Summary
여기에서 우리는 척추동물 Xenopus laevis 배아에서 알려진 조직 운명을 가진 세포 계통의 질량 분석 기반 단백질체 특성 분석을 설명합니다.
Abstract
세포가 조직과 기관을 생성함에 따라 분자 사건의 특성화는 정상적인 발달을 더 잘 이해하고 질병에 대한 효율적인 치료법을 설계할 수 있는 잠재력을 높입니다. 다양한 유형과 많은 수의 단백질을 정확하게 식별하고 정량화할 수 있는 기술은 공간과 시간에서 조직과 유기체 발달을 조율하는 분자 메커니즘에 대한 정보를 여전히 제공하지 못할 것입니다. 여기에서 우리는 Xenopus laevis (개구리) 배아에서 확인된 세포 계통에서 수천 개의 단백질을 측정할 수 있는 질량 분석 기반 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 재현 가능한 세포-운명 지도와 이 척추동물 발달 모델에서 세포와 그 자손(클론)을 식별, 형광 표지, 추적 및 샘플링하는 확립된 방법을 기반으로 합니다. 마이크로 샘플링을 사용하여 세포 내용물을 수집하거나 해부 또는 형광 활성화 세포 분류를 통해 세포를 분리한 후 단백질을 추출하고 처리하여 상향식 단백질체학 분석을 수행합니다. 액체 크로마토그래피 및 모세관 전기영동은 고분해능 질량분석법(HRMS)을 통해 단백질 검출 및 정량화를 위한 확장 가능한 분리를 제공하는 데 사용됩니다. 대표적인 예가 신경-조직 운명 세포의 프로테오믹 특성화에 대해 제공된다. 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학은 다양한 조직과 유기체에 적용할 수 있습니다. 척추동물 발달 동안 프로테옴의 시공간적 역학을 들여다보기에 충분히 민감하고 구체적이며 정량적입니다.
Introduction
세포 분화와 조직 및 기관의 기원에 대한 우리의 이해는 수십 년 동안 유전자와 그 산물에 대한 정교한 표적 스크리닝의 결과입니다. 중요한 세포 사건 동안 모든 생체 분자와 그 양에 대한 지식을 늘리면 척추 동물 신체 계획의 공간적 및 시간적 패턴을 제어하는 분자 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 분자 증폭 및 시퀀싱을 가능하게 하는 기술은 이제 많은 수의 유전자와 전사체에 대해 일상적으로 보고할 수 있어 기초 생물학 및 중개 연구에서 가설 기반 연구를 지원합니다. 개발 중인 시스템을 이해하기 위해 전사와 번역 간의 복잡한 관계는 여러 단백질의 직접 분석과 번역 후 변형을 지지합니다. 유도만능줄기세포와 같은 시험관 내 생물학적 시스템을 사용하는 글로벌 단백질체학은 조직 유도 1,2의 메커니즘을 설명하기 시작했습니다. 척추동물 배아와 같은 복잡한 유기체에서 발달은 공간과 시간의 맥락에서 모르포겐 구배에 의존한다3. 따라서 세포가 분화하여 신경 조직과 같은 특수 조직을 형성함에 따라 단백질체학적 변화에 대한 지식을 얻는 것은 정상 및 결함 발달을 제어하는 분자 프로그램을 잠금 해제하고 차세대 치료법을 안내하는 열쇠를 제공합니다.
척추동물 남아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)는 세포 및 발달, 신경 및 재생 생물학에서 잘 확립된 모델입니다. 체세포의 다능성 발견에 대한 John Gurdon 경의 2012년 노벨 생리의학상 4,5는 기초 및 중개 연구의 발견에 대한 이 모델의 중요성을 강조했습니다. Xenopus 배아는 모체 외부에서 발달하여 다양한 발달 단계에서 세포, 세포 클론 및 유전자 발현의 직접적인 조작을 용이하게 합니다. 비대칭 색소 침착과 고정 관념의 세포 분열은 16-6 및 32 세포 7,8 단계 배아에서 재현 가능한 운명지도의 차트를 가능하게했습니다. 고분해능 질량분석법(HRMS) 기반 단백질체학의 경우, 이 모델의 추가적인 장점은 분석을 위한 풍부한 단백질 함량을 산출하는 비교적 큰 크기(직경 ~1mm)를 포함합니다(초기 절단 단계 배아에서 ~130μg, 16세포 배아의 단일 세포에서 ~10μg의 단백질 함량)9,10.
현재 HRMS는 단백질 검출을 위한 선도적인 기술입니다. 이 기술은 일반적으로 수백에서 수천 개의 서로 다른 단백질을 직접적이고 민감하며 특이적으로 검출하고 정량화할 수 있게 한다11. HRMS에 의한 상향식 단백질체학은 일련의 상호 연결된 단계를 포함합니다. 세포/조직 샘플에서 추출한 후 단백질은 트립신(상향식 단백질체학)과 같은 단백질 분해 효소로 분해됩니다. 생성된 펩타이드는 소수성(reversed-phase liquid chromatography, LC), 순 전하(ion-exchange chromatography), 크기(size exclusion chromatography) 또는 전기영동 이동도(capillary electrophoresis, CE)를 포함한 다양한 물리화학적 특성에 따라 분리됩니다. 그런 다음 펩타이드는 일반적으로 전기분무 이온화(ESI)를 사용하여 충전(이온화)되며, 탠덤 HRMS에 의한 기체상 단편화를 통해 펩타이드 이온이 검출 및 시퀀싱됩니다. 결과 펩타이드 데이터는 연구 중인 유기체의 프로테옴에 매핑됩니다. 농도와 상관관계가 있는 단백질 특이적(proteotypic) 펩타이드 이온 신호 강도를 이용하여, 단백질 정량화는 비표지 또는 표지 기반(multiplexing quantitation)으로 수행될 수 있다. HRMS 단백질체학은 연구 중인 시스템의 분자 상태에 대한 풍부한 정보 리소스를 제공하여 가설 생성 및 후속 기능 연구를 가능하게 합니다.
