Summary
Her beskriver vi en massespektrometribasert proteomisk karakterisering av cellelinjer med kjente vevsskjebner i virveldyret Xenopus laevis-embryoet .
Abstract
Karakterisering av molekylære hendelser som celler gir opphav til vev og organer øker et potensial for å bedre forstå normal utvikling og designe effektive rettsmidler for sykdommer. Teknologier som muliggjør nøyaktig identifisering og kvantifisering av ulike typer og et stort antall proteiner, vil fortsatt gi manglende informasjon om molekylære mekanismer som orkestrerer vev og organismeutvikling i rom og tid. Her presenterer vi en massespektrometribasert protokoll som muliggjør måling av tusenvis av proteiner i identifiserte cellelinjer i Xenopus laevis (frosk) embryoer. Tilnærmingen bygger på reproduserbare celleskjebnekart og etablerte metoder for å identifisere, fluorescerende merke, spore og prøveceller og deres avkom (kloner) fra denne modellen for virveldyrutvikling. Etter å ha samlet cellulært innhold ved hjelp av mikrosampling eller isolering av celler ved disseksjon eller fluorescensaktivert cellesortering, blir proteiner ekstrahert og behandlet for nedenfra og opp proteomisk analyse. Væskekromatografi og kapillær elektroforese brukes til å gi skalerbar separasjon for proteindeteksjon og kvantifisering med høyoppløselig massespektrometri (HRMS). Representative eksempler er gitt for proteomisk karakterisering av nevralvevsskjebner. Cellelinjestyrt HRMS-proteomikk kan tilpasses forskjellige vev og organismer. Det er tilstrekkelig følsomt, spesifikt og kvantitativt til å kikke inn i den romlige-temporale dynamikken til proteomet under vertebratutvikling.
Introduction
Vår forståelse av celledifferensiering og opprinnelsen til vev og organer er resultatet av flere tiår med forseggjorte målrettede skjermer av gener og deres produkter. Å øke vår kunnskap om alle biomolekylene og deres mengder under viktige cellulære hendelser vil bidra til å avdekke molekylære mekanismer som styrer romlig og tidsmessig mønster av virveldyrets kroppsplan. Teknologier som muliggjør molekylær forsterkning og sekvensering er nå i stand til rutinemessig å rapportere om et stort antall gener og transkripsjoner, og støtter hypotesedrevne studier i grunnleggende biologisk og translasjonsforskning. For å forstå utvikling av systemer, tar et komplekst forhold mellom transkripsjon og oversettelse til orde for direkte analyse av flere proteiner og deres posttranslasjonelle modifikasjoner. Global proteomikk ved bruk av in vitro biologiske systemer, slik som induserte pluripotente stamceller, begynte å avgrense mekanismer for vevsinduksjon 1,2. I komplekse organismer, som virveldyrembryoet, er utviklingen avhengig av morfogengradienter i sammenheng med rom og tid3. Det følger at å få kunnskap om proteomiske forandringer når celler skiller seg for å danne spesialiserte vev, for eksempel nevrale vev, gir en nøkkel til å låse opp molekylære programmer som kontrollerer normal og defekt utvikling og veilede neste generasjons terapi.
Virveldyret sørafrikansk klørfrosk (Xenopus laevis) er en veletablert modell innen celle- og utviklings-, nevro- og regenerativ biologi. Sir John Gurdons 2012 Nobelpris i fysiologi eller medisin 4,5 for oppdagelsen av pluripotens av den somatiske kjernen fremhevet betydningen av denne modellen for funn i grunnleggende og translasjonsstudier. Xenopus-embryoer utvikler seg eksternt til moren, og letter dermed direkte manipulering av celler, cellekloner og genuttrykk over ulike utviklingsstadier. Asymmetrisk pigmentering og stereotype celledelinger gjorde det mulig å kartlegge reproduserbare skjebnekart fra 16-6 og 32-celle 7,8 stadium embryo. For høyoppløselig massespektrometri (HRMS) basert proteomikk inkluderer ytterligere fordeler med modellen relativt stor størrelse (~ 1 mm i diameter), noe som gir rikelig proteininnhold for analyse (~ 130 μg i tidlige spaltningsstadiumembryoer, ~ 10 μg proteininnhold i enkeltceller i 16-celleembryoet) 9,10.
For tiden er HRMS den ledende teknologien som er valgt for å oppdage proteiner. Denne teknologien muliggjør direkte, sensitiv og spesifikk deteksjon og kvantifisering av flere, vanligvis hundrevis-til-tusenvis av forskjellige proteiner11. Bottom-up proteomikk av HRMS innebærer en rekke sammenkoblede trinn. Etter ekstraksjon fra celle-/vevsprøven fordøyes proteiner med et proteolytisk enzym, slik som trypsin (bottom-up proteomics). De resulterende peptidene separeres basert på deres forskjellige fysisk-kjemiske egenskaper, inkludert hydrofobicitet (reversert fasevæskekromatografi, LC), nettoladning (ionebytterkromatografi), størrelse (størrelsesekskluderingskromatografi) eller elektroforetisk mobilitet (kapillær elektroforese, CE). Peptider blir deretter ladet (ionisert), vanligvis ved bruk av elektrosprayionisering (ESI), og peptidioner detekteres og sekvenseres via gassfasefragmentering av tandem-HRMS. De resulterende peptiddataene kartlegges til proteomet til organismen som studeres. Med proteinspesifikk (proteotypisk) peptidionsignalintensitet korrelert med konsentrasjon, kan proteinkvantifisering utføres etikettfri eller etikettbasert (multipleksingskvantifisering). HRMS proteomikk gir en rik ressurs av informasjon om molekylær tilstand av systemet under studien, noe som gjør det mulig å generere hypoteser og oppfølging funksjonelle studier.
