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Chemistry

विकासशील (मेंढक) भ्रूण में सेल-वंश निर्देशित मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63586
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, 2Department of Anatomy & Cell Biology, The George Washington University

Summary

यहां हम कशेरुक जेनोपस लेविस भ्रूण में ज्ञात ऊतक भाग्य के साथ सेल वंश के मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन का वर्णन करते हैं।

Abstract

आणविक घटनाओं का लक्षण वर्णन क्योंकि कोशिकाएं ऊतकों और अंगों को जन्म देती हैं, सामान्य विकास को बेहतर ढंग से समझने और रोगों के लिए कुशल उपचार डिजाइन करने की क्षमता बढ़ाती हैं। विभिन्न प्रकारों और बड़ी संख्या में प्रोटीन की सटीक पहचान और परिमाणीकरण को सक्षम करने वाली प्रौद्योगिकियां अंतरिक्ष और समय में ऊतक और जीव विकास को व्यवस्थित करने वाले आणविक तंत्र पर अभी भी लापता जानकारी प्रदान करेंगी। यहां, हम एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो जेनोपस लेविस (मेंढक) भ्रूण में पहचाने गए सेल वंश में हजारों प्रोटीन के माप को सक्षम बनाता है। दृष्टिकोण प्रजनन योग्य सेल-भाग्य मानचित्रों और कशेरुक विकास के इस मॉडल से कोशिकाओं और उनकी संतान (क्लोन) की पहचान, फ्लोरोसेंटली लेबल, ट्रैक और नमूना करने के लिए स्थापित तरीकों पर आधारित है। माइक्रोसैंपलिंग का उपयोग करके सेलुलर सामग्री एकत्र करने या विच्छेदन या प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा कोशिकाओं को अलग करने के बाद, प्रोटीन को निकाला जाता है और नीचे-ऊपर प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए संसाधित किया जाता है। तरल क्रोमैटोग्राफी और केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचआरएमएस) के साथ प्रोटीन का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए स्केलेबल पृथक्करण प्रदान करने के लिए किया जाता है। तंत्रिका-ऊतक वसा कोशिकाओं के प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन के लिए प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान किए जाते हैं। सेल-वंश-निर्देशित एचआरएमएस प्रोटिओमिक्स विभिन्न ऊतकों और जीवों के लिए अनुकूलनीय है। कशेरुक विकास के दौरान प्रोटिओम की स्थानिक-अस्थायी गतिशीलता में देखने के लिए यह पर्याप्त रूप से संवेदनशील, विशिष्ट और मात्रात्मक है।

Introduction

सेल भेदभाव और ऊतकों और अंगों की उत्पत्ति की हमारी समझ जीन और उनके उत्पादों की विस्तृत लक्षित स्क्रीन के दशकों का परिणाम है। महत्वपूर्ण सेलुलर घटनाओं के दौरान सभी बायोमोलेक्यूल्स और उनकी मात्रा के बारे में हमारे ज्ञान को बढ़ाने से आणविक तंत्र को उजागर करने में मदद मिलेगी जो कशेरुक शरीर योजना के स्थानिक और लौकिक पैटर्निंग को नियंत्रित करते हैं। आणविक प्रवर्धन और अनुक्रमण को सक्षम करने वाली प्रौद्योगिकियां अब बड़ी संख्या में जीन और प्रतिलेख पर नियमित रूप से रिपोर्ट करने में सक्षम हैं, जो बुनियादी जैविक और अनुवाद अनुसंधान में परिकल्पना-संचालित अध्ययनों का समर्थन करती हैं। विकासशील प्रणालियों को समझने के लिए, प्रतिलेखन और अनुवाद के बीच एक जटिल संबंध कई प्रोटीनों और उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के प्रत्यक्ष विश्लेषण की वकालत करता है। इन विट्रो जैविक प्रणालियों का उपयोग करके वैश्विक प्रोटिओमिक्स, जैसे कि प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल, ऊतक प्रेरण 1,2 के तंत्र को चित्रित करना शुरू कर दिया। जटिल जीवों में, जैसे कशेरुक भ्रूण, विकास अंतरिक्ष और समय 3 के संदर्भ में मोर्फोजेन ग्रेडिएंट पर निर्भर करताहै। यह इस प्रकार है कि प्रोटिओमिक परिवर्तनों का ज्ञान प्राप्त करना क्योंकि कोशिकाएं विशेष ऊतकों, जैसे तंत्रिका ऊतकों को बनाने के लिए अंतर करती हैं, सामान्य और दोषपूर्ण विकास को नियंत्रित करने वाले आणविक कार्यक्रमों को अनलॉक करने और अगली पीढ़ी के चिकित्सीय मार्गदर्शन के लिए एक कुंजी प्रदान करती हैं।

कशेरुक दक्षिण अफ्रीकी पंजे वाला मेंढक (जेनोपस लेविस) सेल और विकासात्मक, न्यूरो-और पुनर्योजी जीव विज्ञान में एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है। दैहिक नाभिक की प्लूरिपोटेंसी की खोज के लिए सर जॉन गुरडन के 2012 के फिजियोलॉजी या मेडिसिन 4,5 में नोबेल पुरस्कार ने बुनियादी और ट्रांसलेशनल अध्ययनों में खोजों के लिए इस मॉडल के महत्व पर प्रकाश डाला। जेनोपस भ्रूण मां के लिए बाहरी रूप से विकसित होते हैं, इस प्रकार विकास के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं, सेल क्लोन और जीन अभिव्यक्ति के प्रत्यक्ष हेरफेर की सुविधा प्रदान करते हैं। विषम रंजकता और रूढ़िवादी कोशिका विभाजन ने 16-6 और 32-सेल 7,8 चरण भ्रूण से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य भाग्यमानचित्रों के चार्टिंग को सक्षम किया। उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचआरएमएस) आधारित प्रोटिओमिक्स के लिए, मॉडल के अतिरिक्त लाभों में अपेक्षाकृत बड़ा आकार (~ 1 मिमी व्यास) शामिल है, जो विश्लेषण के लिए प्रचुर मात्रा में प्रोटीन सामग्री पैदा करता है (प्रारंभिक दरार-चरण भ्रूण में ~ 130 μg, 16-सेल भ्रूण की एकल कोशिकाओं में ~ 10 μg प्रोटीन सामग्री)9,10।

वर्तमान में, एचआरएमएस प्रोटीन का पता लगाने के लिए पसंद की अग्रणी तकनीक है। यह तकनीक कई, आमतौर पर सैकड़ों से हजारों विभिन्न प्रोटीनों का प्रत्यक्ष, संवेदनशील और विशिष्ट पता लगाने और परिमाणीकरण करने में सक्षम बनातीहै। एचआरएमएस द्वारा बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स में परस्पर जुड़े चरणों की एक श्रृंखला शामिल है। ऊतक के नमूने से निष्कर्षण के बाद, प्रोटीन को प्रोटियोलिटिक एंजाइम के साथ पचाया जाता है, जैसे ट्रिप्सिन (बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स)। परिणामी पेप्टाइड्स को उनके विभिन्न भौतिक रासायनिक गुणों के आधार पर अलग किया जाता है, जिसमें हाइड्रोफोबिसिटी (उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी, एलसी), नेट चार्ज (आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी), आकार (आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी), या इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता (केशिका वैद्युतकणसंचलन, सीई) शामिल हैं। पेप्टाइड्स को तब चार्ज (आयनित) किया जाता है, आमतौर पर इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) का उपयोग करके, और पेप्टाइड आयनों का पता लगाया जाता है और अग्रानुक्रम एचआरएमएस द्वारा गैस-चरण विखंडन के माध्यम से अनुक्रमित किया जाता है। परिणामी पेप्टाइड डेटा का अध्ययन किए जा रहे जीव के प्रोटिओम में मैप किया जाता है। प्रोटीन-विशिष्ट (प्रोटिओटिपिक) पेप्टाइड आयन सिग्नल तीव्रता एकाग्रता के साथ सहसंबंध के साथ, प्रोटीन परिमाणीकरण लेबल-मुक्त या लेबल-आधारित (मल्टीप्लेक्सिंग मात्रा) किया जा सकता है। एचआरएमएस प्रोटिओमिक्स अध्ययन के तहत सिस्टम की आणविक स्थिति पर जानकारी का एक समृद्ध संसाधन उत्पन्न करता है, जिससे परिकल्पनाओं और अनुवर्ती कार्यात्मक अध्ययनों की पीढ़ी की अनुमति मिलती है।

