Summary
Kvalitetskontrollvurderingen av melkesyrebakterier (LAB) kulturer er bekreftet som en effektiv måte å forbedre levedyktigheten og funksjonaliteten til LAB-stammer for gjæringsprosedyrer. For å underbygge denne påstanden utviklet vi en protokoll som belyser hvordan LAB-kulturer aktiveres og dyrkes for fermenterings- og bioprosesseringsprosedyrer.
Abstract
Melkesyrebakterier (LAB) er essensielle meieristarterkulturer som er betydelig ansatt for produksjon av fermenterte meieriprodukter som yoghurt og ost. LAB produserer hovedsakelig melkesyre som et viktig sluttprodukt av gjæring, og de syntetiserer viktige metabolitter som gir de organoleptiske egenskapene til fermenterte matvarer. LAB er kresne bakterier som trives i mange miljøer når tilstrekkelige ernæringsbehov er oppfylt. Etterspørselen etter overlegne LAB meieri startkulturer for gjæring applikasjoner i mat og meieriindustrien, har resultert i behovet for å gi levedyktige og aktive kulturer for alle bioprosessering operasjoner. Utviklingen av en standardprotokoll for å sikre levedyktigheten og forbedret funksjonalitet for LAB-kulturer i laboratoriet så vel som meieribehandlingsmiljøer er derfor svært kritisk. Ved å ta opp bekymringer knyttet til gjenoppliving av svake, stressede og skadede LAB-kulturceller, er en protokoll som levende skisserer fremtredende trinn for å gjenopprette, forbedre celleregenerering og forbedre metabolsk funksjonalitet av LAB-stammer, av største betydning. Vedlikehold av kulturrenhet, funksjonalitet og levedyktighet for LAB-startkulturer er også kritisk. Derfor vil overholdelse av en unik protokollretningslinje resultere i fremme av gjæringsytelse for mange LAB-stammer dedikert til gjærings- og bioteknologiske prosesser. Som et resultat har Food Microbiology and Biotechnology Laboratory ved North Carolina Agriculture and Technical State University utviklet en standardprotokoll for aktivering og kvalitetskontroll av utvalgte LAB-stammer som har resultert i svært funksjonelle og levedyktige LAB-kulturstammer ansatt for gjæringsforskning. Tilpasningen og anbefalingen av en protokoll som denne for bruk i meieri- og næringsmiddelindustrien vil bidra til å sikre LAB levedyktighet og funksjonalitet for mange applikasjoner.
Introduction
Melkesyrebakterier (LAB) er en gruppe unikt varierte bakterier som har industrielt potensial. Stammer som tilhører Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus og Streptococcus thermophilus brukes mest som meieristartkulturer for fermenterte meieriprodukter som yoghurt1. Utvalgte LAB stammer er også klassifisert som probiotika som de gir helsemessige fordeler for mennesker når doser er tilstrekkelig administrert2. Melkesyrebakterier er også gram-positive, ikke-sporedannende, ikke-respirerende, men aerotolerante mikroorganismer som generelt er preget av produksjon av melkesyre som et viktig gjæringsprodukt. LAB syntetiserer også essensielle metabolitter, for eksempel organiske syrer, bakteriociner og andre antimikrobielle forbindelser3 som kan hemme et bredt spekter av matbårnepatogener. Melkesyre, et viktig sluttprodukt av karbohydratkatabolisme og et biprodukt av LAB-gjæring, er en organisk metabolitt som har antimikrobielle egenskaper og er potensielt nyttig for konserveringsapplikasjoner for mat 3,5,6. Videre gir de organiske syrene produsert av LAB smaken, teksturen og aromaen til matvarer, og forbedrer dermed deres samlede organoleptiske egenskaper 5,6. De distinkte ernæringsmessige kravene til LAB kombinert med deres allestedsnærværende natur, gjør det til slutt mulig for bakteriene å trives i forskjellige miljøer som meieribaserte matvarer, gjærede matvarer, grønnsaker samt i menneskets tarm7.