Figur 1: Spatiotemporalt skalerbar proteomikk som muliggjør cellelinjeveiledet HRMS-proteomikk i det utviklende (froske) embryoet. (A) Visualisering av prøven (1) ved hjelp av et stereomikroskop (2) for injeksjon av en identifisert celle (innfelt), ved bruk av en fabrikert mikropipette (3) under kontroll av et oversettelsestrinn (4). (B) Subcellulær prøvetaking av den identifiserte venstre D11-cellen i et 16-celleembryo. (C) Disseksjon av en hel D11 celle fra et 16-celle embryo. (D) Fluorescerende (grønn) sporing av venstre og høyre D111 progenier fra et 32-celleembryo for å lede disseksjon av nevralektoderm (NE) i gastrula (trinn 10) og isolering av etterkommervevet fra rumpetroll ved hjelp av FACS. Skalastenger: 200 μm for embryoer, 1,25 mm for hetteglasset. Tallene ble tilpasset med tillatelse fra referansene 15,19,21,59. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protokollen som presenteres her muliggjør HRMS-basert kvantifisering av et stort antall proteiner i identifiserte celler/vev i utviklingen av X. laevis-embryoer. Tilnærmingen bygger på nøyaktig celleidentifikasjon, reproduserbare celleskjebnekart og etablerte metoder for å spore cellelinjer i denne biologiske modellen 6,7,8. Som vist i figur 1 studerer vi proteomer fra enkeltceller ved å bruke helcelledisseksjon eller kapillær mikrosampling for å aspirere cellulært innhold. Overvåking av avstamningen til en celle tillater oss å studere den spatiotemporale utviklingen av proteomet når celler danner vev under gastrulasjon. Celleavkommet er fluorescerende merket ved å injisere en fluorofor konjugert til inert dextran eller mRNA for fluorescerende protein (f.eks. grønt fluorescerende protein eller GFP). Det merkede avkommet isoleres ved ønskede utviklingstidspunkter. Under gastrulering kan cellekloner som er tett gruppert isoleres ved disseksjon. Etter gastrulering kan cellekloner distribueres i embryoet på grunn av migrerende bevegelser og kan isoleres fra dissosierte vev ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Proteiner i disse cellene og vevene måles via bottom-up-proteomikk som bruker HPLC eller CE for separasjon og ESI-tandem HRMS for identifikasjon. Cellelinjestyrt HRMS-proteomikk er skalerbar til forskjellige cellestørrelser og linjer i embryoet og er spesifikk, sensitiv og kvantitativ. Gjennom utvalgte eksempler vist her, demonstrerer vi også at denne protokollen er skalerbar og bredt tilpasningsdyktig til forskjellige typer celler og cellelinjer.
Figur 2: Den bioanalytiske arbeidsflyten. Mikrodisseksjon og kapillær aspirasjon, eller FACS muliggjorde prøvetaking av cellulært og klonalt proteininnhold. Uttømming av rikelig eggeplommeproteiner og separasjon ved kapillær elektroforese (CE) eller nano-flow væskekromatografi (LC) forbedret identifikasjon (ID) følsomhet ved bruk av elektrosprayionisering (ESI) høyoppløselig massespektrometri (HRMS). Kvantifisering avslørte dysregulering, og ga ny informasjon for hypotesedrevne studier i forbindelse med informasjon tilgjengelig fra genontologi (GO). Figurene ble bearbeidet med tillatelse frareferanse 15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller som sikrer humant vedlikehold og håndtering av Xenopus laevis voksne frosker ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Maryland, College Park (godkjenningsnummer R-DEC-17-57 og R-FEB-21-07).
1. Forbered løsningene
- For embryologi
- Forbered 1x, 0,5x og 0,2x Steinbergs løsning (SS), autoklav dem deretter (120 °C i 20 minutter) til sterilitet etter standardprotokoller12.
- Forbered 3% (w / v) Ficoll i sterilisert 1x SS etter standardprotokoller12.
- For dejellying, tilbered nylig 2% (w / v) cysteinoppløsning og juster pH til 8 ved å tilsette 10 M natriumhydroksidoppløsning dråpevis.
FORSIKTIG: Eksponering for cystein kan forårsake hud- og luftveisskader. Natriumhydroksid er et etsende middel som kan forårsake alvorlig skade på hud og øyne ved direkte eksponering. Bruk egnet personlig verneutstyr (PPE) ved håndtering av disse kjemikaliene, for eksempel hansker og laboratoriefrakk. - For avstamningssporeren, tilbered 0,5% (v / v) av et fluorescerende dextran i sterilt avionisert vann. Alternativt kan du lage en løsning på 0,2 μg / μL mRNA for fluorescerende proteiner i sterilt avionisert vann (f.eks. GFP).
- For å dissosiere celler, klargjør Newport 2.0-bufferen som inneholder 0,1 M natriumisetionat, 20 mM natriumpyrofosfat og 10 mM CAPS, og bring deretter pH til 10,513.
FORSIKTIG: Eksponering for natriumpyrofosfat kan forårsake hud- og øyeirritasjon. Bruk egnet PPE ved håndtering av disse kjemikaliene.
- For nedenfra-og-opp-proteomikk
- Klargjør cellelysebufferen slik at den inkluderer: 250 mM sukrose, 1 % nonidet P-40 substitutt (w/v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM cytochalasin D og 10 μM combretastatin 4A. Forbered et lager av 10% (w / v) natriumdodecylsulfat14,15.
MERK: Tris-HCl ble valgt for å minimere HEPES-forurensning under nano-flow LC (nanoLC)-HRMS.
FORSIKTIG: Eksponering for nonidet P-40 erstatning kan forårsake hudirritasjon. Cytochalasin D er teratogent ved inntak og combretastatin er akutt toksisk ved direkte eksponering. Bruk egnet PPE ved håndtering av disse kjemikaliene. - For å skille peptider ved CE, klargjør følgende løsningsmidler (v / v): Prøveløsningsmiddel, 75% acetonitril (ACN) inneholdende 0,05% eddiksyre (AcOH) i vann; kappeoppløsning, 10% ACN inneholdende 0,05% AcOH i vann; bakgrunnselektrolytt (BGE), 25 % ACN inneholdende 1 M maursyre (FA) i vann.
FORSIKTIG: AcOH og FA er giftige ved innånding eller konsumering og kan forårsake alvorlig hud- og øyeskade ved direkte eksponering. Bruk egnet PPE ved håndtering av disse kjemikaliene. - For å skille peptider ved omvendt fase nanoLC, klargjør (v / v): Mobilfase A (vandig), vann inneholdende 0, 1% FA; mobil fase B (organisk), 0,1 % FA i ACN.
MERK: Alle blandinger skal fremstilles ved hjelp av LC-MS-løsningsmidler for å minimere kjemiske forstyrrelser under HRMS-deteksjon.
- Klargjør cellelysebufferen slik at den inkluderer: 250 mM sukrose, 1 % nonidet P-40 substitutt (w/v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM cytochalasin D og 10 μM combretastatin 4A. Forbered et lager av 10% (w / v) natriumdodecylsulfat14,15.
2. Forbered verktøyene for mikroinjeksjon og disseksjon
- For å forsiktig flytte og orientere embryoer, lag hårsløyfer ved å feste rent hår i en Pasteur-pipette som beskrevet andre steder16.
- For mikroinjeksjon, fremstill nåler ved å trekke borosilikatkapillærene (1 mm / 500 μm ytre / indre diameter) ved hjelp av en pipetteavtrekker som beskrevet andre steder16.
MERK: Her ble en P-1000 pipettetrekker med følgende innstillinger brukt til fremstilling av nåler: varme, 495; trekk, 30, hastighet, 60; tid, 150; trykk, 200. - Med observasjon under et stereomikroskop, kutt spissen av kapillæren ved hjelp av et par skarpe tang for å fremstille kapillæren i en (mikro) nål (f.eks. Dumont #5) 16.
