Summary
הערכת בקרת האיכות של תרביות חיידקי חומצה לקטית (LAB) אושרה כדרך יעילה לשפר את הכדאיות והפונקציונליות של זני LAB להליכי תסיסה. כדי לחזק טענה זו, פיתחנו פרוטוקול המבהיר כיצד תרביות LAB מופעלות ומעובדות לצורך תהליכי תסיסה ועיבוד ביולוגי.
Abstract
חיידקי חומצה לקטית (LAB) הם תרביות חלב חיוניות המשמשות באופן משמעותי לייצור מוצרי חלב מותססים כגון יוגורט וגבינה. LAB מייצרים בעיקר חומצה לקטית כתוצר סופי עיקרי של תסיסה, והם מסנתזים מטבוליטים חשובים המקנים את המאפיינים האורגנולפטיים של מוצרי מזון מותססים. LAB הם חיידקים חזקים שמשגשגים בסביבות רבות כאשר דרישות תזונתיות נאותות מתמלאות. הדרישה לתרביות התחלתיות מעולות של LAB ליישומי תסיסה בתעשיית המזון ומוצרי החלב, הביאה לצורך לספק תרביות בנות קיימא ופעילות לכל פעולות העיבוד הביולוגי. לפיכך, פיתוח פרוטוקול סטנדרטי להבטחת הכדאיות והפונקציונליות המשופרת של תרביות LAB במעבדה, כמו גם בסביבות עיבוד חלב, הוא קריטי מאוד. במתן מענה לחששות הקשורים להחייאת תאי תרבית LAB חלשים, לחוצים ופצועים, פרוטוקול המתווה בצורה חיה צעדים בולטים להתאוששות, שיפור התחדשות התאים ושיפור התפקוד המטבולי של זני LAB הוא בעל חשיבות עליונה. גם השמירה על טוהר התרבית, הפונקציונליות והכדאיות של תרביות התחלתיות LAB היא קריטית. לכן, הקפדה על הנחיית פרוטוקול ייחודית תביא לקידום ביצועי התסיסה עבור זני LAB רבים המוקדשים לתהליכי תסיסה וביוטכנולוגיה. כתוצאה מכך, המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון באוניברסיטת צפון קרוליינה לחקלאות וטכנולוגיה פיתחה פרוטוקול סטנדרטי להפעלה ובקרת איכות של זני LAB נבחרים, שהביא לזני תרבית LAB פונקציונליים וברי קיימא ביותר המשמשים למחקר תסיסה. ההתאמה וההמלצה של פרוטוקול כגון זה לשימוש בתעשיית החלב והמזון תסייע להבטיח את הכדאיות והפונקציונליות של LAB עבור יישומים רבים.
Introduction
חיידקי חומצה לקטית (LAB) הם קבוצה של חיידקים מגוונים באופן ייחודי שיש להם פוטנציאל תעשייתי. זנים השייכים ל-Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus ו-Streptococcus thermophilus משמשים בעיקר כתרביות חלב למוצרי חלב מותססים כגון יוגורט1. זני LAB נבחרים מסווגים גם כפרוביוטיקה מכיוון שהם מעניקים יתרונות בריאותיים לבני אדם כאשר המינונים ניתניםכראוי 2. חיידקי חומצה לקטית הם גם מיקרואורגניזמים גראם חיוביים, לא יוצרי נבגים, לא נושמים אך אירוסובלניים המאופיינים בדרך כלל על ידי ייצור חומצה לקטית כמוצר תסיסה מרכזי. LAB גם מסנתזת מטבוליטים חיוניים, לדוגמה, חומצות אורגניות, בקטריוצינים ותרכובות אנטי-מיקרוביאליות אחרות3 שיכולות לעכב ספקטרום רחב של פתוגנים המועברים במזון4. חומצה לקטית, תוצר סופי עיקרי של קטבוליזם פחמימות ותוצר לוואי של תסיסת LAB, היא מטבוליט אורגני בעל תכונות אנטי-מיקרוביאליות והוא עשוי להיות שימושי ליישומי שימור ביולוגי של מזון 3,5,6. יתר על כן, החומצות האורגניות המיוצרות על ידי LAB מקנות את הטעם, המרקם והארומה של המזונות, ובכך משפרות את התכונות האורגנולפטיות הכלליות שלהם 5,6. הדרישות התזונתיות הייחודיות של LAB יחד עם האופי שלהן בכל מקום, מאפשרות בסופו של דבר לחיידקים לשגשג בקלות בסביבות שונות כגון מזונות המבוססים על מוצרי חלב, מזונות מותססים, ירקות, כמו גם במעיים האנושיים7.
