubblor måste också tas bort. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: RWV-anordningens roterande bas och strömförsörjning . (A) Framifrån av den roterande basen, som visar fyra roterande pinnar som rymmer upp till fyra odlingskärl. (B) Bakifrån av den roterande basen, som visar ingången för bandkabeln (inte på bilden) som förbinder basen och strömförsörjningen. (C) Framifrån av strömförsörjningen som hålls ovanpå inkubatorn. Notera på/av-knappen till vänster och varvtalsjusteringsratten till höger. Strömförsörjningen är ansluten till närmaste uttag (vanligtvis på inkubatorns baksida) och innehåller en ingång för bandkabeln för att ansluta till den roterande basen. Strömförsörjningen stannar utanför inkubatorn. Basen placeras inuti inkubatorn (37 °C, 5% CO2) under drift, och bandkabeln matas genom inkubatordörren och ansluts till strömförsörjningen. Bandkabeln stör inte inkubatorns tätning. När den roterande basen inte används ska den förvaras utanför inkubatorn, förvaras säkert på en laboratoriebänk eller hylla. Se materialförteckningen för information om den kommersiella enhet som används. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| # | Inledande lönsamhet | Sådddensitet celler / ml | Slutlig lönsamhet (F) | Slutlig lönsamhet (1G) | Slutlig lönsamhet (SMG) | Avsluta Conc (F) celler/ml | Avsluta Conc (1G) celler/ml | End Conc (SMG) celler/ml | Anteckningar | |||||
| Suboptimal startlivskraft och sådddensitet (negativt resultat) | 1 | 79% | 0,2 x 106 | 67% | 60% | 60% | 0,10 x 106 | 0,075 x 106 | 0,071 x 106 | Låg såddtäthet och suboptimal startlivskraft ledde till celldöd under behandlingsperioden | ||||
| 2 | 73% | 0,2 x 106 | 43% | 63% | 70% | 0,071 x 106 | 0,081 x 106 | 0,085 x 106 | ||||||
| Optimal startlivskraft och sådddensitet (positivt resultat) | 3 | 93% | 0,4 x 106 | 93% | 93% | 96% | 1,2 x 106 | 1,1 x 106 | 1,5 x 106 | Lämplig sådddensitet och optimal startlivskraft ledde till hälsosam celltillväxt och livskraft under hela behandlingen | ||||
| 4 | 92% | 0,4 x 106 | 92% | 92% | 94% | 0,81 x 106 | 0,80 x 106 | 0,70 x 106 | ||||||
Tabell 1: Jämförelsediagram som visar misslyckade och framgångsrika simulerade mikrogravitationsbehandlingar (SMG). NK92 startviabilitet och sådddensitet jämfördes med den resulterande slutviabiliteten och slutkoncentrationerna efter en 72 h SMG-behandling i en 37 °C cellodlingsinkubator kompletterad med 5% CO2. Två fall av negativa utfall och två fall av positiva utfall jämfördes. Som jämförelse, notera att det optimala koncentrationsområdet för NK92-cellinjen som användes var mellan 0,3 x 10 6 celler / ml och 1,2 x 106 celler / ml, med en fördubblingstid på cirka 2-3 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När mänskligheten förbereder sig för längre rymduppdrag till månen och Mars måste mer forskning genomföras för att mildra allvarliga hälsorisker hos astronauter. En viktig aspekt av rymdmiljön som påverkar människans fysiologi är mikrogravitation. Här har en cellodlingsmetod beskrivits för att utsätta lymfocyter för SMG med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt roterande cellodlingssystem.
Detta protokoll innehåller några kritiska steg som kan behöva optimeras beroende på vilken celltyp eller linje som används. Dessa inkluderar 1) att välja en lämplig sådddensitet beroende på cellernas fördubblingstid och längd på SMG-behandling, och 2) att bestämma en optimal behandlingslängd, rotationshastighet och lämpliga kontroller. Att välja en sådddensitet som ligger i mellanområdet av lämpliga cellkoncentrationer för den celltyp eller linje som studeras bör vara tillräckligt. Att välja en sådddensitet som är för låg kan dock leda till låg cellproliferation och livskraft (tabell 1), och att välja en densitet som är för hög kan leda till för tidig näringsutarmning och låg cellviabilitet. Den valda sådddensiteten beror också på fördubblingstiden för cellerna som studeras; Celler med kortare fördubblingstid kan sås med en lägre densitet, och de med en längre fördubblingstid kan behöva sås med högre densitet. Såningstätheten och längden på behandlingen beror också på hur många celler som behövs för att slutföra de efterföljande experimentella analyserna. Av erfarenhet har sådd av mycket livskraftiga (90% +) NK92-celler vid 0,4-0,5 x 10 6 celler / ml i 10 ml kärl (dvs 4-5 miljoner celler per experimentgrupp; optimalt intervall för cellinjen = 0,3 x 10 6-1,2 x 106 celler / ml, fördubblingstid = 2-3 dagar) och behandling av dem i 72 timmar gett ungefär 8-15 miljoner celler (tabell 1). Som sådan var 10 ml-kärlen lämpliga för att skörda celler för både funktionella analyser (3 x 10 6 celler) och samla celler för qPCR (1 x 10 6 celler) och western blot (2 x 10 6-6 x 10 6 celler). Supernatanter kan också samlas in för analys av sekretoriska komponenter. Men 50 ml kärl är också tillgängliga och kan användas när större cellutbyte krävs. Vid användning av 50 ml kärl måste större sprutor också användas.