Figure 1
चित्रा 1: विकासशील (मेंढक) भ्रूण में सेल-वंश निर्देशित एचआरएमएस प्रोटिओमिक्स को सक्षम करने वाले स्थानिक स्केलेबल प्रोटिओमिक्स। (ए) एक पहचान किए गए सेल (इनसेट) के इंजेक्शन के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (2) का उपयोग करके नमूने का विज़ुअलाइज़ेशन, अनुवाद-चरण द्वारा नियंत्रण में एक निर्मित माइक्रोपिपेट (3) का उपयोग करना (4). (बी) 16-सेल भ्रूण में पहचाने गए बाएं डी11 सेल का उपकोशिकीय नमूना। (सी) 16-सेल भ्रूण से पूरे डी 11 सेल का विच्छेदन। (डी) गैस्ट्रुला (चरण10) में तंत्रिका एक्टोडर्म (एनई) के विच्छेदन और एफएसीएस का उपयोग करके टैडपोल से वंशज ऊतक के अलगाव का मार्गदर्शन करने के लिए 32-सेल भ्रूण से बाएं और दाएं डी 111 संतानों का फ्लोरोसेंट (हरा) अनुरेखण। स्केल बार: भ्रूण के लिए 200 μm, शीशी के लिए 1.25 मिमी। आंकड़ेसंदर्भ 15,19,21,59 से अनुमति के साथ अनुकूलित किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एचआरएमएस-आधारित मात्रा में एक्स लेविस भ्रूण विकसित करने में पहचाने गए कोशिकाओं / ऊतकों में प्रोटीन की बड़ी संख्या का परिमाणीकरण करने में सक्षम बनाता है। दृष्टिकोण इस जैविक मॉडल 6,7,8 में सेल वंशावली को ट्रैक करने के लिए सटीक सेल पहचान, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल भाग्य मानचित्र और स्थापित पद्धतियों पर आधारित है। जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, हम पूरे सेल विच्छेदन या केशिका माइक्रोसैंपलिंग को एस्पिरेट सेलुलर सामग्री को नियोजित करके एकल कोशिकाओं से प्रोटिओम का अध्ययन करते हैं। एक कोशिका के वंश की निगरानी हमें प्रोटिओम के स्थानिक विकास का अध्ययन करने की अनुमति देती है क्योंकि कोशिकाएं गैस्ट्रुलेशन के दौरान ऊतक बनाती हैं। सेल संतान को फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, या जीएफपी) के लिए निष्क्रिय डेक्सट्रान या एमआरएनए के संयुग्मित फ्लोरोफोरे को इंजेक्ट करके फ्लोरोसेंट रूप से चिह्नित किया जाता है। लेबल की गई संतान को वांछित विकास समय बिंदुओं पर अलग किया जाता है। गैस्ट्रुलेशन के दौरान, सेल क्लोन जो कसकर क्लस्टर होते हैं, उन्हें विच्छेदन द्वारा अलग किया जा सकता है। गैस्ट्रुलेशन के बाद, सेल क्लोन को प्रवासी आंदोलनों के कारण भ्रूण के भीतर वितरित किया जा सकता है और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) द्वारा अलग ऊतकों से अलग किया जा सकता है। इन कोशिकाओं और ऊतकों में प्रोटीन को पृथक्करण के लिए एचपीएलसी या सीई और पहचान के लिए ईएसआई टेंडम एचआरएमएस का उपयोग करके बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स के माध्यम से मापा जाता है। सेल-वंश-निर्देशित एचआरएमएस प्रोटिओमिक्स भ्रूण के भीतर विभिन्न सेल आकारों और वंशों के लिए स्केलेबल है और विशिष्ट, संवेदनशील और मात्रात्मक है। यहां दिखाए गए चुनिंदा उदाहरणों के माध्यम से, हम इस प्रोटोकॉल को स्केलेबल और व्यापक रूप से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और सेल वंशों के लिए अनुकूलनीय होने का भी प्रदर्शन करते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: जैव-विश्लेषणात्मक वर्कफ़्लो। सूक्ष्म विच्छेदन और केशिका आकांक्षा, या एफएसीएस ने सेलुलर और क्लोनल प्रोटीन सामग्री के नमूने की सुविधा प्रदान की। इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचआरएमएस) का उपयोग करके प्रचुर मात्रा में जर्दी प्रोटीन की कमी और केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) या नैनो-प्रवाह तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) बढ़ी हुई पहचान (आईडी) संवेदनशीलता द्वारा पृथक्करण। परिमाणीकरण ने डिसरेग्यूलेशन का खुलासा किया, जीन ऑन्कोलॉजी (जीओ) से उपलब्ध जानकारी के साथ संयोजन में परिकल्पना-संचालित अध्ययनों के लिए नई जानकारी प्रदान की। आंकड़े संदर्भ15 से अनुमति के साथ अनुकूलित किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

जेनोपस लेविस वयस्क मेंढकों के मानवीय रखरखाव और हैंडलिंग को सुनिश्चित करने वाले सभी प्रोटोकॉल मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (अनुमोदन संख्या आर-डीईसी-17-57 और आर-एफईबी-21-07) द्वारा अनुमोदित किए गए थे।

1. समाधान तैयार करें

  1. भ्रूण विज्ञान के लिए
    1. 1x, 0.5x, और 0.2x स्टाइनबर्ग के समाधान (एसएस) तैयार करें, फिर मानक प्रोटोकॉल 12 का पालन करते हुए बाँझपन के लिए उन्हें (20 मिनट के लिए120 डिग्री सेल्सियस) ऑटोक्लेव करें।
    2. मानक प्रोटोकॉल12 का पालन करते हुए निष्फल 1x SS में 3% (w/v) Ficol तैयार करें।
    3. डिजेलाइजिंग के लिए, ताजा 2% (डब्ल्यू / वी) सिस्टीन समाधान तैयार करें और 10 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान को ड्रॉपवाइज जोड़कर इसके पीएच को 8 में समायोजित करें।
      चेतावनी: सिस्टीन के संपर्क में आने से त्वचा और श्वसन क्षति हो सकती है। सोडियम हाइड्रॉक्साइड एक संक्षारक है जो सीधे संपर्क में आने पर त्वचा और आंखों को गंभीर नुकसान पहुंचा सकता है। इन रसायनों को संभालते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करें, जैसे दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट।
    4. वंश अनुरेखक के लिए, बाँझ विआयनीकृत पानी में फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान का 0.5% (v / v) तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, बाँझ विआयनीकृत पानी (जैसे, जीएफपी) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एमआरएनए के 0.2 μg / μL का समाधान तैयार करें।
    5. कोशिकाओं को अलग करने के लिए, न्यूपोर्ट 2.0 बफर तैयार करें जिसमें 0.1 एम सोडियम आइसथियोनेट, 20 एमएम सोडियम पाइरोफॉस्फेट और 10 एमएम कैप्स हों, फिर इसके पीएच को 10.513 तक लाएं।
      सावधानी: सोडियम पाइरोफॉस्फेट के संपर्क में आने से त्वचा और आंखों में जलन हो सकती है। इन रसायनों को संभालते समय उचित पीपीई का उपयोग करें।
  2. बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स के लिए
    1. सेल लाइसिस बफर को शामिल करने के लिए तैयार करें: 250 एमएम सुक्रोज, 1% नॉनइडेट पी -40 विकल्प (डब्ल्यू / वी), 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 5 एमएम ईडीटीए, 10 एसएम साइटोचलासिन डी, और 10 μM combretastatin 4A। 10% (डब्ल्यू / वी) सोडियम डोडेसिल सल्फेट14,15 का स्टॉक तैयार करें।
      नोट: नैनो-फ्लो एलसी (नैनोएलसी)-एचआरएमएस के दौरान एचईपीईएस संदूषण को कम करने के लिए ट्राइस-एचसीएल को चुना गया था।
      सावधानी: नॉनआइडेट पी -40 विकल्प के संपर्क में आने से त्वचा में जलन हो सकती है। साइटोचलासिन डी टेराटोजेनिक है यदि इसका सेवन किया जाता है और प्रत्यक्ष संपर्क पर कॉम्ब्रिटास्टेटिन तीव्र रूप से विषाक्त होता है। इन रसायनों को संभालते समय उचित पीपीई का उपयोग करें।
    2. सीई द्वारा पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए, निम्नलिखित सॉल्वैंट्स (वी / वी) तैयार करें: नमूना विलायक, 75% एसिटोनिट्राइल (एसीएन) जिसमें पानी में 0.05% एसिटिक एसिड (एसीओएच) होता है; शीथ समाधान, 10% एसीएन जिसमें पानी में 0.05% एसीओएच होता है; पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट (बीजीई), 25% एसीएन जिसमें पानी में 1 एम फॉर्मिक एसिड (एफए) होता है।
      सावधानी: एसीओएच और एफए साँस लेने या सेवन करने पर विषाक्त होते हैं और प्रत्यक्ष संपर्क में आने पर गंभीर त्वचा और आंखों को नुकसान पहुंचा सकते हैं। इन रसायनों को संभालते समय उचित पीपीई का उपयोग करें।
    3. उलट-चरण नैनोएलसी द्वारा पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए, तैयार करें (v / v): मोबाइल चरण ए (जलीय), 0.1% एफए युक्त पानी; मोबाइल चरण बी (कार्बनिक), एसीएन में 0.1% एफए।
      नोट: एचआरएमएस का पता लगाने के दौरान रासायनिक हस्तक्षेप को कम करने के लिए एलसी-एमएस ग्रेड सॉल्वैंट्स का उपयोग करके सभी मिश्रण तैयार किए जाने चाहिए।

2. माइक्रोइंजेक्शन और विच्छेदन के लिए उपकरण तैयार करें

  1. भ्रूण को धीरे से स्थानांतरित करने और उन्मुख करने के लिए, साफ बालों को पाश्चर पिपेट में ठीक करके बालों के लूप बनाएं जैसाकि कहीं और वर्णित है।
  2. माइक्रोइंजेक्शन के लिए, पिपेट पुलर का उपयोग करके बोरोसिलिकेट केशिकाओं (1 मिमी / 500 μm बाहरी / आंतरिक व्यास) को खींचकर सुइयों का निर्माण करें जैसाकि कहीं और वर्णित है।
    नोट: यहां, सुइयों को बनाने के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक पी -1000 पिपेट पुलर का उपयोग किया गया था: गर्मी, 495; खींच, 30, वेग, 60; समय, 150; दबाव, 200.
  3. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के साथ, केशिका को अनिवार्य रूप से एक (माइक्रो) सुई (जैसे, ड्यूमोंट # 5)16) में बनाने के लिए तेज बल की एक जोड़ी का उपयोग करके केशिका की नोक को काटें।
    सावधानी: खींची हुई केशिकाएं बहुत तेज होती हैं और उन्हें देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
    नोट: सुई की नोक कोशिका झिल्ली को न्यूनतम क्षति के साथ कोशिका को छेदने में सक्षम होने के लिए पर्याप्त तेज (बाहरी व्यास 10-15 μm) होनी चाहिए ताकि इंट्रासेल्युलर सामग्री लीक न हो और कोशिका ठीक हो सके और व्यवहार्य बनी रहे।
  4. माइक्रोइंजेक्शन के दौरान भ्रूण को पकड़ने के लिए, मिट्टी से भरे पकवान में कुएं तैयार करें। 15 मिमी पेट्री डिश में, गैर विषैले प्लास्टिसिन मिट्टी में ~ 1 मिमी व्यास x ~ 0.5 मिमी गहरे कुओं की छाप, जैसाकि कहीं और वर्णित है।
  5. सूक्ष्म विच्छेदन के लिए, अगारोस-लेपित व्यंजन तैयार करें। 1x SS में 2% अगारोस बनाएं और घोल को निष्फल करने के लिए इसे ऑटोक्लेव करें (20 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस)। आधे रास्ते में 60 मिमी पेट्री व्यंजन भरें, और प्लेटों को जमने दें। पहले वर्णित पाश्चर पिपेट उपकरण का उपयोग करके ~ 1 मिमी व्यास x ~ 0.5 मिमी गहरे कुएं बनाएं।

