Summary
Hier beschrijven we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische karakterisering van cellijnen met bekende weefsellotgevallen in het gewervelde Xenopus laevis-embryo .
Abstract
Karakterisering van moleculaire gebeurtenissen als cellen aanleiding geven tot weefsels en organen verhoogt een potentieel om de normale ontwikkeling beter te begrijpen en efficiënte remedies voor ziekten te ontwerpen. Technologieën die een nauwkeurige identificatie en kwantificering van verschillende soorten en grote aantallen eiwitten mogelijk maken, zouden nog steeds ontbrekende informatie opleveren over moleculaire mechanismen die de ontwikkeling van weefsels en organismen in ruimte en tijd orkestreren. Hier presenteren we een op massaspectrometrie gebaseerd protocol dat de meting van duizenden eiwitten in geïdentificeerde cellijnen in Xenopus laevis (kikker) embryo's mogelijk maakt. De aanpak bouwt voort op reproduceerbare cel-lotkaarten en gevestigde methoden om cellen en hun nakomelingen (klonen) te identificeren, fluorescerend te labelen, te volgen en te bemonsteren vanuit dit model van gewervelde ontwikkeling. Na het verzamelen van cellulaire inhoud met behulp van microsampling of het isoleren van cellen door dissectie of fluorescentie-geactiveerde celsortering, worden eiwitten geëxtraheerd en verwerkt voor bottom-up proteomische analyse. Vloeistofchromatografie en capillaire elektroforese worden gebruikt om schaalbare scheiding te bieden voor eiwitdetectie en kwantificering met hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS). Representatieve voorbeelden worden gegeven voor de proteomische karakterisering van neurale weefselvette cellen. Cel-lineage-geleide HRMS proteomics is aanpasbaar aan verschillende weefsels en organismen. Het is voldoende gevoelig, specifiek en kwantitatief om in de spatio-temporele dynamiek van het proteoom te kijken tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren.
Introduction
Ons begrip van celdifferentiatie en het ontstaan van weefsels en organen is het resultaat van tientallen jaren van uitgebreide gerichte screenings van genen en hun producten. Het vergroten van onze kennis van alle biomoleculen en hun hoeveelheden tijdens belangrijke cellulaire gebeurtenissen zou helpen bij het ontrafelen van moleculaire mechanismen die de ruimtelijke en temporele patronen van het gewervelde lichaamsplan beheersen. Technologieën die moleculaire amplificatie en sequencing mogelijk maken, zijn nu in staat om routinematig te rapporteren over grote aantallen genen en transcripten, ter ondersteuning van hypothesegestuurde studies in fundamenteel biologisch en translationeel onderzoek. Om ontwikkelende systemen te begrijpen, pleit een complexe relatie tussen transcriptie en translatie voor directe analyse van meerdere eiwitten en hun posttranslationele modificaties. Globale proteomics met behulp van in vitro biologische systemen, zoals geïnduceerde pluripotente stamcellen, begonnen mechanismen van weefselinductieaf te bakenen 1,2. In complexe organismen, zoals het gewervelde embryo, is de ontwikkeling afhankelijk van morfogene gradiënten in de context van ruimte en tijd3. Hieruit volgt dat het verkrijgen van kennis van proteomische veranderingen naarmate cellen differentiëren om gespecialiseerde weefsels te vormen, zoals neurale weefsels, een sleutel biedt om moleculaire programma's te ontgrendelen die de normale en defecte ontwikkeling beheersen en therapieën van de volgende generatie begeleiden.
De gewervelde Zuid-Afrikaanse klauwkikker (Xenopus laevis) is een beproefd model in de cel- en ontwikkelings-, neuro- en regeneratieve biologie. Sir John Gurdon's 2012 Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde 4,5 voor de ontdekking van pluripotentie van de somatische kern benadrukte het belang van dit model voor ontdekkingen in fundamentele en translationele studies. Xenopus-embryo's ontwikkelen zich extern voor de moeder, waardoor directe manipulatie van cellen, celklonen en genexpressie over verschillende stadia van ontwikkeling mogelijk wordt. Asymmetrische pigmentatie en stereotiepe celdelingen maakten het mogelijk om reproduceerbare lotkaarten van het 16-6 en 32-cel 7,8 stadium embryo in kaart te brengen. Voor op hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS) gebaseerde proteomics zijn bijkomende voordelen van het model een relatief grote omvang (~ 1 mm in diameter), die een overvloedig eiwitgehalte oplevert voor analyse (~ 130 μg in embryo's in het vroege splitsingsstadium, ~ 10 μg eiwitgehalte in enkele cellen van het 16-celembryo)9,10.
Op dit moment is HRMS de toonaangevende technologie bij uitstek voor het detecteren van eiwitten. Deze technologie maakt directe, gevoelige en specifieke detectie en kwantificering van meerdere, meestal honderden tot duizenden verschillende eiwittenmogelijk 11. Bottom-up proteomics door HRMS omvat een reeks onderling verbonden stappen. Na extractie uit het cel/weefselmonster worden eiwitten verteerd met een proteolytisch enzym, zoals trypsine (bottom-up proteomics). De resulterende peptiden worden gescheiden op basis van hun verschillende fysisch-chemische eigenschappen, waaronder hydrofobiciteit (reversed-phase vloeistofchromatografie, LC), nettolading (ionenwisselingschromatografie), grootte (grootte-uitsluitingschromatografie) of elektroforetische mobiliteit (capillaire elektroforese, CE). Peptiden worden vervolgens geladen (geïoniseerd), meestal met behulp van elektrospray-ionisatie (ESI), en peptide-ionen worden gedetecteerd en gesequenced via gasfasefragmentatie door tandem HRMS. De resulterende peptidegegevens worden toegewezen aan het proteoom van het organisme dat wordt bestudeerd. Met eiwitspecifieke (proteotypische) peptide-ionsignaalintensiteit die correleert met concentratie, kan eiwitkwantificering labelvrij of labelgebaseerd (multiplexingkwantificering) worden uitgevoerd. HRMS-proteomics levert een rijke bron van informatie op over de moleculaire toestand van het bestudeerde systeem, waardoor hypothesen kunnen worden gegenereerd en functionele vervolgstudies kunnen worden uitgevoerd.