그림 1: 발달 중인 (개구리) 배아에서 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학을 가능하게 하는 시공간적으로 확장 가능한 단백질체학. (A) 평행 전단 (4)에 의해 제어되는 제작된 마이크로피펫 (3)을 사용하여 확인된 세포(삽입물)의 주입을 위한 실체현미경(2)을 이용한 표본 (1)의 가시화. (B) 16-세포 배아에서 확인된 왼쪽D11 세포의 세포하 샘플링. (C) 16-세포 배아로부터 전체D11 세포의 해부. (D) 32세포 배아에서 왼쪽 및 오른쪽 D111 자손의 형광(녹색) 추적으로 위스트룰라에서 신경 외배엽(NE)의 해부(10단계) 및 FACS를 사용하여 올챙이에서 자손 조직 분리를 안내합니다. 스케일 바: 배아의 경우 200μm, 바이알의 경우 1.25mm. 수치는 참고 문헌 15,19,21,59의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기에 제시된 프로토콜은 발달 중인 X. laevis 배아에서 확인된 세포/조직에서 많은 수의 단백질에 대한 HRMS 기반 정량화를 가능하게 합니다. 이 접근법은 정확한 세포 식별, 재현 가능한 세포 운명 지도 및 이 생물학적 모델 6,7,8에서 세포 계통을 추적하기 위한 확립된 방법론을 기반으로 합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 우리는 세포 내용물을 흡인하기 위해 전체 세포 해부 또는 모세관 마이크로 샘플링을 사용하여 단일 세포에서 프로테옴을 연구합니다. 세포의 혈통을 모니터링하면 세포가 위장 중에 조직을 형성함에 따라 프로테옴의 시공간 진화를 연구할 수 있습니다. 세포 자손은 형광 단백질(예: 녹색 형광 단백질 또는 GFP)에 대해 불활성 덱스트란 또는 mRNA에 접합된 형광단을 주입하여 형광을 표시합니다. 표지된 자손은 원하는 발달 시점에서 분리됩니다. gastrulation 동안, 단단히 클러스터링된 세포 클론은 해부에 의해 분리될 수 있습니다. 위축 후, 세포 클론은 이동 운동으로 인해 배아 내에 분포할 수 있으며 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 해리된 조직에서 분리될 수 있습니다. 이러한 세포 및 조직의 단백질은 분리를 위해 HPLC 또는 CE를 사용하고 식별을 위해 ESI 탠덤 HRMS를 사용하는 상향식 단백질체학을 통해 측정됩니다. 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학은 배아 내에서 다양한 세포 크기와 계통으로 확장 가능하며 특이적이고 민감하며 정량적입니다. 여기에 표시된 선별된 예를 통해 이 프로토콜이 다양한 유형의 세포 및 세포 계통에 확장 가능하고 광범위하게 적응할 수 있음을 보여줍니다.
그림 2: 바이오분석 워크플로우. 미세 해부 및 모세관 흡인 또는 FACS는 세포 및 클론 단백질 함량의 샘플링을 용이하게 했습니다. 풍부한 난황 단백질의 고갈 및 모세관 전기영동(CE) 또는 나노 유동 액체 크로마토그래피(LC)에 의한 분리는 전기분무 이온화(ESI) 고분해능 질량분석법(HRMS)을 사용하여 식별(ID) 감도를 향상시킵니다. 정량화는 유전자 온톨로지(GO)에서 사용할 수 있는 정보와 함께 가설 기반 연구를 위한 새로운 정보를 제공하는 조절 장애를 드러냈습니다. 수치는 참고 문헌15의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Xenopus laevis 성체 개구리의 인도적 유지 및 취급을 보장하는 모든 프로토콜은 메릴랜드 대학교 칼리지 파크의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 R-DEC-17-57 및 R-FEB-21-07).
1. 솔루션 준비
- 발생학의 경우
- 1x, 0.5x 및 0.2x Steinberg's solution(SS)을 준비한 다음 표준 프로토콜 12에 따라 멸균(120분 동안120°C)하여 오토클레이브(20분)합니다.
- 표준 프로토콜 3에 따라 멸균된 1x SS에서12%(w/v) Ficoll을 준비합니다.
- 탈젤을 위해 2%(w/v) 시스테인 용액을 새로 준비하고 10M 수산화나트륨 용액을 한 방울 떨어뜨려 pH를 8로 조정합니다.
주의: 시스테인에 노출되면 피부와 호흡기 손상을 일으킬 수 있습니다. 수산화나트륨은 직접 노출되면 피부와 눈에 심각한 손상을 줄 수 있는 부식성입니다. 장갑 및 실험실 코트와 같은 이러한 화학 물질을 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오. - 계보 추적자의 경우 멸균 탈이온수에서 0.5%(v/v)의 형광 덱스트란을 준비합니다. 대안적으로, 멸균 탈이온수(예: GFP)에서 형광 단백질에 대한 mRNA 0.2μg/μL 용액을 준비합니다.
- 세포를 해리하기 위해 0.1M 이세티오네이트나트륨, 20mM 피로인산나트륨 및 10mM CAPS를 포함하는 Newport 2.0 완충액을 준비한 다음 pH를 10.513으로 만듭니다.
주의 : 피로인산나트륨에 노출되면 피부와 눈에 자극을 줄 수 있습니다. 이러한 화학 물질을 취급할 때는 적절한 PPE를 사용하십시오.
- 상향식 단백질체학(bottom-up proteomics)용
- 250mM 수크로오스, 1% 노니뎃 P-40 대체물(w/v), 20mM Tris-HCl, 5mM EDTA, 10μM 사이토칼라신 D 및 10μM 콤브레타스타틴 4A를 포함하도록 세포 용해 완충액을 준비합니다. 10%(w/v) 나트륨 도데실 설페이트14,15의 스톡을 준비합니다.
참고 : Tris-HCl은 나노 플로우 LC (nanoLC) -HRMS 동안 hepes 오염을 최소화하기 위해 선택되었습니다.
주의: 노니뎃 P-40 대체물에 노출되면 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 사이토찰라신 D는 섭취할 경우 기형을 유발하며 콤브레타스타틴은 직접 노출 시 급성 독성이 있습니다. 이러한 화학 물질을 취급할 때는 적절한 PPE를 사용하십시오. - CE로 펩타이드를 분리하려면 다음 용매(v/v)를 준비합니다: 샘플 용매, 물에 0.05% 아세트산(AcOH)을 함유한 75% 아세토니트릴(ACN); 시스 용액, 물에 0.05% AcOH를 함유하는 10% ACN; 배경 전해질(BGE), 물에 1M 포름산(FA)을 포함하는 25% ACN.
주의 : AcOH 및 FA는 흡입하거나 섭취하면 독성이 있으며 직접 노출되면 심각한 피부와 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 이러한 화학 물질을 취급할 때는 적절한 PPE를 사용하십시오. - 역상 나노LC로 펩타이드를 분리하기 위해 (v/v): 이동상 A(수성), 0.1% FA를 함유한 물; 이동상 B(유기), ACN에서 0.1% FA.
참고: 모든 혼합물은 HRMS 검출 중 화학적 간섭을 최소화하기 위해 LC-MS 등급 용매를 사용하여 준비해야 합니다.
- 250mM 수크로오스, 1% 노니뎃 P-40 대체물(w/v), 20mM Tris-HCl, 5mM EDTA, 10μM 사이토칼라신 D 및 10μM 콤브레타스타틴 4A를 포함하도록 세포 용해 완충액을 준비합니다. 10%(w/v) 나트륨 도데실 설페이트14,15의 스톡을 준비합니다.
2. 미세주입 및 해부를 위한 도구 준비
- 배아를 부드럽게 움직이고 방향을 잡으려면 다른 곳에서 설명한 대로 깨끗한 머리카락을 파스퇴르 피펫에 고정하여 머리카락 고리를 만드십시오16.
- 미세주입의 경우, 다른 곳에서 설명한 대로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 모세관(1mm/500μm 외부/내경)을 당겨 바늘을 제작합니다(16).
참고: 여기에서 바늘 제조에는 다음 설정의 P-1000 피펫 풀러가 사용되었습니다: 열, 495; 당기기, 30, 속도, 60; 시간, 150; 압력, 200. - 실체현미경으로 관찰한 후, 한 쌍의 날카로운 집게를 사용하여 모세관의 끝을 잘라내어 모세관을 (미세)바늘(예: Dumont #5)16로 제작합니다.
주의 : 당겨진 모세관은 매우 날카로우므로 주의해서 다루어야 합니다.