3. कोशिका वंश को अलग करें

नोट: पहचाने गए एकल कोशिकाओं और / या उनके वंशज कोशिका वंश को अलग करने के लिए निम्नलिखित चरण किए जाते हैं। आमतौर पर, भ्रूण को 16- या 32-सेल चरण में सुसंस्कृत किया जाता है, जहां प्रत्येक सेल के ऊतक भाग्यको 6,7,17 में मैप किया जाता है। भ्रूण कोशिकाओं की पहचान आकृति विज्ञान, स्थान और उनके भाग्य मानचित्रों के संदर्भ में की जाती है। एकल-कोशिका विश्लेषण के लिए, पहचानी गई कोशिकाओं को मैन्युअल विच्छेदन द्वारा अलग किया जाता है, या उनकी इंट्रासेल्युलर सामग्री को एक केशिका पिपेट में एकत्र किया जाता है और 0.5 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट के 5 μL में जमा किया जाता है। परिणामी नमूना विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है (चित्रा 1)18,19,20,21। सेल वंश विश्लेषण के लिए, पहचान की गई कोशिकाओं को वंश अनुरेखक के साथ इंजेक्ट किया जाता है, और उनके बाद के क्लोन को विकास के प्रमुख चरणों में अलग किया जाता है (उदाहरण के लिए, ऊतक प्रेरण का अध्ययन करने के लिए गैस्ट्रुलेशन के दौरान, ऊतक प्रतिबद्धता का अध्ययन करने के लिए न्यूरुलेशन के बाद)। निम्नलिखित में, विच्छेदन या एफएसीएस द्वारा अलगाव के लिए पहचानी गई कोशिकाओं के वंश को फ्लोरोसेंटली लेबल करने के लिए चरणों को रेखांकित किया गया है।

  1. भ्रूण की संस्कृति
    1. स्थापित प्रोटोकॉल12 का पालन करते हुए प्राकृतिक संभोग या इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आईवीएफ) के माध्यम से भ्रूण प्राप्त करें।
      नोट: प्राकृतिक संभोग तार्किक रूप से सरल है, वयस्क नर मेंढकों को बचाता है, और विभिन्न विकास चरणों में भ्रूण पैदा करता है, जबकि आईवीएफ उन प्रयोगों के लिए विकासात्मक रूप से सिंक्रनाइज़ भ्रूण प्रदान करता है जिनके लिए सटीक मंचन की आवश्यकता होती है।
    2. भ्रूण को अलग करना। 12,16 में वर्णित डिजेलिंग समाधान के साथ उपचार के माध्यम से भ्रूण के आसपास जेली कोट को हटा दें।
      नोट: माइक्रोइंजेक्शन और विच्छेदन के लिए कोशिकाओं और ऊतकों तक पहुंच की आवश्यकता होती है, जिससे एक्स लेविस भ्रूण में डिजेलिंग की आवश्यकता होती है।
    3. रूढ़िवादी रंजकता16,22 के साथ 2-सेल भ्रूण का चयन करें।
      नोट: यह कदम सेल और उसके वंश की पहचान में सटीकता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    4. वांछित विकास चरण में संस्कृति भ्रूण। डिजेल्ड भ्रूण को 1x SS युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और विकास की गति को नियंत्रित करने के लिए उन्हें 14-25 डिग्री सेल्सियस के बीच इनक्यूबेट करें।
      नोट: विकास की तापमान निर्भरता प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और एक्स लेविस के लिए चार्ट की गई है, जो ज़ेनबेस23 (www.xenbase.org) पर उपलब्ध है। विभिन्न तापमानों पर भ्रूण के बैचों की खेती करने से चौंका देने वाले विकास चरणों की अनुमति मिलती है। ऐसा करने से प्रयोग के लिए एक निश्चित समय पर उपलब्ध भ्रूण की संख्या को वितरित करने में मदद मिलती है।
    5. भ्रूण के दरार पैटर्न की निगरानी करें और माइक्रोइंजेक्शन16 के लिए रूढ़िवादी रंजकता और दरार पैटर्न के साथ भ्रूण का चयन करें।
      नोट: 16- और 32-सेल भ्रूण का चयन करते समय, सुनिश्चित करें कि सेल क्लीवेज प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वंश अनुरेखण के लिए सममित हैं।
  2. ब्याज के सेल (ओं) को लेबल करें
    1. वंश अनुरेखक समाधान युक्त इंजेक्शन सुई सेट करें। माइक्रोइंजेक्शन सुई को एक मल्टी-एक्सिस माइक्रोमैनिपुलेटर द्वारा नियंत्रित माइक्रोपिपेट होल्डर में माउंट करें।
    2. माइक्रोपिपेट धारक को माइक्रोइंजेक्टर से कनेक्ट करें। 16 में वर्णित नकारात्मक दबाव लागू करके वंश ट्रेसर के साथ सुई भरें। चित्रा 1 ए सेटअप का उदाहरण देता है।
    3. सुई को कैलिब्रेट करें। वंश अनुरेखक समाधान के ~ 1 एनएल को वितरित करने के लिए सुई टिप और इंजेक्शन समय के आकार को समायोजित करें, जिसे कहीं और उपलब्ध प्रोटोकॉल का पालन करते हुए (खनिज) तेल में मापाजाता है।
      नोट: एक व्यापक नोक के साथ केशिकाएं कोशिका झिल्ली को नुकसान पहुंचाती हैं, जिससे उपकोशिकीय सामग्री और इंजेक्शन वंश ट्रेसर लीक हो जाता है, जबकि छोटी युक्तियों वाली केशिकाओं को बंद होने का खतरा होता है। ~ 10 μm टिप बाहरी व्यास वाली केशिकाएं आदर्श हैं, जिन्हें ~ 1 nL देने के लिए ~ 300 ms से अधिक 40 psi दबाव पल्स की आवश्यकता होती है।
    4. माइक्रोइंजेक्शन क्ले डिश को 3% फिकोल समाधान के साथ भरें और ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके ~ 10 भ्रूण को मिट्टी के पकवान में स्थानांतरित करें। प्रत्येक भ्रूण को एक कुएं में मार्गदर्शन करने के लिए एक हेयर लूप का उपयोग करें और धीरे से उन्हें स्थिति में रखें ताकि रुचि का लक्षित सेल माइक्रोनीडल के सही कोण पर हो।
    5. लेविस ऊतक भाग्य मानचित्रों के बाद रुचि के वंश के अग्रदूत सेल की पहचान करें। उदाहरण के लिए, चित्रा 1 32-सेल भ्रूण (बाएं और दाएं डी111 कोशिकाओं) में इसके अग्रदूत कोशिकाओं के इंजेक्शन के आधार पर तंत्रिका एक्टोडर्मल क्लोन की लेबलिंग को दर्शाता है।
      नोट: 16-6 और 32-सेल 7,8 भ्रूणके लिए विस्तृत भाग्य मानचित्र ज़ेनबेस23 के माध्यम से एक इंटरैक्टिव प्लेटफॉर्म में उपलब्ध हैं। वंश-अनुरेखण प्रयोगों के लिए उनका उपयोग करते समय भ्रूण पर रूढ़िवादी रंजकता और दरार सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है।
    6. फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान के ~ 1 एनएल या ~ 200 पीजी एमआरएनए के साथ रुचि के सेल (ओं) को इंजेक्ट करें जैसा कि पहले16 में वर्णित है।
      नोट: डेक्सट्रान संयुग्म का उपयोग करें जो 10,000-40,000 मेगावाट हैं। छोटे डेक्सट्रान संयुग्म गैप जंक्शनों से गुजर सकते हैं, जबकि बड़े डेक्सट्रान संयुग्म इंजेक्शन सेल में समान रूप से फैल नहीं सकते हैं। प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त ऊतक रखने के लिए ~ 10 भ्रूण में कोशिकाओं को इंजेक्ट करने की योजना बनाएं।
    7. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत सेल लेबलिंग की सफलता की पुष्टि करें। सुनिश्चित करें कि केवल इच्छित सेल इंजेक्शन दिया गया है। संस्थागत नीतियों का पालन करते हुए घायल या गलत तरीके से लेबल वाली कोशिकाओं वाले भ्रूण को छोड़ दें।
      नोट: क्योंकि एक्स लेविस कई गैर-प्राकृतिक वातावरणों में आक्रामक है, भ्रूण को त्यागने से पहले घातकता सुनिश्चित करने के लिए भ्रूण को फ्रीज किया जा सकता है।
  3. लेबल किए गए सेल संतान को अलग करें
    1. इंजेक्ट किए गए भ्रूण को पेट्री डिश में 0.5xs पर स्थानांतरित करें और वांछित विकास चरण तक पहुंचने तक उन्हें 14-25 डिग्री सेल्सियस के बीच कल्चर करें।
      नोट: ज़ेनबेस पर रिपोर्ट किए गए भ्रूण को स्टेज करने के लिए स्थापित प्रोटोकॉल से परामर्श करें।
    2. माइक्रोडिसेक्शन के लिए 0.2x एसएस समाधान के साथ 3-5 भ्रूण को एक आगर डिश में स्थानांतरित करें।
      नोट: एसएस समाधान की नमक सांद्रता को 0.5x से 0.2x तक कम करने से विच्छेदन के दौरान कोशिकाओं को अलग करने में मदद मिलती है।
    3. भ्रूण के आसपास के विटेलिन झिल्ली को धीरे से हटाने के लिए दो तेज बल का उपयोग करें।
      नोट: ब्याज के क्लोन को नुकसान से बचाने के लिए, फ्लोरोसेंटली लेबल क्लोन के विपरीत तरफ से झिल्ली को छीलें।
    4. लेबल किए गए क्लोन को मैन्युअल विच्छेदन (चरण 3.3.5-3.3.6) या एफएसीएस (चरण 3.3.7-3.3.8) द्वारा निम्नानुसार अलग करें।
    5. भ्रूण से लेबल किए गए क्लोन को विच्छेदित करने के लिए बल का उपयोग करें।
      नोट: अन्य उपकरण जैसे माइक्रोसर्जिकल कैंची, टंगस्टन सुई, या भौं बाल चाकू का उपयोग लेबल क्लोन के विच्छेदन के लिए किया जा सकता है, जैसा कि कहीं और विस्तृतहै।
    6. विच्छेदित ऊतक को 0.5-10 μL पिपेट के साथ इकट्ठा करें और उन्हें एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज शीशी में जमा करें। एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, नमूने में लवण को सीमित करने के लिए एकत्रित ऊतक के आसपास के मीडिया को एस्पिरेट करें, जो बाद के चरणों में एचआरएमएस विश्लेषण में हस्तक्षेप करते हैं।
      नोट: वर्कफ़्लो के बाद के चरणों के दौरान शीशियों की सतहों पर प्रोटीन के नुकसान को कम करने के लिए प्लास्टिक की सतहों पर प्रोटीन सोखना को कम करने वाली शीशियों का उपयोग करें।
    7. एफएसीएस द्वारा अलग करने के लिए, न्यूपोर्ट 2.0 बफर के ~ 5 एमएल वाले 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में ~ 5-8 डिवाइटेलाइज्ड भ्रूण स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान13 पर 20-30 मिनट के लिए 80 आरपीएम पर प्लेट को न्यूट करके भ्रूण को अलग करें।
      चरण 22 से पुराने भ्रूण / लार्वा में प्रचुर मात्रा में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन होते हैं, जिससे अलग-अलग कोशिकाओं में पृथक्करण मुश्किल हो जाता है। पुराने भ्रूण से ऊतकों को अलग करने के लिए अतिरिक्त एंजाइमेटिक दृष्टिकोण अनुकूलित किए जा सकते हैं जैसा कि कहीं और वर्णितहै।
    8. एफएसीएस का उपयोग करके निलंबन से फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं को शुद्ध करें जैसा कि कहीं और वर्णितहै।
    9. सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पेलेट कोशिकाएं और सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
      नोट: सेल लाइसिस को रोकने के लिए कम सेंट्रीफ्यूजेशन गति (400 × ग्राम) और तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करें। यदि एफएसीएस के लिए गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) का उपयोग कर रहे हैं, तो एचआरएमएस का पता लगाने के दौरान बीएसए हस्तक्षेप को कम करने के लिए सेल गोली को धोएं। धीरे से कोशिकाओं को 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में पुन: निलंबित करें और सेंट्रीफ्यूज को फिर से गोली से कुल्ला कोशिकाओं में बदल दें। सतह पर तैरने वाला पीबीएस तरल निकालें।
    10. नमूना शीशी को सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन पर रखकर पृथक कोशिकाओं को तेजी से फ्रीज करें।
      नोट: प्रसंस्करण चरणों के दौरान नमूने (ऊतकों या कोशिकाओं) को ठंडा रखें (उदाहरण के लिए, बर्फ पर)। डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण की सुविधा के लिए नमूने के चारों ओर जितना संभव हो उतना कम मीडिया के साथ कोशिकाओं को फ्रीज करें।
    11. एचआरएमएस विश्लेषण तक नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन का विश्लेषण करें