יש ביקוש הולך וגובר לתרביות התחלתיות מ- LAB לייצור יוגורט ויישומי חלב רבים ומגוונים8,9, ולכן יש לדבוק בתשומת לב קריטית ובטכניקות מדעיות מבוססות, בטיפוח זני LAB, כמו גם בהפעלת זנים ליופיליים ומבודדים כאחד, שכן פעילות זו חיונית לביצועי תסיסה משופרים. לפיכך, המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון עוסקת באופן פעיל בפיתוח טכנולוגי מתאים המיועד להפעלה, גידול מעולה ותסיסה האופייניים לזני LAB המבודדים ממוצרי חלב מותססים, כמו גם מתרביות התחלתיות תעשייתיות המועסקות בייצור יוגורט. יתר על כן, ראוי לציין כי זני תרביות LAB המיוצרים באופן תעשייתי עוברים פעילויות משמרות כגון ייבוש בהקפאה ואחסון קפוא, הגורמים ללחץ ופגיעה בתאים, כתוצאה מתהליך הלם הקור שהם נתונים לו10. כדי להגביל, את אתגרי הכדאיות ולשפר את הפונקציונליות של זני LAB המתקבלים ממוצרי מזון מבודדים או ממוצרים מיובשים בהקפאה, חשוב להפעיל כראוי תרביות אלה כצורה של בקרת איכות כדי לשפר את המאפיין התסיסתי שלהם8. במחקר זה, המטרה הייתה לפתח פרוטוקול בקרת איכות פנימי להפעלה וצמיחה של זני תרבית L. delbrueckii subsp. bulgaricus שבסופו של דבר קידמו צמיחת LAB בת קיימא, כמו גם שיפרו את ביצועי התסיסה ואת הפונקציונליות המטבולית של זני LAB. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בסופו של דבר (באמצעות מדיית גידול אופטימלית ותנאי גידול מתאימים) לטיפוח זני LAB אחרים למחקר תסיסה, כמו גם למטרות תעשייתיות או לפעולות עיבוד ביולוגי. לפיכך, פרוטוקול הפעלה ובקרת איכות זה של LAB יבטיח קבלת תרביות התחלתיות של מוצרי חלב בני קיימא ומתאימות, בעלות פוטנציאל לתפקד עבור יישומים מגוונים בתעשיית החלב והמזון העולמית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חומרים ושיטות כלליים
- מקור לקטובצילוס דלברוצקי תת-קרקעי בולגריקוס
- השג זנים של L. bulgaricus ממקורות אמינים.
הערה: במחקר זה נעשה שימוש בסך הכל בחמישה (5) זני L. bulgaricus במחקר בקרת האיכות (טבלה 1). שני זנים של L. bulgaricus מיובשים בהקפאה לייצור תעשייתי של מוצרי חלב מותססים סופקו על ידי ד"ר אלברט קרסטנוב, המחלקה לביוטכנולוגיה באוניברסיטה לטכנולוגיות מזון, פלובדיב, בולגריה. שני זנים שבודדו ממוצרי יוגורט מסחריים הזמינים בשוק האמריקאי התקבלו ממלאי של -80 מעלות צלזיוס של המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון באוניברסיטת A&T סטייט בצפון קרוליינה, וזן אחד מיובש בהקפאה סופק על ידי ספק C. כל זני LAB נשמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. זן חיידקי נוסף (Limosilactobacillus reuteri) התקבל ממלאי של -80 מעלות צלזיוס של המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון באוניברסיטת צפון קרוליינה A&T סטייט.
- השג זנים של L. bulgaricus ממקורות אמינים.
- מדיום מרק תסיסה סטנדרטי L. MRS
- הכינו את מדיום דה-מן, רוגוסה שארפ (MRS) על ידי המסה מלאה של 55 גרם MRS, ו-0.5 גרם של L-ציסטאין ב-1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה (DW).
- יש לחלק 7 מ"ל ו-2 מ"ל מתמיסת ה-MRS המוכנה למבחנות, בהתאמה, ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן לקרר בטמפרטורת החדר (RT).