참고: 바늘 끝은 세포막의 손상을 최소화하면서 세포를 관통할 수 있을 만큼 충분히 날카로워야 하며(외경 10-15μm) 세포 내 내용물이 누출되지 않고 세포가 치유되고 계속 생존할 수 있어야 합니다. - 미세 주입 중에 배아를 보유하려면 점토로 채워진 접시에 우물을 준비하십시오. 15mm 페트리 접시에 ~1mm 직경 x ~0.5mm 깊이의 우물을 다른 곳에서 설명한 대로 무독성 플라스틱 점토에 각인합니다16.
- 미세 해부를 위해 아가로스 코팅 접시를 준비하십시오. 1x SS에서 2% 아가로스를 만들고 이를 오토클레이브하여 용액을 멸균합니다(120°C에서 20분 동안). 60mm 페트리 접시를 반쯤 채우고 접시가 굳도록 둡니다. 앞에서 설명한 대로 볼형 파스퇴르 피펫 도구를 사용하여 직경 ~1mm x 깊이 ~0.5mm 웰을 만듭니다16.
3. 세포 계통 분리
참고: 다음 단계는 식별된 단일 세포 및/또는 그 하위 세포 계통을 분리하기 위해 수행됩니다. 보통, 배아는 16 또는 32 세포 단계로 배양되며, 여기서 각 세포의 조직 운명은 재현 가능하게 매핑된다 6,7,17. 배아 세포는 형태, 위치 및 운명 지도를 참조하여 식별됩니다. 단일 세포 분석을 위해 식별된 세포를 수동 해부로 분리하거나 세포 내 내용물을 모세관 피펫에 수집하고 5μL의 0.5mM 중탄산암모늄에 증착합니다. 생성된 샘플은 분석될 때까지 -80°C에서 보관됩니다(그림 1)18,19,20,21. 세포 계통 분석을 위해 식별된 세포에 계통 추적자를 주입하고 후속 클론을 주요 발달 단계(예: 조직 유도를 연구하기 위한 위장 중, 조직 투입을 연구하기 위한 신경 조절 후)에서 분리합니다. 다음에서는 해부 또는 FACS에 의한 분리를 위해 식별된 세포의 계통을 형광으로 표시하는 단계를 간략하게 설명합니다.
- 배아를 배양하십시오
- 확립된 프로토콜에 따라 자연 교미 또는 체외 수정(IVF)을 통해 배아를 얻습니다12.
참고: 자연 교미는 논리적으로 더 간단하고 성체 수컷 개구리를 아끼지 않으며 다양한 발달 단계에서 배아를 생성하는 반면 IVF는 정확한 병기 결정이 필요한 실험을 위해 발달적으로 동기화된 배아를 제공합니다. - 배아를 Dejelly. 다른12,16에 설명된 바와 같이 데젤리 용액으로 처리하여 배아를 둘러싸고 있는 젤리 코트를 제거합니다.
참고: 미세 주사 및 해부는 세포와 조직에 대한 접근이 필요하므로 X. laevis 배아에서 젤리잉이 필요합니다. - 고정 관념의 색소 침착을 가진 2 세포 배아를 선택하십시오16,22.
참고: 이 단계는 세포와 그 계통을 식별할 때 정확성과 재현성을 보장하는 데 중요합니다. - 원하는 발달 단계까지의 배양 배아. 탈젤리화된 배아를 1x SS가 들어 있는 페트리 접시에 옮기고 14-25°C 사이에서 배양하여 발달 속도를 조절합니다.
참고: 발달의 온도 의존성은 재현 가능하며 Xenbase23(www.xenbase.org)에서 사용할 수 있는 X. laevis에 대해 차트로 표시됩니다. 다양한 온도에서 배아 배치를 배양하면 엄청난 발달 단계가 가능합니다. 이렇게 하면 주어진 시간에 실험에 사용할 수 있는 배아의 수를 분배하는 데 도움이 됩니다. - 배아의 분열 패턴을 모니터링하고 미세주입을 위한 고정관념의 색소 침착 및 분열 패턴을 가진 배아를 선택한다16.
참고: 16세포 및 32세포 배아를 선택할 때 재현 가능한 계통 추적을 위해 세포 절단이 대칭인지 확인하십시오.
- 확립된 프로토콜에 따라 자연 교미 또는 체외 수정(IVF)을 통해 배아를 얻습니다12.
- 관심 있는 셀에 레이블 지정
- 계보 추적기 용액이 들어 있는 주사 바늘을 설정합니다. 미세 주입 바늘을 다축 미세 조작기로 제어되는 미세 피펫 홀더에 장착합니다.
- 마이크로피펫 홀더를 마이크로인젝터에 연결합니다. 다른 곳에서 설명한 대로 음압을 가하여 계통 추적기로 바늘을 채웁니다16. 그림 1A 는 설정을 예시합니다.
- 바늘을 보정합니다. 바늘 끝의 크기와 주입 시간을 조정하여 다른 곳에서 사용할 수 있는 프로토콜에 따라 (광물) 오일로 측정된 ~1nL의 계보 추적자 용액을 전달합니다 16.
참고: 팁이 넓은 모세혈관은 세포막을 손상시켜 세포내 내용물과 주입된 계통 추적자가 누출되는 경향이 있는 반면, 팁이 작은 모세혈관은 막히기 쉽습니다. 팁 외경이 ~10μm인 모세관이 이상적이며, ~1nL를 전달하려면 ~300ms 동안 40psi 압력 펄스가 필요합니다. - 미세주입 점토 접시에 3% Ficoll 용액을 채우고 이송 피펫을 사용하여 ~10개의 배아를 점토 접시에 옮깁니다. 헤어 루프를 사용하여 각 배아를 우물로 안내하고 관심 대상 세포가 마이크로니들과 직각이 되도록 부드럽게 배치합니다.
- X. laevis 조직 운명 지도에 따라 관심 계통의 전구체 세포를 식별합니다. 예를 들어, 그림 1은 32 세포 배아(왼쪽 및 오른쪽 D111 세포)에 전구체 세포의 주입을 기반으로 한 신경 외배엽 클론의 표지를 보여줍니다.
참고: 16-6 및 32세포 7,8 배아에 대한 자세한 운명 지도는 Xenbase23을 통해 대화형 플랫폼에서 사용할 수 있습니다. 혈통 추적 실험에 배아를 사용할 때 배아의 고정 관념적인 색소 침착과 분열을 보장하는 것이 중요합니다. - 관심 세포에 ~1nL의 형광 덱스트란 또는 ~200pg의 mRNA를 앞서 설명한 바와 같이 주입합니다16.
참고: 10,000-40,000MW의 덱스트란 접합체를 사용하십시오. 더 작은 덱스트란 접합체는 갭 접합부를 통과할 수 있는 반면, 더 큰 덱스트란 접합체는 주입된 세포 내로 고르게 확산되지 않을 수 있습니다. 단백질체 분석을 위한 충분한 조직을 갖기 위해 ~10개의 배아에 세포를 주입할 계획입니다. - 실체현미경으로 세포 라벨링의 성공 여부를 확인합니다. 의도한 세포만 주입되었는지 확인합니다. 손상되었거나 잘못 라벨링된 세포가 포함된 배아는 제도적 정책에 따라 폐기합니다.
참고: X. laevis 는 많은 비자연 환경에서 침습적이기 때문에 배아를 버리기 전에 치사율을 보장하기 위해 배아를 냉동할 수 있습니다.
- 표지된 세포 자손 분리
- 주입된 배아를 페트리 접시에 0.5x SS로 옮기고 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 14-25°C 사이에서 배양합니다.
