Summary
Die Qualitätskontrolle von Milchsäurebakterienkulturen (LAB) wurde als wirksamer Weg zur Verbesserung der Lebensfähigkeit und Funktionalität von LAB-Stämmen für Fermentationsverfahren bestätigt. Um diese Behauptung zu untermauern, haben wir ein Protokoll entwickelt, das aufklärt, wie LAB-Kulturen für Fermentations- und Bioprozessprozesse aktiviert und kultiviert werden.
Abstract
Milchsäurebakterien (LAB) sind essentielle Milchstarterkulturen, die maßgeblich für die Herstellung fermentierter Milchprodukte wie Joghurt und Käse eingesetzt werden. LAB produziert überwiegend Milchsäure als Hauptendprodukt der Fermentation und synthetisiert wichtige Metaboliten, die fermentierten Lebensmitteln die organoleptischen Eigenschaften verleihen. LAB sind anspruchsvolle Bakterien, die in vielen Umgebungen gedeihen, wenn ausreichende Ernährungsanforderungen erfüllt sind. Die Nachfrage nach überlegenen LAB-Molkerei-Starterkulturen für Fermentationsanwendungen in der Lebensmittel- und Milchindustrie hat dazu geführt, dass lebensfähige und aktive Kulturen für alle Bioprozessbetriebe bereitgestellt werden müssen. Die Entwicklung eines Standardprotokolls zur Sicherstellung der Lebensfähigkeit und verbesserten Funktionalität von LAB-Kulturen sowohl im Labor als auch in der Milchverarbeitung ist daher sehr wichtig. Bei der Behandlung von Bedenken im Zusammenhang mit der Wiederbelebung schwacher, gestresster und verletzter LAB-Kulturzellen ist ein Protokoll, das die wichtigsten Schritte zur Genesung, zur Verbesserung der Zellregeneration und zur Verbesserung der metabolischen Funktionalität von LAB-Stämmen anschaulich umreißt, von größter Bedeutung. Die Aufrechterhaltung der Reinheit, Funktionalität und Lebensfähigkeit der Kultur für LAB-Starterkulturen ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Daher wird die Einhaltung einer einzigartigen Protokollrichtlinie zur Förderung der Fermentationsleistung für viele LAB-Stämme führen, die für Fermentations- und Biotechnologieprozesse bestimmt sind. Infolgedessen hat das Labor für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie an der North Carolina Agriculture and Technical State University ein Standardprotokoll für die Aktivierung und Qualitätskontrolle ausgewählter LAB-Stämme entwickelt, das zu hochfunktionellen und lebensfähigen LAB-Kulturstämmen geführt hat, die für die Fermentationsforschung eingesetzt werden. Die Anpassung und Empfehlung eines solchen Protokolls für den Einsatz in der Milch- und Lebensmittelindustrie wird dazu beitragen, die Lebensfähigkeit und Funktionalität von LAB für viele Anwendungen sicherzustellen.
Introduction
Milchsäurebakterien (LAB) sind eine Gruppe von einzigartig vielfältigen Bakterien mit industriellem Potenzial. Stämme von Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus und Streptococcus thermophilus werden meist als Milchstarterkulturen für fermentierte Milchprodukte wie Joghurt1 verwendet. Ausgewählte LAB-Stämme werden ebenfalls als Probiotika eingestuft, da sie dem Menschen gesundheitliche Vorteile bieten, wenn die Dosierungen angemessen verabreicht werden2. Milchsäurebakterien sind ebenfalls grampositive, nicht sporenbildende, nicht atmende, aber aerotolerante Mikroorganismen, die sich im Allgemeinen durch die Produktion von Milchsäure als Schlüsselfermentationsprodukt auszeichnen. LAB synthetisiert auch essentielle Metaboliten, z. B. organische Säuren, Bakteriocine und andere antimikrobielle Verbindungen3, die ein breites Spektrum lebensmittelbedingter Krankheitserreger hemmen können4. Milchsäure, ein Hauptendprodukt des Kohlenhydratkatabolismus und ein Nebenprodukt der LAB-Fermentation, ist ein organischer Metabolit, der antimikrobielle Eigenschaften besitzt und potenziell für Anwendungen zur Biokonservierung von Lebensmitteln nützlich ist 3,5,6. Darüber hinaus verleihen die von LAB hergestellten organischen Säuren den Geschmack, die Textur und das Aroma von Lebensmitteln und verbessern so ihre organoleptischen Eigenschaften insgesamt 5,6. Die unterschiedlichen Ernährungsanforderungen von LAB in Verbindung mit ihrer allgegenwärtigen Natur ermöglichen es den Bakterien schließlich, in verschiedenen Umgebungen wie Milchprodukten, fermentierten Lebensmitteln, Gemüse sowie im menschlichen Darm leicht zu gedeihen7.