पृथक ऊतकों या कोशिकाओं का प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन एचआरएमएस में स्थापित चरणों की एक श्रृंखला पर आधारित है। चित्रा 2 जैव-विश्लेषणात्मक वर्कफ़्लो के चरणों को दर्शाता है। यहां उपयोग किया जाने वाला नमूना संग्रह प्रोटोकॉल प्रोटिओमिक्स केबॉटम-अप 11, मिडिल-डाउन25, या टॉप-डाउन26 वर्कफ़्लो के साथ संगत है। निम्नलिखित में, इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली बॉटम-अप रणनीति का वर्णन किया गया है, जो विभिन्न प्रकार के मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए संवेदनशील, मात्रात्मक और अनुकूलनीय साबित हुई है। प्रोटीन को निकालने और एंजाइमेटिक रूप से पचाने के बाद, परिणामी पेप्टाइड्स को अलग किया जाता है, इसके बाद एचआरएमएस विश्लेषण होता है।

  1. ऊतकों / एकल कोशिकाओं को संसाधित करें
    1. सीई द्वारा एकल-कोशिका विश्लेषण के लिए, प्रोटीन को डिनेचर करने के लिए ~ 15 मिनट के लिए नमूने को 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, फिर नमूने को कमरे के तापमान (आरटी, ~ 5 मिनट) 18,21 के बराबर करें।
      नोट: ऊतकों के साथ काम करने के दौरान, एकल कोशिकाओं से नमूना तैयार करने के दौरान प्रोटीन के नुकसान को सीमित करने के लिए कमी और क्षारीकरण चरणों को छोड़ दिया जाता है। नमूना तैयार करने के दौरान प्रोटीन के नुकसान को कम करने के लिए फ़िल्टर-एडेड नमूना तैयारी (एफएएसपी) 27,28, अन्य एकल पॉट रणनीतियों29, और माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण30 को अपनाया जा सकता है।
    2. नैनोएलसी द्वारा विश्लेषण के लिए, लाइसिस बफर (~ 100 μg कुल प्रोटीन) के 50 μL में 5 विच्छेदित ऊतकों तक लाइस करें। नमूने को कुछ बार ऊपर और नीचे करके प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाएं।
    3. लाइसेट को 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेल मलबे और जर्दी प्लेटलेट्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर × ग्राम को छर्रेट करें। सुपरनैटेंट को एक स्वच्छ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज शीशी में स्थानांतरित करें और लाइसेट (वी / वी) में 1% एसडीएस की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10% एसडीएस जोड़ें।
    4. ऊतकों के लिए, चरण 4.1.5-4.1.7 का पालन करें।
    5. ~ 25 mM की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए लाइसेट में 0.5 M dithiotreitol जोड़ें (उदाहरण के लिए, 0.5 M dithiotretol से 50 μL लाइसेट) की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए और प्रोटीन में डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को रासायनिक रूप से कम करने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए लाइसेट को इनक्यूबेट करें।
    6. लाइसेट में ~ 75 mM की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए 0.5 M iodoacetamide जोड़ें और अंधेरे में RT पर 15 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें (चित्रा 2)।
    7. 0.5 M dithiothreitol जोड़ें, जो प्रारंभिक मात्रा के समान है (उदाहरण के लिए, 0.5 M dithiothretol का 2.5 μL से 50 μL लाइसेट) ताकि अल्काइलेशन प्रतिक्रिया से बचे अभिकारकों को शांत किया जा सके।
      सावधानी: आयोडोसेटामाइड और डिथियोथ्रेइटोल सीधे संपर्क में आने पर गंभीर त्वचा और आंखों को नुकसान पहुंचा सकते हैं। इन रसायनों को संभालते समय उचित पीपीई का उपयोग करें।
    8. वर्षा के माध्यम से प्रोटीन को शुद्ध करें। क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-आधारितवर्षा अच्छी तरह से प्रदर्शन करती है। यह प्रोटोकॉल अन्य प्रकार के वर्षा दृष्टिकोण32 के लिए भी अनुकूल है।
      नोट: एकल-कोशिका विश्लेषण के लिए, जहां प्रोटीन के नुकसान चिंता का विषय हैं, सीई-एचआरएमएस के लिए वर्षा चरण को छोड़ दें।
    9. प्रोटीन अवक्षेप को वैक्यूम कंसंट्रेटर (4-37 डिग्री सेल्सियस) में सुखाएं, फिर निकाले गए प्रोटिओम को 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट के 50 μL में पुन: निलंबित करें। पाचन के लिए आवश्यक एंजाइम की मात्रा निर्धारित करने के लिए कुल-प्रोटीन कलरिमेट्रिक परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाएं (उदाहरण के लिए, बिसिनकोनिनिक एसिड प्रोटीन परख)।
    10. प्रोटीन को पेप्टाइड्स में पचाएं। 1:50 का प्रोटीज:प्रोटीन अनुपात प्राप्त करने के लिए ट्रिप्सिन (1 μg/μL स्टॉक) जोड़ें और मिश्रण को एकल-कोशिका नमूनों के लिए 5 घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस और ऊतक के नमूनों के लिए 14 घंटे तक इनक्यूबेट करें। प्रतिक्रिया के लिए विक्रेता-विशिष्ट सिफारिशों से परामर्श करें।
      नोट: 14 घंटे या उससे अधिक सांद्रता के लिए ट्रिप्सिन के साथ पाचन दरार पेश कर सकता है जो प्रोटीन के अनुक्रम के लिए निरर्थक हैं, इस प्रकार प्रोटीन पहचानको चुनौती देते हैं।
    11. एक रंगीन परख का उपयोग करके कुल पेप्टाइड एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें।
    12. वैकल्पिक: मल्टीप्लेक्सिंग परिमाणीकरण के लिए, विक्रेता-विशिष्ट निर्देशों के बाद प्रत्येक नमूने से पेप्टाइड्स को एक अलग आइसोबेरिक द्रव्यमान टैग के साथ टैग करें। प्रति पेप्टाइड नमूने में समान अनुपात में बारकोडेड पेप्टाइड्स मिलाएं।
      नोट: मात्रात्मक पूर्वाग्रहों से बचने के लिए सटीक लेबलिंग और मिश्रण सुनिश्चित करें। मात्रा-सीमित नमूनों या एकल-कोशिका नमूनों के लिए, पूल किए गए ऊतकों / कोशिकाओं से बना एक टीएमटी-आधारित वाहक चैनल शामिल किया जा सकता है ताकि बाद के पृथक्करणचरणों के दौरान नमूना नुकसान को कम किया जा सके और कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की संवेदनशीलता को बढ़ाया जा सके।
    13. वैकल्पिक: एलसी-एमएस सिस्टम की रक्षा के लिए सी 18 रिवर्स-फेज स्पिन कॉलम / टिप पर लवण और दूषित पदार्थों (जैसे, अपरिवर्तित आइसोबेरिक मास टैग अभिकर्मकों) को हटाने के लिए डीसाल्ट पेप्टाइड्स।
    14. वैकल्पिक: फ्रैक्शनेट (जैसे, मध्यम- या उच्च-पीएच रिवर्स-फेज फ्रैक्शनेशन) मैनुअल या स्वचालित प्लेटफार्मों के माध्यम से प्रोटिओम का गहरा पता लगाने के लिए पेप्टाइड मिश्रण। पेप्टाइड डाइजेस्ट की कम मात्रा (1-10 μg) को अलग करने के लिए युक्त युक्तियों वाले C18 स्थिर चरण का उपयोग करें।
    15. वैक्यूम कंसंट्रेटर में पेप्टाइड मिश्रण को 60 डिग्री सेल्सियस पर सुखाएं।
    16. माप तक पेप्टाइड मिश्रण को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. पेप्टाइड्स को अलग करें
    नोट: प्रोटीन निकालने और एंजाइमेटिक रूप से पचाने के बाद, परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स को नैनोएलसी या सीई द्वारा अलग किया जाता है और टेंडम एचआरएमएस द्वारा अनुक्रमण के लिए ईएसआई द्वारा आयनित किया जाता है। उलट-चरण नैनोएलसी पृथक्करण प्रति विश्लेषण ~ 150 एनजी से ~ 1 μg एकत्र करने वाले पेप्टाइड्स के लिए आदर्श है। सीई फेम्टोग्राम से लेकर पेप्टाइड्स के लिए पूरक संवेदनशीलता प्रदान करता है <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 और एकल-कोशिका विश्लेषण के लिए तेजी से उपयोग किया जाता है18,36,37.
    1. CE का उपयोग करअलग करने के लिए, चरण 4.2.2-4.2.7 का पालन करें।
      नोट: निम्नानुसार, पेप्टाइड्स को मापने के लिए कस्टम-निर्मित सीई प्लेटफॉर्म का उपयोग वर्णित है। इस सीई उपकरण को बनाने और उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉलपहले 38 प्रदान किए गए थे, साथ ही छोटे अणुओं के उपयोग पर एक विज़ुअलाइज़ किए गए प्रयोगके साथ 20. वैकल्पिक रूप से, इन मापों को एक वाणिज्यिक सीई प्रणाली पर किया जा सकता है, जैसे कि एबी एससीआईईएक्स सीईएसआई, एगिलेंट 7100, या समकक्ष।
    2. नमूना विलायक के 1-2 μL में प्रोटीन पाचन का पुनर्गठन करें, नमूना मिश्रण करने के लिए भंवर, और इसे 2 मिनट के लिए 10,000 x g पर पेलेट सेल मलबे में सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: सेल मलबे को हटाने से सीई केशिका को बंद करने की संभावना कम हो जाती है, इस प्रकार पृथक्करण प्रणाली के जीवनकाल को लंबा किया जाता है और माप थ्रूपुट को बढ़ावा दिया जाता है।
    3. बीजीई के साथ सीई केशिका को फ्लश करके सीई-ईएसआई उपकरण को शुरू करें।
    4. एक ज्ञात मानक (जैसे, साइटोक्रोम सी या बीएसए डाइजेस्ट, एंजियोटेंसिन पेप्टाइड्स) का उपयोग करके वाद्य प्रदर्शन को मान्य करें।
      नोट: कीमती नमूनों को मापने से पहले बड़े पैमाने पर सटीकता, पहचान संवेदनशीलता, प्रजनन क्षमता और परिमाणीकरण की रैखिक गतिशील सीमा के संदर्भ में उपकरण का मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है। सीई-ईएसआई-एमएस प्रदर्शन के सत्यापन और समस्या निवारण पर अतिरिक्त नोट्सकहीं और सूचीबद्ध हैं 18,20,38।
    5. सीई पृथक्करण केशिका में नमूने के ~ 1-10 एनएल इंजेक्ट करें।
      नोट: यह अध्ययन इलेक्ट्रोकाइनेटिक रूप से पंप किए गए शीथ-फ्लो सेटअप के साथ ~ 1 मीटर लंबे फ्यूज्ड सिलिका केशिका (40/110 μm आंतरिक / बाहरी व्यास) का उपयोग करता है। वाणिज्यिक सीई उपकरणों को आमतौर पर इंजेक्शन के लिए माइक्रोवियल में 5-10 μL नमूने की प्रस्तुति की आवश्यकता होती है। कस्टम-निर्मित सीई प्लेटफॉर्म18,38 नमूना-लोडिंग माइक्रोवियल में जमा नमूने के ~ 250 एनएल से 1 μL के साथ संगत है।
    6. सीई पृथक्करण केशिका के इनलेट छोर को बीजीई में स्थानांतरित करें।
    7. पृथ्वी की जमीन से सीई पृथक्करण वोल्टेज को धीरे-धीरे बढ़ाकर इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण शुरू करें (उदाहरण के लिए, 1 मिनट से अधिक चरणबद्ध)। ~ 10 μA से नीचे धारा के साथ 20-28 kV की क्षमता विश्लेषण के लिए स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वाद्य प्रदर्शन सुनिश्चित करती है।