Figuur 1: Spatiotemporaal schaalbare proteomics die cel-afstamming geleide HRMS proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo mogelijk maken. (A) Visualisatie van het monster (1) met behulp van een stereomicroscoop (2) voor injectie van een geïdentificeerde cel (inzet), met behulp van een gefabriceerde micropipette (3) onder controle door een translatiestadium (4). B) Subcellulaire bemonstering van de geïdentificeerde linker D11-cel in een embryo met 16 cellen. (C) Dissectie van een hele D11-cel uit een embryo van 16 cellen. (D) Fluorescerende (groene) tracering van de linker en rechter D111 nakomelingen van een 32-celig embryo om dissectie van het neurale ectoderm (NE) in de gastrula (stadium 10) en isolatie van het afstammelingsweefsel van het kikkervisje met behulp van FACS te begeleiden. Schaalstaven: 200 μm voor embryo's, 1,25 mm voor de injectieflacon. De cijfers werden met toestemming aangepast van referenties 15,19,21,59. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het hier gepresenteerde protocol maakt hrms-gebaseerde kwantificering mogelijk van grote aantallen eiwitten in geïdentificeerde cellen / weefsels bij het ontwikkelen van X. laevis-embryo's. De aanpak bouwt voort op nauwkeurige celidentificatie, reproduceerbare cellotkaarten en gevestigde methodologieën om cellijnen te volgen in dit biologische model 6,7,8. Zoals te zien is in figuur 1, bestuderen we proteomen van afzonderlijke cellen door gebruik te maken van hele-celdissectie of capillaire microsampling om cellulaire inhoud te aspirateren. Het monitoren van de afstamming van een cel stelt ons in staat om de spatiotemporale evolutie van het proteoom te bestuderen als cellen weefsels vormen tijdens gastrulatie. Het celprogenaat wordt fluorescerend gemarkeerd door het injecteren van een fluorofoor geconjugeerd aan inert dextran of mRNA voor fluorescerend eiwit (bijv. Groen fluorescerend eiwit of GFP). Het gelabelde nageslacht wordt geïsoleerd op de gewenste ontwikkelingstijdstippen. Tijdens gastrulatie kunnen celklonen die strak geclusterd zijn, worden geïsoleerd door dissectie. Na gastrulatie kunnen celklonen in het embryo worden verspreid als gevolg van migratiebewegingen en kunnen ze worden geïsoleerd uit gedissocieerde weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Eiwitten in deze cellen en weefsels worden gemeten via bottom-up proteomics met HPLC of CE voor scheiding en ESI tandem HRMS voor identificatie. Cel-lineage-geleide HRMS proteomics is schaalbaar naar verschillende celgroottes en afstammingslijnen binnen het embryo en is specifiek, gevoelig en kwantitatief. Aan de hand van geselecteerde voorbeelden die hier worden getoond, laten we ook zien dat dit protocol schaalbaar en breed aanpasbaar is aan verschillende soorten cellen en cellijnen.
Figuur 2: De bioanalytische workflow. Microdissectie en capillaire aspiratie, of FACS, vergemakkelijkten de bemonstering van cellulair en klonaal eiwitgehalte. Uitputting van overvloedige dooiereiwitten en scheiding door capillaire elektroforese (CE) of nano-flow vloeistofchromatografie (LC) verbeterde identificatie (ID) gevoeligheid met behulp van elektrospray ionisatie (ESI) hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS). Kwantificering onthulde ontregeling en leverde nieuwe informatie op voor hypothese-gedreven studies in combinatie met informatie die beschikbaar was via genontologie (GO). De cijfers zijn met toestemming aangepast aan referentie15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocollen die het humane onderhoud en de behandeling van Xenopus laevis volwassen kikkers garanderen, zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Maryland, College Park (goedkeuringsnummers R-DEC-17-57 en R-FEB-21-07).
1. Bereid de oplossingen voor
- Voor embryologie
- Bereid 1x, 0,5x en 0,2x Steinberg's oplossing (SS), autoclaaf ze vervolgens (120 °C gedurende 20 min) tot steriliteit volgens standaardprotocollen12.
- Bereid 3% (w/v) Ficoll in gesteriliseerd 1x SS volgens standaardprotocollen12.
- Voor het dejellying, vers bereiden 2% (w / v) cysteïne-oplossing en pas de pH aan tot 8 door druppelsgewijs 10 M natriumhydroxideoplossing toe te voegen.
LET OP: Blootstelling aan cysteïne kan huid- en ademhalingsschade veroorzaken. Natriumhydroxide is een bijtend middel dat bij directe blootstelling ernstige schade aan huid en ogen kan veroorzaken. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) bij het hanteren van deze chemicaliën, zoals handschoenen en een laboratoriumjas. - Bereid voor de lineage tracer 0,5% (v/v) van een fluorescerend dextran in steriel gedeïoniseerd water. U kunt ook een oplossing van 0,2 μg/μL mRNA bereiden voor fluorescerende eiwitten in steriel gedeïoniseerd water (bijv. GFP).
- Om cellen te dissociëren, bereidt u Newport 2.0-buffer voor die 0,1 M natriumisethionaat, 20 mM natriumpyrofosfaat en 10 mM CAPS bevat en brengt u de pH vervolgens op 10,513.
LET OP: Blootstelling aan natriumpyrofosfaat kan huid- en oogirritatie veroorzaken. Gebruik geschikte PBM's bij het hanteren van deze chemicaliën.
- Voor bottom-up proteomics
- Bereid de cellysisbuffer voor op: 250 mM sucrose, 1% nonidet P-40 substituut (w/v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM cytochalasine D en 10 μM combretastatine 4A. Maak een bouillon van 10% (m/v) natriumdodecylsulfaat14,15.
OPMERKING: Tris-HCl is gekozen om HEPES-verontreiniging tijdens nano-flow LC (nanoLC)-HRMS te minimaliseren.
LET OP: Blootstelling aan nonidet P-40 substituut kan huidirritatie veroorzaken. Cytochalasine D is teratogeen als het wordt geconsumeerd en combretastatine is acuut toxisch bij directe blootstelling. Gebruik geschikte PBM's bij het hanteren van deze chemicaliën. - Om peptiden per CE te scheiden, bereidt u de volgende oplosmiddelen (v / v): Monsteroplosmiddel, 75% acetonitril (ACN) met 0,05% azijnzuur (AcOH) in water; manteloplossing, 10% ACN met 0,05% AcOH in water; achtergrondelektrolyt (BGE), 25% ACN met 1 M mierenzuur (FA) in water.
LET OP: AcOH en FA zijn giftig bij inademing of consumptie en kunnen ernstige huid- en oogbeschadiging veroorzaken bij directe blootstelling. Gebruik geschikte PBM's bij het hanteren van deze chemicaliën. - Om peptiden te scheiden door nanoLC met omgekeerde fase, bereidt u (v / v): Mobiele fase A (waterig), water met 0,1% FA; mobiele fase B (biologisch), 0,1% FA in ACN.
OPMERKING: Alle mengsels moeten worden bereid met behulp van oplosmiddelen van LC-MS-kwaliteit om chemische interferenties tijdens HRMS-detectie te minimaliseren.
- Bereid de cellysisbuffer voor op: 250 mM sucrose, 1% nonidet P-40 substituut (w/v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM cytochalasine D en 10 μM combretastatine 4A. Maak een bouillon van 10% (m/v) natriumdodecylsulfaat14,15.
2. Bereid de gereedschappen voor op micro-injectie en dissectie
- Om embryo's voorzichtig te bewegen en te oriënteren, maakt u haarlussen door schoon haar in een Pasteur-pipet te fixeren zoals elders beschreven16.
- Voor micro-injectie naalden fabriceren door borosilicaatcapillairen (1 mm/500 μm buiten-/binnendiameter) te trekken met behulp van een pipettrekker zoals elders beschreven16.
OPMERKING: Hier werd een P-1000 pipettrekker met de volgende instellingen gebruikt voor het vervaardigen van naalden: warmte, 495; trekkracht, 30, snelheid, 60; tijd, 150; druk, 200. - Snijd met observatie onder een stereomicroscoop de punt van het capillair af met behulp van een scherpe tang om het capillair in wezen te fabriceren tot een (micro)naald (bijv. Dumont #5)16.
LET OP: Getrokken haarvaten zijn zeer scherp en moeten met zorg worden behandeld.