Es gibt eine wachsende Nachfrage nach Starterkulturen von LAB für die Joghurtherstellung und viele verschiedene Milchanwendungen8,9, daher sollten kritische Aufmerksamkeit und etablierte wissenschaftliche Techniken eingehalten werden, sowohl bei der Kultivierung von LAB-Stämmen als auch bei der Aktivierung von lyophilisierten und isolierten Stämmen, da diese Aktivität für eine verbesserte Fermentationsleistung von entscheidender Bedeutung ist. Das Labor für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie engagiert sich daher aktiv in der Entwicklung geeigneter Technologien, die auf die Aktivierung, das überlegene Wachstum und die Fermentationseigenschaften von LAB-Stämmen ausgerichtet sind, die aus fermentierten Milchprodukten sowie aus industriellen Starterkulturen für die Joghurtherstellung isoliert werden. Darüber hinaus ist es bemerkenswert, dass industriell hergestellte LAB-Kulturstämme konservierenden Aktivitäten wie Gefriertrocknung und Tiefkühllagerung unterzogen werden, was zu Zellstress und Verletzungen führt, als Folge des Kälteschockprozesses, dem sie ausgesetzt sind10. Bei der Begrenzung der Lebensfähigkeitsherausforderungen und der Verbesserung der Funktionalität von LAB-Stämmen, die entweder aus isolierten Lebensmittelprodukten oder gefriergetrockneten Produkten gewonnen werden, ist es wichtig, diese Kulturen als eine Form der Qualitätskontrolle richtig zu aktivieren, um ihre fermentativen Eigenschaften zu verbessern8. In dieser Studie bestand das Ziel darin, ein internes Qualitätskontrollprotokoll für die Aktivierung und das Wachstum von L. delbrueckii subsp. bulgaricus-Kulturstämmen zu entwickeln, das letztendlich ein lebensfähiges LAB-Wachstum förderte und die Fermentationsleistung und die metabolische Funktionalität von LAB-Stämmen verbesserte. Dieses Protokoll könnte letztendlich (unter Verwendung optimaler Wachstumsmedien und geeigneter Kulturbedingungen) für die Kultivierung anderer LAB-Stämme für die Fermentationsforschung sowie für industrielle Zwecke oder Bioprozessprozesse angepasst werden. Dieses LAB-Aktivierungs- und Qualitätskontrollprotokoll wird daher sicherstellen, dass überlegene lebensfähige Milchstarterkulturen erhalten werden und potenziell für verschiedene Anwendungen in der globalen Molkerei- und Lebensmittelindustrie funktionsfähig sind.
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Protocol
1. Allgemeine Materialien und Methoden
- Quelle von Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
- Beziehen Sie L. bulgaricus-Stämme aus zuverlässigen Quellen.
