Summary
Kvalitetskontrolvurderingen af mælkesyrebakterier (LAB) kulturer er blevet bekræftet som en effektiv måde at forbedre levedygtigheden og funktionaliteten af LAB-stammer til fermenteringsprocedurer. For at understøtte denne påstand udviklede vi en protokol, der belyser, hvordan LAB-kulturer aktiveres og dyrkes til fermenterings- og biobehandlingsprocedurer.
Abstract
Mælkesyrebakterier (LAB) er essentielle mejeristarterkulturer, der er væsentligt anvendt til fremstilling af fermenterede mejeriprodukter som yoghurt og ost. LAB producerer overvejende mælkesyre som et vigtigt slutprodukt af fermentering, og de syntetiserer vigtige metabolitter, der giver de organoleptiske egenskaber ved fermenterede fødevarer. LAB er kræsne bakterier, der trives i mange miljøer, når tilstrækkelige ernæringsmæssige krav er opfyldt. Efterspørgslen efter overlegne LAB-mejeristarterkulturer til fermenteringsapplikationer i fødevare- og mejeriindustrien har resulteret i behovet for at levere levedygtige og aktive kulturer til alle bioforarbejdningsoperationer. Udviklingen af en standardprotokol til sikring af levedygtigheden og forbedret funktionalitet af LAB-kulturer i laboratoriet såvel som mejeriforarbejdningsmiljøer er derfor meget kritisk. For at løse bekymringer forbundet med genoplivning af svage, stressede og skadede LAB-kulturceller er en protokol, der levende skitserer fremtrædende trin til at komme sig, forbedre celleregenerering og forbedre metabolisk funktionalitet af LAB-stammer, af største betydning. Vedligeholdelsen af kulturens renhed, funktionalitet og levedygtighed for LAB-startkulturer er ligeledes kritisk. Derfor vil overholdelse af en unik protokolretningslinje resultere i fremme af fermenteringsydelse for mange LAB-stammer dedikeret til fermenterings- og bioteknologiske processer. Som et resultat har Food Microbiology and Biotechnology Laboratory ved North Carolina Agriculture and Technical State University udviklet en standardprotokol til aktivering og kvalitetskontrol af udvalgte LAB-stammer, der har resulteret i yderst funktionelle og levedygtige LAB-kulturstammer, der anvendes til fermenteringsforskning. Tilpasningen og anbefalingen af en protokol som denne til brug i mejeri- og fødevareindustrien vil bidrage til at sikre LAB's levedygtighed og funktionalitet til mange applikationer.
Introduction
Mælkesyrebakterier (LAB) er en gruppe af unikt forskelligartede bakterier, der har industrielt potentiale. Stammer tilhørende Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus og Streptococcus thermophilus anvendes mest som mejeri starter kulturer til fermenterede mejeriprodukter såsom yoghurt1. Udvalgte LAB stammer er også klassificeret som probiotika, da de giver sundhedsmæssige fordele for mennesker, når doser er tilstrækkeligt administreret2. Mælkesyrebakterier er også grampositive, ikke-sporedannende, ikke-respirerende, men aerotolerante mikroorganismer, der generelt er karakteriseret ved produktion af mælkesyre som et nøglefermenteringsprodukt. LAB syntetiserer også essentielle metabolitter, for eksempel organiske syrer, bakteriociner og andre antimikrobielle forbindelser3, der kan hæmme et bredt spektrum af fødevarebårne patogener4. Mælkesyre, et vigtigt slutprodukt af kulhydratkatabolisme og et biprodukt af LAB-fermentering, er en organisk metabolit, der besidder antimikrobielle egenskaber og er potentielt nyttig til fødevarebiokonserveringsapplikationer 3,5,6. Desuden giver de organiske syrer, der produceres af LAB, smag, tekstur og aroma af fødevarer, hvilket øger deres samlede organoleptiske egenskaber 5,6. De forskellige ernæringsmæssige krav i LAB kombineret med deres allestedsnærværende natur gør det i sidste ende muligt for bakterierne let at trives i forskellige miljøer såsom mejeribaserede fødevarer, gærede fødevarer, grøntsager såvel som i den menneskelige tarm7.
