Summary
乳酸菌（LAB）培养物的质量控制评估已被证实是增强乳酸菌菌株在发酵过程中的活力和功能的有效方法。为了支持这一说法，我们开发了一个协议，阐明了乳酸菌培养物是如何被激活和培养用于发酵和生物工艺程序的。
Abstract
乳酸菌 （LAB） 是必需的乳制品发酵剂培养物，主要用于生产酸奶和奶酪等发酵乳制品。乳酸主要生产乳酸作为发酵的主要最终产物，它们合成重要的代谢物，赋予发酵食品的感官特性。乳酸菌是挑剔的细菌，当满足足够的营养需求时，它们在许多环境中茁壮成长。食品和乳制品行业对用于发酵应用的优质乳品发酵剂发酵剂的需求导致需要为所有生物工艺操作提供可行和活性的培养物。因此，制定标准方案以确保实验室和乳品加工环境中乳酸菌种的可行性和增强功能非常重要。在解决与复苏脆弱、应激和受伤的乳酸菌培养细胞相关的问题时，一个生动地概述恢复、增强细胞再生和改善乳酸菌株代谢功能的突出步骤的方案至关重要。保持 LAB 起始培养物的培养物纯度、功能性和活力同样至关重要。因此，遵守独特的方案指南将提高许多专门用于发酵和生物技术过程的LAB菌株的发酵性能。因此，北卡罗来纳州农业技术州立大学的食品微生物学和生物技术实验室开发了一种标准方案，用于所选乳酸菌株的活化和质量控制，从而产生了用于发酵研究的高功能和可行的乳酸菌株。对乳制品和食品行业使用这样的协议进行调整和推荐将有助于确保许多应用的LAB可行性和功能。
Introduction
乳酸菌（LAB）是一组具有工业潜力的独特多样化细菌。属于保加利亚乳杆菌亚种和嗜热链球菌的菌株主要用作发酵乳制品（如酸奶1）的乳制品发酵剂培养物。选定的乳酸菌菌株也被归类为益生菌，因为当剂量充分施用时，它们会给人类带来健康益处2.乳酸菌也是革兰氏阳性，非孢子形成，非呼吸但耐气的微生物，其特征通常是生产乳酸作为关键发酵产物。乳酸菌还合成必需代谢物，例如有机酸、细菌素和其他可抑制广谱食源性病原体的抗菌化合物34。乳酸是碳水化合物分解代谢的主要最终产物和LAB发酵的副产物，是一种具有抗菌特性的有机代谢物，可能对食品生物保鲜应用有用3，5，6。此外，乳酸产生的有机酸赋予食物的风味、质地和香气，从而增强其整体感官特性5，6。乳酸菌独特的营养需求加上其无处不在的性质，最终使细菌能够在不同的环境中轻松茁壮成长，例如乳制品，发酵食品，蔬菜以及人体肠道7。
乳酸乳酸对发酵剂的需求不断增长，用于酸奶生产和许多不同的乳制品应用8，9，因此在乳酸菌株培养以及冻干和分离菌株的活化中，应坚持关键关注和既定的科学技术，因为这种活性对于提高发酵性能至关重要。因此，食品微生物学和生物技术实验室积极从事合适的技术开发，旨在从发酵乳制品以及用于酸奶生产的工业发酵剂中分离的乳酸菌株的活化、卓越生长和发酵特性。此外，值得注意的是，工业生产的LAB培养菌株经过冷冻干燥和冷冻储存等防腐活动，导致细胞应激和损伤，由于冷休克过程，它们受到10。为了限制从分离食品或冷冻干燥产品中获得的LAB菌株的生存能力挑战和改善其功能，重要的是适当激活这些培养物作为质量控制的一种形式，以增强其发酵特性8。在这项研究中，目标是开发一种内部质量控制方案，用于激活和生长L. delbrueckii保加利亚亚种培养菌株，最终促进可行的LAB生长，并增强LAB菌株的发酵性能和代谢功能。该方案最终可以调整（使用最佳生长培养基和适当的培养条件）用于培养用于发酵研究的其他LAB菌株，以及用于工业目的或生物工艺操作。因此，该 LAB 活化和质量控制方案将确保获得卓越的活乳制品发酵剂培养物，并有可能在全球乳制品和食品行业的各种应用中发挥作用。