HINWEIS: In dieser Studie wurden insgesamt fünf (5) L. bulgaricus-Stämme in der Qualitätskontrollstudie verwendet (Tabelle 1). Zwei Stämme von gefriergetrocknetem L. bulgaricus für die industrielle Herstellung von fermentierten Milchprodukten wurden von Dr. Albert Krastanov, Abteilung für Biotechnologie an der Universität für Lebensmitteltechnologien, Plovdiv, Bulgarien, zur Verfügung gestellt. Zwei Stämme, die aus kommerziellen Joghurtprodukten isoliert wurden, die auf dem US-Markt erhältlich sind, wurden aus dem -80 °C-Bestand des Labors für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie an der North Carolina A & T State University gewonnen, und ein gefriergetrockneter Stamm wurde von einem Anbieter C geliefert. Alle LAB-Stämme wurden bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gehalten. Ein weiterer Bakterienstamm (Limosilactobacillus reuteri) wurde aus dem -80 °C-Bestand des Labors für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie an der North Carolina A&T State University gewonnen.
- Beziehen Sie L. bulgaricus-Stämme aus zuverlässigen Quellen.
- Standard L. MRS Fermentationsbrühe Medium
- Bereiten Sie deMan, Rogosa Sharpe (MRS) -Medium vor, indem Sie 55 g MRS und 0,5 g L-Cystein in 1 l entionisiertem Wasser (DW) vollständig auflösen.
- 7 ml bzw. 2 ml der vorbereiteten MRS-Lösung in Reagenzgläser geben, 15 min lang bei 121 °C autoklavieren und anschließend bei Raumtemperatur (RT) abkühlen.
- MRS Agar mittel
- Bereiten Sie MRS-Agarmedium vor, indem Sie 55 g MRS und 0,5 g L-Cystein in 1 l DW vollständig auflösen. Agarpulver (15 g) zugeben, das Agarmedium bei 121 °C 15 min sterilisieren und anschließend im Wasserbad abkühlen lassen.
- Gießen Sie alle frisch zubereiteten Medien in sterile Petrischalen und lagern Sie sie bei 4 °C, bis sie weiter benötigt werden.
- Modifiziertes verstärktes Clostridien-Medium-Pyruvat (mRCM-PYR)
- Optimierung eines verstärkten Clostridienmediums gemäß Oyeniran et al.13 und Nwamaioha und Ibrahim18 für Selektivität und genaue Zählung von L. bulgaricus durch Auflösen von 10 g Pepton #3, 10 g Rindfleischextrakt, 5 g Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid, 3 g Natriumacetat, 2 g Kaliumphosphat dibasisch, 0,1 g Uracil, 0,25 g Calciumchlorid, 5 g Dextrose, 5 g Fructose, 10 g Maltose, 2 g Natriumpyruvat, 0,2% Tween 80 und 0,5 g L-Cystein in 1 l DW.
- Der endgültige pH-Wert (6,0 ± 0,2) der Lösung wird mit 6 N HCl eingestellt, bevor 0,008% Anilinblau und 15 g Agar hinzugefügt werden. Das Medium bei 121 °C 15 min autoklavieren, im Wasserbad abkühlen und in sterile Petrischalen gießen. Lagern Sie alle frisch zubereiteten Medien in sterilen Petrischalen bei 4 °C bis zum Bedarf.
- Glycerin-Vorrat von LAB-Kulturen
- Glycerinbrühen (50% Glycerin) durch Verdünnen von 100% Glycerin im gleichen Volumen DW zubereiten und bei 100 °C für 30 min mit einem trockenen Sterilisationszyklus sterilisieren. Kühlen Sie die Glycerinvorräte auf RT ab und lagern Sie sie für die weitere Verwendung aseptisch.
- Verwenden Sie Bakterienwachstum (eine einzelne Kolonie von L. bulgaricus , die mit dem entwickelten QC-Protokoll erhalten wurde) aus Nachtkulturen.