Det er en økende etterspørsel etter startkulturer fra LAB for yoghurtproduksjon og mange forskjellige meieriapplikasjoner8,9, derfor bør kritisk oppmerksomhet og etablerte vitenskapelige teknikker overholdes, i LAB-stammedyrking, samt i aktivering av både lyofiliserte og isolerte stammer, da denne aktiviteten er avgjørende for forbedret gjæringsytelse. Matmikrobiologi- og bioteknologilaboratoriet engasjerer seg derfor aktivt i egnet teknologiutvikling rettet mot aktivering, overlegen vekst og gjæring som er karakteristisk for LAB-stammer isolert fra fermenterte meieriprodukter, samt fra industrielle startkulturer ansatt for yoghurtproduksjon. Videre er det bemerkelsesverdig at LAB-kulturstammer industrielt produsert gjennomgår konserveringsaktiviteter som frysetørking og frossen lagring, noe som forårsaker cellestress og skade, som et resultat av kaldsjokkprosessen de blir utsatt for10. Ved å begrense levedyktighetsutfordringene og forbedre funksjonaliteten til LAB-stammer hentet fra enten isolerte matvarer eller frysetørkede produkter, er det viktig å aktivere disse kulturene riktig som en form for kvalitetskontroll for å forbedre deres fermentative karakteristikk8. I denne studien var målet å utvikle en intern kvalitetskontrollprotokoll for aktivering og vekst av L. delbrueckii subsp. bulgaricus kulturstammer som til slutt fremmet levedyktig LAB-vekst, samt forbedret gjæringsytelsen og den metabolske funksjonaliteten til LAB-stammer. Denne protokollen kan til slutt tilpasses (ved hjelp av optimale vekstmedier og passende dyrkingsforhold) for dyrking av andre LAB-stammer for fermenteringsforskning, samt for industrielle formål eller bioprosesseringsoperasjoner. Denne LAB-aktiverings- og kvalitetskontrollprotokollen vil derfor sikre at overlegne levedyktige meieristarterkulturer oppnås og potensielt funksjonelle for ulike applikasjoner i den globale meieri- og næringsmiddelindustrien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generelle materialer og metoder
- Kilde til Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
- Få L. bulgaricus-stammer fra pålitelige kilder.
MERK: I denne studien ble totalt fem (5) L. bulgaricus-stammer brukt i kvalitetskontrollstudien (tabell 1). To stammer av frysetørket L. bulgaricus for industriell produksjon av fermenterte melkeprodukter ble levert av Dr. Albert Krastanov, Institutt for bioteknologi ved University of Food Technologies, Plovdiv, Bulgaria. To stammer isolert fra kommersielle yoghurtprodukter tilgjengelig i det amerikanske markedet ble hentet fra -80 ° C-lageret av Food Microbiology and Biotechnology-laboratoriet ved North Carolina A &T State University, og en frysetørket stamme ble levert av en leverandør C. Alle LAB-stammer ble holdt ved -80 °C til videre bruk. En annen bakteriestamme (Limosilactobacillus reuteri) ble oppnådd fra -80 ° C-stammen av matmikrobiologi og bioteknologilaboratorium ved North Carolina A &T State University ble også evaluert.
- Få L. bulgaricus-stammer fra pålitelige kilder.
- Standard L. MRS gjæring kjøttkraft medium
- Forbered deMan, Rogosa Sharpe (MRS) medium ved å fullstendig oppløse 55 g MRS, og 0,5 g L-Cystein i 1 liter avionisert vann (DW).
- Dispenser 7 ml og 2 ml av den tilberedte MRS-oppløsningen i henholdsvis reagensrør, autoklav ved 121 °C i 15 minutter, og avkjøl deretter ved romtemperatur (RT).
- MRS agar medium
- Forbered MRS agar medium ved fullstendig oppløsning av 55 g MRS og 0,5 g L-Cystein i 1 liter DW. Tilsett agarpulver (15 g), steriliser agarmediet ved 121 °C i 15 minutter, og avkjøl det deretter i et vannbad.
- Hell alle nylagde medier i sterile petriskåler og oppbevar dem ved 4 °C til det er behov for det.
- Modifisert forsterket clostridial medium-pyruvat (mRCM-PYR)
- Optimaliser et forsterket clostridial medium i henhold til Oyeniran et al.13 og Nwamaioha og Ibrahim18, for selektivitet og nøyaktig oppregning av L. bulgaricus ved å oppløse 10 g pepton # 3, 10 g biffekstrakt, 5 g gjærekstrakt, 5 g natriumklorid, 3 g natriumacetat, 2 g kaliumfosfatdibasisk, 0,1 g uracil, 0,25 g kalsiumklorid, 5 g druesukker, 5 g fruktose, 10 g maltose, 2 g natriumpyruvat, 0,2% Tween 80 og 0,5 g L- Cystein i 1 liter DW.