Der er en stigende efterspørgsel efter startkulturer fra LAB til yoghurtproduktion og mange forskellige mejeriapplikationer8,9, derfor bør kritisk opmærksomhed og etablerede videnskabelige teknikker overholdes i LAB-stammedyrkning såvel som i aktivering af både frysetørrede og isolerede stammer, da denne aktivitet er afgørende for forbedret gæringsydelse. Fødevaremikrobiologi- og bioteknologilaboratoriet engagerer sig derfor aktivt i passende teknologiudvikling rettet mod aktivering, overlegen vækst og gæring, der er karakteristisk for LAB-stammer isoleret fra fermenterede mejeriprodukter såvel som fra industrielle starterkulturer, der anvendes til yoghurtproduktion. Desuden er det bemærkelsesværdigt, at LAB-kulturstammer, der produceres industrielt, gennemgår konserveringsaktiviteter såsom frysetørring og frossen opbevaring, hvilket forårsager cellestress og skade som følge af den koldchokproces, de udsættes for10. For at begrænse levedygtighedsudfordringerne og forbedre funktionaliteten af LAB-stammer opnået fra enten isolerede fødevarer eller frysetørrede produkter er det vigtigt at aktivere disse kulturer korrekt som en form for kvalitetskontrol for at forbedre deres fermenterende egenskaber8. I denne undersøgelse var målet at udvikle en intern kvalitetskontrolprotokol til aktivering og vækst af L. delbrueckii subsp. bulgaricus-kulturstammer, der i sidste ende fremmede levedygtig LAB-vækst, samt forbedrede fermenteringsydelsen og den metaboliske funktionalitet af LAB-stammer. Denne protokol kan i sidste ende tilpasses (ved hjælp af optimale vækstmedier og passende dyrkningsforhold) til dyrkning af andre LAB-stammer til fermenteringsforskning såvel som til industrielle formål eller bioforarbejdningsoperationer. Denne LAB-aktiverings- og kvalitetskontrolprotokol vil derfor sikre, at der opnås overlegne levedygtige mejeristarterkulturer, der potentielt er funktionelle til forskellige applikationer i den globale mejeri- og fødevareindustri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generelle materialer og metoder
- Kilde til Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
- Få L. bulgaricus stammer fra pålidelige kilder.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev i alt fem (5) L. bulgaricus-stammer anvendt i kvalitetskontrolundersøgelsen (tabel 1). To stammer af frysetørret L. bulgaricus til industriel produktion af fermenterede mejeriprodukter blev leveret af Dr. Albert Krastanov, Institut for Bioteknologi ved University of Food Technologies, Plovdiv, Bulgarien. To stammer isoleret fra kommercielle yoghurtprodukter, der var tilgængelige på det amerikanske marked, blev opnået fra -80 ° C-lageret i fødevaremikrobiologi- og bioteknologilaboratoriet ved North Carolina A &T State University, og en frysetørret stamme blev leveret af en sælger C. Alle LAB-stammer blev holdt ved -80 °C indtil videre brug. En anden bakteriestamme (Limosilactobacillus reuteri) blev opnået fra -80 ° C-bestanden af fødevaremikrobiologi og bioteknologilaboratoriet ved North Carolina A &T State University blev også evalueret.
- Få L. bulgaricus stammer fra pålidelige kilder.
- Standard L. MRS gæring bouillon medium
- Forbered deMan, Rogosa Sharpe (MRS) medium ved fuldstændig opløsning af 55 g MRS og 0,5 g L-cystein i 1 liter deioniseret vand (DW).
- Der dispenseres 7 ml og 2 ml af den tilberedte MRS-opløsning i henholdsvis reagensglas, autoklave ved 121 °C i 15 minutter, og afkøles derefter ved stuetemperatur (RT).
- MRS agar medium
- Forbered MRS agar medium ved fuldstændig opløsning af 55 g MRS og 0,5 g L-Cystein i 1 L DW. Tilsæt agarpulver (15 g), steriliser agarmediet ved 121 °C i 15 min., og afkøl det derefter i et vandbad.
- Hæld alle frisklavede medier i sterile petriskåle og opbevar dem ved 4 °C, indtil det er nødvendigt yderligere.
- Modificeret forstærket clostridial medium-pyruvat (mRCM-PYR)
- Optimer et forstærket clostridialmedium ifølge Oyeniran et al.13 og Nwamaioha og Ibrahim18 for selektivitet og nøjagtig optælling af L. bulgaricus ved at opløse 10 g pepton # 3, 10 g oksekødekstrakt, 5 g gærekstrakt, 5 g natriumchlorid, 3 g natriumacetat, 2 g kaliumphosphatdibasisk, 0,1 g uracil, 0,25 g calciumchlorid, 5 g dextrose, 5 g fructose, 10 g maltose, 2 g natriumpyruvat, 0,2% Tween 80 og 0,5 g L- Cystein i 1 liter DW.