OPMERKING: De punt van de naald moet scherp genoeg zijn (buitendiameter 10-15 μm) om de cel te kunnen doorboren met minimale schade aan het celmembraan, zodat de intracellulaire inhoud niet lekt en de cel kan genezen en levensvatbaar blijven. - Om embryo's vast te houden tijdens micro-injectie, bereidt u putten voor in een met klei gevulde schaal. In een petrischaal van 15 mm, opdruk ~1 mm diameter x ~0,5 mm diepe putten in niet-giftige plasticine klei zoals elders beschreven16.
- Voor microdissectie, bereid agarose-gecoate gerechten. Maak 2% agarose in 1x RVS en autoclaaf het om de oplossing te steriliseren (120 °C gedurende 20 min). Vul 60 mm petrischalen halverwege en laat de borden stollen. Maak ~ 1 mm diameter x ~ 0,5 mm diepe putten met behulp van een Pasteur-pipetgereedschap met een bal zoals eerder beschreven16.
3. Isoleer de cellijn
OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd om geïdentificeerde afzonderlijke cellen en/of hun afstammende cellijnen te isoleren. Meestal wordt het embryo gekweekt tot het 16- of 32-celstadium, waar het weefsellot van elke cel reproduceerbaar in kaart wordt gebracht 6,7,17. De embryonale cellen worden geïdentificeerd op basis van morfologie, locatie en in verwijzing naar hun lotkaarten. Voor eencellige analyse worden geïdentificeerde cellen geïsoleerd door handmatige dissectie, of hun intracellulaire inhoud wordt verzameld in een capillaire pipet en afgezet in 5 μL van 0,5 mM ammoniumbicarbonaat. Het resulterende monster wordt bewaard bij -80 °C tot de analyse (figuur 1)18,19,20,21. Voor cellijnanalyse worden geïdentificeerde cellen geïnjecteerd met een afstammingstracer en hun daaropvolgende klonen worden geïsoleerd in belangrijke stadia van ontwikkeling (bijvoorbeeld tijdens gastrulatie om weefselinductie te bestuderen, na neurulatie om weefselbetrokkenheid te bestuderen). In wat volgt, worden stappen beschreven om de afstamming van geïdentificeerde cellen fluorescerend te labelen voor isolatie door dissectie of FACS.
- Kweek de embryo's
- Verkrijg embryo's via natuurlijke paring of in-vitrofertilisatie (IVF) volgens vastgestelde protocollen12.
OPMERKING: Natuurlijke paring is logistiek eenvoudiger, spaart de volwassen mannelijke kikkers en levert embryo's op in verschillende ontwikkelingsstadia, terwijl IVF ontwikkelingsgesynchroniseerde embryo's biedt voor experimenten die nauwkeurige stadiëring vereisen. - Dejelly de embryo's. Verwijder de geleilaag rond de embryo's via behandeling met de dejellie-oplossing zoals elders beschreven12,16.
OPMERKING: Micro-injecties en dissectie vereisen toegang tot de cellen en weefsels, waardoor dejellying in X. laevis-embryo's noodzakelijk is. - Selecteer 2-cel embryo's met stereotiepe pigmentatie16,22.
OPMERKING: Deze stap is belangrijk om nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te garanderen bij de identificatie van de cel en zijn afstamming. - Kweek embryo's tot het gewenste ontwikkelingsstadium. Breng de gedejelli-embryo's over in een petrischaaltje met 1x SS en incubeer ze tussen 14-25 °C om de snelheid van ontwikkeling te regelen.
OPMERKING: De temperatuurafhankelijkheid van ontwikkeling is reproduceerbaar en in kaart gebracht voor X. laevis, beschikbaar op Xenbase23 (www.xenbase.org). Het kweken van partijen embryo's bij verschillende temperaturen zorgt voor duizelingwekkende ontwikkelingsstadia. Dit helpt bij het verdelen van het aantal embryo's dat op een bepaald moment beschikbaar is voor experimenten. - Controleer het splitsingspatroon van embryo's en selecteer embryo's met stereotiepe pigmentatie- en splitsingspatronen voor micro-injectie16.
OPMERKING: Zorg er bij het selecteren van 16- en 32-celembryo's voor dat de celsplitsingen symmetrisch zijn voor reproduceerbare afstammingstracering.
- Verkrijg embryo's via natuurlijke paring of in-vitrofertilisatie (IVF) volgens vastgestelde protocollen12.
- Label de gewenste cel(en)
- Zet de injectienaald met de lineage tracer-oplossing op. Monteer de microinjectienaald in een micropipethouder die wordt bestuurd door een meerassige micromanipulator.
- Sluit de micropipettehouder aan op een micro-injector. Vul de naald met de lineage tracer door negatieve druk toe te passen zoals eldersbeschreven 16. Figuur 1A illustreert de opzet.
- Kalibreer de naald. Pas de grootte van de naaldpunt en de injectietijd aan om ~ 1 nL van de lineage tracer-oplossing af te leveren, gemeten in (minerale) olie volgens een protocol dat elders beschikbaaris 16.
OPMERKING: Capillairen met een bredere punt hebben de neiging om het celmembraan te beschadigen, waardoor subcellulaire inhoud en de geïnjecteerde lineage tracer weglekken, terwijl haarvaten met kleinere uiteinden gevoelig zijn voor verstopping. Capillairen met ~ 10 μm tip buitendiameter zijn ideaal en vereisen een drukpuls van 40 psi over ~ 300 ms om ~ 1 nL te leveren. - Overspoel de micro-injectie kleischaal met de 3% Ficoll-oplossing en breng ~ 10 embryo's over naar de kleischaal met behulp van een transferpipet. Gebruik een haarlus om elk embryo in een put te leiden en plaats ze voorzichtig zo dat de beoogde cel van belang zich in een rechte hoek met de micronaald bevindt.
- Identificeer de voorlopercel van de afstamming van belang volgens de X. laevis-weefsellotkaarten. Figuur 1 toont bijvoorbeeld de etikettering van neurale ectodermale klonen op basis van de injectie van de voorlopercellen in embryo's met 32 cellen (linker en rechter D111-cellen ).
OPMERKING: Gedetailleerde lotkaarten voor de 16-6 en 32-cel 7,8 embryo's zijn beschikbaar in een interactief platform via Xenbase23. Het is belangrijk om stereotiepe pigmentatie en splitsingen op embryo's te garanderen wanneer ze worden gebruikt voor experimenten met het traceren van afstamming. - Injecteer de cel (en) van belang met ~ 1 nL van het fluorescerende dextran of ~ 200 pg mRNA zoals eerder beschreven16.
OPMERKING: Gebruik dextran conjugaten van 10.000-40.000 MW. Kleinere dextranconjugaten kunnen door gap junctions gaan, terwijl grotere dextransconjugaten mogelijk niet gelijkmatig in de geïnjecteerde cel diffunderen. Plan om cellen in ~ 10 embryo's te injecteren om voldoende weefsels te hebben voor proteomische analyses. - Bevestig het succes van cellabeling onder een stereomicroscoop. Zorg ervoor dat alleen de beoogde cel wordt geïnjecteerd. Gooi embryo's weg die gewonde of onjuist gelabelde cellen bevatten volgens institutioneel beleid.
OPMERKING: Omdat X. laevis invasief is in veel niet-natuurlijke omgevingen, kunnen embryo's worden ingevroren om dodelijkheid te garanderen voordat de embryo's worden weggegooid.