    8. नैनोएलसी का उपयोग करके अलग करने के लिए, चरण 4.2.9-4.2.12 का पालन करें।
    9. मोबाइल चरण ए में पेप्टाइड नमूने को पुन: निलंबित करें। इंजेक्शन के लिए नमूने की एकाग्रता और इसकी मात्रा उपलब्ध एलसी सिस्टम और कॉलम पर निर्भर करती है। इस अध्ययन में, ~ 250 एनजी -1 μg प्रोटीन डाइजेस्ट को C18 पैक-बेड कॉलम (75 μm आंतरिक व्यास, 100 A छिद्रों के साथ 2 μm कण आकार, 25 सेमी लंबाई पृथक्करण स्तंभ) पर नमूना मात्रा के 1-20 μL में इंजेक्ट किया जाता है।
    10. नमूने को एलसी शीशी में स्थानांतरित करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि शीशी में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं, जो विश्लेषणात्मक कॉलम को नुकसान पहुंचा सकते हैं। इंसर्ट के साथ शीशियों का उपयोग कम मात्रा वाले ऊतक या एकल-कोशिका नमूनों के लिए किया जा सकता है।
    11. सी 18 विश्लेषणात्मक कॉलम पर पेप्टाइड नमूने के ~ 200 एनजी से 2 μg लोड करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, पेप्टाइड्स को विश्लेषणात्मक पृथक्करण से पहले डीसाल्टिंग के लिए एक ट्रैप कॉलम पर लोड किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 0.1 मिमी आंतरिक व्यास, 5 μm कण आकार, 100 A छिद्र आकार, 20 मिमी लंबाई के साथ एक C18 ट्रैप कॉलम। पृथक्करण प्रवणता शुरू होने से पहले 5 मिनट के लिए 5 μL/ min की प्रवाह दर पर 100% बफर A के साथ डेसाल्ट पेप्टाइड्स।
    12. ग्रेडिएंट क्षालन का उपयोग करके पेप्टाइड्स को अलग करें। 300 nL/min प्रवाह दर पर, इस अध्ययन में प्रयुक्त 120-मिनट ढाल निम्नानुसार है: 0-5 मिनट 2% B, 5-85 मिनट 2-35% B, 86-90 मिनट 70% B, 91-120 मिनट 2% B।
  3. ईएसआई द्वारा पेप्टाइड्स को आयनित करें
    नोट: सीई या नैनोएलसी केशिका को आमतौर पर आयनीकरण के लिए ईएसआई स्रोत में युग्मित किया जाता है। अल्ट्रासेंसिटिव डिटेक्शन के लिए माइक्रो-फ्लो (ब्लंट-टिप) और नैनो-फ्लो (टेपर्ड-टिप39 और इलेक्ट्रोकाइनेटिक पंप शीथ-फ्लो36 डिजाइन) सीई-ईएसआई इंटरफेस पहले विकसित किए गए हैं।
    1. वाणिज्यिक या कस्टम-निर्मित ईएसआई इंटरफ़ेस का उपयोग करके आयनीकरण के लिए इलेक्ट्रोस्प्रे आयन स्रोत में पेप्टाइड्स को अलग करने की आपूर्ति करें। जेनोपस भ्रूण में एकल-सेल सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण के लिए, एक इलेक्ट्रोकाइनेटिक रूप से पंप किए गए कम-प्रवाह इंटरफ़ेस का उपयोग करें जिसमें सीई केशिका आउटलेट एक खींचे गए बोरोसिलिकेट उत्सर्जक में संलग्न है।
    2. कैमरे का उपयोग करके इलेक्ट्रोस्प्रे उत्सर्जक के माध्यम से तरल प्रवाह की जांच करें और संभावित लीक के लिए सेटअप का निरीक्षण करें।
    3. ईएसआई स्रोत (बनाम पृथ्वी जमीन) शुरू करने के लिए इलेक्ट्रोस्प्रे वोल्टेज को ~ 2.5 केवी पर सेट करें।
    4. कुल आयन प्रवाह की निगरानी करके एचआरएमएस विश्लेषण के लिए एक स्थिर नैनोस्प्रे सुनिश्चित करें। स्थिर स्प्रे (कुल तीव्रता में <15% सापेक्ष मानक विचलन) प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रोस्प्रे वोल्टेज और एमिटर की दूरी को एचआरएमएस इनलेट में समायोजित करें।
  4. पेप्टाइड्स का पता लगाएं
    नोट: पेप्टाइड्स का पता लगाना आइसोबेरिक द्रव्यमान टैग किए गए और अनटैग किए गए पेप्टाइड्स के लिए विभिन्न वाद्य विचारों का पालन करता है और उपलब्ध मास स्पेक्ट्रोमीटर के प्रकार पर निर्भर करता है। यह अध्ययन निम्नलिखित चरणों के अनुसार एक ऑर्बिटरैप ट्राइब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करता है।
    1. सेटिंग्स के साथ एमएस1 घटनाओं को प्राप्त करें: विश्लेषक, ऑर्बिटरैप; स्पेक्ट्रल रिज़ॉल्यूशन, आधा अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) पर 120,000 पूर्ण चौड़ाई; अधिकतम इंजेक्शन समय (आईटी), 50 एमएस; स्वचालित लाभ नियंत्रण (एजीसी), 4 x 105 गिनती; माइक्रोस्कैन, 1.
    2. पेप्टाइड्स को अनुक्रमित करने के लिए, सेटिंग्स का उपयोग करके आयन ट्रैप विश्लेषक में पता लगाने के लिए अग्रदूत आयनों को टुकड़े करें: विखंडन मोड, उच्च ऊर्जा टकराव पृथक्करण (एचसीडी); टकराव गैस, नाइट्रोजन; टकराव ऊर्जा, 32% सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा (एनसीई); अधिकतम आईटी, 70 एमएस; एजीसी, 1 x 104 गिनती; माइक्रोस्कैन, 1.
    3. वैकल्पिक: टेंडम/मल्टीस्टेज एचआरएमएस (एमएस2/एमएस3) का उपयोग करके टीएमटी टैग किए गए पेप्टाइड्स की मात्रा निर्धारित करें। सिंक्रोनस अग्रदूत चयन को नियोजित करने वाले एमएस3 के लिए, विशिष्ट वाद्य सेटिंग्स निम्नानुसार हैं। सबसे प्रचुर मात्रा में आयनों का सर्वेक्षण करने वाले एकल-चरण (एमएस1) स्कैन को मापदंडों का उपयोग करके डेटा-निर्भर अधिग्रहण के माध्यम से अलग किया जाता है: एमएस2 विखंडन मोड, टकराव-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी); टक्कर गैस, हीलियम; टकराव ऊर्जा, 35% एनसीई; खंड आयनों के लिए विश्लेषक, आयन ट्रैप निम्नलिखित सेटिंग्स: अधिकतम आईटी, 50 एमएस; एजीसी, 5 x 104 गिनती; माइक्रोस्कैन, 1. 10 एमएस2 टुकड़ा आयनों का चयन करें और उन्हें नाइट्रोजन (65% एनसीई) में एचसीडी के साथ टुकड़े करें। निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके एमएस3 टुकड़ा आयनों का पता लगाएं: ऑर्बिट्राप रिज़ॉल्यूशन 15,000 एफडब्ल्यूएचएम, अधिकतम आईटी, 120 एमएस; एजीसी, 1 × 105 गिनती; माइक्रोस्कैन, 1.
      नोट: विभिन्न एमएस अधिग्रहण विधियों और मापदंडों का उपयोग विक्रेता सिफारिशों के बाद टैग किए गए नमूनों के लिए किया जा सकता है जैसा कि कहीं और वर्णितहै।
  5. डेटा का विश्लेषण करें
    नोट: उन्नत जैव सूचना विज्ञान पैकेजों का उपयोग करके प्रोटीन की पहचान और मात्रा निर्धारित की जाती है। पहचान की निष्ठा की गणना डिकॉय डेटाबेस का उपयोग करके की जाती है, जिसे पेप्टाइड्स और प्रोटीन के स्तर पर झूठी खोज दर (एफडीआर) के रूप में व्यक्त किया जाता है।
    1. वाणिज्यिक या ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर पैकेज (संदर्भ41 में समीक्षा) का उपयोग करके डेटा को संसाधित करें। एक डेटाबेस के खिलाफ कच्चे डेटा का मिलान करें जो एमआरएनए-व्युत्पन्न पीआरओजी डेटाबेस42 के साथ जेनोपस प्रोटिओम 9.2 को जोड़कर तैयार किया गया था।
      नोट: खोज पैरामीटर हैं: पाचन एंजाइम, ट्रिप्सिन; क्लीवेज छूट गए, 2 तक; चर संशोधन, मेथिओनिन ऑक्सीकरण; स्थैतिक संशोधन, सिस्टीन कार्बामिडोमिथाइलेशन; अग्रदूत द्रव्यमान सहिष्णुता, 10 पीपीएम; टुकड़ा द्रव्यमान सहिष्णुता, 0.6 डीए; न्यूनतम पेप्टाइड लंबाई, 5; पेप्टाइड्स और प्रोटीन के लिए निष्ठा, <1% एफडीआर की पहचान। पेप्टाइड्स के लिए क्षारीकरण के बिना, डेटाबेस खोज (जैसे, एकल-सेल विश्लेषण के लिए) के दौरान एक स्थिर संशोधन के रूप में कार्बामिडोमिथाइलेशन को बाहर रखा गया है।
    2. लेबल-मुक्त43 या लेबल-आधारित रणनीतियों44,45 के माध्यम से प्रोटीन की प्रचुरता की मात्रा निर्धारित करें।
    3. वैकल्पिक: जीन ऑन्कोलॉजी के लिए प्रोटीन को एनोटेट करें। पैंथरडीबी46, रिएक्टोम47, या ज़ेनबेस23 का उपयोग किया जा सकता है।
    4. वैकल्पिक: ट्रांस-प्रोटिओमिक पाइपलाइन48, पर्सियस49 और ऑरेंज50 जैसे सॉफ्टवेयर पैकेज / वेबटूल्स का उपयोग करके सेल / ऊतक प्रकारों में प्रोटीन बहुतायत और प्रोटीन बहुतायत में अंतर की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: प्रयोगात्मक डिजाइन और सॉफ्टवेयर विकल्पों पर अतिरिक्त विचारों की समीक्षा कहीं और की गईथी 41,51.
    5. वैकल्पिक: ज्ञान के आधारों का उपयोग करके परिणामों का मूल्यांकन करें, जैसे कि ज्ञात प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए स्ट्रिंग52 और बायोप्लेक्स डिस्प्ले53 और फॉस्फोराइलेशन के लिए फॉस्फोसाइटप्लस54 । प्रोटिओम में दर्शाए गए रूपांकनों और डोमेन का विश्लेषण करने के लिए, सरल मॉड्यूलर आर्किटेक्चर रिसर्च (SMART)55 जैसे वेबटूल्स का उपयोग करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल ने एकल कोशिकाओं और उनके वंशों में प्रोटीन के अध्ययन को सक्षम किया क्योंकि वे एक्स लेविस भ्रूण में ऊतक स्थापित करते हैं। चित्रा 1 तंत्रिका-ऊतक-वसा कोशिकाओं और भ्रूण में नए प्रेरित तंत्रिका एक्टोडर्म में प्रोटीन का अध्ययन करने के दृष्टिकोण के एक ऐसे अनुप्रयोग को दर्शाता है। जैसा कि चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, बायोएनालिटिकल वर्कफ़्लो ने कोशिकाओं की पहचान करने, इंजेक्ट करने / एस्पिरेट कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एकत्र करने के लिए सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के पारंपरिक उपकरणों को एकीकृत किया। चित्रा 1 बी एक माइक्रोइंजेक्टर का उपयोग करके विवो में16-सेल भ्रूण में बाएं पृष्ठीय-पशु (डी 11) सेल के माइक्रोप्रोब नमूनाकरण को दर्शाता है; प्रयोग के बाद, भ्रूण सफलतापूर्वक सामान्य शरीर रचना विज्ञान56 के साथ टैडपोल में विकसित हुए। बड़ी भ्रूण कोशिकाएं (~ 100-250 μm व्यास) मैन्युअल माइक्रोडिसेक्शन के लिए भी अनुकूल थीं। एक दाएं पृष्ठीय-पशु मध्यरेखा (डी11) कोशिका का विच्छेदन चित्र 1 सी में 16-कोशिका भ्रूण से चित्रित किया गया है। सेटअप ने पहचाने गए अग्रदूत में एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर इंजेक्ट करके क्लोनल प्रक्षेपवक्र का पता लगाने की भी अनुमति दी। जैसा कि चित्रा 1 डी में दिखाया गया है, दृष्टिकोण ने ऊतक विच्छेदन या प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) के माध्यम से बाएं और दाएं डी111 कोशिकाओं से उत्पन्न क्लोन को अलग करने की अनुमति दी। यहां वर्णित नमूना संग्रह रणनीतियां नए विवरणों में भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए अंतरिक्ष और समय में पर्याप्त रूप से स्केलेबल हैं।