- 500 μL der Nachtkulturen in einem 2-ml-Zentrifugenröhrchen zu 50% Glycerin pipettieren und vorsichtig miteinander vermischen. Gefrieren und lagern Sie den Glycerinvorrat mit den LAB-Kulturen bei einer extrem niedrigen Temperatur von -80 °C, bis er benötigt wird.
HINWEIS: Ein grafisches Schema des Protokolls für die Qualitätskontrolle und Aktivierung von LAB-Kulturen ist in Abbildung 1 dargestellt.
| Nein | Produktcode | Probe | Quelle | Bakterielle Zusammensetzung wie markiert1 |
| 1 | S9 | Reine Industriebelastung | Bulgarien | Lb. bulgaricus |
| 2 | LB6 | Reine Industriebelastung | Bulgarien | Lb. bulgaricus, |
| 3 | ATCC 11842 | Reine Industriebelastung | ATCC | Lb. bulgaricus |
| 4 | DOHLE | Joghurt | USA | Lb. bulgaricus, andere lebende Kultur |
| 5 | E22 | Joghurt | USA | Lb. bulgaricus, andere lebende Kultur |
| 6 | Reuteri | Joghurt | USA | Limosilactobacillus reuteri |
| 1Pfund = Lactobacillus | ||||
Tabelle 1: Probiotische Stämme. Die Tabelle listet die in dieser Studie verwendeten probiotischen Stämme auf.
2. Protokoll zur Aktivierung und Qualitätskontrolle von LAB-Kulturen
- Nehmen Sie den vorbereiteten Glycerinvorrat der LAB-Stämme (in 2-ml-Zentrifugenröhrchen) aus dem -80 °C Ultra-Low-Gefrierschrank und lassen Sie sie vor Gebrauch nicht auftauen.
- Reinigen und desinfizieren Sie die Öffnung der Zentrifugenröhrchen mit 70% Alkohol und wirbeln Sie sie vor Gebrauch sanft an.
- Pipettieren Sie ca. 250 μL (0,25 ml) der LAB-Stammkultur aus den Zentrifugenröhrchen in frische 2 mL MRS-Reagenzgläser.
- Die Reagenzgläser vorsichtig antexen, parafilmen und anaerob über Nacht bei 42 °C für 12-16 h inkubieren.
- Nehmen Sie etwa 500 μL (0,5 ml) aus den über Nacht gewachsenen Kulturen aus den 2 mL MRS-Reagenzgläsern in frische 7 mL MRS-Reagenzgläser, wirbeln Sie sie und inkubieren Sie sie anaerob über Nacht bei 42 °C für 12-16 h.
- Beurteilen Sie das mikrobielle Wachstum, indem Sie die optische Dichte (OD) oder das Wachstum der Kulturen bei 610 nm mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer messen und akzeptable Ergebnisse zwischen 0,7 und 0,9 aufzeichnen.
- Die Nachtkulturen aus den 7-ml-MRS-Röhrchen auf MRS- und MRCM-PYR-Agarplatten streifen und 72 h bei 42 °C anaerob inkubieren.
- Nehmen Sie isolierte Kolonien von den Agarplatten, geben Sie sie in frische 7-ml-MRS-Reagenzgläser, wirbeln Sie sie sanft vor und inkubieren Sie sie anaerob über Nacht bei 42 ° C für 12-16 h.
- Lagern Sie die Agarplatten mit den isolierten Stämmen eine Woche lang bei 4 °C im Kühlschrank.
- Messen und bestätigen Sie den OD (zwischen 0,7 und 0,9) aus den 7 ml MRS-Reagenzgläsern der LAB-Kulturen, die aus den gestreiften Platten bei 610 nm isoliert wurden, und verwenden Sie sie als Arbeitskulturen für alle verwandten Experimente.
- Führen Sie zehnfache Verdünnungen (seriell verdünnen) der gewachsenen LAB-Kulturen aus den endgültigen 7-ml-MRS-Reagenzgläsern unter Verwendung von 9 ml Peptonwasser (einem physiologischen Puffer) durch, um ein Verhältnis von 1:10 zu erhalten.