- Den endelige pH-værdi (6,0 ± 0,2) i opløsningen justeres med 6 N HCl før tilsætning af 0,008 % anilinblåt og 15 g agar. Autoklave mediet ved 121 °C i 15 min, afkøles i et vandbad og hældes i sterile petriskåle. Alle frisklavede medier opbevares i sterile petriskåle ved 4 °C, indtil det er nødvendigt.
- Glycerolbestand af LAB-kulturer
- Forbered glycerollagre (50% glycerol) ved at fortynde 100% glycerol i samme volumen DW og steriliser ved 100 ° C i 30 minutter ved hjælp af en tør steriliseringscyklus. Afkøl glycerollagrene til RT og opbevar dem aseptisk til videre brug.
- Brug bakterievækst (en enkelt koloni af L. bulgaricus opnået ved hjælp af den udviklede QC-protokol) fra dag-til-dag-kulturer.
- Pipetter 500 μL af nattens kulturer til 50% glycerol i et 2 ml centrifugerør og bland dem forsigtigt sammen. Frys og opbevar glycerolbestanden indeholdende LAB-kulturerne ved en ultralav temperatur på -80 °C, indtil det er nødvendigt.
BEMÆRK: Et grafisk skema over protokollen til kvalitetskontrol og aktivering af LAB-kulturer er vist i figur 1.
| Nej | Produkt kode | Prøve | Kilde | Bakteriesammensætning som mærket1 |
| 1 | S9 | Ren industriel belastning | Bulgarien | Lb. bulgaricus |
| 2 | LB6 | Ren industriel belastning | Bulgarien | Lb. bulgaricus, |
| 3 | ATCC 11842 | Ren industriel belastning | ATCC | Lb. bulgaricus |
| 4 | ALLIKE | Yoghurt | De Forenede Stater | Lb. bulgaricus, anden levende kultur |
| 5 | E22 | Yoghurt | De Forenede Stater | Lb. bulgaricus, anden levende kultur |
| 6 | Reuteri | Yoghurt | De Forenede Stater | Limosilactobacillus reuteri |
| 1lb. = Lactobacillus | ||||
Tabel 1: Probiotiske stammer. Tabellen viser de probiotiske stammer, der anvendes i denne undersøgelse.
2. Protokol til aktivering og kvalitetskontrol af LAB-kulturer
- Tag den tilberedte glycerolbestand af LAB-stammer (i 2 ml centrifugerør) fra -80 °C ultra-lav fryser, og lad dem ikke tø op før brug.
- Rengør og desinficer åbningen af centrifugerørene med 70% alkohol og forsigtigt hvirvel før brug.
- Der pipetteres ca. 250 μL (0,25 ml) af LAB-stamkulturen fra centrifugerørene til friske 2 ml MRS-reagensglas.
- Forsigtigt hvirvel, parafilmer reagensglassene og inkuberer dem anaerobt natten over ved 42 °C i 12-16 timer.
- Tag ca. 500 μL (0,5 ml) fra de dyrkede kulturer natten over fra 2 ml MRS-reagensglas til friske 7 ml MRS-reagensglas, hvirvel, og inkuberer dem anaerobt natten over ved 42 ° C i 12-16 timer.
- Vurder den mikrobielle vækst ved at måle den optiske tæthed (OD) eller vækst af kulturerne ved 610 nm med et UV-synligt spektrofotometer, og registrer acceptable resultater mellem 0,7 og 0,9.
- Stribe de natlige kulturer fra 7 ml MRS-rør på MRS- og MRCM-PYR-agarplader og inkuber dem anaerobt i 72 timer ved 42 °C.
- Pluk isolerede kolonier fra agarpladerne, overfør dem til friske 7 ml MRS-reagensglas, forsigtigt hvirvel, og inkuber dem anaerobt natten over ved 42 ° C i 12-16 timer.
- Opbevares agarpladerne med de isolerede stammer ved 4 °C i køleskabet i en uge.
- Mål og bekræft OD (mellem 0,7 og 0,9) fra 7 ml MRS-reagensglas i LAB-kulturerne isoleret fra de stribede plader ved 610 nm og brug dem som arbejdskulturer til alle relaterede eksperimenter.