- MRS אגר בינוני
- יש להכין את MRS אגר בינוני על ידי המסה מלאה של 55 גרם MRS ו-0.5 גרם של L-ציסטאין ב-1 ליטר של DW. מוסיפים אבקת אגר (15 גרם), מעקרים את מדיום האגר בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז מקררים אותו באמבט מים.
- מוזגים את כל חומרי הגלם הטריים לתוך צלחות פטרי סטריליות ומאחסנים אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להמשך הצורך.
- מולוסטרידיאל בינוני-פירובט מחוזק מותאם (mRCM-PYR)
- מטב מדיום קלוסטרידיאלי מחוזק על פי Oyeniran et al.13 ו- Nwamaioha ו- Ibrahim18, לסלקטיביות וספירה מדויקת של L. bulgaricus על ידי המסת 10 גרם של פפטון #3, 10 גרם של תמצית בקר, 5 גרם של תמצית שמרים, 5 גרם של נתרן כלורי, 3 גרם של נתרן אצטט, 2 גרם של אשלגן פוספט dibasic, 0.1 גרם של uracil, 0.25 גרם של סידן כלורי, 5 גרם של דקסטרוז, 5 גרם של פרוקטוז, 10 גרם של מלטוז, 2 גרם של נתרן פירובט, 0.2% טווין 80, ו 0.5 גרם של L- ציסטאין ב 1 ליטר של DW.
- התאם את ה- pH הסופי (6.0 ± 0.2) של התמיסה באמצעות 6 N HCl לפני תוספת של 0.008% כחול אנילין ו- 15 גרם אגר. אוטוקלאב את המדיום בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, מצננים באמבט מים ויוצקים לתוך צלחות פטרי סטריליות. אחסנו את כל חומרי הגלם הטריים בצלחות פטרי סטריליות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
- מלאי גליצרול של תרביות LAB
- הכינו מלאי גליצרול (50% גליצרול) על ידי דילול 100% גליצרול באותו נפח של DW ועיקור בטמפרטורה של 100°C למשך 30 דקות באמצעות מחזור עיקור יבש. מקררים את מלאי הגליצרול ל-RT ומאחסנים אותם באופן אספטי לשימוש נוסף.
- השתמש בצמיחת חיידקים (מושבה אחת של L. bulgaricus שהושגה באמצעות פרוטוקול QC שפותח) מתרביות לילה.
- פיפטה 500 μL של תרביות הלילה לתוך 50% גליצרול בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל ומערבבים בעדינות אותם יחד. הקפיאו ואחסנו את מלאי הגליצרול המכיל את תרביות LAB בטמפרטורה נמוכה במיוחד של -80°C עד הצורך.
הערה: סכימה גרפית של הפרוטוקול לבקרת איכות והפעלה של תרביות LAB מוצגת באיור 1.
| לא | קוד מוצר | לדוגמה | מקור | הרכב החיידקים כפי שמסומן1 |
| 1 | S9 | זן תעשייתי טהור | בולגריה | Lb. בולגריקוס |
| 2 | ל"ב6 | זן תעשייתי טהור | בולגריה | ל"ג בולגריקוס, |
| 3 | ATCC 11842 | זן תעשייתי טהור | ATCC | Lb. בולגריקוס |
| 4 | דאו | יוגורט | ארצות הברית | Lb. בולגריקוס, תרבות חיה אחרת |
| 5 | E22 | יוגורט | ארצות הברית | Lb. בולגריקוס, תרבות חיה אחרת |
| 6 | ראוטרי | יוגורט | ארצות הברית | לימוסילקטובצילוס ראוטרי |
| 1ק"ג =לקטובצילוס | ||||
טבלה 1: זנים פרוביוטיים. הטבלה מפרטת את הזנים הפרוביוטיים שבהם נעשה שימוש במחקר זה.
2. פרוטוקול להפעלה ובקרת איכות של תרביות LAB
- קח את מלאי הגליצרול המוכן של זני LAB (בצינורות צנטריפוגה של 2 מ"ל) מהמקפיא האולטרה-נמוך במיוחד של -80 מעלות צלזיוס, ואל תאפשר להם להפשיר לפני השימוש.
- נקו וחטאו את פתח צינורות הצנטריפוגה ב-70% אלכוהול, ומערבלים בעדינות לפני השימוש.