- Juster den endelige pH (6,0 ± 0,2) av løsningen ved å bruke 6 N HCl før tilsetning av 0,008% anilinblått og 15 g agar. Autoklav mediet ved 121 ° C i 15 minutter, avkjøl i et vannbad, og hell i sterile petriskåler. Oppbevar alle nylagde medier i sterile petriskåler ved 4 °C ved behov.
- Glyserol lager av LAB kulturer
- Forbered glyserollagre (50% glyserol) ved å fortynne 100% glyserol i samme volum DW og steriliser ved 100 ° C i 30 minutter ved hjelp av en tørr steriliseringssyklus. Avkjøl glyserollagrene til RT og lagre dem aseptisk for videre bruk.
- Bruk bakterievekst (en enkelt koloni av L. bulgaricus oppnådd ved hjelp av den utviklede QC-protokollen) fra kulturer over natten.
- Pipette 500 μL av nattkulturene til 50 % glyserol i et 2 ml sentrifugerør og bland dem forsiktig sammen. Frys ned og oppbevar glyserolstammen som inneholder LAB-kulturene ved en ultralav temperatur på -80 °C til det er nødvendig.
MERK: Et grafisk skjema av protokollen for kvalitetskontroll og aktivering av LAB-kulturer er vist i figur 1.
| Nei | Produkt Kode | Eksempel | Kilde | Bakteriell sammensetning som merket1 |
| 1 | S9 | Ren industriell stamme | Bulgaria | Lb. bulgaricus |
| 2 | LB6 | Ren industriell stamme | Bulgaria | Lb. bulgaricus, |
| 3 | ATCC 11842 | Ren industriell stamme | ATCC | Lb. bulgaricus |
| 4 | KAIE | Yoghurt | Norge | Lb. bulgaricus, annen levende kultur |
| 5 | E22 | Yoghurt | Norge | Lb. bulgaricus, annen levende kultur |
| 6 | Reuteri | Yoghurt | Norge | Limosilactobacillus reuteri |
| 1pund = Lactobacillus | ||||
Tabell 1: Probiotiske stammer. Tabellen viser de probiotiske stammene som ble brukt i denne studien.
2. Protokoll for aktivering og kvalitetskontroll av LAB-kulturer
- Ta den tilberedte glyserolbeholdningen av LAB-stammer (i 2 ml sentrifugerør) fra -80 ° C ultra-lav fryser, og ikke la dem tine før bruk.
- Rengjør og desinfiser åpningen av sentrifugerørene med 70% alkohol, og forsiktig virvel før bruk.
- Pipette ca. 250 μL (0,25 ml) av LAB-lagerkulturen fra sentrifugerørene til ferske 2 ml MRS-reagensrør.
- Virvle forsiktig, parafilm reagensrørene, og inkuber dem anaerobt over natten ved 42 °C i 12-16 timer.
- Ta ca. 500 μL (0,5 ml) fra de nattlige dyrkede kulturene fra 2 ml MRS-reagensrør til ferske 7 ml MRS-reagensrør, virvel, og inkubert dem anaerobt over natten ved 42 °C i 12-16 timer.
- Vurder den mikrobielle veksten ved å måle den optiske tettheten (OD) eller veksten av kulturene ved 610 nm med et UV-synlig spektrofotometer og registrer akseptable resultater mellom 0,7 og 0,9.
- Strek nattkulturene fra 7 ml MRS-rørene på MRS- og MRCM-PYR-agarplatene og inkuber dem anaerobt i 72 timer ved 42 °C.
- Plukk isolerte kolonier fra agarplatene, overfør dem til ferske 7 ml MRS-reagensrør, forsiktig virvel, og inkubert dem anaerobt over natten ved 42 °C i 12-16 timer.
- Oppbevar agarplatene som inneholder de isolerte stammene ved 4 °C i kjøleskapet i en uke.
- Mål og bekreft OD (mellom 0,7 og 0,9) fra 7 ml MRS-reagensrør fra LAB-kulturene isolert fra de stripete platene ved 610 nm og bruk dem som arbeidskulturer for alle relaterte eksperimenter.
- Utfør ti ganger fortynninger (serielt fortynnet) av de dyrkede LAB-kulturene fra de endelige 7 ml MRS-reagensrørene ved å bruke 9 ml peptonvann (en fysiologisk buffer) for å oppnå et 1:10-forhold.