FORSIKTIG: Pulled kapillærer er veldig skarpe og bør håndteres med forsiktighet.
MERK: Spissen av nålen skal være skarp nok (ytre diameter 10-15 μm) for å kunne gjennombore cellen med minimal skade på cellemembranen, slik at det intracellulære innholdet ikke lekker ut og cellen kan helbrede og fortsette å være levedyktig. - For å holde embryoer under mikroinjeksjon, lag brønner i en leirefylt tallerken. I en 15 mm petriskål, påtrykt ~1 mm diameter x ~0,5 mm dype brønner i giftfri plasticine leire som beskrevet andre steder16.
- For mikrodisseksjon, tilbered agarosebelagte retter. Lag 2% agarose i 1x SS og autoklav den for å sterilisere løsningen (120 ° C i 20 minutter). Fyll 60 mm petriskåler halvveis, og la platene stivne. Lag ~1 mm diameter x ~0,5 mm dype brønner ved hjelp av et ballet Pasteur-pipetteverktøy som beskrevet tidligere16.
3. Isoler cellelinjen
MERK: Følgende trinn utføres for å isolere identifiserte enkeltceller og/eller deres etterkommere av cellelinjer. Vanligvis dyrkes embryoet til 16- eller 32-cellestadiet, hvor vevsskjebnene til hver celle er reproduserbart kartlagt 6,7,17. De embryonale cellene identifiseres basert på morfologi, plassering og i referanse til deres skjebnekart. For enkeltcelleanalyse isoleres identifiserte celler ved manuell disseksjon, eller deres intracellulære innhold samles inn i en kapillær pipette og avsettes i 5 μL 0, 5 mM ammoniumbikarbonat. Den resulterende prøven lagres ved -80 °C til analyse (figur 1)18,19,20,21. For celleavstamningsanalyse injiseres identifiserte celler med en avstamningssporer, og deres påfølgende kloner isoleres i viktige utviklingsstadier (f.eks. Under gastrulering for å studere vevsinduksjon, etter neurulasjon for å studere vevsforpliktelse). I det følgende er trinn skissert for å fluorescerende merke avstamningen av identifiserte celler for isolasjon ved disseksjon eller FACS.
- Dyrk embryoene
- Få embryoer via naturlig parring eller in vitro fertilisering (IVF) etter etablerte protokoller12.
MERK: Naturlig parring er logistisk enklere, sparer de voksne mannlige froskene og gir embryoer på forskjellige utviklingsstadier, mens IVF gir utviklingssynkroniserte embryoer for eksperimenter som krever nøyaktig iscenesettelse. - Dejelly embryoene. Fjern gelépelsen som omgir embryoene via behandling med den geléaktige oppløsningen som beskrevet andre steder12,16.
MERK: Mikroinjeksjoner og disseksjon krever tilgang til celler og vev, noe som nødvendiggjør dejellying i X. laevis embryoer. - Velg 2-celleembryoer med stereotyp pigmentering 16,22.
MERK: Dette trinnet er viktig for å sikre nøyaktighet og reproduserbarhet i identifiseringen av cellen og dens avstamning. - Kultur embryoer til ønsket utviklingsstadium. Overfør de dejellied embryoene til en petriskål som inneholder 1x SS og inkuber dem mellom 14-25 ° C for å kontrollere utviklingshastigheten.
MERK: Temperaturavhengigheten av utvikling er reproduserbar og kartlagt for X. laevis, tilgjengelig på Xenbase23 (www.xenbase.org). Dyrking av partier av embryoer ved forskjellige temperaturer muliggjør svimlende utviklingsstadier. Å gjøre det bidrar til å distribuere antall embryoer som er tilgjengelige på et gitt tidspunkt for eksperimentering. - Overvåk spaltningsmønsteret til embryoer og velg embryoer med stereotype pigmenterings- og spaltningsmønstre for mikroinjeksjon16.
MERK: Når du velger 16- og 32-celleembryoer, må du sørge for at cellespaltningene er symmetriske for reproduserbar avstamningssporing.
- Få embryoer via naturlig parring eller in vitro fertilisering (IVF) etter etablerte protokoller12.
- Merk cellen(e) av interesse
- Sett opp injeksjonsnålen som inneholder lineage tracer-oppløsningen. Monter mikroinjeksjonsnålen i en mikropipetteholder styrt av en flerakset mikromanipulator.
- Koble mikropipetteholderen til en mikroinjektor. Fyll nålen med avstamningssporeren ved å påføre undertrykk som beskrevet andre steder16. Figur 1A eksemplifiserer oppsettet.
- Kalibrer kanylen. Juster størrelsen på nålespissen og injeksjonstiden for å levere ~1 nL av avstamningssporingsoppløsningen, målt i (mineral)olje etter en protokoll tilgjengelig andre steder16.
MERK: Kapillærer med bredere spiss har en tendens til å skade cellemembranen, noe som forårsaker subcellulært innhold og den injiserte avstamningssporeren lekker ut, mens kapillærer med mindre spisser er tilbøyelige til tilstopping. Kapillærer med ~ 10 μm spiss ytre diameter er ideelle, og krever en 40 psi trykkpuls over ~ 300 ms for å levere ~ 1 nL. - Oversvømme mikroinjeksjonsfatet med 3% Ficoll-løsningen og overfør ~10 embryoer til leirfatet ved hjelp av en overføringspipette. Bruk en hårsløyfe for å lede hvert embryo inn i en brønn og plasser dem forsiktig slik at den målrettede cellen av interesse er i rett vinkel mot mikronålen.
- Identifiser forløpercellen til avstamningen av interesse etter X. laevis vevsskjebnekart. For eksempel viser figur 1 merkingen av nevrale ektodermale kloner basert på injeksjon av forløperceller i 32-celleembryoer (venstre og høyre D111-celler ).
MERK: Detaljerte skjebnekart for 16-6 og 32-celle 7,8 embryoer er tilgjengelig i en interaktiv plattform via Xenbase23. Det er viktig å sikre stereotyp pigmentering og spaltninger på embryoer når du bruker dem til avstamningssporingseksperimenter. - Injiser cellen (e) av interesse med ~ 1 nL av fluorescerende dextran eller ~ 200 pg mRNA som beskrevet tidligere16.
MERK: Bruk dekstrankonjugater som er 10.000-40.000 MW. Mindre dekstrankonjugater kan passere gjennom gapkryss, mens større dekstrankonjugater kanskje ikke diffunderer jevnt inn i den injiserte cellen. Planlegg å injisere celler i ~ 10 embryoer for å ha tilstrekkelig vev for proteomiske analyser. - Bekreft suksessen med cellemerking under et stereomikroskop. Forsikre deg om at bare den tiltenkte cellen injiseres. Kast embryoer som inneholder skadede eller feilmerkede celler etter institusjonelle retningslinjer.