참고: Xenbase에 보고된 배아의 병기를 결정하기 위해 확립된 프로토콜을 참조하십시오. - 3-5개의 배아를 미세 해부를 위한 0.2x SS 용액이 있는 한천 접시에 옮깁니다.
참고: SS 용액의 염 농도를 0.5배에서 0.2배로 줄이면 해부 중 세포를 분리하는 데 도움이 됩니다. - 두 개의 뾰족한 집게를 사용하여 배아를 둘러싼 vitelline 막을 부드럽게 제거합니다.
참고: 관심 있는 클론이 손상되지 않도록 하려면 형광 라벨이 붙은 클론의 반대쪽에서 멤브레인을 벗겨냅니다. - 다음과 같이 수동 해부(단계 3.3.5-3.3.6) 또는 FACS(단계 3.3.7-3.3.8)로 표지된 클론을 분리합니다.
- 집게를 사용하여 배아에서 표지된 클론을 해부합니다.
참고: 미세 수술용 가위, 텅스텐 바늘 또는 눈썹 털 칼과 같은 다른 도구를 사용하여 표지된 클론을 해부할 수 있습니다(다른 곳에서 자세히 설명됨)16. - 0.5-10 μL 피펫으로 해부된 조직을 수집하고 미세 원심분리기 바이알에 넣습니다. 이송 피펫을 사용하여 수집된 조직을 둘러싼 배지를 흡인하여 이후 단계에서 HRMS 분석을 방해하는 시료의 염분을 제한합니다.
참고: 플라스틱 표면에 단백질 흡착을 최소화하는 바이알을 사용하여 워크플로의 이후 단계에서 바이알 표면의 단백질 손실을 최소화합니다. - FACS로 분리하려면 ~5-8개의 실투된 배아를 ~5mL의 Newport 2.0 완충액이 들어 있는 12웰 플레이트의 각 웰에 이식합니다. 플레이트를 실온에서 20-30분 동안 80rpm으로 너트화하여 배아를 해리시킨다13.
참고: 22기보다 오래된 배아/유충은 세포외 기질 단백질이 풍부하여 별도의 세포로 해리하기 어렵습니다. 추가의 효소적 접근법은 다른 곳에 기술된 바와 같이 오래된 배아로부터 조직을 해리시키기 위해 적응될 수 있다24. - 형광 표지된 세포를 다른 곳에 기재된 바와 같이 FACS를 사용하여 현탁액으로부터 정제한다(24).
- 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 상층액을 버린다.
참고: 낮은 원심분리 속도(400× g)와 온도(4°C)를 사용하여 세포 용해를 방지하십시오. FACS에 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하는 경우 HRMS 검출 중 BSA 간섭을 줄이기 위해 세포 펠릿을 세척합니다. 세포를 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 부드럽게 재현탁하고 다시 원심분리하여 헹굼된 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 PBS 액체로 제거합니다. - 샘플 바이알을 드라이아이스 또는 액체 질소에 올려 분리된 세포를 신속하게 동결합니다.
참고: 샘플을 보관하십시오(조직 또는 세포) 처리 단계 동안 냉각(예: 얼음 위에서). 다운스트림 처리를 용이하게 하기 위해 샘플 주위에 가능한 한 적은 배지로 세포를 동결합니다. - HRMS 분석이 있을 때까지 샘플을 -80°C에서 보관합니다.
- 주입된 배아를 페트리 접시에 0.5x SS로 옮기고 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 14-25°C 사이에서 배양합니다.
4. 질량분석법으로 단백질 분석
분리된 조직 또는 세포의 단백질체 특성 분석은 HRMS에서 확립된 일련의 단계를 기반으로 합니다. 그림 2 는 바이오분석 워크플로우의 단계를 보여줍니다. 여기에 사용된 시료 채취 프로토콜은 단백질체학의 상향식11, 중간 하향식25 또는 하향식26 워크플로우와 호환됩니다. 다음에서는 이 연구에 사용된 상향식 전략에 대해 설명하며, 이는 민감하고 정량적이며 다양한 유형의 질량 분석기에 적응할 수 있는 것으로 입증되었습니다. 단백질을 추출하고 효소로 분해한 후, 생성된 펩타이드를 분리한 후 HRMS 분석을 수행합니다.
- 조직/단세포 처리
- CE에 의한 단일 세포 분석의 경우 샘플을 60°C로 ~15분 동안 가열하여 단백질을 변성시킨 다음 샘플을 실온(RT, ~5분)으로 평형화합니다18,21.
참고: 조직으로 작업할 때와 달리 환원 및 알킬화 단계를 건너뛰어 단일 세포에서 샘플을 준비하는 동안 단백질 손실을 제한합니다. 여과 보조 시료 전처리(Filter-aided sample preparation)27,28, 기타 단일 포트 전략29 및 미세유체 접근법(microfluidic approach)30을 채택하여 시료 전처리 중 단백질 손실을 최소화할 수 있다. - nanoLC에 의한 분석을 위해 50μL의 용해 완충액(~100μg의 총 단백질)에서 최대 5개의 해부된 조직을 용해합니다. 샘플을 위아래로 몇 번 피펫팅하여 공정을 용이하게 합니다.
- 용해물을 4°C에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 4°C에서 4,500× g 에서 원심분리하여 세포 파편과 난황 혈소판을 펠렛화합니다. 상층액을 깨끗한 미세 원심분리기 바이알에 옮기고 10% SDS를 추가하여 용해물(v/v)에서 1% SDS의 최종 농도를 얻습니다.
- 조직의 경우 4.1.5-4.1.7 단계를 따르십시오.
- 용해물에 0.5M 디티오트레이톨을 첨가하여 ~25mM(예: 용해물 50μL에 0.5M 디티오트레톨 2.5μL)의 최종 농도를 얻고 용해물을 60°C에서 30분 동안 배양하여 단백질의 이황화 결합을 화학적으로 감소시킵니다.
- 0.5M 요오도아세트아미드를 첨가하여 용해물에서 ~75mM의 최종 농도를 얻고 암실의 RT에서 15분 동안 혼합물을 배양합니다(그림 2).
- 초기 부피와 동일한 0.5M 디티오트레이톨(예: 용해물 50μL에 0.5M 디티오트레톨 2.5μL)을 추가하여 알킬화 반응에서 남은 반응물을 소멸시킵니다.
주의: 요오도아세트아미드와 디티오트레이톨은 직접 노출되면 심각한 피부와 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 이러한 화학 물질을 취급할 때는 적절한 PPE를 사용하십시오. - 침전을 통해 단백질을 정제합니다. 클로로포름-메탄올계 침전은 잘 수행된다31. 이 프로토콜은 또한 다른 유형의 강수 접근법(32)에 적응할 수 있다.
참고: 단백질 손실이 우려되는 단일 세포 분석의 경우 CE-HRMS에 대한 침전 단계를 건너뜁니다. - 단백질 침전물을 진공 농축기(4-37°C)에서 건조시킨 다음, 추출된 프로테옴을 50 μL의 50 mM 중탄산암모늄에 재현탁시켰다. 소화에 필요한 효소의 양을 결정하기 위해 총 단백질 비색 분석(예: bicinchoninic acid protein assay)을 사용하여 단백질 농도를 추정합니다.