- Til slutt, ta ca 250 μL (0,25 ml) fra passende serielle fortynninger for alle gjæringseksperimenter.
- Aktiver buljongen som inneholder stammer (250 μL) fra trinn 2.12 ved å overføre dem til fersk 7 ml MRS-buljong og inkubere dem anaerobt ved 42 °C i 16 timer.
- Fortsett ved å gjenta trinn 2.6-2.12 for å sikre levedyktig og overlegen cellevekst fra LAB-kulturer.
MERK: Alle L. bulgaricus-stammer ble aktivert i den nylagde MRS-buljongen og ble deretter inkubert anaerobt ved 42 ° C i 16 timer for å nå en optisk tetthet (OD610 nm) av bakterievekst mellom 0,7 og 0,9. Bakterievekst ble målt med et UV-synlig spektrofotometer ved 610 nm. pH-verdiene i nattkulturene var i området 3,5 til 5,3 som et resultat av produksjonen av melkesyre, et organisk sluttprodukt av LAB-gjæring. Sikkerhetsprosedyrer som riktig luftstrømsirkulasjon i biosikkerhetshetten og unngå brannskader under bruk av bunsenbrenneren ble overholdt og observert.
Figur 1: Et grafisk skjema av protokollen for aktivering av melkesyrebakterier (LAB) kulturer. Ordningen gir detaljer og de grunnleggende instrumentene som kreves for håndtering og aktivering av LAB-kulturstammer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellevekst av de evaluerte LAB-stammene dyrket med kvalitetskontrollprotokollen var signifikant forskjellig (P < 0,05) enn stammene dyrket uten denne standardprotokollen. QC-protokollen for både L. bulgaricus og L. reuteri benyttet en multi-subculturing tilnærming (subculturing tre ganger før streaking på agarplater), mens kontrollprosedyren bare hadde subkulturering gjort en gang med alle andre forhold holdt konstant. Koloniveksten var også høyere og godt definert på vekstmedieplatene som ble dyrket ved hjelp av denne standard QC-protokollen. Dette bekreftet effektiviteten av protokollen for å sikre forbedret LAB-vekst gjennom celledeling i gjærende buljong, og bidro derfor til forbedret cellemetabolisme i LAB-stammene. Veksten av to stammer dyrket med og uten den utviklede kvalitetskontrollprotokollen er vist i figur 2. Stammene ble streket på agarplater etter at intens vekst (0,7-0,9 ved OD610 nm) ble observert og målt. Platene ble anaerobt inkubert ved 42 °C i 72 timer, hvoretter diskrete kolonier ble observert langs streker. En annen studie (figur 3) bekreftet effektiviteten av kvalitetskontrollprotokollen om veksten av Lactobacillus reuteri dyrket i TPY-medium og inkubert ved 37 ° C, hvor kolonier generert av QC-protokollteknikken bekreftet en stabil steady-state vekst (gjennomsnittlig 0,9 ved OD610 nm) basert på historiske data. En kontrollmetode for LAB-aktivering uten flere underkulturer som ikke benyttet den utviklede QC-teknikken, resulterte i et ujevnt vekstmønster (0,9-0,75 ved OD610 nm) av L. reuteri.
Figur 2: Kolonial morfologi av vekst av L. bulgaricus-stammer dyrket med og uten den utviklede kvalitetskontrollprotokollen. Stammene ble stripet i tre eksemplarer og ble anaerobt inkubert ved 42 °C i 72 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oppførselen til L. reuteri over en periode etter vekst i TPY-medium ved 37 °C ved bruk av den standardiserte QC-protokollen og den konvensjonelle metoden for bakteriedyrking (P < 0,05). Veksten av L. reuteri ble overvåket periodisk i en måned og ble justert med historiske data fra tidligere år basert på kulturaktivering med standard QC-protokollen. Feilfeltene angir standardavviket for OD-verdiene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resultatene av alle stammer evaluert med kvalitetskontrollprotokollen og uten bruk av protokollen var de samme, og som sådan ble resultater knyttet til bare stammer (S9 og LB6) presentert. De aktiverte LAB-stammene hadde overlegen cellevekst som ble preget av en høy intensitet av cellebiomasse, og forårsaket derfor et uklart utseende av MRS-fermentativ buljong i reagensrøret11. Den observerte celleveksten etter dyrkningsaktivering var tydelig mellom 12 timer og 16 timer ved en anaerob gjæringstemperatur på 42 °C. Det ble også bekreftet at LAB-stammene aktivert basert på denne protokollen kontinuerlig hadde sine kolonimorfologier transformert som et resultat av multi-sub-dyrkingsprosedyren12 med diskrete kolonier synlige langs streker. Kontrolleksperimentet brukte ikke denne standardprotokollen og ble bare subkulturert en gang; det viste imidlertid ikke også intens turbiditet i gjærende buljong, selv om veksten fortsatt var innenfor det aksepterte området 0,7-0,9 ved OD610 nm. Det var også bemerkelsesverdig at strekking av kontrollkulturene på agarplatene og anaerob inkubering av dem under samme forhold som standardprosedyren bare avbildet mindre og færre kolonier sammenlignet med de som ble observert i standardprotokollen13.