MERK: Fordi X. laevis er invasiv i mange ikke-naturlige miljøer, kan embryoer fryses for å sikre dødelighet før de kasserer embryoene.
- Isoler det merkede celleavkommet
- Overfør de injiserte embryoene til 0,5x SS i en petriskål og dyrk dem mellom 14-25 °C til ønsket utviklingsstadium er nådd.
MERK: Konsulter etablerte protokoller for å iscenesette embryoer rapportert på Xenbase. - Overfør 3-5 embryoer til en agarfat med 0,2x SS-løsning for mikrodisseksjoner.
MERK: Redusere saltkonsentrasjonen av SS-løsning fra 0,5x til 0,2x hjelper separate celler under disseksjon. - Bruk to skjerpede tang for å forsiktig fjerne vitellinemembranen som omgir embryoet.
MERK: For å spare klonen av interesse fra skade, fjern membranen fra motsatt side av den fluorescerende merkede klonen. - Isoler den merkede klonen ved manuell disseksjon (trinn 3.3.5-3.3.6) eller FACS (trinn 3.3.7-3.3.8) som følger.
- Bruk tang for å dissekere den merkede klonen fra embryoet.
MERK: Andre verktøy som mikrokirurgisk saks, wolframnåler eller øyenbrynshårkniver kan brukes til disseksjon av den merkede klonen, som beskrevet andre steder16. - Samle det dissekerte vevet med en 0,5-10 μL pipette og legg dem i et mikrosentrifugeglass. Bruk en overføringspipette til å aspirere mediet som omgir det oppsamlede vevet for å begrense salter i prøven, noe som forstyrrer HRMS-analysen i senere trinn.
MERK: Bruk hetteglass som minimerer proteinadsorpsjon på plastoverflater for å minimere proteintap på hetteglassoverflater under senere trinn i arbeidsflyten. - For å isolere ved FACS, overfør ~ 5-8 devitellized embryoer i hver brønn i en 12-brønns plate som inneholder ~ 5 ml Newport 2.0 buffer. Dissosiere embryoene ved å nøtte platen ved 80 o / min i 20-30 minutter ved romtemperatur13.
MERK: Embryoer / larver eldre enn stadium 22 har rikelig ekstracellulære matriksproteiner, noe som gjør dissosiasjon i separate celler vanskelig. Ytterligere enzymatiske tilnærminger kan tilpasses for å dissosiere vev fra eldre embryoer som beskrevet andre steder24. - Rens de fluorescerende merkede cellene fra suspensjonen ved hjelp av FACS som beskrevet andre steder24.
- Pelletsceller ved sentrifugering og kast supernatanten.
MERK: Bruk lav sentrifugeringshastighet (400 × g) og temperatur (4 °C) for å forhindre cellelyse. Hvis du bruker bovint serumalbumin (BSA) for FACS, vask cellepelleten for å redusere BSA-interferens under HRMS-deteksjon. Resuspender cellene forsiktig i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) og sentrifuge igjen for å pelletsskyllede celler. Fjern den supernatante PBS-væsken. - Frys de isolerte cellene raskt ved å plassere hetteglasset med prøven på tørris eller flytende nitrogen.
MERK: Hold prøvene (vev eller celler) avkjølt (f.eks. på is) under behandlingstrinn. Frys cellene med så lite media rundt prøven som mulig for å lette nedstrøms behandling. - Oppbevar prøvene ved −80 °C inntil HRMS-analyse.
- Overfør de injiserte embryoene til 0,5x SS i en petriskål og dyrk dem mellom 14-25 °C til ønsket utviklingsstadium er nådd.
4. Analyser proteinene ved massespektrometri
Proteomisk karakterisering av isolert vev eller celler er basert på en rekke etablerte trinn i HRMS. Figur 2 illustrerer trinnene i den bioanalytiske arbeidsflyten. Prøveinnsamlingsprotokollen som brukes her, er kompatibel med arbeidsflyter nedenfra og opp11, midt-ned25 eller ovenfra og ned26 arbeidsflyter for proteomikk. I det følgende beskrives bottom-up-strategien som ble brukt i denne studien, som har vist seg å være sensitiv, kvantitativ og tilpasningsdyktig til ulike typer massespektrometre. Etter ekstrahering og enzymatisk fordøying av proteiner, separeres de resulterende peptidene, etterfulgt av HRMS-analyse.
- Behandle vev / enkeltceller
- For encelleanalyse ved CE, varm prøven til 60 °C i ~15 minutter til denaturproteiner, og øk deretter prøven til romtemperatur (RT, ~5 min)18,21.
MERK: I motsetning til under arbeid med vev, hoppes reduksjons- og alkyleringstrinnene over for å begrense proteintap under prøvepreparering fra enkeltceller. Filterstøttet prøvepreparering (FASP) 27,28, andre enkeltpottestrategier 29 og mikrofluidiske tilnærminger30 kan tas i bruk for å minimere proteintap under prøvepreparering. - For analyse av nanoLC, lyse opptil 5 dissekerte vev i 50 μL lysisbuffer (~ 100 μg totalt protein). Forenkle prosessen ved å pipetere prøven opp og ned noen ganger.
- Inkuber lysatet ved 4 °C i 10 minutter, og pellet deretter cellerester og eggeplommeplater ved sentrifugering ved 4 500 × g ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent mikrosentrifugehetteglass og tilsett 10 % SDS for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 % SDS i lysatet (v/v).
- For vev, følg trinn 4.1.5-4.1.7.
- Tilsett 0,5 M dithiothreitol til lysatet for å oppnå en endelig konsentrasjon på ~25 mM (f.eks. 2,5 μL på 0,5 M dithiothretol til 50 μL lysat) og inkuber lysatet i 30 minutter ved 60 °C for kjemisk å redusere disulfidbindinger i proteiner.
- Tilsett 0,5 M jodoacetamid for å oppnå en endelig konsentrasjon på ~75 mM i lysatet og inkuber blandingen i 15 minutter ved RT i mørket (figur 2).
- Tilsett 0,5 M dithiothreitol, samme som det opprinnelige volumet (f.eks. 2,5 μL 0,5 M dithiothretol til 50 μL lysat) for å slukke reaktanter som gjenstår fra alkyleringsreaksjonen.
FORSIKTIG: Jodoacetamid og dithiothreitol kan forårsake alvorlig hud- og øyeskade ved direkte eksponering. Bruk egnet PPE ved håndtering av disse kjemikaliene. - Rens proteiner via utfelling. Kloroform-metanolbasert nedbør fungerer godt31. Denne protokollen kan også tilpasses andre typer nedbørsmetoder32.
MERK: For enkeltcelleanalyse, der proteintap er bekymringsfullt, hopp over nedbørstrinnet for CE-HRMS. - Tørk proteinutfellingen i en vakuumkonsentrator (4-37 °C), og resuspender deretter det ekstraherte proteomet i 50 μL 50 mM ammoniumbikarbonat. Beregn proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en totalproteinkolorimetrisk analyse for å bestemme mengden enzym som kreves for fordøyelsen (f.eks. Bicinchoninsyreproteinanalyse).