- Schließlich nehmen Sie etwa 250 μL (0,25 ml) aus geeigneten seriellen Verdünnungen für alle Fermentationsexperimente.
- Aktivieren Sie die brühehaltigen Stämme (250 μL) aus Schritt 2.12, indem Sie sie in frische 7 mL MRS-Brühe geben und anaerob bei 42 °C für 16 h inkubieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.6-2.12, um ein lebensfähiges und überlegenes Zellwachstum aus LAB-Kulturen sicherzustellen.
HINWEIS: Alle L. bulgaricus-Stämme wurden in der frisch zubereiteten MRS-Brühe aktiviert und dann anaerob bei 42 °C für 16 h inkubiert, um eine optische Dichte (OD610 nm) des Bakterienwachstums zwischen 0,7 und 0,9 zu erreichen. Das Bakterienwachstum wurde mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer bei 610 nm gemessen. Die pH-Werte der Nachtkulturen lagen im Bereich von 3,5 bis 5,3 infolge der Produktion von Milchsäure, einem organischen Endprodukt der LAB-Fermentation. Sicherheitsverfahren wie eine ordnungsgemäße Luftzirkulation in der Biosicherheitshaube und die Vermeidung von Verbrennungen während der Verwendung des Bunsenbrenners wurden eingehalten und eingehalten.
Abbildung 1: Ein grafisches Schema des Protokolls zur Aktivierung von Milchsäurebakterien (LAB)-Kulturen. Das Programm enthält Details und die grundlegenden Instrumente, die für die Handhabung und Aktivierung von LAB-Kulturstämmen erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Representative Results
Das Zellwachstum der bewerteten LAB-Stämme, die mit dem Qualitätskontrollprotokoll kultiviert wurden, unterschied sich signifikant (P < 0,05) von den Stämmen, die ohne dieses Standardprotokoll kultiviert wurden. Das QC-Protokoll für L. bulgaricus und L. reuteri verwendete einen Multi-Subkultur-Ansatz (Subkulturierung dreimal vor dem Streifen auf Agarplatten), während das Kontrollverfahren nur einmal subkultiviert wurde, wobei alle anderen Bedingungen konstant blieben. Das Koloniewachstum war auch höher und gut definiert auf den Wachstumsmedienplatten, die mit diesem Standard-QC-Protokoll kultiviert wurden. Dies bestätigte die Wirksamkeit des Protokolls bei der Gewährleistung eines verbesserten LAB-Wachstums durch Zellteilung in der fermentativen Brühe und unterstützt somit den verbesserten Zellstoffwechsel in den LAB-Stämmen. Das Wachstum von zwei Stämmen, die mit und ohne das entwickelte Qualitätskontrollprotokoll kultiviert wurden, ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Stämme wurden auf Agarplatten gestreift, nachdem ein intensives Wachstum (0,7-0,9 bei OD610 nm) beobachtet und gemessen wurde. Die Platten wurden 72 h lang bei 42 °C anaerob inkubiert, woraufhin diskrete Kolonien entlang der Linien der Streifenbildung beobachtet wurden. Eine weitere Studie (Abbildung 3) bestätigte die Effizienz des Qualitätskontrollprotokolls für das Wachstum von Lactobacillus reuteri, das in TPY-Medium kultiviert und bei 37 °C inkubiert wurde, wobei die durch die QC-Protokolltechnik erzeugten Kolonien ein stabiles stationäres Wachstum (durchschnittlich 0,9 bei OD610 nm) auf der Grundlage historischer Daten bestätigten. Eine Kontrollmethode der LAB-Aktivierung ohne multiple Subkultur, die nicht die entwickelte QC-Technik verwendete, führte zu einem ungleichmäßigen Wachstumsmuster (0,9-0,75 bei OD610 nm) von L. reuteri.