Dette kan tilskrives de svake og ikke-levedyktige egenskapene til LAB-cellene. Følgelig resulterer konseptet med sub-dyrking av LAB-stammer flere ganger og streker på agarplater dermed i generering av nye celler gjennom celledeling og utveksling av genetisk materiale i bakteriene. Dette forbedrer cellulær og metabolsk funksjonalitet og fremmer veksten av celler under gjæringsoperasjoner14. I tillegg gjenvinnes også stressede og skadede LAB-celler basert på steady-state av vekstforhold (ernæringsmessige krav, pH og temperatur) som gjør at de enkelt kan tilpasse seg og gjenvinne full celle- og metabolsk funksjonalitet6. Videre begrenser streng overholdelse av denne protokollen forurensning av cellekulturer i større grad, og sikrer dermed at bare rene og overlegne cellekolonier isoleres for gjæringsformål. Dermed ga gjentatt streking og gjenoppretting av LAB-cellekulturer fra agarplater en forbedret cellevegg som var godt egnet for metabolske aktiviteter som for LAB-gjæringsoperasjoner15. Videre bekrefter studien om vekst av L. reuteri basert på den utviklede kvalitetskontrollprotokollen (figur 3) hvordan subkulturering av LAB via koloni til kulturmetode gir en stabil jevn vekst i det optimale vekstområdet (0,9-1,0 OD 610 nm) over en periode sammenlignet med subkulturering direkte fra kultur til kultur (konvensjonell metode), noe som resulterte i en kraftig vekst fra 0,75 til 0,9 ved OD610 nm . Det var også tydelig at QC-protokollen over tid konsekvent ga et stabilt bakterievekstmønster, som hadde et standardavvik (SD) på 0,1. Den ujevne veksten av L. reuteri hadde imidlertid sin SD større enn 0,1 på grunn av ujevn vekst av bakteriecellene. Dette ujevne vekstmønsteret, som allerede nevnt, ble tilskrevet svake og skadede celler; Dermed ble cellens metabolske funksjonalitet redusert i gjæringsperioden14. Den nåværende studien ble også bekreftet av en tidligere av Ahmed et al.16 hvorved L. reuteri i sin studie ble forplantet i trypticase pepton gjærekstrakt (TPY) agarmedium i 8 uker ved 37 ° C. En medvirkende faktor for den jevne veksten av L. reuteri ble tilskrevet metoden for celledyrking og kvalitetskontrollteknikk som genererte nye og overlegent aktive kulturer selv etter flere subkultureringsaktiviteter i studieperioden.
De kritiske trinnene i denne protokollen inkluderer alltid å bruke nye og mindre enn en dag gamle gjærende kulturer og alltid ha den fermentative buljongen eller vekstmediet som nylig er tilberedt før gjæringen påbegynnes, og ikke bruke lagret vekstmedium ettersom styrken og styrken til mediet avtar over en lengre lagringsperiode. Ved bruk av stamkulturer fra enten -80 °C eller -20 °C skal kulturene håndteres aseptisk. Videre, hvis lagerkulturer observeres å være svake på grunn av kuldesjokk fra fryseren, er gjenopplivning nødvendig som følger. Kun lave konsentrasjoner (ca. 100 μL) av stamkulturene bør inokuleres i supplert fermentativ buljong (MRS) på ca. 2 ml for pre-anaerob inkubasjon i ca. 6 timer før ytterligere supplert MRS på ca. 5-6 ml tilsettes for endelig anaerob inkubasjon i ca. 16 timer17. Ved bruk av lyofiliserte eller frysetørkede kulturer anbefales det sterkt å gjenopprette frysetørkede kulturer i 3 ml skummet væskemelk og anaerobt inkubere dem i ca. 4-5 timer før de inokuleres i den supplerte fermentative buljongen som MRS. Disse prosessene er nøkkelen til å sikre LAB-cellens levedyktighet til enhver tid13.