- Fordøy proteinene til peptider. Tilsett trypsin (1 μg / μL-lager) for å oppnå et protease: proteinforhold på 1:50 og inkuber blandingen ved 37 ° C i opptil 5 timer for enkeltcelleprøver og opptil 14 timer for vevsprøver. Se leverandørspesifikke anbefalinger for reaksjonen.
MERK: Fordøyelse med trypsin i mer enn 14 timer eller høyere konsentrasjoner kan introdusere spaltninger som ikke er spesifikke for proteinets sekvens, og dermed utfordre proteinidentifikasjoner33. - Kvantifiser den totale peptidkonsentrasjonen ved hjelp av en kolorimetrisk analyse.
- VALGFRITT: For multipleksing kvantifisering, merk peptidene fra hver prøve med en annen isobarisk massekode etter leverandørspesifikke instruksjoner. Bland de strekkodede peptidene i like store mengder per peptidprøve.
MERK: Sørg for nøyaktig merking og blanding for å unngå kvantitative skjevheter. For mengdebegrensede prøver eller enkeltcelleprøver kan en TMT-basert bærerkanal sammensatt av samlede vev/celler inkluderes for å minimere prøvetap under påfølgende separasjonstrinn og for å øke følsomheten til lavere rikelige proteiner34. - VALGFRITT: Desaltpeptider for å fjerne salter og forurensninger (f.eks. uomsatte isobariske massemerkereagenser) på en C18 reversfase-spinnkolonne / spiss for å beskytte LC-MS-systemet.
- VALGFRITT: Fraksjoner (f.eks. reversert fasefraksjonering med middels eller høy pH) peptidblandingen for dypere deteksjon av proteomet via manuelle eller automatiske plattformer. Bruk C18 stasjonær fase som inneholder tips for å fraksjonere lave mengder (1-10 μg) peptidfordøyelser.
- Tørk peptidblandingen ved 60 °C i en vakuumkonsentrator.
- Oppbevar peptidblandingen ved -80 °C inntil måling.
- For encelleanalyse ved CE, varm prøven til 60 °C i ~15 minutter til denaturproteiner, og øk deretter prøven til romtemperatur (RT, ~5 min)18,21.
- Separat peptidene
MERK: Etter ekstrahering og enzymatisk fordøying av proteiner, separeres de resulterende peptidene av nanoLC eller CE og ioniseres av ESI for sekvensering ved tandem HRMS. Omvendt fase nanoLC-separasjon er ideell for peptider som samler ~ 150 ng til ~ 1 μg per analyse. CE gir komplementær følsomhet for peptider fra femtogrammer til <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 og brukes i økende grad til enkeltcelleanalyse18,36,37.- For å skille ved hjelp av CE, følg trinn 4.2.2-4.2.7.
MERK: I det følgende beskrives bruken av den spesialbygde CE-plattformen for måling av peptidene. Protokoller for å bygge og bruke dette CE-instrumentet ble gitt tidligere38, sammen med et visualisert eksperiment på bruk for små molekyler20. Alternativt kan disse målingene utføres på et kommersielt CE-system, for eksempel AB SCIEX CESI, Agilent 7100 eller tilsvarende. - Rekonstituer proteinfordøyelsen i 1-2 μL av prøveløsningsmidlet, virvel for å blande prøven, og sentrifuge den ved 10.000 x g i 2 minutter til pelletscelleavfall.
MERK: Fjerning av celleavfallet minimerer sannsynligheten for tilstopping av CE-kapillæren, og forlenger dermed levetiden til separasjonssystemet og øker målegjennomstrømningen. - Initialiser CE-ESI-instrumentet ved å skylle CE-kapillæren med BGE.
- Validere instrumentell ytelse ved hjelp av en kjent standard (f.eks. cytokrom C eller BSA-fordøyelse, angiotensinpeptider).
MERK: Evaluering av instrumentet med hensyn til massenøyaktighet, deteksjonsfølsomhet, reproduserbarhet og lineært dynamisk kvantifiseringsområde anbefales før måling av dyrebare prøver. Ytterligere merknader om validering og feilsøking av CE-ESI-MS-ytelse er oppført andre steder:18,20,38. - Injiser ~1-10 nL av prøven i CE-separasjonskapillæren.
MERK: Denne studien bruker ~ 1 m lang smeltet silikakapillær (40/110 μm indre / ytre diameter) med det elektrokinetisk pumpede kappestrømningsoppsettet. Kommersielle CE-instrumenter krever vanligvis presentasjon av 5-10 μL prøve i et mikrohetteglass for injeksjon. Den spesialbygde CE-plattformen18,38 er kompatibel med ~250 nL til 1 μL prøve avsatt i et prøvelastende mikrovial. - Overfør innløpsenden av CE-separasjonskapillæren til BGE.
- Start elektroforetisk separasjon ved gradvis å øke CE-separasjonsspenningen fra jordgrunnen (f.eks. trinnvis over 1 min). Potensialer på 20-28 kV med strøm under ~10 μA sikrer stabil og reproduserbar instrumentell ytelse for analyse.
- For å skille ved hjelp av nanoLC, følg trinn 4.2.9-4.2.12.
- Resuspender peptidprøven i mobil fase A. Konsentrasjonen av prøven og dens injeksjonsvolum avhenger av tilgjengelig LC-system og kolonne. I denne studien injiseres ~250 ng-1 μg proteinfordøyelse i 1-20 μL prøvevolum på en C18-pakket sengkolonne (75 μm indre diameter, 2 μm partikkelstørrelse med 100 Å porer, 25 cm lengde separasjonskolonne).
- Overfør prøven til et LC-hetteglass.
MERK: Kontroller at det ikke er luftbobler i hetteglasset, da dette kan skade analysekolonnen. Hetteglass med innlegg kan brukes til vevs- eller encelleprøver med lavt volum. - Legg ~200 ng til 2 μg peptidprøve på C18 analytisk kolonne.
MERK: Eventuelt kan peptidene lastes på en fellekolonne for avsalting før analytisk separasjon. For eksempel en C18 fellesøyle med 0,1 mm indre diameter, 5 μm partikkelstørrelse, 100 Å porestørrelse, 20 mm lengde. Desaltpeptider med 100 % buffer A ved en strømningshastighet på 5 μL/min i 5 minutter før separasjonsgradienten begynner. - Separer peptidene ved hjelp av gradienteluering. Ved en strømningshastighet på 300 nL/min er gradienten på 120 minutter brukt i denne studien som følger: 0-5 min 2 % B, 5-85 min 2-35 % B, 86-90 min 70 % B, 91-120 min 2 % B.
- For å skille ved hjelp av CE, følg trinn 4.2.2-4.2.7.