- 단백질을 펩타이드로 소화합니다. 트립신(1μg/μL 스톡)을 추가하여 1:50의 프로테아제:단백질 비율을 얻고 단일 세포 샘플의 경우 최대 5시간, 조직 샘플의 경우 최대 14시간 동안 37°C에서 혼합물을 배양합니다. 반응에 대한 공급업체별 권장 사항을 참조하십시오.
참고: 트립신을 사용한 14시간 이상의 농도 또는 그 이상의 농도로 분해하면 단백질 서열에 비특이적인 절단이 도입되어 단백질 식별이 어려워질 수 있습니다33. - 비색 분석을 사용하여 총 펩티드 농도를 정량화합니다.
- 선택 사항: 멀티플렉싱 정량을 위해 공급업체별 지침에 따라 각 샘플의 펩타이드에 다른 동중원소 질량 태그를 부착합니다. 바코드화된 펩타이드를 펩타이드 샘플당 동일한 비율로 혼합합니다.
알림: 정량적 편향을 피하기 위해 정확한 라벨링 및 혼합을 보장하십시오. 수량이 제한된 샘플 또는 단일 세포 샘플의 경우, 후속 분리 단계 동안 샘플 손실을 최소화하고 더 낮은 풍부 단백질의 감도를 높이기 위해 풀링된 조직/세포로 구성된 TMT 기반 캐리어 채널을 포함할 수 있습니다(34). - 선택 사항: LC-MS 시스템을 보호하기 위해 C18 역상 스핀 컬럼/팁에서 염분 및 오염 물질(예: 미반응 동중원소 질량 태그 시약)을 제거하기 위해 펩타이드를 탈염합니다.
- 선택 사항: 수동 또는 자동 플랫폼을 통해 단백질체의 심층 검출을 위해 펩타이드 혼합물을 분별(예: 중간 또는 높은 pH 역상 분획)합니다. 팁을 함유한 C18 고정상을 사용하여 소량(1-10 μg)의 펩타이드 분해물을 분별합니다.
- 펩티드 혼합물을 진공 농축기에서 60°C에서 건조시킨다.
- 측정할 때까지 펩타이드 혼합물을 -80°C에서 보관합니다.
- CE에 의한 단일 세포 분석의 경우 샘플을 60°C로 ~15분 동안 가열하여 단백질을 변성시킨 다음 샘플을 실온(RT, ~5분)으로 평형화합니다18,21.
- 펩타이드 분리
참고: 단백질을 추출하고 효소적으로 분해한 후, 생성된 펩타이드는 nanoLC 또는 CE로 분리되고 직렬 HRMS에 의한 시퀀싱을 위해 ESI에 의해 이온화됩니다. 역상 나노LC 분리는 분석당 ~150 ng ~ 1 μg의 펩타이드에 이상적입니다. CE는 펨토그램에서 <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 단일 세포 분석에 점점 더 많이 사용되고 있습니다.18,36,37.- CE를 사용하여 분리하려면 4.2.2-4.2.7단계를 따릅니다.
참고: 다음에서는 펩타이드 측정을 위한 맞춤형 CE 플랫폼의 사용에 대해 설명합니다. 이 CE 기기를 만들고 사용하기 위한 프로토콜은 소분자사용에 대한 시각화된 실험과 함께 이전에 제공되었다38 20. 또는 이러한 측정은 AB SCIEX CESI, Agilent 7100 또는 이와 동등한 상용 CE 시스템에서 수행할 수 있습니다. - 단백질 분해물을 1-2 μL의 시료 용매로 재구성하고, 시료를 혼합하기 위해 소용돌이치고, 10,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.
참고: 셀 파편을 제거하면 CE 모세관이 막힐 가능성이 최소화되어 분리 시스템의 수명이 연장되고 측정 처리량이 향상됩니다. - CE 모세관을 BGE로 세척하여 CE-ESI 기기를 초기화합니다.
- 알려진 표준물질(예: 시토크롬 C 또는 BSA 분해, 안지오텐신 펩타이드)을 사용하여 기기 성능을 검증합니다.
참고: 귀중한 샘플을 측정하기 전에 질량 정확도, 검출 감도, 재현성 및 정량화의 선형 동적 범위 측면에서 기기를 평가하는 것이 좋습니다. CE-ESI-MS 성능의 검증 및 문제 해결에 대한 추가 참고 사항은다른 곳에 나열되어 있습니다 18,20,38. - ~1-10nL의 샘플을 CE 분리 모세관에 주입합니다.
참고: 이 연구는 동전기적으로 펌핑된 시스 흐름 설정과 함께 ~1m 길이의 용융 실리카 모세관(40/110μm 내/외경)을 사용합니다. 상업용 CE 기기는 일반적으로 주사를 위해 미생물 바이알에 5-10 μL의 시료를 제시해야 합니다. 맞춤형 CE 플랫폼 18,38은 시료 로딩 미생물에 증착된 ~250nL에서1μL의 시료와 호환됩니다. - CE 분리 모세관의 입구 끝을 BGE로 옮깁니다.
- CE 분리 전압을 점진적으로 램핑하여 전기 영동 분리를 시작합니다.tage 접지에서(예: 1분에 걸쳐 단계적으로). ~10μA 미만의 전류에서 20-28kV의 전위는 분석을 위한 안정적이고 재현 가능한 기기 성능을 보장합니다.
- nanoLC를 사용하여 분리하려면 4.2.9-4.2.12 단계를 따르십시오.
- 이동상 A에서 펩타이드 샘플을 재현탁합니다. 시료의 농도와 주입 부피는 사용 가능한 LC 시스템 및 컬럼에 따라 다릅니다. 이 연구에서는 ~250ng-1μg의 단백질 분해물을 C18 충전층 컬럼(내경 75μm, 입자 크기 2μm, 기공 100Å, 길이 25cm 분리 컬럼)의 샘플 부피 1-20μL에 주입합니다.
- 샘플을 LC 바이알에 옮깁니다.
알림: 바이알에 분석 컬럼을 손상시킬 수 있는 기포가 없는지 확인하십시오. 삽입물이 있는 바이알은 저용량 조직 또는 단일 세포 샘플에 사용할 수 있습니다. - ~200ng에서 2μg의 펩타이드 샘플을 C18 분석 컬럼에 로드합니다.
참고: 선택적으로 펩타이드를 분석 분리 전에 탈염을 위해 트랩 컬럼에 로드할 수 있습니다. 예를 들어, 0.1 mm 내경, 5 μm 입자 크기, 100 Å 공극 크기, 20 mm 길이를 갖는 C18 트랩 컬럼. 분리 구배가 시작되기 전에 5분 동안 5μL/min의 유속으로 100% 완충액 A로 펩타이드를 탈염합니다. - 그래디언트 용리를 사용하여 펩타이드를 분리합니다. 300nL/min 유속에서 이 연구에 사용된 120분 기울기는 다음과 같습니다: 0-5분 2% B, 5-85분 2-35% B, 86-90분 70% B, 91-120분 2% B.
- CE를 사용하여 분리하려면 4.2.2-4.2.7단계를 따릅니다.