- Udfør ti gange fortyndinger (serielt fortyndet) af de dyrkede LAB-kulturer fra de endelige 7 ml MRS-reagensglas ved hjælp af 9 ml peptonvand (en fysiologisk buffer) for at opnå et forhold på 1:10.
- Endelig tages ca. 250 μL (0,25 ml) fra passende serielle fortyndinger til alle fermenteringsforsøg.
- Bouillonen indeholdende stammer (250 μL) aktiveres fra trin 2.12 ved at overføre dem til frisk 7 ml MRS-bouillon og inkubere dem anaerobt ved 42 °C i 16 timer.
- Fortsæt med at gentage trin 2.6-2.12 for at sikre levedygtig og overlegen cellevækst fra LAB-kulturer.
BEMÆRK: Alle L. bulgaricus-stammer blev aktiveret i den frisklavede MRS-bouillon og blev derefter inkuberet anaerobt ved 42 ° C i 16 timer for at nå en optisk tæthed (OD610 nm) af bakterievækst mellem 0,7 og 0,9. Bakterievæksten blev målt med et UV-synligt spektrofotometer ved 610 nm. pH-værdierne for dag-til-dag-kulturerne lå i intervallet 3,5 til 5,3 som følge af produktionen af mælkesyre, et organisk slutprodukt af LAB-fermentering. Sikkerhedsprocedurer såsom korrekt luftstrømscirkulation i biosikkerhedshætten og undgåelse af forbrændinger under brug af bunsenbrænderen blev overholdt og overholdt.
Figur 1: Et grafisk skema over protokollen til aktivering af mælkesyrebakterier (LAB) kulturer. Ordningen indeholder detaljer og de grundlæggende instrumenter, der er nødvendige for håndtering og aktivering af LAB-kulturstammer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellevækst af de evaluerede LAB-stammer, der blev dyrket med kvalitetskontrolprotokollen, var signifikant anderledes (P < 0,05) end de stammer, der blev dyrket uden denne standardprotokol. QC-protokollen for både L. bulgaricus og L. reuteri anvendte en multi-subkulturerende tilgang (subkulturering tre gange før striber på agarplader), mens kontrolproceduren kun havde subkulturering udført én gang med alle andre forhold holdt konstant. Kolonivæksten var også højere og veldefineret på vækstmediepladerne, der blev dyrket ved hjælp af denne standard QC-protokol. Dette bekræftede protokollens effektivitet til at sikre forbedret LAB-vækst gennem celledeling i den fermenterende bouillon og hjalp derfor forbedret cellemetabolisme i LAB-stammerne. Væksten af to stammer dyrket med og uden den udviklede kvalitetskontrolprotokol er vist i figur 2. Stammerne blev stribet på agarplader efter intens vækst (0,7-0,9 ved OD610 nm) blev observeret og målt. Pladerne blev anaerob inkuberet ved 42 °C i 72 timer, hvorefter diskrete kolonier blev observeret langs striberne. En anden undersøgelse (figur 3) bekræftede effektiviteten af kvalitetskontrolprotokollen på væksten af Lactobacillus reuteri dyrket i TPY-medium og inkuberet ved 37 °C, hvorved kolonier genereret af QC-protokolteknikken bekræftede en stabil steady state-vækst (gennemsnitligt 0,9 ved OD610 nm) baseret på historiske data. En kontrolmetode til LAB-aktivering uden multipel subkulturation, der ikke anvendte den udviklede QC-teknik, resulterede i et ujævnt vækstmønster (0,9-0,75 ved OD610 nm) af L. reuteri.