- Ioniser peptidene ved ESI
MERK: CE- eller nanoLC-kapillæren er vanligvis koblet til en ESI-kilde for ionisering. Mikrostrømning (stump spiss) og nanostrømning (konisk spiss39 og elektrokinetisk pumpet kappe-flow36 design) CE-ESI-grensesnitt for ultrasensitiv deteksjon har blitt utviklet tidligere.- Tilfør separasjonspeptidene til en elektrosprayionkilde for ionisering ved hjelp av et kommersielt eller spesialbygd ESI-grensesnitt. For enkeltcelle CE-ESI-MS-analyse i Xenopus-embryoer , bruk et elektrokinetisk pumpet lavstrømningsgrensesnitt hvor CE-kapillærutløpet er innelukket i en trukket borosilikatemitter.
- Kontroller væskestrømmen gjennom elektrosprayemitteren ved hjelp av et kamera og inspiser oppsettet visuelt for mulige lekkasjer.
- Sett elektrosprayspenningen til ~ 2,5 kV for å starte ESI-kilden (vs. jordjord).
- Sørg for en stabil nanospray for HRMS-analyse ved å overvåke den totale ionstrømmen. Juster elektrosprayspenningen og avstanden til emitteren til HRMS-innløpet for å oppnå en stabil spray (<15% relativt standardavvik i total intensitet).
- Oppdag peptidene
MERK: Deteksjon av peptider følger forskjellige instrumentelle hensyn for isobariske massemerkede og umerkede peptider og avhenger av typen tilgjengelig massespektrometer. Denne studien bruker et orbitrap tribrid massespektrometer i henhold til følgende trinn.- Skaff MS1-hendelser med innstillingene: Analysator, orbitrap; Spektral oppløsning, 120 000 full bredde ved halv maksimum (FWHM); maksimal injeksjonstid (IT), 50 ms; automatisk forsterkningskontroll (AGC), 4 x 105 teller; mikroskanninger, 1.
- For å sekvensere peptider, fragmentforløperioner for deteksjon i ionefelleanalysatoren ved hjelp av innstillingene: fragmenteringsmodus, høyere energikollisjonsdissosiasjon (HCD); kollisjonsgass, nitrogen; kollisjonsenergi, 32% normalisert kollisjonsenergi (NCE); maksimal IT, 70 ms; AGC, 1 x 104 teller; mikroskanninger, 1.
- VALGFRITT: Kvantifiser TMT-merkede peptider ved hjelp av tandem/flertrinns HRMS (MS2/MS3). For MS3 som bruker synkron forløpervalg, er de typiske instrumentelle innstillingene som følger. Etttrinns (MS1) skanninger som kartlegger de mest tallrike ionene, dissosieres via dataavhengig innsamling ved hjelp av parametrene: MS 2-fragmenteringsmodus, kollisjonsindusert dissosiasjon (CID); kollisjonsgass, helium; kollisjonsenergi, 35% NCE; analysator for fragmentioner, ionfelle følgende innstillinger: maksimal IT, 50 ms; AGC, 5 x 104 teller; mikroskanninger, 1. Velg 10 MS2 fragmentioner og fragmenter dem med HCD i nitrogen (65% NCE). Oppdag MS 3-fragmentioner ved hjelp av følgende innstillinger: Orbitrap-oppløsning 15 000 FWHM, maksimal IT, 120 ms; AGC, 1 × 105 teller; mikroskanninger, 1.
MERK: Ulike MS-innsamlingsmetoder og parametere kan brukes for merkede prøver etter leverandøranbefalinger som beskrevet andre steder11,40.
- Analysere dataene
MERK: Proteiner identifiseres og kvantifiseres ved hjelp av avanserte bioinformatiske pakker. Identifikasjonstroheten beregnes ved hjelp av en lokkedatabase, uttrykt som falsk oppdagelsesrate (FDR) på nivået av peptider og proteiner.- Behandle dataene ved hjelp av kommersielle programvarepakker eller programvarepakker med åpen kildekode (gjennomgått i referanse41). Match rådataene mot en database som ble utarbeidet ved å sammenkoble Xenopus-proteomet 9.2 med den mRNA-avledede PHROG-databasen42.
MERK: Søkeparametrene er: fordøyelsesenzym, trypsin; savnet spaltninger, opptil 2; variabel modifikasjon, metionin oksidasjon; statisk modifikasjon, cysteinkarbamidometylering; forløper massetoleranse, 10 ppm; fragment masse toleranse, 0, 6 Da; minimum peptid lengde, 5; identifikasjonstroskap, <1% FDR for peptider og proteiner. Uten alkylering til peptider utelukkes karbamidometylering som statisk modifikasjon under databasesøk (f.eks. for encelleanalyse). - Kvantifiser proteinmengder via etikettfrie43 eller etikettbaserte strategier44,45.
- VALGFRITT: Annoter proteiner for genontologi. PantherDB46, Reactome47 eller Xenbase23 kan brukes.
- VALGFRITT: Kvantifiser proteinmengde og forskjeller i proteinmengder på tvers av celle / vevstyper ved hjelp av programvarepakker / webverktøy, for eksempel Trans-Proteomic Pipeline48, Perseus49 og Orange50.
MERK: Ytterligere hensyn til eksperimentell design og programvarealternativer ble gjennomgått andre steder41,51. - VALGFRITT: Evaluere resultatene videre ved hjelp av kunnskapsbaser, for eksempel STRING52 og BioPlex Display 53 for kjente protein-protein-interaksjoner og PhosphoSiteplus54 for fosforyleringer. For å analysere motiver og domener som er representert i proteomet, bruk webverktøy som Simple Modular Architecture Research (SMART)55.
- Behandle dataene ved hjelp av kommersielle programvarepakker eller programvarepakker med åpen kildekode (gjennomgått i referanse41). Match rådataene mot en database som ble utarbeidet ved å sammenkoble Xenopus-proteomet 9.2 med den mRNA-avledede PHROG-databasen42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen muliggjorde studiet av proteiner i enkeltceller og deres linjer når de etablerer vev i X. laevis-embryoer. Figur 1 illustrerer en slik anvendelse av tilnærmingen til å studere proteiner i nevralvevsceller og den nyinduserte nevrale ektodermen i embryoet. Som vist i figur 1A, integrerte den bioanalytiske arbeidsflyten tradisjonelle verktøy for celle- og utviklingsbiologi for å identifisere, injisere / aspirere celler og samle prøver. Figur 1B viser mikrosondeprøvetaking av venstre dorsal-dyr (D11) celle i 16-celleembryoet in vivo ved hjelp av en mikroinjektor; Etter forsøket ble embryoer vellykket utviklet til rumpetroll med normal anatomi56. Store embryonale celler (~ 100-250 μm i diameter) bidro også til manuell mikrodisseksjon. Disseksjon av en høyre dorsal-dyr midtlinje (D11) celle er illustrert fra 16-celleembryoet i figur 1C. Oppsettet tillot også sporing av en klonal bane ved å injisere et fluorescerende sporstoff i den identifiserte forløperen. Som vist i figur 1D, tillot tilnærmingen å isolere kloner som oppstår fra venstre og høyre D111-celler via vevsdisseksjon eller ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Prøveinnsamlingsstrategiene beskrevet her er tilstrekkelig skalerbare i rom og tid til å studere embryonal utvikling i nye detaljer.