Abbildung 2: Koloniale Morphologie des Wachstums von L. bulgaricus-Stämmen , die mit und ohne das entwickelte Qualitätskontrollprotokoll kultiviert wurden. Die Stämme wurden dreifach gestreift und bei 42 °C für 72 h anaerob inkubiert .
Abbildung 3: Verhalten von L. reuteri über einen Zeitraum nach dem Wachstum in TPY-Medium bei 37 °C unter Verwendung des standardisierten QC-Protokolls und der herkömmlichen Methode der bakteriellen Kultivierung (P < 0,05). Das Wachstum von L. reuteri wurde einen Monat lang regelmäßig überwacht und mit historischen Daten aus früheren Jahren abgestimmt, die auf der Kulturaktivierung mit dem Standard-QC-Protokoll basierten. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung der OD-Werte an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Ergebnisse aller Stämme, die mit dem Qualitätskontrollprotokoll und ohne die Verwendung des Protokolls bewertet wurden, waren die gleichen, und als solche wurden Ergebnisse präsentiert, die nur mit Stämmen (S9 und LB6) verknüpft waren. Die aktivierten LAB-Stämme hatten ein überlegenes Zellwachstum, das durch eine hohe Intensität der Zellbiomasse gekennzeichnet war, was zu einem trüben Aussehen der MRS-fermentativen Brühe im Reagenzglasführte 11. Das beobachtete Zellwachstum nach der Kulturaktivierung zeigte sich zwischen 12 h und 16 h bei einer anaeroben fermentativen Temperatur von 42 °C. Es wurde auch bestätigt, dass die auf der Grundlage dieses Protokolls aktivierten LAB-Stämme ihre Koloniemorphologien als Ergebnis des Multi-Subkulturverfahrens12 mit diskreten Kolonien, die entlang der Linien der Streifenbildung sichtbar waren, kontinuierlich transformiert hatten. Das Kontrollexperiment verwendete dieses Standardprotokoll nicht und wurde nur einmal subkultiviert; es zeigte jedoch auch keine intensive Trübung in der fermentativen Brühe, obwohl das Wachstum beiOD 610 nm immer noch im akzeptierten Bereich von 0,7-0,9 lag. Bemerkenswert war auch, dass die Streifenbildung der Kontrollkulturen auf den Agarplatten und deren anaerobe Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie beim Standardverfahren nur kleinere und weniger Kolonien im Vergleich zu den im Standardprotokoll13 beobachteten abbildete.
Dies könnte auf die schwachen und nicht lebensfähigen Eigenschaften der LAB-Zellen zurückgeführt werden. Folglich führt das Konzept der mehrfachen Subkultivierung von LAB-Stämmen und Streifen auf Agarplatten zur Erzeugung neuer Zellen durch Zellteilung und Austausch von genetischem Material in den Bakterien. Dies verbessert die zelluläre und metabolische Funktionalität und fördert das Wachstum von Zellen während der Fermentationsvorgänge14. Darüber hinaus werden gestresste und verletzte LAB-Zellen auch auf der Grundlage der stabilen Wachstumsbedingungen (Nährstoffbedarf, pH-Wert und Temperatur) wiederhergestellt, die es ihnen ermöglichen, sich leicht anzupassen und die volle Zell- und Stoffwechselfunktionalität wiederzuerlangen6. Darüber hinaus begrenzt die strikte Einhaltung dieses Protokolls die Kontamination von Zellkulturen in größerem Maße, wodurch sichergestellt