Figur 2: Kolonial morfologi af vækst af L. bulgaricus stammer dyrket med og uden den udviklede kvalitetskontrolprotokol. Stammerne blev stribet i tre eksemplarer og blev anaerob inkuberet ved 42 °C i 72 timer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Opførsel af L. reuteri over en periode efter vækst i TPY-medium ved 37 °C ved anvendelse af den standardiserede QC-protokol og den konventionelle bakteriedyrkningsmetode (P < 0,05). Væksten af L. reuteri blev overvåget periodisk i en måned og blev tilpasset historiske data fra tidligere år baseret på kulturaktivering med standard QC-protokollen. Fejllinjerne angiver standardafvigelsen for OD-værdierne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resultaterne af alle stammer, der blev evalueret med kvalitetskontrolprotokollen og uden brug af protokollen, var de samme, og som sådan blev der kun præsenteret resultater knyttet til stammer (S9 og LB6). De aktiverede LAB-stammer havde overlegen cellevækst, der var kendetegnet ved en høj intensitet af cellebiomasse, hvilket forårsagede et uklart udseende af MRS-fermenterende bouillon i reagensglasset11. Den observerede cellevækst efter dyrkningsaktivering var tydelig mellem 12 timer og 16 timer ved en anaerob gæringstemperatur på 42 °C. Det blev også bekræftet, at LAB-stammerne, der blev aktiveret baseret på denne protokol, kontinuerligt fik deres kolonimorfologier transformeret som et resultat af multi-subkultureringsproceduren12 med diskrete kolonier synlige langs striberne. Kontroleksperimentet anvendte ikke denne standardprotokol og blev kun subkultureret én gang; det viste imidlertid ikke også intens turbiditet i den fermenterende bouillon, selvom væksten stadig var inden for det accepterede interval på 0,7-0,9 ved OD610 nm. Det var også bemærkelsesværdigt, at stribe kontrolkulturerne på agarpladerne og anaerob inkubering af dem under de samme betingelser som standardproceduren kun skildrede mindre og færre kolonier sammenlignet med dem, der blev observeret i standardprotokol13.
Dette kan tilskrives de svage og ikke-levedygtige egenskaber ved LAB-cellerne. Følgelig resulterer konceptet med at subkulturere LAB-stammer flere gange og striber på agarplader således i generering af nye celler gennem celledeling og udveksling af genetisk materiale i bakterierne. Dette forbedrer cellulær og metabolisk funktionalitet og fremmer væksten af celler under fermenteringsoperationer14. Derudover genvindes stressede og skadede LAB-celler også baseret på vækstbetingelsernes stabile tilstand (ernæringsmæssige krav, pH og temperatur), der gør det muligt for dem let at tilpasse sig og genvinde fuld celle- og metabolisk funktionalitet6. Desuden begrænser streng overholdelse af denne protokol forurening af cellekulturer i større grad og sikrer dermed, at kun rene og overlegne cellekolonier isoleres til fermenteringsformål. Således gav gentagen striber og genopretning af LAB-cellekulturer fra agarplader en forbedret cellevæg, der var velegnet til metaboliske aktiviteter, såsom til LAB-fermenteringsoperationer15. Desuden bekræfter undersøgelsen af væksten af L. reuteri baseret på den udviklede kvalitetskontrolprotokol (figur 3), hvordan subkulturering af LAB via koloni til dyrkningsmetode giver en stabil stabil vækst i det optimale vækstområde (0,9-1,0 OD 610 nm) over en periode sammenlignet med subkulturering direkte fra kultur til kultur (konventionel metode), hvilket resulterede i en kraftig vækst fra 0,75 til 0,9 ved OD610 nm . Det var også tydeligt, at QC-protokollen over tid konsekvent gav et stabilt bakterievækstmønster, som havde en standardafvigelse (SD) på 0,1. Den ujævne vækst af L. reuteri havde imidlertid sin SD større end 0,1 på grund af den ujævne vækst af bakteriecellerne. Dette ujævne vækstmønster, som allerede nævnt, blev tilskrevet svage og skadede celler; cellernes metaboliske funktionalitet faldt således i fermenteringsperioden14. Den nuværende undersøgelse blev også bekræftet af en tidligere af Ahmed et al.16, hvorved L. reuteri i deres undersøgelse blev formeret i trypticase pepton gærekstrakt (TPY) agar medium i 8 uger ved 37 ° C. En medvirkende faktor til den stadige vækst af L. reuteri blev tilskrevet metoden til celledyrkning og kvalitetskontrolteknik, der genererede nye og overlegent aktive kulturer, selv efter flere subkulturerende aktiviteter i undersøgelsesperioden.
De kritiske trin i denne protokol inkluderer altid at anvende nye og mindre end en dag gamle fermenterende kulturer og altid have den fermenterende bouillon eller vækstmedium nyfremstillet inden påbegyndelse af gæringen og ikke bruge lagret vækstmedium, da mediets styrke og styrke falder over en længere opbevaringsperiode. Ved anvendelse af stamkulturer fra enten -80 °C eller -20 °C skal kulturerne håndteres aseptisk. Hvis det konstateres, at bestandskulturer er svage på grund af kuldechok fra fryseren, kræves der desuden genoplivning som følger. Kun lave koncentrationer (ca. 100 μL) af stamkulturerne bør podes i den supplerede fermentative bouillon (MRS) på ca. 2 ml til præ-anaerob inkubation i ca. 6 timer, før yderligere suppleret MRS på ca. 5-6 ml tilsættes til endelig anaerob inkubation i ca. 16 h17. I tilfælde af anvendelse af frysetørrede eller frysetørrede kulturer anbefales det stærkt at genvinde de frysetørrede kulturer i 3 ml skummetflydende mælk og anaerobt inkubere dem i ca. 4-5 timer, før de podes i den supplerede fermenterende bouillon såsom MRS. Disse processer er nøglen til at sikre LAB-cellelevedygtighed til enhver tid13.