Att bestämma en lämplig behandlingslängd beror också på celltypen / linjen som används. Om tidigare studier finns, bör de hänvisas till för att välja en lämplig behandlingslängd att börja med. Några studier har använt RWV-enheter för att odla NK-celler och refereras här17,18,19. Därifrån bör behandlingsresultaten eller hur väl cellerna förökade sig och deras livskraft och deras prestanda i efterföljande experimentella analyser undersökas. Det kan vara möjligt att förlänga behandlingslängden förbi 72 timmar genom att avlägsna cellkulturen från kärlen till ett rör, centrifugera och sedan återsuspendera cellerna i 10 ml varmt, färskt komplett odlingsmedium, ersätta dem i kärlen och starta om rotationen. Detta kan dock leda till förvirring på grund av exponering för hypergravitation genom centrifugering, och splittring/utspädning av cellerna kan vara nödvändigt för att säkerställa att cellerna hålls inom sitt optimala koncentrationsintervall. Om några stimulerande molekyler (t.ex. LPS, cytokiner, etc.) ska användas, rekommenderas att dessa tillsätts i lämplig koncentration till det fullständiga mediereceptet innan SMG-behandlingen inleds.
Att ställa in en lämplig rotationshastighet (rpm) är också nyckeln till att upprätthålla den simulerade mikrogravitationsbehandlingen. Företaget rekommenderar att man börjar med en rotationshastighet mellan 8 och 10 rpm vid odling av lymfocyter. Av erfarenhet har en hastighet på 11 rpm fungerat bra för att säkerställa att NK92-celler hålls i suspension och har använts i en tidigare NK-cellstudie17. Beroende på tillväxtmönstren för den celltyp/linje som används kan rotationshastigheten behöva ökas för att ta hänsyn till cellklumpning. Detta skulle leda till ökad sedimentering av cellerna på grund av ökad massa. För en optimal SMG-behandling måste odlingskärlets rotationshastighet justeras för att matcha sedimentationshastigheten hos cellerna 5,6,8,9. Med andra ord bör celler eller cellklumpar inte ses falla genom media, och de bör förbli relativt stationära.
I detta sammanhang är det god praxis att prova två negativa kontroller genom att jämföra celler som odlats i en standard T25-odlingskolv ("kolv") och celler som odlats i den specialiserade HARV men inte utsatts för SMG (dvs. bara placerats i inkubatorn; "1G"). Helst bör cellprestanda och resultat i nedströms experimentella analyser mellan de två negativa kontrollerna vara jämförbara. Eventuella inkonsekvenser bör noteras. För de flesta analyser är den bästa jämförelsen sannolikt mellan "1G" -kontrollen och SMG-behandlingen; Att inkludera både "Flask" och "1G" -kontrollerna kan dock vara fördelaktigt för tillräcklig jämförelse och initial optimering.
De största begränsningarna i detta protokoll inkluderar 1) bubbelbildning under cellodling, 2) omfattningen av SMG och 3) den möjliga behandlingstiden. Det är viktigt att övervaka bubbelbildning under hela SMG-behandlingen. Även små mikrobubblor kan ackumuleras, växa och leda till bildandet av mycket störande större bubblor. Dessa större bubblor avbryter lågskjuvvätskedynamiken i odlingskärlet, vilket orsakar ökad turbulens när vätskeflödet avböjs runt bubblan21. I slutändan stör detta helt SMG-tillståndet. Detta fenomen diskuteras utförligt och visualiseras av Phelan et al21. Dessutom är det viktigt att komma ihåg att den här enheten producerar SMG och inte verklig mikrogravitation som upplevs ombord på ISS6. Ändå har studier visat liknande effekter av SMG som produceras av denna enhet jämfört med effekter av verklig mikrogravitation från studier utförda på ISS 1,5,6.
Det finns alternativa metoder för att utsätta cellodling för SMG. Dessa inkluderar användning av 3D-klinostater eller slumpmässiga positioneringsmaskiner (RPM) och diamagnetisk levitation. 3D-klinostater roterar cellodling på två vinkelräta axlar med samma hastighet, medan varvtal roterar på två vinkelräta axlar, varigenom både rotationshastigheten och rotationsriktningen randomiseras 5,6. Därför, jämfört med 2D-klinostater eller RWV-enheter, är varvtal mer komplexa, vilket medför flera fördelar och nackdelar. För det första kan graden av mikrogravitation som kan uppnås i ett varvtal moduleras för att simulera partiell gravitation, såsom den som upplevs på månen (0,16 g) och Mars (0,33 g)6. Den extra komplexiteten hos randomiserade rotationsriktningar och hastigheter kan emellertid introducera ryckrörelse och accelerativa krafter, särskilt mot de yttre områdena av odlingskärlet, vilket kan leda till förvirring i data. Diamagnetisk levitation exponerar prover för starka repulsiva magnetfält för att motverka vikten av vatten i biologiska prover, som ett sätt att motverka gravitationen. Det starka magnetfältet som genereras för att göra det kan emellertid också påverka cellerna negativt, vilket introducerar förvirringar till data 5,6. Dessa metoder diskuteras närmare på annan plats 5,6.
Sammanfattningsvis är det kommersiellt tillgängliga roterande cellodlingssystemet som diskuteras här en relativt lättanvänd, tillgänglig plattform för forskare som vill studera effekterna av SMG på lymfocyter. Även om det finns begränsningar för denna cellodlingsmetod, är det fortfarande ett genomförbart alternativ för odling av lymfocyter och potentiellt andra suspensionscellkulturer i simulerad mikrogravitation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Canadian Space Agency (CSA), forskningsbidrag (17ILSRA3, Immuno Profile). Författare vill erkänna och tacka Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) och Preteesh Mylabathula (University of Arizona) för deras hjälp med den första felsökningen av detta protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
References
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. The Immune System in Space: Are we Prepared. , Springer International Publishing. Cham. (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology 9th Edition. , Garland Science/Taylor & Francis Group LLC. New York, NY. (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022).
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