wird, dass nur reine und überlegene Zellkolonien für Fermentationszwecke isoliert werden. So lieferten wiederholtes Streifen und die Gewinnung von LAB-Zellkulturen aus Agarplatten eine verbesserte Zellwand, die sich gut für metabolische Aktivitäten wie für LAB-Fermentationsoperationen eignete15. Darüber hinaus bestätigt die Studie über das Wachstum von L. reuteri auf der Grundlage des entwickelten Qualitätskontrollprotokolls (Abbildung 3), wie die Subkulturierung von LAB über die Kolonie-zu-Kultur-Methode ein stabiles, stetiges Wachstum im optimalen Wachstumsbereich (0,9-1,0 OD 610 nm) über einen Zeitraum im Vergleich zur Subkulturierung direkt von Kultur zu Kultur (konventionelle Methode) ergibt, was zu einem starken Wachstum von 0,75 auf 0,9 bei OD610 nm führte. . Es war auch offensichtlich, dass das QC-Protokoll im Laufe der Zeit konsistent ein stabiles Bakterienwachstumsmuster ergab, das eine Standardabweichung (SD) von 0,1 aufwies. Das ungleichmäßige Wachstum von L. reuteri hatte jedoch aufgrund des ungleichmäßigen Wachstums der Bakterienzellen einen SD von mehr als 0,1. Dieses ungleichmäßige Wachstumsmuster wurde, wie bereits erwähnt, schwachen und verletzten Zellen zugeschrieben; So nahm die metabolische Funktionalität der Zellen während der Fermentationsperiodeab 14. Die aktuelle Studie wurde auch durch eine frühere von Ahmed et al.16 bestätigt, in der in ihrer Studie L. reuteri in Trypticase-Pepton-Hefeextrakt (TPY)-Agarmedium für 8 Wochen bei 37 °C vermehrt wurde. Ein Faktor für das stetige Wachstum von L. reuteri wurde der Methode der Zellkultivierung und Qualitätskontrolltechnik zugeschrieben, die auch nach mehreren Subkulturaktivitäten während des Studienzeitraums neue und überlegen aktive Kulturen erzeugte.
Zu den kritischen Schritten in diesem Protokoll gehört es, immer neue und weniger als einen Tag alte fermentative Kulturen zu verwenden und die fermentative Brühe oder das Wachstumsmedium vor Beginn der Fermentation immer neu vorzubereiten und kein gelagertes Wachstumsmedium zu verwenden, da die Stärke und Wirksamkeit des Mediums über einen längeren Zeitraum der Lagerung abnimmt. Bei Verwendung von Stammkulturen von -80 °C oder -20 °C sollten die Kulturen aseptisch gehandhabt werden. Wenn außerdem festgestellt wird, dass Stammkulturen aufgrund eines Kälteschocks aus dem Gefrierschrank schwach sind, ist eine Wiederbelebung wie folgt erforderlich. Nur geringe Konzentrationen (ca. 100 μL) der Stammkulturen sollten in der ergänzten fermentativen Brühe (MRS) von ca. 2 mL zur präanaeroben Inkubation für ca. 6 h beimpft werden, bevor zusätzlich ergänzte MRS von ca. 5-6 mL für die abschließende anaerobe Inkubation für ca.16 h 17 hinzugefügt wird. Im Falle der Verwendung von lyophilisierten oder gefriergetrockneten Kulturen wird dringend empfohlen, die gefriergetrockneten Kulturen in 3 ml Magermilch zurückzugewinnen und anaerob für ca. 4-5 h zu inkubieren, bevor sie in der ergänzten fermentativen Brühe wie MRS inokuliert werden. Diese Prozesse sind der Schlüssel, um die Lebensfähigkeit der LAB-Zellen jederzeit sicherzustellen13.