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Protocol
1. 一般材料和方法
- 保加利亚乳杆菌亚种的来源
- 从可靠来源获取 保加利亚乳杆菌 菌株。
注意：在本研究中，在质量控制研究中总共使用了五（5）株 保加利亚乳杆菌 菌株（表1）。保加利亚普罗夫迪夫食品技术大学生物技术系的Albert Krastanov博士提供了两种用于发酵乳制品工业生产的冻干 保加利亚乳杆菌 菌株。从北卡罗来纳州A&T州立大学食品微生物学和生物技术实验室的-80°C库存中获得从美国市场上的商业酸奶产品中分离出的两种菌株，一种冻干菌株由供应商C提供。所有LAB菌株均保持在-80°C直至进一步使用。还评估了另一种细菌菌株（罗伊氏利莫西乳杆菌）从北卡罗来纳州A&T州立大学食品微生物学和生物技术实验室的-80°C库存中获得。
- 从可靠来源获取 保加利亚乳杆菌 菌株。
- 标准L. MRS发酵液培养基
- 通过完全溶解 55 克 MRS 和 0.5 克 L-半胱氨酸在 1 升去离子水 （DW） 中制备 deMan， 罗戈萨夏普 （MRS） 培养基。
- 将7mL和2mL制备的MRS溶液分别分配到试管中，在121°C高压灭菌15分钟，然后在室温（RT）下冷却。
- MRS琼脂培养基
- 通过将55gMRS和0.5gL-半胱氨酸完全溶解在1L DW中来制备MRS琼脂培养基。加入琼脂粉（15g），将琼脂培养基在121°C灭菌15分钟，然后在水浴中冷却。
- 将所有新鲜制备的培养基倒入无菌培养皿中，并将其储存在4°C直至需要。
- 改良增强梭菌中-丙酮酸（mRCM-PYR）
- 根据Oyeniran等人13 和Nwamaioha和Ibrahim18优化增强梭菌培养基，通过溶解10g蛋白胨#3，10g牛肉提取物，5g酵母提取物，5g氯化钠，3g乙酸钠，2g磷酸 钾二元 ， 尿嘧啶0.1g，氯化钙0.25g，葡萄糖5g，果糖5g，麦芽糖10g，丙酮酸钠2g，吐温80和L-半胱氨酸0.5g在1L的DW中。
- 在加入0.008%苯胺蓝和15g琼脂之前，使用6N HCl调节溶液的最终pH（6.0±0.2）。将培养基在121°C高压灭菌15分钟，在水浴中冷却，然后倒入无菌培养皿中。将所有新鲜制备的培养基储存在4°C的无菌培养皿中，直到需要为止。
- 乳酸菌培养物的甘油原液
- 通过在相同体积的DW中稀释100%甘油来制备甘油储备液（50%甘油），并使用干燥灭菌循环在100°C下灭菌30分钟。将甘油原料冷却至室温，并无菌储存以备将来使用。
- 使用来自过夜培养物的细菌生长（使用开发的QC方案获得的 保加利亚乳杆菌 的单个菌落）。
- 将 500 μL 过夜培养物移液到 2 mL 离心管中的 50% 甘油中，并轻轻混合在一起。将含有LAB培养物的甘油原液冷冻并储存在-80°C的超低温下，直到需要为止。
注意：用于乳酸菌培养物质量控制和活化的实验方案的图形方案如图 1所示。
| 不 | 产品代码 | 样本 | 源 | 标记的细菌组成1 |
| 1 | S9 | 纯工业菌株 | 保加利亚 | 保加利亚磅 |
| 2 | LB6 | 纯工业菌株 | 保加利亚 | 保加利亚磅， |
| 3 | ATCC 11842 | 纯工业菌株 | 空管 | 保加利亚磅 |
| 4 | 穴鸟 | 酸奶 | 美国 | 保加利亚，其他活体文化 |
| 5 | E22 | 酸奶 | 美国 | 保加利亚，其他活体文化 |
| 6 | 罗伊特里 | 酸奶 | 美国 | 罗伊氏利莫西乳杆菌 |