Et annet kritisk skritt er å sikre at cellevekst av fermentative kulturer alltid er innenfor vekstområdet 0,7-0,9, som vanligvis er ved OD610nm. Dette er viktig da vekstområdet anbefales som riktig logg- eller eksponentiell fase av bakterievekstkurven17. Enhver optisk tetthetsverdi (OD) over 1 er unøyaktig, da dette bekrefter at gjæringskulturene har nådd sin dødsfase med de fleste døde celler og akkumulering av giftig cellulært avfall som hovedsakelig er tilstede i gjæringsmediet. Ved å nå en OD-verdi over 1 (OD 610 nm > 1)., anbefales det å fortynne kulturene 2 eller 3 ganger eller mer til den når en OD-verdi under 1 (OD610 nm < 1)18. Et annet problem er å hensiktsmessig anaerobt inkubere de stripete platene med gjæringskulturene. Selv om de fleste LAB er fakultative anaerober, er økt vekst begrenset i nærvær av oksygen; derfor er preferansen for anaerobe forhold nødvendig for å fremme effektiv vekst. Det anbefales å bruke et CO 2 kammer eller et improvisert kar som kan generere CO2 i inkubasjonsperioden ved 42 °C. For de beste cellevekstresultatene på inkuberte plater anbefales 72 timer for optimale resultater18.
Det er imidlertid ingen begrensninger i denne standardprosedyren, da streng overholdelse av trinnene vil sikre levedyktige og rene LAB-celler for fermentative prosedyrer. Betydningen av denne standardprotokollen er basert på dens proaktive tilnærming for å sikre probiotisk celle levedyktighet, spesielt for fermentative kulturer. Det fungerer som en kvalitetskontrollmekanisme som søker å eliminere forurensning og til slutt fremme sterke og svært levedyktige kulturer som kan produsere ønskelige fermenteringsutbytter under standardforhold. Med henvisning til eksisterende eller konvensjonelle metoder eliminerer denne standardprotokollen sjansen for LAB-celle levedyktighetsutfordringer (på grunn av kuldesjokk og dårlig vekstmedium) den søker også å sikre det første gangs riktige konseptet om å ha rene og levedyktige probiotiske kulturer, sparer tid og fremmer produktivitet når du arbeider med LAB-kulturer.
Fremtidige anvendelser av denne teknikken er enorme, da denne protokollen kan brukes i både forskningslaboratorier, meieri- og næringsmiddelindustri, bioprosessering, gjæring og bioteknologiske institutter. Den ekstra fordelen med denne protokollen er basert på dens forenklede natur og krever dermed ikke sofistikert bruk av laboratorieutstyr. Som sådan kan denne protokollen brukes til demonstrasjon eller pedagogisk læring i videregående skoler som har et grunnleggende laboratoriemiljø for å oppmuntre og bygge interessen til studenter innen vitenskap, teknologi, ingeniørfag og matematikk (STEM) relaterte felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne publiseringen ble muliggjort av tilskuddsnummer NC. X-267-5-12-170-1 fra National Institute of Food and Agriculture (NIFA) og delvis av NIZO Food Research BV, Nederland, Jarrow Formulas, USA, og Department of Family and Consumer Sciences og Agriculture Research Station ved North Carolina Agriculture and Technical State University (Greensboro, NC, USA 27411). Dette arbeidet ble også delvis støttet av 1890 Kapasitetsbyggingsprogram tilskudd nr. (2020-38821-31113/prosjekttiltredelse nr. 021765). Dette arbeidet ble også delvis støttet av det bulgarske utdannings- og vitenskapsdepartementet under det nasjonale forskningsprogrammet 'Sunn mat for en sterk bioøkonomi og livskvalitet' godkjent av DCM # 577 / 17.08.2018.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
References
- Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
- Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047 (2019).
- Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
- Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
- Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
- Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
- Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
- Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
- Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
- Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
- Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321 (2020).
- Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284 (2015).
- Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
- Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
- Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
- Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).
- Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
- Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).