- Isoleer het gelabelde celnageslacht
- Breng de geïnjecteerde embryo's over tot 0,5x RVS in een petrischaaltje en kweek ze tussen 14-25 °C totdat het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt.
OPMERKING: Raadpleeg vastgestelde protocollen voor het stadium van embryo's die op Xenbase zijn gerapporteerd. - Breng 3-5 embryo's over in een agarschaal met 0,2x SS-oplossing voor microdissecties.
OPMERKING: Het verlagen van de zoutconcentratie van SS-oplossing van 0,5x naar 0,2x helpt cellen te scheiden tijdens dissectie. - Gebruik twee geslepen tangen om voorzichtig het vitellinemembraan rond het embryo te verwijderen.
OPMERKING: Om de kloon van belang te behoeden voor schade, pelt u het membraan van de andere kant van de fluorescerend gelabelde kloon. - Isoleer de gelabelde kloon als volgt door handmatige dissectie (stappen 3.3.5-3.3.6) of FACS (stappen 3.3.7-3.3.8).
- Gebruik een tang om de gelabelde kloon van het embryo te ontleden.
OPMERKING: Andere hulpmiddelen zoals microchirurgische scharen, wolfraamnaalden of wenkbrauwhaarmessen kunnen worden gebruikt voor dissectie van de gelabelde kloon, zoals elders beschreven16. - Verzamel het ontleedde weefsel met een pipet van 0,5-10 μL en deponeer ze in een injectieflacon met microcentrifuge. Gebruik een transferpipet om de media rond het verzamelde weefsel op te zuigen om zouten in het monster te beperken, die de HRMS-analyse in latere stappen verstoren.
OPMERKING: Gebruik injectieflacons die eiwitadsorptie op plastic oppervlakken minimaliseren om eiwitverliezen op injectieflaconoppervlakken tijdens latere stappen van de workflow te minimaliseren. - Om te isoleren door FACS, breng ~ 5-8 gedevitelliseerde embryo's over in elke put van een 12-putplaat met ~ 5 ml Newport 2.0-buffer. Dissocieer de embryo's door de plaat gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur13 bij 80 rpm te nutten.
OPMERKING: Embryo's / larven ouder dan stadium 22 hebben overvloedige extracellulaire matrixeiwitten, waardoor dissociatie in afzonderlijke cellen moeilijk is. Aanvullende enzymatische benaderingen kunnen worden aangepast voor het dissociëren van weefsels van oudere embryo's zoals elders beschreven24. - Zuiver de fluorescerend gelabelde cellen uit de suspensie met behulp van FACS zoals elders beschreven24.
- Pelletcellen door centrifugeren en het supernatant weggooien.
OPMERKING: Gebruik een lage centrifugatiesnelheid (400 × g) en temperatuur (4 °C) om cellysis te voorkomen. Als u runderserumalbumine (BSA) voor FACS gebruikt, was dan de celpellet om BSA-interferentie tijdens HRMS-detectie te verminderen. Breng de cellen voorzichtig terug in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en centrifugeer opnieuw tot pelletgespoelde cellen. Verwijder de bovennatuurlijke PBS-vloeistof. - Bevries de geïsoleerde cellen snel door de injectieflacon met het monster op droogijs of vloeibare stikstof te plaatsen.
OPMERKING: Houd de monsters (weefsels of cellen) gekoeld (bijvoorbeeld op ijs) tijdens de verwerkingsstappen. Bevries de cellen met zo min mogelijk media rond het monster om de verwerking stroomafwaarts te vergemakkelijken. - Bewaar de monsters bij −80 °C tot hrms-analyse.
- Breng de geïnjecteerde embryo's over tot 0,5x RVS in een petrischaaltje en kweek ze tussen 14-25 °C totdat het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt.
4. Analyseer de eiwitten door massaspectrometrie
Proteomische karakterisering van de geïsoleerde weefsels of cellen is gebaseerd op een reeks vastgestelde stappen in HRMS. Figuur 2 illustreert de stappen van de bioanalytische workflow. Het hier gebruikte monsterverzamelingsprotocol is compatibel met bottom-up11, middle-down25 of top-down26 workflows van proteomics. In wat volgt, wordt de bottom-up strategie beschreven die in deze studie wordt gebruikt, die gevoelig, kwantitatief en aanpasbaar is gebleken aan verschillende soorten massaspectrometers. Na het extraheren en enzymatisch verteren van eiwitten worden de resulterende peptiden gescheiden, gevolgd door HRMS-analyse.
- Verwerk de weefsels/afzonderlijke cellen
- Voor eencellige analyse door CE, verwarm het monster tot 60 °C gedurende ~15 minuten om eiwitten te denatureren en breng het monster vervolgens in evenwicht tot kamertemperatuur (RT, ~5 min)18,21.
OPMERKING: In tegenstelling tot tijdens het werken met weefsels, worden de reductie- en alkyleringsstappen overgeslagen om eiwitverliezen tijdens de monstervoorbereiding uit afzonderlijke cellen te beperken. Filter-aided sample preparation (FASP)27,28, andere single pot strategieën 29 en microfluïdische benaderingen30 kunnen worden toegepast om eiwitverliezen tijdens de monstervoorbereiding te minimaliseren. - Voor analyse met nanoLC, lyseer tot 5 ontleedde weefsels in 50 μL lysisbuffer (~ 100 μg totaal eiwit). Faciliteer het proces door het monster een paar keer op en neer te pipetteren.
- Incubeer het lysaat bij 4 °C gedurende 10 minuten en pellet vervolgens het celafval en de dooierplaatjes door centrifugatie bij 4.500 × g bij 4 °C. Breng het supernatant over in een schone microcentrifugeflacon en voeg 10% SDS toe om een eindconcentratie van 1% SDS in het lysaat (v/v) te verkrijgen.
- Volg voor weefsels de stappen 4.1.5-4.1.7.
- Voeg 0,5 M dithiothreitol toe aan het lysaat om een eindconcentratie van ~25 mM te verkrijgen (bijv. 2,5 μL van 0,5 M dithiothretol tot 50 μL lysaat) en incubeer het lysaat gedurende 30 minuten bij 60 °C om disulfidebindingen in eiwitten chemisch te verminderen.
- Voeg 0,5 M jodoacetamide toe om een eindconcentratie van ~75 mM in het lysaat te verkrijgen en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij RT in het donker (figuur 2).
- Voeg 0,5 M dithiothreitol toe, hetzelfde als het beginvolume (bijv. 2,5 μL van 0,5 M dithiothretol tot 50 μL lysaat) om reactanten te doven die overblijven van de alkyleringsreactie.
LET OP: Jodoacetamide en dithiothreitol kunnen ernstige huid- en oogbeschadiging veroorzaken bij directe blootstelling. Gebruik geschikte PBM's bij het hanteren van deze chemicaliën. - Zuiver eiwitten via neerslag. Precipitatie op basis van chloroform-methanol presteert goed31. Dit protocol is ook aanpasbaar aan andere soorten neerslagbenaderingen32.
OPMERKING: Voor eencellige analyse, waarbij eiwitverliezen van belang zijn, slaat u de neerslagstap voor CE-HRMS over. - Droog het eiwitprecipitaat in een vacuümconcentrator (4-37 °C) en resuspensie vervolgens het geëxtraheerde proteoom in 50 μL 50 mM ammoniumbicarbonaat. Schat de eiwitconcentratie met behulp van een colorimetrische test met totaal eiwit om de hoeveelheid enzym te bepalen die nodig is voor de spijsvertering (bijv. Bicinchinezuureiwittest).