- פיפטה על 250 μL (0.25 מ"ל) של תרבית LAB המניות מצינורות צנטריפוגה לתוך מבחנות MRS טריות 2 מ"ל.
- מערבלים בעדינות, עושים פרפילם למבחנות, ומדגרים אותם באופן אנאירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
- קח כ-500 μL (0.5 מ"ל) מהתרביות הגדלות בן לילה ממבחנות MRS של 2 מ"ל למבחנות MRS טריות של 7 מ"ל, מערבולות, ודגירה אנאירובית שלהן למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
- הערך את הגידול המיקרוביאלי על ידי מדידת הצפיפות האופטית (OD) או הצמיחה של התרביות ב-610 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר הנראה לעין UV ותעד תוצאות מקובלות בין 0.7 ל-0.9.
- פסו את תרביות הלילה מצינורות MRS של 7 מ"ל על צלחות אגר MRS ו- MRCM-PYR ודגרו אותן באופן אנאירובי למשך 72 שעות ב-42 מעלות צלזיוס.
- בחרו מושבות מבודדות מצלחות האגר, העבירו אותן למבחנות MRS טריות של 7 מ"ל, מערבולות עדינות, ודגרו אותן באופן אנאירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
- אחסנו את צלחות האגר המכילות את הזנים המבודדים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר למשך שבוע.
- למדוד ולאשר את ה-OD (בין 0.7 ל-0.9) ממבחנות MRS של 7 מ"ל של תרביות LAB שבודדו מהלוחות המפוספסים ב-610 ננומטר ולהשתמש בהם כתרביות עבודה לכל הניסויים הקשורים.
- בצע דילול פי עשרה (מדולל סדרתי) של תרביות LAB שגודלו ממבחנות MRS אחרונות של 7 מ"ל באמצעות 9 מ"ל של מי פפטון (חיץ פיזיולוגי) כדי להשיג יחס של 1:10.
- לבסוף, קח כ 250 μL (0.25 מ"ל) מדילולים סדרתיים מתאימים עבור כל ניסויי התסיסה.
- הפעל את המרק המכיל זנים (250 μL) משלב 2.12 על ידי העברתם למרק MRS טרי של 7 מ"ל ודגירתם באופן אנאירובי בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
- המשך על ידי חזרה על שלבים 2.6-2.12 כדי להבטיח צמיחת תאים בת קיימא ומעולה מתרביות LAB.
הערה: כל זני L. bulgaricus הופעלו בציר MRS שהוכן זה עתה ולאחר מכן דוגרו באופן אנאירובי בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות על מנת להגיע לצפיפות אופטית (OD610 ננומטר) של צמיחת חיידקים בין 0.7 ל-0.9. צמיחת חיידקים נמדדה באמצעות ספקטרופוטומטר הנראה לעין UV ב-610 ננומטר. ערכי ה-pH של תרביות הלילה היו בטווח של 3.5 עד 5.3 כתוצאה מייצור חומצה לקטית, תוצר סופי אורגני של תסיסת LAB. נהלי בטיחות כגון זרימת אוויר תקינה במכסה המנוע ומניעת כוויות במהלך השימוש במבער הבונזן הודבקו ונצפו.