| 1磅=乳酸菌 | ||||
表1：益生菌菌株。 下表列出了本研究中使用的益生菌菌株。
2. 乳酸菌培养物活化和质量控制方案
- 从-80°C超低温冰箱中取出LAB菌株（在2mL离心管中）的制备甘油原液，并且在使用前不要让它们解冻。
- 用70%酒精清洁和消毒离心管的开口，并在使用前轻轻涡旋。
- 将离心管中约 250 μL （0.25 mL） 的 LAB 原液培养物移液到新鲜的 2 mL MRS 试管中。
- 轻轻涡旋，封口膜试管，并在42°C下厌氧孵育过夜12-16小时。
- 从 2 mL MRS 试管中从过夜生长的培养物中取出约 500 μL （0.5 mL） 到新鲜的 7 mL MRS 试管中，涡旋，并在 42 °C 下厌氧孵育过夜 12-16 小时。
- 通过使用紫外可见分光光度计测量610nm处培养物的光密度（OD）或生长来评估微生物生长，并记录0.7至0.9之间的可接受结果。
- 将来自7mL MRS管的过夜培养物划线到MRS和MRCM-PYR琼脂平板上，并在42°C下厌氧孵育72小时。
- 从琼脂平板中挑选分离的菌落，将它们转移到新鲜的7mL MRS试管中，轻轻涡旋，并在42°C下厌氧孵育过夜12-16小时。
- 将含有分离菌株的琼脂平板在4°C下在冰箱中储存一周。
- 测量并确认从 610 nm 条纹板中分离的 LAB 培养物的 7 mL MRS 试管中的 OD（0.7 和 0.9 之间），并将其用作所有相关实验的工作培养物。
- 使用9 mL蛋白胨水（生理缓冲液）对最终7 mL MRS试管中生长的LAB培养物进行10倍稀释（连续稀释），以获得1：10的比例。
- 最后，从适当的连续稀释液中取出约 250 μL （0.25 mL），用于所有发酵实验。
- 通过将含有步骤2.12中的菌株（250μL）的肉汤转移到新鲜的7mL MRS肉汤中并在42°C厌氧孵育16小时来激活含有步骤2.12的菌株的肉汤。
- 继续重复步骤2.6-2.12，以确保乳酸菌培养物的活细胞生长和优越。
注意：所有 保加利亚乳杆菌 菌株在新鲜制备的MRS肉汤中被激活，然后在42°C下厌氧孵育16小时，以达到细菌生长的光密度（OD610nm）在0.7和0.9之间。用紫外可见分光光度计在610nm处测量细菌生长。由于乳酸（乳酸是LAB发酵的有机最终产物）的生产，过夜培养物的pH值在3.5至5.3的范围内。遵守并遵守安全程序，例如生物安全罩中的适当气流循环和避免在使用本生燃烧器期间灼伤。
图 1：乳酸菌 （LAB） 培养物活化方案的图形方案。 该方案提供了处理和激活乳酸菌株所需的细节和基本仪器。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
用质量控制方案培养的评估的LAB菌株的细胞生长与没有该标准方案培养的菌株显着不同（P < 0.05）。保加利亚乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的QC方案采用多传培养方法（在琼脂平板上划线之前传代三次），而对照程序仅进行一次传代培养，所有其他条件保持不变。菌落生长也更高，并且在使用该标准QC方案培养的生长培养基板上定义良好。这证实了该方案通过发酵肉汤中的细胞分裂确保增强乳酸菌生长的有效性，因此有助于增强乳酸菌株中的细胞代谢。使用和不使用开发的质量控制方案培养的两种菌株的生长如图2所示。在观察和测量剧烈生长（OD610 nm处0.7-0.9）后，将菌株划线到琼脂平板上。将板在42°C下厌氧孵育72小时，然后沿条纹线观察到离散菌落。另一项研究（图3）证实了质量控制方案对在TPY培养基中培养并在37°C下孵育的罗伊氏乳杆菌生长的效率，其中QC方案技术产生的菌落证实了稳定的稳态生长（在OD610nm处平均为0.9）基于历史数据。没有多次传培养的LAB活化对照方法没有采用开发的QC技术，导致罗伊氏乳杆菌的生长模式不均匀（OD610 nm处为0.9-0.75）。