- Verteer de eiwitten tot peptiden. Voeg trypsine (1 μg/μL bouillon) toe om een protease/eiwitverhouding van 1:50 te verkrijgen en incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende maximaal 5 uur voor eencellige monsters en tot 14 uur voor weefselmonsters. Raadpleeg leverancierspecifieke aanbevelingen voor de reactie.
OPMERKING: Vertering met trypsine langer dan 14 uur of hogere concentraties kan splitsingen introduceren die niet specifiek zijn voor de sequentie van het eiwit, waardoor eiwitidentificaties worden uitgedaagd33. - Kwantificeer de totale peptideconcentratie met behulp van een colorimetrische assay.
- OPTIONEEL: Voor multiplexingkwantificering tagt u de peptiden van elk monster met een andere isobare massatag volgens leverancierspecifieke instructies. Meng de peptiden met streepjescode in gelijke verhoudingen per peptidemonster.
OPMERKING: Zorg voor nauwkeurige etikettering en menging om kwantitatieve vooroordelen te voorkomen. Voor monsters met beperkte hoeveelheden of eencellige monsters kan een op TMT gebaseerd dragerkanaal bestaande uit gepoolde weefsels / cellen worden opgenomen om monsterverliezen tijdens volgende scheidingsstappen te minimaliseren en de gevoeligheid van lagere overvloedige eiwitten te verhogen34. - OPTIONEEL: Desaltpeptiden om zouten en verontreinigingen (bijv. niet-gereageerde isobare massalabelreagentia) te verwijderen op een C18 reversed-phase spin column/tip om het LC-MS-systeem te beschermen.
- OPTIONEEL: Fractioneer (bijv. Medium- of hoge-pH reversed-phase fractionering) van het peptidemengsel voor diepere detectie van het proteoom via handmatige of automatische platforms. Gebruik C18 stationaire fase met tips om lage hoeveelheden (1-10 μg) peptideverteringen te fractioneren.
- Droog het peptidemengsel bij 60 °C in een vacuümconcentrator.
- Bewaar het peptidemengsel bij −80 °C tot de meting.
- Voor eencellige analyse door CE, verwarm het monster tot 60 °C gedurende ~15 minuten om eiwitten te denatureren en breng het monster vervolgens in evenwicht tot kamertemperatuur (RT, ~5 min)18,21.
- Scheid de peptiden
OPMERKING: Na het extraheren en enzymatisch verteren van eiwitten, worden de resulterende peptiden gescheiden door nanoLC of CE en geïoniseerd door ESI voor sequencing door tandem HRMS. Reversed-phase nanoLC-scheiding is ideaal voor peptiden die ~150 ng tot ~1 μg per analyse verzamelen. CE biedt complementaire gevoeligheid voor peptiden, variërend van femtogrammen tot <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 en worden in toenemende mate gebruikt voor eencellige analyse18,36,37.- Als u wilt scheiden met CE, volgt u de stappen 4.2.2-4.2.7.
OPMERKING: In wat volgt, wordt het gebruik van het op maat gemaakte CE-platform voor het meten van de peptiden beschreven. Protocollen om dit CE-instrument te bouwen en te gebruiken werden eerderverstrekt 38, samen met een gevisualiseerd experiment over het gebruik voor kleine moleculen20. Als alternatief kunnen deze metingen worden uitgevoerd op een commercieel CE-systeem, zoals de AB SCIEX CESI, Agilent 7100 of gelijkwaardig. - Reconstitueer de eiwitvertering in 1-2 μL van het monsteroplosmiddel, vortex om het monster te mengen en centrifugeer het op 10.000 x g gedurende 2 minuten tot pelletcelresten.
OPMERKING: Verwijdering van het celafval minimaliseert de kans op verstopping van het CE-capillair, waardoor de levensduur van het scheidingssysteem wordt verlengd en de meetdoorvoer wordt verhoogd. - Initialiseer het CE-ESI-instrument door het CE-capillair te spoelen met de BGE.
- Valideer instrumentele prestaties met behulp van een bekende standaard (bijv. Cytochroom C of BSA digest, angiotensinepeptiden).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het instrument te evalueren in termen van massanauwkeurigheid, detectiegevoeligheid, reproduceerbaarheid en lineair dynamisch kwantificeringsbereik voordat kostbare monsters worden gemeten. Aanvullende opmerkingen over validatie en probleemoplossing van CE-ESI-MS-prestaties zijn elders vermeld18,20,38. - Injecteer ~1-10 nL van het monster in het CE-scheidingscapillair.
OPMERKING: Deze studie maakt gebruik van ~ 1 m lang gesmolten silica capillair (40/110 μm binnen/ buitendiameter) met de elektrokinetisch gepompte mantelstroomopstelling. Commerciële CE-instrumenten vereisen meestal de presentatie van 5-10 μL monster in een microvial voor injectie. Het op maat gemaakte CE-platform18,38 is compatibel met ~ 250 nL tot 1 μL monster afgezet in een microvial met monsterlading. - Breng het inlaatuiteinde van het CE-scheidingscapillair over in de BGE.
- Start elektroforetische scheiding door de CE-scheidingsspanning geleidelijk op te voeren vanaf de aarde (bijvoorbeeld stapsgewijs gedurende 1 min). Potentialen van 20-28 kV met een stroom van minder dan ~10 μA zorgen voor stabiele en reproduceerbare instrumentele prestaties voor analyse.
- Als u wilt scheiden met nanoLC, volgt u de stappen 4.2.9-4.2.12.
- Resuspendeer het peptidemonster in mobiele fase A. De concentratie van het monster en het volume voor injectie zijn afhankelijk van het beschikbare LC-systeem en de beschikbare kolom. In deze studie wordt ~250 ng-1 μg eiwitvertering geïnjecteerd in 1-20 μL monstervolume op een C18-kolom met verpakt bed (75 μm binnendiameter, 2 μm deeltjesgrootte met 100 Å poriën, 25 cm lengte scheidingskolom).
- Breng het monster over in een LC-injectieflacon.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de injectieflacon zitten, die de analytische kolom kunnen beschadigen. Injectieflacons met inserts kunnen worden gebruikt voor weefsel- of eencellige monsters met een laag volume. - Laad ~200 ng tot 2 μg peptidemonster op de C18 analytische kolom.
OPMERKING: Optioneel kunnen de peptiden op een vangkolom worden geladen voor ontzouting voorafgaand aan analytische scheiding. Bijvoorbeeld een C18-vangkolom met 0,1 mm binnendiameter, 5 μm deeltjesgrootte, 100 Å poriegrootte, 20 mm lengte. Desaltpeptiden met 100% buffer A bij een debiet van 5 μL/min gedurende 5 minuten voordat de scheidingsgradiënt begint. - Scheid de peptiden met behulp van gradiëngetalelutie. Bij een debiet van 300 nL/min is de in deze studie gebruikte gradiënt van 120 min als volgt: 0-5 min 2% B, 5-85 min 2-35% B, 86-90 min 70% B, 91-120 min 2% B.
- Als u wilt scheiden met CE, volgt u de stappen 4.2.2-4.2.7.