איור 1: סכימה גרפית של הפרוטוקול להפעלת תרביות חיידקי חומצה לקטית (LAB). התוכנית מספקת פרטים ואת המכשירים הבסיסיים הדרושים לטיפול והפעלה של זני תרבית LAB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גידול התאים של זני ה-LAB המוערכים שטופחו באמצעות פרוטוקול בקרת האיכות היה שונה באופן משמעותי (P < 0.05) מהזנים שטופחו ללא פרוטוקול סטנדרטי זה. פרוטוקול QC הן עבור L. bulgaricus והן עבור L. reuteri נקט בגישה רב-תרבותית (תת-תרבות שלוש פעמים לפני פסים על לוחות אגר), בעוד שהליך הבקרה נעשה רק פעם אחת כאשר כל התנאים האחרים נשמרו קבועים. גידול המושבה היה גם גבוה יותר ומוגדר היטב על לוחות המדיה לגידול שטופחו באמצעות פרוטוקול QC סטנדרטי זה. זה אישר את היעילות של הפרוטוקול בהבטחת צמיחת LAB משופרת באמצעות חלוקת תאים בציר התסיסה, ולכן, סיוע לחילוף חומרים משופר של תאים בזני LAB. הצמיחה של שני זנים שטופחו עם פרוטוקול בקרת האיכות המפותח ובלעדיו מוצגת באיור 2. הזנים הודבקו על לוחות אגר לאחר שנצפתה ונמדדה צמיחה אינטנסיבית (0.7-0.9 ב-OD610 ננומטר). הלוחות דוגרו באופן אנאירובי בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות, ולאחר מכן נצפו מושבות בדידות לאורך קווי הפסים. מחקר אחר (איור 3) אישר את היעילות של פרוטוקול בקרת האיכות על הצמיחה של לקטובצילוס ראוטרי בתרבית במדיום TPY, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לפיה מושבות שנוצרו על ידי טכניקת פרוטוקול QC אישרו צמיחה יציבה במצב יציב (בממוצע 0.9 ב-OD610 ננומטר) בהתבסס על נתונים היסטוריים. שיטת בקרה של הפעלת LAB ללא תת-תרבויות מרובות שלא השתמשו בטכניקת QC שפותחה הביאה לדפוס גידול לא אחיד (0.9-0.75 ב-OD610 ננומטר) של L. reuteri.
איור 2: מורפולוגיה קולוניאלית של גדילה של זני L. bulgaricus המעובדים עם פרוטוקול בקרת האיכות המפותח ובלעדיו. הזנים היו מפוספסים במשולשים והודגרו באופן אנאירובי בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: התנהגות של L. ראוטרי במשך תקופה לאחר גידול במדיום TPY ב 37 מעלות צלזיוס באמצעות פרוטוקול QC סטנדרטי והשיטה הקונבנציונלית של גידול חיידקים (P < 0.05). הצמיחה של L. reuteri הייתה במעקב תקופתי במשך חודש והותאמה לנתונים היסטוריים משנים קודמות בהתבסס על הפעלת תרבית עם פרוטוקול QC סטנדרטי. קווי השגיאה מציינים את סטיית התקן של ערכי OD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התוצאות של כל הזנים שהוערכו באמצעות פרוטוקול בקרת האיכות וללא שימוש בפרוטוקול היו זהות, ולכן הוצגו תוצאות המקושרות לזנים בלבד (S9 ו-LB6). זני ה-LAB המופעלים היו בעלי צמיחת תאים מעולה שהתאפיינה בעוצמה גבוהה של ביומסה תאית, ולכן גרמה להופעה עכורה של המרק התסיסתי MRS במבחנה11. צמיחת התאים שנצפתה לאחר הפעלת התרבית ניכרה בין 12 שעות ל -16 שעות בטמפרטורה תסיסה אנאירובית של 42 מעלות צלזיוס. כמו כן אושר כי זני ה-LAB שהופעלו על סמך פרוטוקול זה עברו באופן רציף את המורפולוגיות של המושבות שלהם כתוצאה מהליך רב-תרבותי12 עם מושבות בדידות הנראות לאורך קווי הפסים. ניסוי הבקרה לא השתמש בפרוטוקול סטנדרטי זה והיה רק תת-תרבות פעם אחת; עם זאת, הוא לא הראה גם עכירות אינטנסיבית במרק התסיסה, אם כי הצמיחה עדיין הייתה בטווח המקובל של 0.7-0.9 ב- OD610 ננומטר. כמו כן, ראוי לציין כי פסים של תרביות הבקרה על לוחות האגר ודגירה אנאירובית שלהם באותם תנאים כמו הנוהל הסטנדרטי תיארו רק מושבות קטנות יותר ופחות בהשוואה לאלה שנצפו בפרוטוקול הסטנדרטי13.