Den bioanalytiske arbeidsflyten integrerte HRMS-teknologier for å forbedre sensitivitet og kvantifisering (figur 2). De innsamlede proteinene ble målt via en bottom-up proteomisk tilnærming. Valgfri fraksjonering av prøver basert på ortogonal kjemi (f.eks. høy pH og deretter lav pH reversert fase LC) hjalp deteksjonsfølsomheten. For å skille peptider ble CE valgt for spormengder av prøver (<< ~ 100 ng)) og nanoLC for begrensede mengder materialer (>>150 ng). Peptider ble sekvensert ved hjelp av ESI-HRMS. De påviste proteinene ble kvantifisert ved hjelp av etikettfrie og etikettbaserte strategier. Forenkling av prøvebehandling for enkeltcelleanalyse, for eksempel eliminering av de typiske trinnene for reduksjon og alkylering etterfulgt av CE-analyse, forenklet identifiseringen av ~ 400-800 forskjellige proteiner. Blant de rapporterte proteinene var mange med viktige funksjonelle roller, som chaperoninholdig TCP1-underenhet 3 (Cct3), spenningsavhengig ionekanal (Vdac2) og kreatinkinasehjerne (Ckb). Multivariate og statistiske datamodeller hjalp oss10,57 og andre 9,58 med å finne tidligere ukjente forskjeller i den proteomiske sammensetningen av utvalgte celler og vev ved hjelp av tilnærmingene som er oppsummert i denne protokollen. Spesielt krevde disse HRMS-målingene ingen fungerende sonder eller kunnskap om sammensetningen av prøvene på forhånd, noe som støtter funn.
I en serie studier ble den proteomiske tilstanden til identifiserte celler i utvikling av embryoer av X. laevis (fig 3) kvantifisert21. Figur 3A viser påvisning av gentranslasjonsforskjeller mellom D11-celler som ble dissekert fra forskjellige embryoer10. Mikrosampling CE-ESI-HRMS tillot oss å identifisere og kvantifisere opptil ~ 700 proteiner fra enkeltceller21. De representative primære HRMS-MS/MS-dataene for identifisering av ~400 kumulative proteiner fra tekniske dupliserte målinger på en D11-celle i embryoet ble deponert til PRIDE. Tilnærmingen var skalerbar til mindre celler og embryoer fra andre modellorganismer, for eksempel sebrafisk21. Skalerbarhet til mindre cellestørrelser tillot oss å utforske den spatiotemporale reorganiseringen av D11-avkommet fra et levende embryo som det utviklet seg i tide. Figur 3B viser bruken av denne protokollen til å utføre subcellulær kvantitativ proteomikk av identifiserte celler i 16-, 32-, 64- og 128-celleembryoene. Proteiner ble delt inn i fire grupper som viste forskjellige overflodsprofiler over klonal utvikling21.
Figur 3: Protokollskalerbarhet fra det subcellulære rommet til klonalt vev i X. laevis embryo. (A) Måling av proteomiske forskjeller mellom identifiserte hele D11-celler, som avslører celle-celle heterogenitet. Gennavn vist for utvalgte proteiner. (B) Reorganisering av det cellulære proteomet i den utviklende D11-celleklonen. Fuzzy C-means cluster analysis (GProx) av proteindynamikk, gruppering av proteiner basert på lignende uttrykksmønstre. Grå tall viser antall forskjellige proteiner som ble kvantifisert i hver klynge. Tallene ble tilpasset med tillatelse fra referansene21,57. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Denne protokollen tillot oss å utføre romlig og temporal proteomikk i identifiserte, utviklende cellekloner (figur 4). Figur 4A viser anvendelsen av tilnærmingen for merking og isolering av cellekloner som utgjør to vev med viktige roller i nevralvevsutvikling og mønster av embryoet. Flertallet av Spemann-arrangøren (SO) ble sporet ved å merke venstre og høyre D 112 og D212 celler via injeksjon av fluorescerende dextran. Parallelt ble de nærliggende dorsaldyrcellene (D111) merket for å markere flertallet av nevrale ektoderm (NE). Vevene ble dissekert, og deres proteininnhold ble analysert etter denne protokollen. nanoLC-ESI-HRMS returnerte opptil 2000 forskjellige proteiner fra vevet, inkludert signalering, som Wnt-, Fgf- og Tgfβ-banene. De representative primære HRMS-MS / MS-dataene om identifisering av ~ 1,800 kumulative proteiner fra tekniske dupliserte målinger på et basseng av dissekerte SO-vev ble deponert til PRIDE. Wnt-baneliganden Wnt10a og Wntless (Wls), et membranprotein dedikert til sekresjonen av Wnt-ligander, ble bare påvist i NE-proteomet. Wnt-banen ble funnet undertrykt i SO og kan forklare mangel på Wnt-interagerende proteiner oppdaget i SO. Disse resultatene viser anvendeligheten av denne protokollen for å studere avstamningsspesifikke forskjeller i embryoet.
Figur 4: Eksempel på dataanalyse fra romlig vevsproteomikk i X. laevis-embryoene . (A) Differensiell merking av Spemann's Organizer (SO) og nevrale ektoderm (NE) vev ved injeksjon av fluorescerende protein mRNA i forgjengeren D 112 og D212 i henholdsvis 32-celleembryoet. (B) Topp 5 overrepresenterte biologiske prosesser i SO (rød) og NE (grønn) proteom som viser påviselige forskjeller. Pathway overrepresentasjonsanalyse viser biologiske prosesser ved hjelp av Bonferroni-korreksjon. (C) Proteindomeneberikelsesanalyse (SMART), som avslører anrikning av DNA- og RNA-bindende motivholdige proteiner i SO. (D) STRING-analyse som forutsier kanoniske protein-protein-interaksjoner basert på det oppdagede SO-proteomet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
De ulike proteomiske dataene tjener som verdifull informasjon for vurdering av funksjon. De proteomiske dataene kan evalueres ved hjelp av kanoniske kunnskapsbaser. Som vist i figur 4B viste baneanalyse av dysregulerte proteiner overrepresentert oversettelse og energimetabolisme i både SO- og NE-datasettene i våre nyere studier. NØ-proteomet ble anriket i proteiner assosiert med kjernefysisk transport av proteinlast i cellen, noe som sannsynligvis indikerer nedstrømshendelser etter signalering i den nyetablerte NE (figur 4C). Anrikningsanalysen i figur 4D fant oppregulering i translasjonsinitiering, RNA-binding, binding i proteasomkomplekset, noe som tyder på en rolle for dynamisk proteinomsetning som utvikler SO. Cellelinjestyrt HRMS-proteomikk er skalerbar i rom og tid og tilstrekkelig følsom til å bedre forstå molekylær organisering av celler under normal og nedsatt utvikling.
Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen muliggjør karakterisering av proteinuttrykk i identifiserte cellelinjer i embryoer av Xenopus-arten. Metodikken stammer fra HRMS, og kombinerer utsøkt spesifisitet i molekylær identifikasjon, evne til multiproteindeteksjon uten molekylære prober (vanligvis hundrevis til tusenvis av forskjellige proteiner) og en evne til kvantifisering. Tilpasningsevne til klassiske verktøy og arbeidsflyter i celle- og utviklingsbiologi (nevro) utvider HRMS-proteomikk til spennende applikasjoner, inkludert helhetlig karakterisering av stamcelledifferensiering i virveldyret X. laevis-embryoet.
Trinnene beskriver cellelinjestyrt proteomikk i X. laevis-embryoet. Som eksempler demonstrerer vi analysen av nevrale enkeltceller og deres linjer og gir de tilsvarende CE- og nanoLC HRMS-datasettene gjennom et offentlig datalager (se PRIDE). Denne tilnærmingen er lett tilpasningsdyktig til studier på spatiotemporal regulering av proteiner i flere celletyper (og linjer). Spatiotemporalt styrt proteomikk i det utviklende embryoet kan også utvides til transkriptomiske og metabolomiske studier for å fremme molekylærsystembiologiens forståelse av celledifferensiering og utvikling av nøkkelorganer, som nervesystemet.
Denne protokollen gir nye dimensjoner til bioanalysen. Cellekulturer, som induserte pluripotente stamceller (iPSCs)1,2, letter målingen av temporal proteomdynamikk under celledifferensiering. Tilnærmingen som er beskrevet i denne studien, ser på celleskjebneinduksjon i det 3-dimensjonale levende embryoet, hvor komplekse morfogengradienter, parallelle signalveier og konvergente forlengelsesprosesser samarbeider for å få til vevsinduksjon og morfogenese. Å studere proteomdynamikk i sammenheng med et embryo kan gi informasjon om parallelle mekanismer som styrer celledifferensiering, en spennende retning for å utdype forståelsen av differensiering og utvikling.
Tilnærmingen beskrevet her låner de eksperimentelle fordelene med Xenopus-arten til dette formålet, X. laevis spesielt. Hver celle i det tidlige 16- og 32- celle X. laevis-embryoet er kartlagt til reproduserbare vevsskjebner i den voksne organismen, i hovedsak en romlig projeksjon av celler i spaltningsstadiet embryoer. Reproduserbarhet for cellestyrt proteomikk bygger på nøyaktig celletyping. Vi hjelper suksess ved å credentialing embryoer for stereotyp pigmentering og spaltning før vi går videre til eksperimenter som beskriver celledisseksjon og avstamningssporing16,20. Det er viktig å merke seg at celler i spaltningsstadiumembryoer ofte bidrar til dannelsen av forskjellige vevstyper i forskjellige grader; detaljer om deres nivåbidrag til hver vevstype er tilgjengelig på Xenbase23. Det embryonale stadium og forløperceller som skal spores, bør derfor velges ut fra det biologiske spørsmålet. Ved dyrking av embryoer over lengre tidsperioder (f.eks. >1 d), bør man være forsiktig med å fjerne skadede/døde embryoer, noe som igjen kan redusere levedyktigheten for de andre embryoene i populasjonen.
For vellykket HRMS-proteomikk bør det tas nøye hensyn til det analytiske grunnlaget for celle-/vevsoppsamling, proteinekstraksjon og HRMS-måling. Fordi Xenopus-embryoer dyrkes i medier som inneholder høye konsentrasjoner av ikke-flyktige salter som er kjent for å redusere HRMS-følsomheten, anbefales det å redusere aspirerte medier ved innsamling av celler og vev for proteomiske studier. Det er en god praksis å utforske avsalting for å fremme identifisering og kvantifisering av proteinene. Før HRMS-måling bør den analytiske ytelsen til CE- og LC-ESI-HRMS-instrumentene evalueres, inkludert separasjon, ionisering, reproduserbarhet og lineært dynamisk kvantifiseringsområde. Med gode analytiske beregninger bidrar denne protokollen til å redusere dyrebruk i biologisk forskning, hjelper følsomhet for å skaffe kraftigere sett med biokjemiske data, og forbedrer kraften til statistisk dataanalyse for å tolke resultater. Som standard analyserer vi hver biologisk replikat i minst 3 tekniske replikater ved hjelp av CE eller LC-HRMS, som brukes til å evaluere teknisk reproduserbarhet og utdype dekningen av det detekterbare proteomet. Kraftanalyse hjelper estimering av statistisk styrke og utforming av den biologiske replikasjonsstørrelsen. Bruk av forskjellige sett med foreldrefrosker anbefales å ta hensyn til naturlig forekommende biologisk variasjon blant embryoer.
UTFYLLENDE INFORMASJON
HRMS-MS/MS-proteomikkdataene og relaterte behandlingsfiler ble deponert til ProteomeExchange Consortium via PRIDE60-partnerlageret med datasettidentifikatoren PXD030059.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Jie Li (University of Maryland, College Park) for verdifulle diskusjoner om embryonal dissosiasjon og FACS. Vi takker Vi M. Quach og Camille Lombard-Banek for hjelp med prøvepreparering og datainnsamling i tidligere studier som eksemplifiserer de proteomiske applikasjonene som er fremhevet i denne protokollen. Deler av dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation under tildelingsnummer IOS-1832968 KARRIERE (til P.N.), National Institutes of Health under prisnummer R35GM124755 (til P.N.), University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (til P.N.), og COSMOS Club Foundation forskningspriser (til ABB og LRP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
References
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560 (2021).
- Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
- Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2000).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. Vleminckx, K. 1865, Humana Press Inc. NY. 175-194 (2018).
- Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
- Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
- Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P. Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. 628, 263-292 (2019).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11 (2016).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956 (2017).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Developmental Biology. 120 (1), 299-304 (1987).
- Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
- Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
- Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
- Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
- Wisniewski, J. R. Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. Becher, D. 1841, Humana Press Inc. NY. 3-10 (2018).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882 (2018).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
- Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
- Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161 (2018).
- Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
- Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21 (2019).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
- Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
- Pino, L. K., Rose, J., O'Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
- Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25 (2020).
- Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
- Schmidt, E., et al. On the Move Federated Workshops. , Springer, Verlag. Berlin. 710-719 (2006).
- Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
- Jensen, L. J., et al. STRING 8 - a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
- Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
- Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
- Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
- Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
- Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
- Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