जैव-विश्लेषणात्मक वर्कफ़्लो ने संवेदनशीलता और परिमाणीकरण में सुधार के लिए एचआरएमएस प्रौद्योगिकियों को एकीकृत किया (चित्रा 2)। एकत्रित प्रोटीन को नीचे-ऊपर प्रोटिओमिक दृष्टिकोण के माध्यम से मापा गया था। ऑर्थोगोनल रसायन विज्ञान (उदाहरण के लिए, उच्च-पीएच फिर कम-पीएच उलट-चरण एलसी) के आधार पर नमूनों के वैकल्पिक विभाजन ने पहचान संवेदनशीलता में सहायता की। पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए, सीई को नमूनों की ट्रेस मात्रा (<< ~ 100 एनजी)) और सीमित मात्रा में सामग्री (>>150 एनजी) के लिए नैनोएलसी के लिए चुना गया था। पेप्टाइड्स को ईएसआई-एचआरएमएस का उपयोग करके अनुक्रमित किया गया था। लेबल-मुक्त और लेबल-आधारित रणनीतियों का उपयोग करके पता लगाए गए प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की गई थी। एकल-सेल विश्लेषण के लिए नमूना प्रसंस्करण का सरलीकरण, जैसे कि सीई विश्लेषण के बाद कमी और क्षारीकरण के विशिष्ट चरणों को समाप्त करना, ~ 400-800 विभिन्न प्रोटीनों की पहचान की सुविधा प्रदान करता है। रिपोर्ट किए गए प्रोटीनों में महत्वपूर्ण कार्यात्मक भूमिकाओं वाले कई थे, जैसे कि चैपरोनिन युक्त टीसीपी 1 सबयूनिट 3 (सीसीटी 3), वोल्टेज-निर्भर आयन चैनल (वीडीएसी 2), और क्रिएटिन किनेज-मस्तिष्क (सीकेबी)। मल्टीवेरिएट और सांख्यिकीय डेटा मॉडल ने हमेंइस प्रोटोकॉल में सारांशित दृष्टिकोणों का उपयोग करके चुनिंदा कोशिकाओं और ऊतकों की प्रोटिओमिक संरचना में पहले अज्ञात अंतर खोजने में मदद की। विशेष रूप से, इन एचआरएमएस मापों को समय से पहले नमूनों की संरचना के बारे में कोई कार्यशील जांच या ज्ञान की आवश्यकता नहीं थी, जो खोजों का समर्थन करता था।