- Ioniseer de peptiden door ESI
OPMERKING: Het CE- of nanoLC-capillair is meestal gekoppeld aan een ESI-bron voor ionisatie. Micro-flow (stompe tip) en nano-flow (taps toelopende tip39 en elektrokinetische gepompte mantelstroom36 ontwerp) CE-ESI interfaces voor ultragevoelige detectie zijn eerder ontwikkeld.- Lever de scheidende peptiden in een elektrospray-ionenbron voor ionisatie met behulp van een commerciële of op maat gemaakte ESI-interface. Gebruik voor eencellige CE-ESI-MS-analyse in Xenopus-embryo's een elektrokinetisch gepompte low-flow interface waarbij de CE-capillaire uitlaat is ingesloten in een getrokken borosilicaat-emitter.
- Controleer de vloeistofstroom door de elektrospray-emitter met behulp van een camera en inspecteer de opstelling visueel op mogelijke lekken.
- Stel de elektrosprayspanning in op ~ 2,5 kV om de ESI-bron te starten (versus aardegrond).
- Zorg voor een stabiele nanospray voor HRMS-analyse door de totale ionenstroom te bewaken. Pas de elektrosprayspanning en afstand van de emitter tot de HRMS-inlaat aan om een stabiele spray te bereiken (<15% relatieve standaardafwijking in totale intensiteit).
- Detecteer de peptiden
OPMERKING: Detectie van peptiden volgt verschillende instrumentele overwegingen voor isobare massa gelabelde en ongelabelde peptiden en is afhankelijk van het type beschikbare massaspectrometer. Deze studie maakt gebruik van een orbitrap tribrid massaspectrometer volgens de volgende stappen.- Verkrijg MS1-gebeurtenissen met de instellingen: Analyzer, orbitrap; Spectrale resolutie, 120.000 volledige breedte bij half maximum (FWHM); maximale injectietijd (IT), 50 ms; automatische versterkingsregeling (AGC), 4 x 105 tellen; microscans, 1.
- Om peptiden te sequencen, fragmenteren voorlopers voor detectie in de ionenvalanalysator met behulp van de instellingen: fragmentatiemodus, botsingsdissociatie met hogere energie (HCD); botsingsgas, stikstof; botsingsenergie, 32% genormaliseerde botsingsenergie (NVU); maximale IT, 70 ms; AGC, 1 x 104 tellen; microscans, 1.
- OPTIONEEL: Kwantificeer TMT-gelabelde peptiden met behulp van tandem/meertraps HRMS (MS2/MS3). Voor MS3 met synchrone voorloperselectie zijn de typische instrumentele instellingen als volgt. Eentraps (MS1) scans die de meest voorkomende ionen onderzoeken, worden gedissocieerd via data-afhankelijke acquisitie met behulp van de parameters: MS 2-fragmentatiemodus, botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID); botsingsgas, helium; botsingsenergie, 35% NVU; analyzer voor fragmentionen, ionenval volgende instellingen: maximale IT, 50 ms; AGC, 5 x 104 tellen; microscans, 1. Selecteer 10 MS 2-fragmentionen en fragmenteer ze met HCD in stikstof (65% NVU). Detecteer MS 3-fragmentionen met behulp van de volgende instellingen: Orbitrap-resolutie 15.000 FWHM, maximale IT, 120 ms; AGC, 1 × 105 tellen; microscans, 1.
OPMERKING: Verschillende MS-acquisitiemethoden en -parameters kunnen worden gebruikt voor gelabelde monsters volgens aanbevelingen van leveranciers zoals elders beschreven 11,40.
- Analyseer de gegevens
OPMERKING: Eiwitten worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van geavanceerde bioinformatische pakketten. De betrouwbaarheid van identificaties wordt berekend met behulp van een lokdatabase, uitgedrukt als de false discovery rate (FDR) op het niveau van peptiden en eiwitten.- Verwerk de gegevens met behulp van commerciële of open-source softwarepakketten (besproken in referentie41). Vergelijk de onbewerkte gegevens met een database die is opgesteld door het Xenopus-proteoom 9.2 samen te voegen met de van mRNA afgeleide PHROG-database42.
OPMERKING: De zoekparameters zijn: spijsverteringsenzym, trypsine; gemiste decolletés, tot 2; variabele modificatie, methionine-oxidatie; statische modificatie, cysteïne carbamidomethylatie; massatolerantie voorloper, 10 ppm; fragmentmassatolerantie, 0,6 Da; minimale peptidelengte, 5; identificatiegetrouwheid, <1% FDR voor peptiden en eiwitten. Zonder alkylering naar peptiden is carbamidomethylatie als statische modificatie uitgesloten tijdens het zoeken in de database (bijvoorbeeld voor eencellige analyse). - Kwantificeer eiwitrijkdom via labelvrije43 of labelgebaseerde strategieën44,45.
- OPTIONEEL: Annoteer eiwitten voor genontologie. PantherDB46, Reactome47 of Xenbase23 kunnen worden gebruikt.
- OPTIONEEL: Kwantificeer eiwitrijkdom en verschillen in eiwitrijkdom tussen cel- / weefseltypen met behulp van softwarepakketten / webtools, zoals de Trans-Proteomic Pipeline48, Perseus49 en Orange50.
OPMERKING: Aanvullende overwegingen over experimenteel ontwerp en software-opties werden elders besproken41,51. - OPTIONEEL: Evalueer de resultaten verder met behulp van kennisbanken, zoals STRING52 en BioPlex Display 53 voor bekende eiwit-eiwitinteracties en PhosphoSiteplus54 voor fosforyleringen. Voor het analyseren van motieven en domeinen die in het proteoom worden weergegeven, gebruikt u webtools zoals Simple Modular Architecture Research (SMART)55.
- Verwerk de gegevens met behulp van commerciële of open-source softwarepakketten (besproken in referentie41). Vergelijk de onbewerkte gegevens met een database die is opgesteld door het Xenopus-proteoom 9.2 samen te voegen met de van mRNA afgeleide PHROG-database42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol maakte de studie van eiwitten in afzonderlijke cellen en hun afstamming mogelijk terwijl ze weefsels in X. laevis-embryo's vaststellen. Figuur 1 illustreert een dergelijke toepassing van de benadering om eiwitten in neurale weefsel-vette cellen en het nieuw geïnduceerde neurale ectoderm in het embryo te bestuderen. Zoals te zien is in figuur 1A, integreerde de bioanalytische workflow traditionele hulpmiddelen van cel- en ontwikkelingsbiologie om cellen te identificeren, te injecteren / te aspirateren en monsters te verzamelen. Figuur 1B toont microprobebebe-bemonstering van de linker dorsale dierlijke (D11) cel in het 16-cel embryo in vivo met behulp van een micro-injector; Na het experiment ontwikkelden embryo's zich met succes tot kikkervisjes met een normale anatomie56. Grote embryonale cellen (~ 100-250 μm in diameter) waren ook bevorderlijk voor handmatige microdissectie. Dissectie van een rechter dorsale-dierlijke middellijn (D11) cel wordt geïllustreerd aan de hand van het 16-cel embryo in figuur 1C. De opstelling maakte het ook mogelijk om een klonaal traject te traceren door een fluorescerende tracer in de geïdentificeerde voorloper te injecteren. Zoals te zien is in figuur 1D, maakte de aanpak het mogelijk om klonen te isoleren die voortkomen uit de linker en rechter D111-cellen via weefseldissectie of door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). De hier beschreven monsterverzamelingsstrategieën zijn voldoende schaalbaar in ruimte en tijd om de embryonale ontwikkeling in nieuwe details te bestuderen.