图2：使用和不使用开发的质量控制方案培养的 保加利亚乳杆菌 菌株生长的殖民形态。将菌株一式三份划线，并在42°C下厌氧孵育72小时。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：L 的行为。使用标准化QC方案和常规细菌培养方法（P < 0.05）在37°C的TPY培养基中生长一段时间后的罗伊氏菌。 定期监测罗伊氏乳杆菌的生长一个月，并与前几年基于标准QC方案的培养活化的历史数据保持一致。误差线表示OD值的标准偏差。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
使用质量控制方案和不使用该方案评估的所有菌株的结果是相同的，因此，仅显示与菌株（S9和LB6）相关的结果。活化的LAB菌株具有优异的细胞生长，其特征在于高强度的细胞生物质，因此，导致试管11中的MRS发酵液出现浑浊外观。在42°C的厌氧发酵温度下，培养活化后观察到的细胞生长在12小时至16小时之间很明显。 还证实，基于该协议激活的LAB菌株由于多亚培养程序12 而连续地改变了其菌落形态，沿条纹线可见离散菌落。对照实验没有采用这种标准方案，只传代培养一次;然而，它在发酵液中也没有显示出强烈的浑浊，尽管在OD610nm处生长仍在0.7-0.9的可接受范围内。还值得注意的是，与标准方案13中观察到的菌落相比，在琼脂平板上划线对照培养物并在与标准程序相同的条件下厌氧孵育它们仅描绘了更小和更少的菌落。
这可以归因于LAB细胞的弱和不可存活的特性。因此，多次传代培养LAB菌株并在琼脂平板上划线的概念，因此，通过细菌中的细胞分裂和遗传物质交换产生新细胞。这增强了细胞和代谢功能，并促进了发酵操作过程中细胞的生长14。此外，压力和受伤的乳酸菌细胞也会根据生长条件的稳定状态（营养需求、pH 值和温度）进行恢复，使它们能够轻松适应并恢复完整的细胞和代谢功能6。此外，严格遵守此协议在更大程度上限制了细胞培养物的污染，从而确保仅分离纯和优质的细胞菌落用于发酵目的。因此，从琼脂平板中重复划线和回收LAB细胞培养物提供了增强的细胞壁，非常适合代谢活动，例如LAB发酵操作15。此外，基于开发的质量控制方案（图3）对罗伊氏乳杆菌生长的研究证实了通过菌落到培养方法传代LAB如何在一段时间内在最佳生长范围（0.9-1.0 OD 610 nm）产生稳定的稳定生长与直接从培养物传代到培养物（传统方法）相比，这导致在OD610 nm处从0.75急剧增长到0.9.同样明显的是，随着时间的推移，QC方案始终产生稳定的细菌生长模式，其标准差（SD）为0.1。然而，由于细菌细胞的不均匀生长，罗伊氏乳杆菌的不均匀生长使其SD大于0.1。如前所述，这种不均匀的生长模式归因于脆弱和受伤的细胞;因此，细胞的代谢功能在发酵期间降低14。Ahmed等人先前的研究也证实了当前的研究16，其中，在他们的研究中，罗伊氏乳杆菌在胰蛋白酶蛋白胨酵母提取物（TPY）琼脂培养基中在37°C下繁殖8周。 罗伊氏乳杆菌稳定生长的一个促成因素归因于细胞培养方法和质量控制技术，即使在研究期间的几次传代培养活动之后，也能产生新的和具有更高活性的培养物。