- ESI에 의한 펩타이드 이온화
참고: CE 또는 nanoLC 모세관은 가장 일반적으로 이온화를 위해 ESI 소스에 결합됩니다. 초고감도 검출을 위한 마이크로-플로우(블런트-팁) 및 나노-플로우(테이퍼-팁-39 및 동전기적 펌핑 시스-플로우36 설계) CE-ESI 인터페이스가 이전에 개발되었다.- 분리된 펩타이드를 전기분무 이온 소스에 공급하여 상용 또는 맞춤형 ESI 인터페이스를 사용하여 이온화합니다. Xenopus 배아의 단일 세포 CE-ESI-MS 분석의 경우, CE 모세관 배출구가 당겨진 붕규산 방출기로 둘러싸인 동전기적 펌핑 저유량 인터페이스를 사용합니다.
- 카메라를 사용하여 전기 분무 방출기를 통한 액체 흐름을 확인하고 누출 가능성이 있는지 설정을 육안으로 검사합니다.
- 전기 분무 볼륨 설정tage ESI 소스를 시작하려면 ~2.5kV로 설정합니다(접지 대비).
- 총 이온 전류를 모니터링하여 HRMS 분석을 위한 안정적인 나노스프레이를 보장합니다. 전기 분무 전압과 이미터와 HRMS 주입구까지의 거리를 조정하여 안정적인 분무를 달성합니다(총 강도에서 <15% 상대 표준 편차).
- 펩타이드 검출
참고: 펩타이드 검출은 동중원소 질량 태그가 부착된 펩타이드와 태그가 지정되지 않은 펩타이드에 대한 다양한 도구적 고려 사항을 따르며 사용 가능한 질량 분석기의 유형에 따라 다릅니다. 본 연구에서는 다음 단계에 따라 orbitrap tribrid 질량분석기를 사용합니다.- 설정을 사용하여 MS1 이벤트 획득: 분석기, orbitrap; 스펙트럼 분해능, 절반 최대에서 120,000 전폭(FWHM); 최대 주입 시간(IT), 50ms; 자동 게인 제어(AGC), 4 x 105 카운트; 마이크로스캔, 1.
- 펩티드를 서열화하기 위해, 검출을 위한 전구체 이온을 이온 트랩 분석기에서 검출하기 위한 설정: 단편화 모드, 고에너지 충돌 해리(HCD); 충돌 가스, 질소; 충돌 에너지, 32% 정규화된 충돌 에너지(NCE); 최대 IT, 70ms; AGC, 1 x 104 카운트; 마이크로스캔, 1.
- 선택 사항: 탠덤/다단계 HRMS(MS2/MS3)를 사용하여 TMT 태그 펩타이드를 정량화합니다. 동기식 전구체 선택을 사용하는 MS3 의 경우 일반적인 기기 설정은 다음과 같습니다. 가장 풍부한 이온을 조사하는 단일 단계 (MS1) 스캔은 파라미터를 사용하여 데이터 의존적 획득을 통해 해리된다: MS2 단편화 모드, 충돌 유도 해리 (CID); 충돌 가스, 헬륨; 충돌 에너지, 35% NCE; 단편 이온용 분석기, 이온 트랩 다음 설정: 최대 IT, 50 ms; AGC, 5 x 104 카운트; 마이크로스캔, 1. 10 MS2 단편 이온을 선택하고 질소(65% NCE)에서 HCD로 단편화합니다. 다음 설정을 사용하여 MS3 단편 이온을 검출한다: Orbitrap 분해능 15,000 FWHM, 최대 IT, 120 ms; AGC, 1 × 105 카운트; 마이크로스캔, 1.
참고: 다른 MS 획득 방법 및 파라미터는 다른 곳에서 설명된 바와 같이 공급업체 권장 사항에 따라 태그된 샘플에 사용할 수 있습니다(11,40).
- 데이터 분석
참고: 단백질은 고급 생물정보학 패키지를 사용하여 식별 및 정량화됩니다. 식별의 충실도는 펩타이드 및 단백질 수준에서 FDR(false discovery rate)로 표현되는 미끼 데이터베이스를 사용하여 계산됩니다.- 상용 또는 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터를 처리합니다(참고 문헌41에서 검토됨). 제노푸스 프로테옴 9.2를 mRNA 유래 PHROG 데이터베이스(42)와 연결시킴으로써 제조된 데이터베이스와 원시 데이터를 일치시킨다.
참고: 검색 매개변수는 소화 효소, 트립신입니다. 놓친 분열, 최대 2개; 가변 변형, 메티오닌 산화; 정적 변형, 시스테인 카르바미도메틸화; 전구체 질량 허용 오차, 10 ppm; 단편 질량 허용 오차, 0.6 Da; 최소 펩티드 길이, 5; 식별 충실도, 펩타이드 및 단백질에 대한 <1% FDR. 펩티드에 대한 알킬화 없이, 정적 변형으로서의 카르바미도메틸화는 데이터베이스 검색 중에 제외됩니다(예: 단일 세포 분석용). - 라벨 없는 전략(label-free)을 통해 단백질 풍부도를 정량화(Quantify of protein) 43 또는 라벨 기반전략(label-based strategies)44,45.
- 선택 사항: 유전자 온톨로지를 위해 단백질에 주석을 답니다. PantherDB46, Reactome47 또는 Xenbase23 을 사용할 수 있습니다.
- 선택 사항: Trans-Proteomic Pipeline48, Perseus49 및 Orange50과 같은 소프트웨어 패키지/웹 도구를 사용하여 세포/조직 유형 전반에 걸쳐 단백질 풍부도 및 단백질 풍부도 차이를 정량화합니다.
참고: 실험 설계 및 소프트웨어 옵션에 대한 추가 고려 사항은 다른 곳에서 검토되었습니다41,51. - 선택 사항: 알려진 단백질-단백질 상호작용을 위한 STRING52 및 BioPlex Display 53 및 인산화를 위한 PhosphoSiteplus54와 같은 지식 기반을 사용하여 결과를 추가로 평가합니다. 프로테옴에 표현된 모티프와 영역을 분석하려면 SMART(Simple Modular Architecture Research)55와 같은 웹 도구를 사용합니다.
- 상용 또는 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터를 처리합니다(참고 문헌41에서 검토됨). 제노푸스 프로테옴 9.2를 mRNA 유래 PHROG 데이터베이스(42)와 연결시킴으로써 제조된 데이터베이스와 원시 데이터를 일치시킨다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜은 단일 세포에서 단백질과 X. laevis 배아에서 조직을 확립할 때 그 계통에 대한 연구를 가능하게 했습니다. 그림 1은 신경-조직 운명 세포와 배아에서 새로 유도된 신경 외배엽에서 단백질을 연구하기 위한 접근 방식의 이러한 적용 중 하나를 보여줍니다. 그림 1A에서 볼 수 있듯이 생물 분석 워크플로는 세포를 식별, 주입/흡인하고 표본을 수집하기 위해 세포 및 발달 생물학의 전통적인 도구를 통합했습니다. 도 1B는 마이크로인젝터를 사용하여 생체 내에서 좌측 등쪽 동물(D11) 세포 16-세포 배아의 마이크로프로브 샘플링을 도시한다; 실험 후, 배아는 정상적인 해부학적 56을 가진 올챙이로 성공적으로 발달했습니다. 큰 배아 세포(직경 ~100-250μm)도 수동 미세 해부에 도움이 되었습니다. 우측 등-동물 정중선 (D11) 세포의 절개는 도 1C의 16-세포 배아로부터 예시된다. 이 설정은 또한 확인된 전구체에 형광 추적자를 주입하여 클론 궤적을 추적할 수 있도록 했습니다. 도 1D에 나타낸 바와 같이, 상기 접근법은 조직 해부를 통해 또는 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 좌측 및 우측D111 세포로부터 발생하는 클론을 단리할 수 있게 하였다. 여기에 설명된 샘플 수집 전략은 새로운 세부 사항에서 배아 발달을 연구하기 위해 공간과 시간적으로 충분히 확장 가능합니다.