De bioanalytische workflow integreerde HRMS-technologieën om de gevoeligheid en kwantificering te verbeteren (figuur 2). De verzamelde eiwitten werden gemeten via een bottom-up proteomische benadering. Optionele fractionering van monsters op basis van orthogonale chemie (bijv. Hoge pH en vervolgens lage pH omgekeerde fase LC) hielp de detectiegevoeligheid. Om peptiden te scheiden, werd CE geselecteerd voor sporenhoeveelheden monsters (<< ~ 100 ng)) en nanoLC voor beperkte hoeveelheden materialen (>>150 ng). Peptiden werden gesequenced met behulp van ESI-HRMS. De gedetecteerde eiwitten werden gekwantificeerd met behulp van labelvrije en op etiketten gebaseerde strategieën. Vereenvoudiging van de monsterverwerking voor eencellige analyse, zoals eliminatie van de typische stappen van reductie en alkylering gevolgd door CE-analyse, vergemakkelijkte de identificatie van ~ 400-800 verschillende eiwitten. Onder de gerapporteerde eiwitten waren er veel met belangrijke functionele rollen, zoals chaperonine met TCP1 subunit 3 (Cct3), spanningsafhankelijk ionkanaal (Vdac2) en creatinekinase-hersenen (Ckb). Multivariate en statistische gegevensmodellen hielpen ons10,57 en anderen 9,58 voorheen onbekende verschillen in de proteomische samenstelling van geselecteerde cellen en weefsels te vinden met behulp van de benaderingen die in dit protocol zijn samengevat. Met name deze HRMS-metingen vereisten geen functionerende sondes of kennis over de samenstelling van de monsters van tevoren, wat ontdekkingen ondersteunde.
In een reeks studies werd de proteomische toestand van geïdentificeerde cellen in zich ontwikkelende embryo's van X. laevis (fig. 3) gekwantificeerd21. Figuur 3A toont de detectie van gentranslationele verschillen tussen D11-cellen die werden ontleed uit verschillende embryo's10. Microsampling CE-ESI-HRMS stelde ons in staat om tot ~ 700 eiwitten uit afzonderlijke cellen te identificeren en te kwantificeren21. De representatieve primaire HRMS-MS/MS-gegevens over het identificeren van ~400 cumulatieve eiwitten uit technische duplicaatmetingen op een D11-cel in het embryo werden gedeponeerd bij PRIDE. De aanpak was schaalbaar naar kleinere cellen en embryo's van andere modelorganismen, zoals zebravissen21. Schaalbaarheid naar kleinere celgroottes stelde ons in staat om de spatiotemporale reorganisatie van het D11-nageslacht van een levend embryo te onderzoeken zoals het zich in de tijd ontwikkelde. Figuur 3B toont het gebruik van dit protocol voor het uitvoeren van subcellulaire kwantitatieve proteomics van geïdentificeerde cellen in de 16-, 32-, 64- en 128-celembryo's. Eiwitten werden verdeeld in vier groepen die verschillende abundantieprofielen vertoonden gedurende de klonale ontwikkeling21.
Figuur 3: Protocol schaalbaarheid van de subcellulaire ruimte naar klonale weefsels in X. laevis embryo. (A) Meting van proteomische verschillen tussen geïdentificeerde hele D11-cellen, waarbij cel-cel heterogeniteit wordt onthuld. Gennamen getoond voor geselecteerde eiwitten. (B) Reorganisatie van het cellulaire proteoom in de zich ontwikkelende D11-celkloon. Fuzzy C-betekent clusteranalyse (GProx) van eiwitdynamica, waarbij eiwitten worden gegroepeerd op basis van vergelijkbare expressiepatronen. Grijze getallen tonen het aantal verschillende eiwitten dat in elk cluster is gekwantificeerd. De cijfers zijn met toestemming aangepast aan referenties21,57. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Dit protocol stelde ons in staat om ruimtelijke en temporele proteomics uit te voeren in geïdentificeerde, zich ontwikkelende celklonen (figuur 4). Figuur 4A toont de toepassing van de aanpak voor het labelen en isoleren van celklonen die twee weefsels vormen met een belangrijke rol in de ontwikkeling van neuraal weefsel en patronen van het embryo. Het grootste deel van de Spemann-organizer (SO) werd getraceerd door de linker- en rechtercellen D 112- en D212-cellen te labelen via injectie van fluorescerend dextran. Tegelijkertijd werden de naburige dorsale dierlijke (D111) cellen gelabeld om de meerderheid van het neurale ectoderm (NE) te markeren. De weefsels werden ontleed en hun eiwitgehalte werd geanalyseerd volgens dit protocol. nanoLC-ESI-HRMS retourneerde tot 2.000 verschillende eiwitten uit de weefsels, inclusief signalering, zoals de Wnt-, Fgf- en Tgfβ-routes. De representatieve primaire HRMS-MS/MS-gegevens over het identificeren van ~1.800 cumulatieve eiwitten uit technische duplicaatmetingen op een pool van ontleedde SO-weefsels werden gedeponeerd bij PRIDE. De Wnt-route ligand Wnt10a en Wntless (Wls), een membraaneiwit dat zich toelegt op de secretie van Wnt-liganden, werden alleen gedetecteerd in het NE-proteoom. De Wnt-route werd onderdrukt gevonden in de SO en kan een gebrek aan Wnt-interagerende eiwitten verklaren die in de SO zijn gedetecteerd. Deze resultaten tonen de toepasbaarheid van dit protocol voor het bestuderen van afstammingsspecifieke verschillen binnen het embryo.
Figuur 4: Voorbeeld van data-analyse van ruimtelijke weefselproteomics in de X. laevis-embryo's . (A) Differentiële labeling van de Spemann's Organizer (SO) en de neurale ectoderm (NE) weefsels door injectie van fluorescerend eiwit mRNA in de voorganger D 112 en D212 in het 32-cel embryo, respectievelijk. (B) Top 5 oververtegenwoordigde biologische processen in het SO (rood) en NE (groen) proteoom met detecteerbare verschillen. Pathway overrepresentatieanalyse toont biologische processen met behulp van Bonferroni-correctie. (C) Eiwitdomeinverrijkingsanalyse (SMART), die verrijking van DNA- en RNA-bindende motiefbevattende eiwitten in de SO onthult. (D) STRING-analyse die canonieke eiwit-eiwitinteracties voorspelt op basis van het gedetecteerde SO-proteoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De diverse proteomische gegevens dienen als waardevolle informatie voor de beoordeling van de functie. De proteomische gegevens kunnen worden geëvalueerd met behulp van canonieke kennisbanken. Zoals te zien is in figuur 4B, toonde pathway-analyse van ontregelde eiwitten oververtegenwoordigde translatie en energiemetabolisme in zowel de SO- als de NE-datasets in onze recente studies. Het NE-proteoom was verrijkt met eiwitten geassocieerd met nucleair transport van eiwitlading in de cel, wat waarschijnlijk wijst op stroomafwaartse gebeurtenissen na signalering in het nieuw vastgestelde NE (figuur 4C). De verrijkingsanalyse in figuur 4D vond upregulatie in translatie-initiatie, RNA-binding, binding in het proteasoomcomplex, wat een rol suggereert voor dynamische eiwitvernieuwing die SO ontwikkelt. Cellijngeleide HRMS-proteomics is schaalbaar in ruimte en tijd en voldoende gevoelig om de moleculaire organisatie van cellen tijdens normale en verminderde ontwikkeling beter te begrijpen.