该方案中的关键步骤包括始终使用新的和不到一天的发酵培养物，并且始终在发酵开始之前新制备发酵液或生长培养基，并且不使用储存的生长培养基，因为培养基的强度和效力在长时间的储存中降低。在使用-80°C或-20°C的原液培养物的情况下，应无菌处理培养物。此外，如果观察到由于冰箱的冷休克而导致原液培养物较弱，则需要进行如下复苏。仅将低浓度（约100μL）的原液培养物接种在约2mL的补充发酵液（MRS）中，以进行预厌氧孵育约6小时，然后再添加约5-6mL的额外补充MRS用于最终厌氧孵育约16小时17。如果使用冻干或冻干培养物，强烈建议在3mL脱脂液态奶中回收冻干培养物，并厌氧孵育约4-5小时，然后再将其接种到补充的发酵液中，例如MRS。这些过程是始终确保LAB细胞活力的关键13。
另一个关键步骤是确保发酵培养物的细胞生长始终在0.7-0.9的生长范围内，通常在OD610nm处。 这很重要，因为建议将该生长范围作为细菌生长曲线17的适当对数或指数阶段。任何高于1的光密度（OD）值都是不准确的，因为这证实了发酵培养物已经达到死亡阶段，大多数死细胞和有毒细胞废物的积累主要存在于发酵培养基中。如果OD值高于1（OD610nm > 1），建议将培养物稀释2或3倍或更多，直到OD值低于1（OD610nm < 1）18。另一个关注点是用发酵培养物适当地厌氧孵育条纹板。虽然大多数乳酸菌是兼性厌氧菌，但在有氧气的情况下，生长增强受到限制;因此，需要偏好厌氧条件以促进有效生长。建议使用CO 2室或临时容器，在42°C的孵育期间可能产生CO2。 为了在孵育板上获得最佳细胞生长结果，建议72小时以获得最佳结果18。
然而，该标准程序没有任何限制，因为严格遵守这些步骤将确保发酵过程中的活和纯乳酸菌细胞。该标准方案的重要性在于其确保益生菌细胞活力的积极方法，特别是对于发酵培养物。它作为一种质量控制机制，旨在消除污染并最终促进强大且高度可行的培养，从而在标准条件下产生理想的发酵产量。参考现有或常规方法，该标准方案消除了乳酸菌细胞活力挑战的机会（由于冷休克和生长不良培养基），它还旨在确保获得纯且可行的益生菌培养物的一次性正确概念，节省时间，并在使用LAB培养物时提高生产率。
该技术的未来应用是巨大的，因为该协议可用于研究实验室，乳制品和食品工业，生物加工，发酵和生物技术研究所。该协议的额外优点是基于其简单性，因此不需要复杂地使用实验室设备。因此，该协议可用于具有基本实验室环境的高中的示范或教学学习，以鼓励和建立学生对科学，技术，工程和数学（STEM）相关领域的兴趣。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该出版物由授权号NC实现。X-267-5-12-170-1来自国家食品和农业研究所（NIFA），部分由荷兰NIZO食品研究BV，美国Jarrow Formulas以及北卡罗来纳州农业技术州立大学家庭和消费者科学系以及农业研究站（美国北卡罗来纳州格林斯伯勒27411）提供。这项工作也得到了1890能力建设计划拨款号（2020-38821-31113/项目入藏号021765）的部分支持。这项工作也得到了保加利亚教育和科学部在DCM # 577 / 17.08.2018批准的国家研究计划“健康食品促进强大的生物经济和生活质量”下的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
References
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