Ein weiterer kritischer Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass das Zellwachstum fermentativer Kulturen immer im Wachstumsbereich von 0,7-0,9 liegt, der normalerweise beiOD 610nm liegt. Dies ist wichtig, da dieser Wachstumsbereich als geeignete logarithmische oder exponentielle Phase der bakteriellen Wachstumskurve17 empfohlen wird. Jeder optische Dichtewert (OD) über 1 ist ungenau, da dies bestätigt, dass die fermentativen Kulturen ihre Todesphase erreicht haben, wobei die meisten toten Zellen und die Ansammlung von toxischen Zellabfällen überwiegend im fermentativen Medium vorhanden sind. Bei Erreichen eines OD-Wertes über 1 (OD 610nm > 1) wird empfohlen, die Kulturen 2 oder 3-fach oder mehr zu verdünnen, bis sie einen OD-Wert unter 1 (OD610nm < 1)18 erreichen. Ein weiteres Anliegen ist es, die gestreiften Platten mit den fermentativen Kulturen angemessen anaerob zu inkubieren. Obwohl die meisten LAB fakultative Anaerobier sind, ist ein verstärktes Wachstum in Gegenwart von Sauerstoff begrenzt; Daher ist die Bevorzugung anaerober Bedingungen erforderlich, um ein effizientes Wachstum zu fördern. Es wird empfohlen, eine CO2-Kammer oder ein improvisiertes Gefäß zu verwenden, das während der Inkubationszeit bei42 °C CO2 erzeugen könnte. Für beste Zellwachstumsergebnisse auf inkubierten Platten wird 72 h für optimale Ergebnisse empfohlen18.
Es gibt jedoch keine Einschränkungen dieses Standardverfahrens, da die strikte Einhaltung der Schritte lebensfähige und reine LAB-Zellen für fermentative Verfahren gewährleistet. Die Bedeutung dieses Standardprotokolls beruht auf seinem proaktiven Ansatz zur Sicherstellung der Lebensfähigkeit probiotischer Zellen, insbesondere für fermentative Kulturen. Es dient als Qualitätskontrollmechanismus, der darauf abzielt, Verunreinigungen zu beseitigen und letztendlich starke und hochrentable Kulturen zu fördern, die unter Standardbedingungen wünschenswerte Fermentationserträge erzielen können. In Bezug auf bestehende oder konventionelle Methoden eliminiert dieses Standardprotokoll die Wahrscheinlichkeit von LAB-Zelllebensfähigkeitsproblemen (aufgrund von Kälteschock und schlechtem Wachstumsmedium) Es versucht auch, das First-Time-Right-Konzept reiner und lebensfähiger probiotischer Kulturen sicherzustellen, Zeit zu sparen und die Produktivität bei der Arbeit mit LAB-Kulturen zu fördern.
Die zukünftigen Anwendungen dieser Technik sind enorm, da dieses Protokoll sowohl in Forschungslabors als auch in der Milch- und Lebensmittelindustrie, in der Bioprozess-, Fermentations- und Biotechnologie eingesetzt werden könnte. Der zusätzliche Vorteil dieses Protokolls beruht auf seiner vereinfachten Natur und erfordert daher keinen anspruchsvollen Einsatz von Laborgeräten. Als solches könnte dieses Protokoll für Demonstration oder pädagogisches Lernen in Gymnasien verwendet werden, die über eine grundlegende Laborumgebung verfügen, um das Interesse der Schüler an naturwissenschaftlichen, technologischen, ingenieurwissenschaftlichen und mathematischen Bereichen (STEM) zu fördern und aufzubauen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Veröffentlichung wurde durch die Fördernummer NC ermöglicht. X-267-5-12-170-1 vom National Institute of Food and Agriculture (NIFA) und teilweise von NIZO Food Research BV, Niederlande, Jarrow Formulas, USA, und dem Department of Family and Consumer Sciences und der Agriculture Research Station der North Carolina Agriculture and Technical State University (Greensboro, NC, USA 27411). Diese Arbeit wurde teilweise auch durch das 1890 Capacity Building Program Grant Nr. (2020-38821-31113 / Project Accession No. 021765) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch teilweise vom bulgarischen Ministerium für Bildung und Wissenschaft im Rahmen des Nationalen Forschungsprogramms "Gesunde Lebensmittel für eine starke Bioökonomie und Lebensqualität" unterstützt, das von DCM # 577 / 17.08.2018 genehmigt wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
References
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