Aanvullend dossier. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol maakt de karakterisering van eiwitexpressie in geïdentificeerde cellijnen in embryo's van de Xenopus-soort mogelijk. Voortkomend uit HRMS, combineert de methodologie voortreffelijke specificiteit in moleculaire identificatie, vermogen voor multi-eiwitdetectie zonder moleculaire sondes (meestal honderden tot duizenden verschillende eiwitten) en een vermogen tot kwantificering. Aanpassingsvermogen aan klassieke hulpmiddelen en workflows in cel- en ontwikkelingsbiologie (neuro)biologie breiden HRMS-proteomics uit naar spannende toepassingen, waaronder holistische karakterisering van stamceldifferentiatie in het gewervelde X. laevis-embryo.
De stappen beschrijven cellijngeleide proteomics in het X. laevis-embryo. Als voorbeelden demonstreren we de analyse van neural-fated single cells en hun afstamming en leveren we de bijbehorende CE- en nanoLC HRMS-datasets via een openbare gegevensrepository (zie PRIDE). Deze benadering is gemakkelijk aan te passen aan studies over de spatiotemporele regulatie van eiwitten in meerdere celtypen (en afstammingslijnen). Spatiotemporaal geleide proteomics in het zich ontwikkelende embryo kan ook worden uitgebreid tot transcriptomische en metabolomische studies om het moleculaire systeembiologisch begrip van celdifferentiatie en ontwikkeling van belangrijke organen, zoals het zenuwstelsel, te bevorderen.
Dit protocol voegt nieuwe dimensies toe aan de bioanalyse. Celculturen, zoals de geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's)1,2, vergemakkelijken de meting van de temporele proteoomdynamiek tijdens celdifferentiatie. De benadering die in deze studie wordt beschreven, kijkt naar de inductie van het lot van cellen in het 3-dimensionale levende embryo, waar complexe morfogene gradiënten, parallelle signaalroutes en convergente uitbreidingsprocessen samenwerken om weefselinductie en morfogenese tot stand te brengen. Het bestuderen van proteoomdynamica in de context van een embryo kan informatie opleveren over parallelle mechanismen die celdifferentiatie begeleiden, een opwindende richting om het begrip van differentiatie en ontwikkeling te verdiepen.
De hier beschreven aanpak leent hiervoor de experimentele voordelen van de Xenopus-soort, X. laevis in het bijzonder. Elke cel van het vroege 16- en 32-cel X. laevis-embryo is toegewezen aan reproduceerbare weefsellotgevallen in het volwassen organisme, in wezen een ruimtelijke projectie van cellen in embryo's in het splitsingsstadium. Reproduceerbaarheid voor celgeleide proteomica bouwt voort op nauwkeurige celtypering. We helpen succes door embryo's te registreren op stereotiepe pigmentatie en splitsing voordat we doorgaan met experimenten die celdissectie en afstammingstracering beschrijven16,20. Het is belangrijk op te merken dat cellen van embryo's in het splitsingsstadium vaak in verschillende mate bijdragen aan de vorming van verschillende weefseltypen; de details van hun niveaubijdrage aan elk weefseltype zijn beschikbaar op Xenbase23. Het embryonale stadium en de voorlopercellen die moeten worden getraceerd, moeten daarom worden gekozen op basis van de biologische kwestie in kwestie. Bij het kweken van embryo's gedurende langere perioden (bijv. >1 d), moet ervoor worden gezorgd dat beschadigde/dode embryo's worden verwijderd, wat op zijn beurt de levensvatbaarheid voor de andere embryo's in de populatie kan verminderen.
Voor succesvolle HRMS-proteomica moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan de analytische grondslagen van cel- / weefselverzameling, eiwitextractie en HRMS-meting. Omdat Xenopus-embryo's worden gekweekt in media die hoge concentraties niet-vluchtige zouten bevatten waarvan bekend is dat ze de gevoeligheid voor HRMS verminderen, wordt aanbevolen om de geaspireerde media te verminderen bij het verzamelen van de cellen en weefsels voor proteomische studies. Het is een goede gewoonte om ontzouting te onderzoeken om de identificatie en kwantificering van de eiwitten te bevorderen. Voorafgaand aan de HRMS-meting moeten de analytische prestaties van de CE- en LC-ESI-HRMS-instrumenten worden geëvalueerd, inclusief scheiding, ionisatie, reproduceerbaarheid en lineair dynamisch kwantificeringsbereik. Met goede analytische statistieken helpt dit protocol het gebruik van dieren in biologisch onderzoek te verminderen, helpt het de gevoeligheid voor het verkrijgen van krachtigere sets biochemische gegevens en verbetert het de kracht van statistische gegevensanalyse om resultaten te interpreteren. Standaard analyseren we elke biologische replicatie in ten minste 3 technische replicaties met behulp van CE of LC-HRMS, die worden gebruikt om de technische reproduceerbaarheid te evalueren en de dekking van het detecteerbare proteoom te verdiepen. Vermogensanalyse helpt bij het schatten van de statistische kracht en het ontwerp van de biologische replicatiegrootte. Het gebruik van verschillende sets ouderkikkers wordt geadviseerd om rekening te houden met natuurlijk voorkomende biologische variabiliteit tussen embryo's.
AANVULLENDE INFORMATIE
De HRMS-MS/MS proteomics-gegevens en gerelateerde verwerkingsbestanden werden via de PRIDE60-partnerrepository bij het ProteomeExchange Consortium gedeponeerd met de dataset-id PXD030059.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We zijn Jie Li (University of Maryland, College Park) dankbaar voor waardevolle discussies over embryonale dissociatie en FACS. We danken Vi M. Quach en Camille Lombard-Banek voor hun hulp bij de voorbereiding van monsters en het verzamelen van gegevens in eerdere studies die een voorbeeld zijn van de proteomische toepassingen die in dit protocol worden benadrukt. Delen van dit werk werden ondersteund door de National Science Foundation onder toekenningsnummer IOS-1832968 CAREER (aan P.N.), de National Institutes of Health onder toekenningsnummer R35GM124755 (aan P.N.), de University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (aan P.N.), en COSMOS Club Foundation onderzoeksprijzen (aan A.B.B. en L.R.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
References
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560 (2021).
- Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
- Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2000).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. Vleminckx, K. 1865, Humana Press Inc. NY. 175-194 (2018).
- Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
- Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
- Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P. Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. 628, 263-292 (2019).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11 (2016).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956 (2017).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Developmental Biology. 120 (1), 299-304 (1987).
- Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
- Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
- Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
- Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
- Wisniewski, J. R. Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. Becher, D. 1841, Humana Press Inc. NY. 3-10 (2018).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882 (2018).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
- Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
- Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161 (2018).
- Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
- Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21 (2019).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
- Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
- Pino, L. K., Rose, J., O'Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
- Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25 (2020).
- Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
- Schmidt, E., et al. On the Move Federated Workshops. , Springer, Verlag. Berlin. 710-719 (2006).
- Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
- Jensen, L. J., et al. STRING 8 - a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
- Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
- Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
- Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
- Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
- Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
- Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