Et andet kritisk trin er at sikre, at cellevækst af fermenterende kulturer altid er inden for vækstområdet 0,7-0,9, hvilket normalt er ved OD610 nm. Dette er vigtigt, da dette vækstområde anbefales som den relevante log eller eksponentielle fase af bakterievækstkurven17. Enhver optisk densitet (OD) værdi over 1 er unøjagtig, da dette bekræfter, at fermenteringskulturerne har nået deres dødsfase med de fleste døde celler og ophobning af giftigt cellulært affald overvejende til stede i det fermentative medium. I tilfælde af at nå en OD-værdi over 1 (OD 610nm > 1)., anbefales det at fortynde kulturerne 2 eller 3 gange eller mere, indtil den når en OD-værdi under 1 (OD610nm < 1)18. Et andet bekymringspunkt er at passende anaerobt inkubere de stribede plader med de fermenterende kulturer. Selvom de fleste LAB er fakultative anaerober, er øget vækst begrænset i nærvær af ilt; derfor foretrækkes anaerobe forhold for at fremme effektiv vækst. Det anbefales at anvende et CO 2 -kammer eller en improviseret beholder, der kan generere CO2 i inkubationsperioden ved 42 °C. For de bedste cellevækstresultater på inkuberede plader anbefales 72 timer for optimale resultater18.
Der er dog ingen begrænsninger ved denne standardprocedure, da streng overholdelse af trinene vil sikre levedygtige og rene LAB-celler til fermenterende procedurer. Betydningen af denne standardprotokol er baseret på dens proaktive tilgang til at sikre probiotisk cellelevedygtighed, især for fermenterende kulturer. Det tjener som en kvalitetskontrolmekanisme, der søger at eliminere forurening og i sidste ende fremme stærke og meget levedygtige kulturer, der kan producere ønskelige udbytter af gæring under standardbetingelser. Med henvisning til eksisterende eller konventionelle metoder eliminerer denne standardprotokol chancen for LAB-cellelevedygtighedsudfordringer (på grund af kuldechok og dårligt vækstmedium), den søger også at sikre det første gangs rigtige koncept om at have rene og levedygtige probiotiske kulturer, sparer tid og fremmer produktiviteten, når man arbejder med LAB-kulturer.
De fremtidige anvendelser af denne teknik er enorme, da denne protokol kan bruges i både forskningslaboratorier, mejeri- og fødevareindustrier, bioprocessing, fermentering og bioteknologiske institutter. Den ekstra fordel ved denne protokol er baseret på dens forenklede karakter og kræver derfor ikke sofistikeret brug af laboratorieudstyr. Som sådan kan denne protokol bruges til demonstration eller pædagogisk læring i gymnasier, der har et grundlæggende laboratoriemiljø for at opmuntre og opbygge elevernes interesse inden for videnskab, teknologi, teknik og matematik (STEM) relaterede områder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne publikation blev muliggjort af tilskudsnummer NC. X-267-5-12-170-1 fra National Institute of Food and Agriculture (NIFA) og delvist af NIZO Food Research BV, Holland, Jarrow Formulas, USA, og Department of Family and Consumer Sciences og Agriculture Research Station ved North Carolina Agriculture and Technical State University (Greensboro, NC, USA 27411). Dette arbejde blev også delvist støttet af 1890 Capacity Building Program grant nr. (2020-38821-31113 / projekttiltrædelse nr. 021765). Dette arbejde blev også delvist støttet af det bulgarske ministerium for uddannelse og videnskab under det nationale forskningsprogram "Sunde fødevarer for en stærk bioøkonomi og livskvalitet" godkendt af DCM # 577 / 17.08.2018.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
References
- Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
- Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047 (2019).
- Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
- Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
- Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
- Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
- Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
- Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
- Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
- Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
- Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321 (2020).
- Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284 (2015).
- Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
- Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
- Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
- Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).
- Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
- Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).