ניתן לייחס זאת למאפיינים החלשים והלא ברי קיימא של תאי המעבדה. כתוצאה מכך, הרעיון של תת-זנים של LAB מספר פעמים ופסים על צלחות אגר, ובכך גורם ליצירת תאים חדשים באמצעות חלוקת תאים והחלפת חומר גנטי בחיידק. זה משפר את הפונקציונליות התאית והמטבולית ומקדם את צמיחת התאים במהלך פעולות תסיסה14. בנוסף, תאי מעבדה בסטרס ופצועים מתאוששים גם על סמך המצב היציב של תנאי הגדילה (דרישות תזונתיות, pH וטמפרטורה) המאפשרים להם להסתגל בקלות ולהחזיר לעצמם תפקוד מלא של התאים וחילוף החומרים6. יתר על כן, הקפדה על פרוטוקול זה מגבילה את הזיהום של תרביות תאים במידה רבה יותר, ובכך מבטיחה שרק מושבות תאים טהורות ועליונות יבודדו למטרות תסיסה. לפיכך, פסים חוזרים ונשנים והתאוששות של תרביות תאי LAB מצלחות אגר סיפקו דופן תא משופרת שהתאימה היטב לפעילויות מטבוליות כגון לפעולות תסיסה של LAB15. יתר על כן, המחקר על הצמיחה של L. reuteri המבוסס על פרוטוקול בקרת האיכות שפותח (איור 3) מאשר כיצד תת-תרבות LAB דרך מושבה לשיטת תרבית מניבה צמיחה יציבה בטווח הצמיחה האופטימלי (0.9-1.0 OD 610 ננומטר) לאורך תקופה בהשוואה לתת-תרבות ישירות מתרבית לתרבית (שיטה קונבנציונלית), שהביאה לצמיחה חדה מ-0.75 ל-0.9ב-OD 610 ננומטר . עוד ניכר היה כי פרוטוקול QC, לאורך זמן, הניב באופן עקבי דפוס גידול יציב של חיידקים, עם סטיית תקן (SD) של 0.1. הצמיחה הלא אחידה של L. reuteri, לעומת זאת, היה SD שלה גדול מ 0.1 בשל צמיחה לא אחידה של תאי החיידקים. דפוס גדילה לא אחיד זה, כאמור, יוחס לתאים חלשים ופצועים; לכן הפונקציונליות המטבולית של התאים ירדה במהלך תקופת התסיסה14. המחקר הנוכחי אושר גם על ידי מחקר קודם של אחמד ואחרים לפיו, במחקרם, L. reuteri הופץ בתמצית שמרי פפטון טריפטיקאז (TPY) אגר בינוני במשך 8 שבועות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. גורם תורם לצמיחה המתמדת של L. reuteri יוחס לשיטת טיפוח התאים וטכניקת בקרת האיכות שיצרה תרביות חדשות ופעילות במיוחד גם לאחר מספר פעילויות תת-תרבותיות במהלך תקופת המחקר.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה כוללים תמיד שימוש בתרביות תסיסה חדשות וישנות פחות מיום ותמיד שימוש במדיום התסיסה או במדיום הצמיחה שהוכן לאחרונה לפני תחילת התסיסה, ולא שימוש במדיום גדילה מאוחסן ככל שהחוזק והעוצמה של המדיום פוחתים לאורך תקופה ממושכת של אחסון. במקרה של שימוש בתרביות מלאי מ -80 °C או -20 °C (70 °F), התרבויות צריכות להיות מטופלות באופן אספטי. יתר על כן, אם תרבויות המלאי נצפות חלשות עקב הלם קר מהמקפיא, נדרשת החייאה כדלקמן. רק ריכוזים נמוכים (כ-100 μL) של תרביות המלאי צריכים להיות מחוסנים במרק התסיסה המשלים (MRS) של כ-2 מ"ל לדגיר קדם-אנאירובי למשך כ-6 שעות, לפני שמוסיפים תוספת MRS של כ-5-6 מ"ל לדגירה אנאירובית סופית למשך כ-16 שעותו-17. במקרה של שימוש בתרביות lyophilized או מיובשות בהקפאה, מומלץ מאוד לשחזר את התרביות מיובשות בהקפאה ב 3 מ"ל של חלב נוזלי דל שומן לדגור אותם באופן אנאירובי במשך כ 4-5 שעות לפני חיסון אותם במרק תסיסה בתוספת כגון MRS. תהליכים אלה הם המפתח להבטחת הכדאיות של תאי LAB בכל עת13.