अध्ययनों की एक श्रृंखला में, एक्स लेविस (चित्र 3) के विकासशील भ्रूणों में पहचानी गई कोशिकाओं की प्रोटिओमिक स्थितिको 21 निर्धारित किया गया था। चित्रा 3 ए डी11 कोशिकाओं के बीच जीन ट्रांसलेशनल अंतर का पता लगाता है जो विभिन्न भ्रूण10 से विच्छेदित किए गए थे। माइक्रोसैंपलिंग सीई-ईएसआई-एचआरएमएस ने हमें एकल कोशिकाओं21 से ~ 700 प्रोटीन की पहचान और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति दी। भ्रूण में डी 11 सेल पर तकनीकी डुप्लिकेट माप से ~ 400 संचयी प्रोटीन की पहचान करने पर प्रतिनिधि प्राथमिक एचआरएमएस-एमएस / एमएस डेटा को प्राइड में जमा किया गया था। यह दृष्टिकोण अन्य मॉडल जीवों, जैसे ज़ेब्राफिश 21 से छोटी कोशिकाओं औरभ्रूणों के लिए स्केलेबल था। छोटे सेल आकारों के लिए स्केलेबिलिटी ने हमें एक जीवित भ्रूण से डी11 संतान के स्थानिक पुनर्गठन का पता लगाने की अनुमति दी क्योंकि यह समय में विकसित हुआ था। चित्रा 3 बी 16-, 32-, 64-, और 128-सेल भ्रूण में पहचाने गए कोशिकाओं के उपकोशिकीय मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स करने के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग को प्रस्तुत करता है। प्रोटीन को चार समूहों में विभाजित किया गया था जो क्लोनल विकास21 पर अलग-अलग बहुतायत प्रोफाइल प्रदर्शित करते थे।

Figure 3
चित्र 3: एक्स लेविस भ्रूण में उपकोशिकीय स्थान से क्लोनल ऊतकों तक प्रोटोकॉल स्केलेबिलिटी। (ए) पहचाने गए पूरे डी11 कोशिकाओं के बीच प्रोटिओमिक अंतर का मापन, सेल-सेल विषमता का खुलासा करता है। चुनिंदा प्रोटीन के लिए दिखाए गए जीन नाम। (बी) विकासशील डी 11 सेल क्लोन में सेलुलर प्रोटिओम का पुनर्गठन। फजी सी-का अर्थ है प्रोटीन गतिशीलता का क्लस्टर विश्लेषण (जीप्रोक्स), समान अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर प्रोटीन को समूहीकृत करना। ग्रे संख्याएं विभिन्न प्रोटीनों की संख्या दिखाती हैं जो प्रत्येक क्लस्टर में निर्धारित की गई थीं। आंकड़ेसंदर्भ 21,57 से अनुमति के साथ अनुकूलित किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस प्रोटोकॉल ने हमें पहचाने गए, विकासशील सेल क्लोन (चित्रा 4) में स्थानिक और लौकिक प्रोटिओमिक्स का संचालन करने की अनुमति दी। चित्रा 4 ए भ्रूण के तंत्रिका ऊतक विकास और पैटर्निंग में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के साथ दो ऊतकों का गठन करने वाले सेल क्लोन को लेबल करने और अलग करने के लिए दृष्टिकोण के अनुप्रयोग को दर्शाता है। फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान के इंजेक्शन के माध्यम से बाएं और दाएं डी112 और डी 212 कोशिकाओं को लेबल करके स्पेमन आयोजक (एसओ) के बहुमत का पता लगाया गया था। समानांतर में, पड़ोसी पृष्ठीय-पशु (डी111) कोशिकाओं को तंत्रिका एक्टोडर्म (एनई) के बहुमत को चिह्नित करने के लिए लेबल किया गया था। ऊतकों को विच्छेदित किया गया था, और इस प्रोटोकॉल के बाद उनकी प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण किया गया था। नैनोएलसी-ईएसआई-एचआरएमएस ऊतकों से 2,000 विभिन्न प्रोटीनों तक लौट आया, जिसमें सिग्नलिंग शामिल है, जैसे कि डब्ल्यूएनटी, एफजीएफ और टीजीएफ मार्ग। विच्छेदित एसओ ऊतकों के पूल पर तकनीकी डुप्लिकेट माप से ~ 1,800 संचयी प्रोटीन की पहचान करने पर प्रतिनिधि प्राथमिक एचआरएमएस-एमएस / एमएस डेटा प्राइड में जमा किया गया था। डब्ल्यूएनटी मार्ग लिगैंड डब्ल्यूएनटी 10 ए और डब्ल्यूएनटीलेस (डब्ल्यूएलएस), डब्ल्यूएनटी लिगेंड के स्राव के लिए समर्पित एक झिल्ली प्रोटीन, केवल एनई प्रोटिओम में पाया गया था। डब्ल्यूएनटी मार्ग एसओ में दबा हुआ पाया गया था और एसओ में पाए गए डब्ल्यूएनटी-इंटरैक्शन प्रोटीन की कमी की व्याख्या कर सकता है। ये परिणाम भ्रूण के भीतर वंश-विशिष्ट मतभेदों का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 4
चित्र 4: एक्स लेविस भ्रूण में स्थानिक ऊतक प्रोटिओमिक्स से डेटा विश्लेषण का उदाहरण। (ए) क्रमशः 32-सेल भ्रूण में पूर्ववर्ती डी112 और डी 212 में फ्लोरोसेंट प्रोटीन एमआरएनए के इंजेक्शन द्वारा स्पेमन के आयोजक (एसओ) और तंत्रिका एक्टोडर्म (एनई)ऊतकों की विभेदक लेबलिंग। (बी) एसओ (लाल) और एनई (हरे) प्रोटिओम में शीर्ष 5 ओवरप्रजेंटेड जैविक प्रक्रियाएं पता लगाने योग्य अंतर दिखाती हैं। पाथवे ओवररिप्रेजेंटेशन विश्लेषण बोनफेरोनी सुधार का उपयोग करके जैविक प्रक्रियाओं को दर्शाता है। (ग) प्रोटीन डोमेन संवर्धन विश्लेषण (स्मार्ट), एसओ में डीएनए और आरएनए बाइंडिंग मोटिफ युक्त प्रोटीन के संवर्धन का खुलासा करता है। (डी) स्ट्रिंग विश्लेषण पता लगाए गए एसओ प्रोटिओम के आधार पर कैननिकल प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की भविष्यवाणी करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विविध प्रोटिओमिक डेटा फ़ंक्शन के मूल्यांकन के लिए मूल्यवान जानकारी के रूप में काम करते हैं। प्रोटिओमिक डेटा का मूल्यांकन कैननिकल नॉलेज बेस का उपयोग करके किया जा सकता है। जैसा कि चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, अनियमित प्रोटीन के मार्ग विश्लेषण ने हमारे हाल के अध्ययनों में एसओ और एनई डेटासेट दोनों में अनुवाद और ऊर्जा चयापचय को अधिक दर्शाया। एनई प्रोटिओम सेल में प्रोटीन कार्गो के परमाणु परिवहन से जुड़े प्रोटीन में समृद्ध था, संभवतः नए स्थापित एनई (चित्रा 4 सी) में सिग्नलिंग के बाद डाउनस्ट्रीम घटनाओं का संकेत देता है। चित्रा 4 डी में संवर्धन विश्लेषण में प्रोटियासम कॉम्प्लेक्स में अनुवाद दीक्षा, आरएनए-बाइंडिंग, बाइंडिंग में सुधार पाया गया, जो एसओ के विकास के लिए गतिशील प्रोटीन टर्नओवर की भूमिका का सुझाव देता है। सेल वंश-निर्देशित एचआरएमएस प्रोटिओमिक्स अंतरिक्ष और समय में स्केलेबल है और सामान्य और बिगड़ा हुआ विकास के दौरान कोशिकाओं के आणविक संगठन को बेहतर ढंग से समझने में मदद करने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील है।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल जेनोपस प्रजातियों के भ्रूण में पहचाने गए सेल वंश में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है। एचआरएमएस से उपजी, कार्यप्रणाली आणविक पहचान में उत्तम विशिष्टता, आणविक जांच के बिना बहु-प्रोटीन का पता लगाने की क्षमता (आमतौर पर सैकड़ों से हजारों विभिन्न प्रोटीन), और परिमाणीकरण की क्षमता को जोड़ती है। सेल और विकासात्मक (न्यूरो) जीव विज्ञान में शास्त्रीय उपकरणों और वर्कफ़्लो के लिए अनुकूलनक्षमता एचआरएमएस प्रोटिओमिक्स को रोमांचक अनुप्रयोगों में विस्तारित करती है, जिसमें कशेरुक एक्स लेविस भ्रूण में स्टेम सेल भेदभाव के समग्र लक्षण वर्णन शामिल हैं ।