바이오분석 워크플로우는 HRMS 기술을 통합하여 감도와 정량화를 개선했습니다(그림 2). 수집된 단백질은 상향식 단백질체학 접근법을 통해 측정되었습니다. 직교 화학(예: 높은 pH에서 낮은 pH 역상 LC)을 기반으로 한 시료의 선택적 분획은 검출 감도에 도움이 되었습니다. 펩타이드를 분리하기 위해 CE는 미량의 샘플(<<~100ng)에 대해 선택되었고 제한된 양의 재료(>>150ng)에 대해 nanoLC를 선택했습니다. 펩티드는 ESI-HRMS를 사용하여 시퀀싱되었습니다. 검출된 단백질은 무표지 및 표지 기반 전략을 사용하여 정량화되었습니다. 일반적인 환원 및 알킬화 단계를 제거한 후 CE 분석과 같은 단일 세포 분석을 위한 시료 처리의 단순화를 통해 ~400-800개의 서로 다른 단백질을 쉽게 식별할 수 있었습니다. 보고된 단백질 중에는 TCP1 서브유닛 3(Cct3), 전압 의존성 이온 채널(Vdac2) 및 크레아틴 키나아제-뇌(Ckb)를 포함하는 샤페로닌과 같은 중요한 기능적 역할을 하는 많은 단백질이 있었습니다. 다변량 및 통계 데이터 모델은 우리10,57 및 기타 9,58이 이 프로토콜에 요약된 접근 방식을 사용하여 선택된 세포 및 조직의 단백질체 구성에서 이전에 알려지지 않은 차이를 찾는 데 도움이 되었습니다. 특히, 이러한 HRMS 측정에는 미리 작동하는 프로브나 표본 구성에 대한 지식이 필요하지 않아 발견을 뒷받침할 수 있었습니다.
일련의 연구에서, X. laevis 의 발달 중인 배아에서 확인된 세포의 단백질체 상태(도 3)를 정량화하였다21. 도 3A 는 상이한 배아로부터 해부된D11 세포 사이의 유전자 번역 차이의 검출을 보여준다10. 마이크로샘플링 CE-ESI-HRMS를 통해 단일 세포에서 최대 ~700개의 단백질을 식별하고 정량화할 수 있었다21. 배아의 D11 세포에 대한 기술적 중복 측정에서 ~400개의 누적 단백질을 식별하는 대표적인 1차 HRMS-MS/MS 데이터가 PRIDE에 기탁되었습니다. 이 접근법은 제브라피쉬(zebrafish)와 같은 다른 모델 유기체의 더 작은 세포와 배아로 확장할 수 있었습니다21. 더 작은 세포 크기로의 확장성을 통해 우리는 시간이 지남에 따라 발달한 살아있는 배아에서 D11 자손의 시공간적 재구성을 탐색할 수 있었습니다. 도 3B 는 16-, 32-, 64- 및 128-세포 배아에서 확인된 세포의 세포하 정량적 단백질체학을 수행하기 위한 이 프로토콜의 사용을 제시한다. 단백질은 클론 발달에 비해 뚜렷한 풍부도 프로파일을 나타내는 4개의 그룹으로 분리되었다21.
그림 3: X. laevis 배아의 세포 내 공간에서 클론 조직으로의 프로토콜 확장성. (A) 확인된 전체D11 세포 간의 단백질체학적 차이 측정, 세포 간 이질성 드러내기. 일부 단백질에 대해 표시된 유전자 이름. (B) 발달 중인 D11 세포 클론에서 세포 프로테옴의 재구성. 유사한 발현 패턴을 기반으로 단백질을 그룹화하는 단백질 역학의 퍼지 C-평균 클러스터 분석(GProx). 회색 숫자는 각 클러스터에서 정량화된 서로 다른 단백질의 수를 나타냅니다. 수치는 참고 문헌21,57의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜을 통해 우리는 확인된 개발 중인 세포 클론에서 공간 및 시간 단백질체학을 수행할 수 있었습니다(그림 4). 도 4A 는 배아의 신경 조직 발달 및 패터닝에서 중요한 역할을 하는 2개의 조직을 구성하는 세포 클론을 표지 및 분리하기 위한 접근법의 적용을 보여준다. Spemann organizer (SO)의 대다수는 형광 덱스트란의 주입을 통해 좌측 및 우측D112 및 D212 세포를 표지함으로써 추적하였다. 동시에, 이웃하는 등-동물(D111) 세포는 신경 외배엽(NE)의 대부분을 표시하기 위해 표지되었습니다. 조직을 해부하고 이 프로토콜에 따라 단백질 함량을 분석했습니다. nanoLC-ESI-HRMS는 Wnt, Fgf 및 Tgfβ 경로와 같은 신호 전달을 포함하여 조직에서 최대 2,000개의 서로 다른 단백질을 반환했습니다. 해부된 SO 조직 풀에 대한 기술적 중복 측정에서 ~1,800개의 누적 단백질을 식별하는 대표적인 1차 HRMS-MS/MS 데이터가 PRIDE에 기탁되었습니다. Wnt 경로 리간드 Wnt10a 및 Wnt 리간드의 분비에 전념하는 막 단백질인 Wntless(Wls)는 NE 프로테옴에서만 검출되었습니다. Wnt 경로는 SO에서 억제된 것으로 밝혀졌으며 SO에서 검출된 Wnt 상호작용 단백질의 부족을 설명할 수 있습니다. 이러한 결과는 배아 내에서 혈통별 차이를 연구하기 위한 이 프로토콜의 적용 가능성을 보여줍니다.
그림 4: X. laevis 배아의 공간 조직 단백질체학에서 데이터 분석의 예. (A) 32 세포 배아에서 각각 전임자 D 112 및 D212에 형광 단백질 mRNA를 주입하여 Spemann's Organizer(SO) 및 신경 외배엽(NE) 조직의 차등 표지. (B) 검출 가능한 차이를 보여주는 SO(빨간색) 및 NE(녹색) 프로테옴에서 상위 5개의 과대 대표된 생물학적 과정. 경로 과대 표현 분석은 Bonferroni 보정을 사용한 생물학적 과정을 보여줍니다. (C) 단백질 도메인 농축 분석(SMART), SO에서 DNA 및 RNA 결합 모티프 함유 단백질의 농축을 나타냅니다. (D) 검출된 SO 프로테옴을 기반으로 표준 단백질-단백질 상호작용을 예측하는 STRING 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다양한 단백질체 데이터는 기능 평가를 위한 귀중한 정보 역할을 합니다. 단백질체 데이터는 표준 지식 기반을 사용하여 평가할 수 있습니다. 그림 4B에서 볼 수 있듯이, 조절 장애 단백질의 경로 분석은 최근 연구에서 SO 및 NE 데이터 세트 모두에서 과대 대표된 번역 및 에너지 대사를 보여주었습니다. NE 프로테옴은 세포 내 단백질 화물의 핵 수송과 관련된 단백질이 풍부했으며, 이는 새로 확립된 NE에서 신호 전달 후 다운스트림 사건을 나타낼 가능성이 높습니다(그림 4C). 그림 4D 의 농축 분석은 프로테아좀 복합체에서 번역 개시, RNA 결합, 결합의 상향 조절을 발견했으며, 이는 동적 단백질 회전율 발달 SO에 대한 역할을 시사합니다. 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학은 공간과 시간에 따라 확장 가능하며 정상 및 손상된 발달 과정에서 세포의 분자 조직을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 만큼 충분히 민감합니다.