צעד קריטי נוסף הוא להבטיח שצמיחת תאים של תרביות תסיסה תהיה תמיד בטווח הצמיחה של 0.7-0.9, שהוא בדרך כלל ב- OD610nm. זה חשוב מכיוון שטווח גדילה זה מומלץ כלוג המתאים או כשלב האקספוננציאלי של עקומת צמיחת החיידקים17. כל ערך צפיפות אופטית (OD) מעל 1, אינו מדויק מכיוון שהדבר מאשר שהתרביות התסיסתיות הגיעו לשלב המוות שלהן עם רוב התאים המתים והצטברות של פסולת תאית רעילה הקיימת בעיקר בתווך התסיסה. במקרה של הגעה לערך OD מעל 1 (OD 610nm > 1)., מומלץ לדלל את התרביות פי 2 או 3 או יותר עד שהוא מגיע לערך OD מתחת ל- 1 (OD610nm < 1)18. נקודה נוספת לדאגה היא לדגור באופן אנאירובי הולם את הצלחות המפוספסות עם התרביות התסיסתיות. למרות שרוב LAB הם אנארובים פקולטטיביים, צמיחה משופרת מוגבלת בנוכחות חמצן; מכאן שנדרשת העדפה לתנאים אנאירוביים כדי לקדם צמיחה יעילה. מומלץ להשתמש בתא CO 2 או בכלי מאולתר שיכול לייצר CO2 במהלך תקופת הדגירה ב 42 מעלות צלזיוס. לקבלת תוצאות צמיחת התאים הטובות ביותר על צלחות דגירה, מומלץ 72 שעות לתוצאות אופטימליות18.
עם זאת, אין מגבלות על הליך סטנדרטי זה, שכן הקפדה על הצעדים תבטיח תאי מעבדה ברי קיימא וטהורים להליכים מותססים. חשיבותו של פרוטוקול סטנדרטי זה מבוססת על גישתו הפרואקטיבית להבטחת יכולת הקיום של תאים פרוביוטיים, במיוחד עבור תרביות תסיסתיות. הוא משמש כמנגנון בקרת איכות המבקש לחסל את הזיהום ובסופו של דבר לקדם תרבויות חזקות וברות קיימא מאוד שיכולות לייצר תשואות רצויות של תסיסה בתנאים סטנדרטיים. בהתייחס לשיטות קיימות או קונבנציונליות, פרוטוקול סטנדרטי זה מבטל את הסיכוי לאתגרי הכדאיות של תאי LAB (עקב הלם קר ומדיום גדילה ירוד) הוא גם מבקש להבטיח את הרעיון הנכון בפעם הראשונה של תרביות פרוביוטיקה טהורות וברות קיימא, חוסך זמן ומקדם פרודוקטיביות בעת עבודה עם תרביות LAB.
היישומים העתידיים של טכניקה זו הם עצומים, שכן פרוטוקול זה יכול לשמש הן במעבדות מחקר, תעשיות חלב ומזון, עיבוד ביולוגי, תסיסה ומכוני ביוטכנולוגיה. היתרון הנוסף של פרוטוקול זה מבוסס על אופיו הפשטני ולכן אינו דורש שימוש מתוחכם בציוד מעבדה. ככזה, פרוטוקול זה יכול לשמש להדגמה או למידה פדגוגית בבתי ספר תיכוניים שיש להם סביבת מעבדה בסיסית כדי לעודד ולבנות את העניין של תלמידים בתחומים הקשורים למדע, טכנולוגיה, הנדסה ומתמטיקה (STEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
פרסום זה התאפשר על ידי מענק מספר NC. X-267-5-12-170-1 מהמכון הלאומי למזון וחקלאות (NIFA) ובחלקו על ידי NIZO Food Research BV, הולנד, נוסחאות ג'ארו, ארה"ב, והמחלקה למדעי המשפחה והצרכנות ותחנת המחקר החקלאית באוניברסיטת צפון קרוליינה לחקלאות ומדינה טכנית (גרינסבורו, קרוליינה הצפונית, ארה"ב 27411). עבודה זו נתמכה גם, בין השאר, על ידי מענק תוכנית בניית קיבולת מס' 1890 (2020-38821-31113/הצטרפות לפרויקט מס' 021765). עבודה זו נתמכה חלקית גם על ידי משרד החינוך והמדע הבולגרי במסגרת תוכנית המחקר הלאומית 'מזונות בריאים לכלכלה ביולוגית חזקה ואיכות חיים' שאושרה על ידי DCM # 577 / 17.08.2018.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
References
- Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
- Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047 (2019).
- Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
- Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
- Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
- Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
- Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
- Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
- Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
- Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
- Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321 (2020).
- Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284 (2015).
- Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
- Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
- Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
- Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).
- Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
- Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).