보충 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 Xenopus 종의 배아에서 확인된 세포 계통에서 단백질 발현의 특성화를 가능하게 합니다. HRMS에서 비롯된 이 방법론은 분자 식별의 정교한 특이성, 분자 프로브 없이 다중 단백질 검출 기능(일반적으로 수백에서 수천 개의 서로 다른 단백질) 및 정량 기능을 결합합니다. 세포 및 발달 (신경) 생물학의 고전적인 도구 및 워크플로우에 대한 적응성은 척추동물 X. laevis 배아에서 줄기 세포 분화의 전체론적 특성 분석을 포함하여 HRMS 단백질체학을 흥미로운 응용 분야로 확장합니다.
이 단계는 X. laevis 배아의 세포 계통 유도 단백질체학을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 신경 운명 단일 세포와 그 계통의 분석을 시연하고 공개 데이터 저장소를 통해 해당 CE 및 nanoLC HRMS 데이터 세트를 제공합니다(PROUD 참조). 이 접근법은 여러 세포 유형(및 계통)에서 단백질의 시공간 조절에 대한 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다. 발달 중인 배아의 시공간 유도 단백질체학은 또한 세포 분화에 대한 분자 시스템 생물학 이해 및 신경계와 같은 주요 기관의 발달을 촉진하기 위해 전사체 및 대사체학 연구로 확장될 수 있습니다.
이 프로토콜은 생물 분석에 새로운 차원을 추가합니다. 유도만능줄기세포(iPSC)1,2와 같은 세포 배양은 세포 분화 중 시간적 프로테옴 역학의 측정을 용이하게 합니다. 이 연구에서 자세히 설명된 접근 방식은 복잡한 모르포겐 구배, 병렬 신호 전달 경로 및 수렴 확장 과정이 협력하여 조직 유도 및 형태 형성을 가져오는 3차원 살아있는 배아의 세포 운명 유도를 살펴봅니다. 배아의 맥락에서 프로테옴 역학을 연구하면 세포 분화를 안내하는 병렬 메커니즘에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 이는 분화 및 발달에 대한 이해를 심화시키는 흥미로운 방향입니다.
여기에 설명된 접근 방식은 이를 위해 Xenopus 종, 특히 X. laevis의 실험적 이점을 차용합니다. 초기 16- 및 32- 세포 X. laevis 배아의 각각의 세포는 성인 유기체에서 재현가능한 조직 운명에 맵핑되며, 본질적으로 분열 단계 배아에서 세포의 공간적 투영이다. 세포 유도 단백질체학의 재현성은 정확한 세포 유형 분석을 기반으로 합니다. 우리는 세포 해부 및 혈통 추적16,20을 설명하는 실험을 진행하기 전에 고정 관념의 색소 침착 및 분열에 대한 배아의 자격을 부여함으로써 성공을 돕습니다. 분열 단계 배아의 세포는 종종 다양한 조직 유형의 형성에 다양한 정도로 기여한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 각 조직 유형에 대한 수준 기여도에 대한 자세한 내용은 Xenbase23에서 확인할 수 있습니다. 따라서 혈통을 추적할 배아 단계와 전구체 세포는 당면한 생물학적 질문에 따라 선택해야 합니다. 장기간(예: >1일)에 걸쳐 배아를 배양할 때 손상되거나 죽은 배아를 제거하는 데 주의를 기울여야 하며, 이는 결국 개체군 내 다른 배아의 생존력을 감소시킬 수 있습니다.
성공적인 인적 자원 관리 시스템(HRMS proteomics)을 위해서는 세포/조직 수집, 단백질 추출 및 인적 자원 관리 시스템 측정의 분석적 토대에 세심한 주의를 기울여야 합니다. Xenopus 배아는 HRMS 민감도를 감소시키는 것으로 알려진 고농도의 비휘발성 염을 함유한 배지에서 배양되기 때문에 단백질체 연구를 위해 세포와 조직을 수집할 때 흡인 배지를 줄이는 것이 좋습니다. 단백질의 식별 및 정량화를 진행하기 위해 탈염을 탐색하는 것이 좋습니다. HRMS 측정에 앞서, 분리, 이온화, 재현성 및 정량화의 선형 동적 범위를 포함하여 CE- 및 LC-ESI-HRMS 기기의 분석 성능을 평가해야 합니다. 우수한 분석 메트릭을 통해 이 프로토콜은 생물학적 연구에서 동물 사용을 줄이는 데 도움이 되고, 보다 강력한 생화학 데이터 세트를 얻기 위한 민감도를 돕고, 결과를 해석하기 위한 통계 데이터 분석의 힘을 향상시킵니다. 기본적으로 CE 또는 LC-HRMS를 사용하여 최소 3개의 기술 복제에서 각 생물학적 복제를 분석하며, 이는 기술적 재현성을 평가하고 검출 가능한 프로테옴의 범위를 심화하는 데 사용됩니다. 검정력 분석은 통계적 검정력을 추정하고 생물학적 반복 크기를 설계하는 데 도움이 됩니다. 다른 세트의 부모 개구리를 사용하는 것은 배아 사이에서 자연적으로 발생하는 생물학적 다양성을 설명하는 것이 좋습니다.
보충 정보
HRMS-MS/MS 단백질체학 데이터 및 관련 처리 파일은 데이터 세트 식별자 PXD030059와 함께 PRIDE60 파트너 리포지토리를 통해 ProteomeExchange 컨소시엄에 기탁되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
배아 해리 및 FACS에 대한 귀중한 토론을 해주신 Jie Li (University of Maryland, College Park)에게 감사드립니다. 이 프로토콜에서 강조된 단백질체학 응용 분야를 예시하는 이전 연구에서 샘플 준비 및 데이터 수집에 도움을 준 Vi M. Quach와 Camille Lombard-Banek에게 감사드립니다. 이 연구의 일부는 수상 번호 IOS-1832968 CAREER(PN으로), 국립 보건원(National Institutes of Health)에서 수상 번호 R35GM124755(PN), 메릴랜드 대학교-국립 암 연구소 파트너십 프로그램(PN) 및 COSMOS Club Foundation 연구 상(ABB 및 LRP)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
References
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560 (2021).
- Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
- Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2000).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. Vleminckx, K. 1865, Humana Press Inc. NY. 175-194 (2018).
- Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
- Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
- Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P. Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. 628, 263-292 (2019).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11 (2016).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956 (2017).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Developmental Biology. 120 (1), 299-304 (1987).
- Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
- Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
- Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
- Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
- Wisniewski, J. R. Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. Becher, D. 1841, Humana Press Inc. NY. 3-10 (2018).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882 (2018).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
- Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
- Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161 (2018).
- Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
- Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21 (2019).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
- Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
- Pino, L. K., Rose, J., O'Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
- Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25 (2020).
- Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
- Schmidt, E., et al. On the Move Federated Workshops. , Springer, Verlag. Berlin. 710-719 (2006).
- Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
- Jensen, L. J., et al. STRING 8 - a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
- Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
- Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
- Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
- Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
- Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
- Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