चरण एक्स लेविस भ्रूण में सेल वंश-निर्देशित प्रोटिओमिक्स का वर्णन करते हैं। उदाहरण के लिए, हम तंत्रिका-वसा वाले एकल कोशिकाओं और उनके वंशों के विश्लेषण का प्रदर्शन करते हैं और सार्वजनिक डेटा रिपॉजिटरी के माध्यम से संबंधित सीई- और नैनोएलसी एचआरएमएस डेटासेट प्रदान करते हैं (प्राइड देखें)। यह दृष्टिकोण कई सेल प्रकारों (और वंशों) में प्रोटीन के स्थानिक विनियमन पर अध्ययन के लिए आसानी से अनुकूलनीय है। विकासशील भ्रूण में स्थानिक रूप से निर्देशित प्रोटिओमिक्स को सेल भेदभाव और तंत्रिका तंत्र जैसे प्रमुख अंगों के विकास की आणविक प्रणाली जीव विज्ञान की समझ को बढ़ावा देने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक और मेटाबोलिक अध्ययनों तक भी बढ़ाया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल जैव विश्लेषण के लिए नए आयाम जोड़ता है। सेल संस्कृतियां, जैसे कि प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) 1,2, सेल भेदभाव के दौरान अस्थायी प्रोटिओम गतिशीलता के माप की सुविधा प्रदान करती हैं। इस अध्ययन में विस्तृत दृष्टिकोण 3-आयामी जीवित भ्रूण में सेल भाग्य प्रेरण में साथियों को जोड़ता है, जहां जटिल मोर्फोजेन ग्रेडिएंट, समानांतर सिग्नलिंग मार्ग और अभिसरण विस्तार प्रक्रियाएं ऊतक प्रेरण और मोर्फोजेनेसिस लाने के लिए सहयोग करती हैं। भ्रूण के संदर्भ में प्रोटिओम गतिशीलता का अध्ययन समानांतर तंत्र पर जानकारी प्रदान कर सकता है जो सेल भेदभाव का मार्गदर्शन करता है, भेदभाव और विकास की समझ को गहरा करने के लिए एक रोमांचक दिशा।

यहां वर्णित दृष्टिकोण इस अंत तक जेनोपस प्रजातियों के प्रयोगात्मक लाभों को उधार लेता है, विशेष रूप से एक्स लेविस। लेविस भ्रूण को वयस्क जीव में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ऊतक भाग्य के लिए मैप किया जाता है, अनिवार्य रूप से दरार चरण भ्रूण में कोशिकाओं का एक स्थानिक प्रक्षेपण। सेल-निर्देशित प्रोटिओमिक्स के लिए प्रजनन क्षमता सटीक सेल टाइपिंग पर बनती है। हम सेल विच्छेदन और वंश अनुरेखण 16,20 का वर्णन करने वाले प्रयोगों के लिए आगे बढ़ने से पहले रूढ़िवादी रंजकता और दरार के लिए भ्रूणको प्रमाणित करके सफलता की सहायता करते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि दरार चरण भ्रूण की कोशिकाएं अक्सर विभिन्न डिग्री तक विभिन्न ऊतक प्रकारों के गठन में योगदान करती हैं; प्रत्येक ऊतक प्रकार में उनके स्तर के योगदान का विवरण ज़ेनबेस23 पर उपलब्ध है। भ्रूण चरण और अग्रदूत कोशिकाओं को वंश का पता लगाया जाना चाहिए, इसलिए हाथ में जैविक प्रश्न के आधार पर चुना जाना चाहिए। लंबे समय तक भ्रूण का संवर्धन करते समय (उदाहरण के लिए, >1 डी), क्षतिग्रस्त / मृत भ्रूण को हटाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, जो बदले में, आबादी में अन्य भ्रूणों के लिए व्यवहार्यता को कम कर सकती है।

सफल एचआरएमएस प्रोटिओमिक्स के लिए, सेल / ऊतक संग्रह, प्रोटीन निष्कर्षण और एचआरएमएस माप की विश्लेषणात्मक नींव पर सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए। क्योंकि जेनोपस भ्रूण को गैर-वाष्पशील लवण की उच्च सांद्रता वाले मीडिया में सुसंस्कृत किया जाता है जो एचआरएमएस संवेदनशीलता को कम करने के लिए जाना जाता है, प्रोटिओमिक अध्ययन के लिए कोशिकाओं और ऊतकों को इकट्ठा करते समय एस्पिरेटेड मीडिया को कम करने की सिफारिश की जाती है। प्रोटीन की पहचान और परिमाणीकरण को आगे बढ़ाने के लिए डीसाल्टिंग का पता लगाना एक अच्छा अभ्यास है। एचआरएमएस माप से पहले, सीई- और एलसी-ईएसआई-एचआरएमएस उपकरणों के विश्लेषणात्मक प्रदर्शन का मूल्यांकन किया जाना चाहिए, जिसमें पृथक्करण, आयनीकरण, प्रजनन क्षमता और परिमाणीकरण की रैखिक गतिशील सीमा शामिल है। अच्छे विश्लेषणात्मक मैट्रिक्स के साथ, यह प्रोटोकॉल जैविक अनुसंधान में पशु उपयोग को कम करने में मदद करता है, जैव रासायनिक डेटा के अधिक शक्तिशाली सेट प्राप्त करने के लिए संवेदनशीलता में सहायता करता है, और परिणामों की व्याख्या करने के लिए सांख्यिकीय डेटा विश्लेषण की शक्ति को बढ़ाता है। डिफ़ॉल्ट रूप से, हम सीई या एलसी-एचआरएमएस का उपयोग करके कम से कम 3 तकनीकी प्रतिकृतियों में प्रत्येक जैविक प्रतिकृति का विश्लेषण करते हैं, जिसका उपयोग तकनीकी प्रजनन क्षमता का मूल्यांकन करने और पता लगाने योग्य प्रोटिओम के कवरेज को गहरा करने के लिए किया जाता है। शक्ति विश्लेषण सांख्यिकीय शक्ति के आकलन और जैविक प्रतिकृति आकार के डिजाइन में मदद करता है। भ्रूण के बीच स्वाभाविक रूप से होने वाली जैविक परिवर्तनशीलता के लिए माता-पिता मेंढकों के विभिन्न सेटों के उपयोग की सलाह दी जाती है।

पूरक जानकारी
एचआरएमएस-एमएस /एमएस प्रोटिओमिक्स डेटा और संबंधित प्रसंस्करण फ़ाइलों को डेटा सेट पहचानकर्तापीएक्सडी030059 के साथ प्राइड 60 पार्टनर रिपॉजिटरी के माध्यम से प्रोटिओम एक्सचेंज कंसोर्टियम में जमा किया गया था।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

हम भ्रूण पृथक्करण और एफएसीएस पर मूल्यवान चर्चा के लिए जी ली (मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क) के आभारी हैं। क्वाच और केमिली लोम्बार्ड-बैनेक को पिछले अध्ययनों में नमूना तैयार करने और डेटा संग्रह के साथ सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं जो इस प्रोटोकॉल में हाइलाइट किए गए प्रोटिओमिक अनुप्रयोगों का उदाहरण देते हैं। इस काम के कुछ हिस्सों को पुरस्कार संख्या आईओएस -1832968 करियर (पीएन को), पुरस्कार संख्या आर 35 जीएम 124755 (पीएन को) के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, मैरीलैंड विश्वविद्यालय-राष्ट्रीय कैंसर संस्थान साझेदारी कार्यक्रम (पीएन को), और कॉसमॉस क्लब फाउंडेशन अनुसंधान पुरस्कार (एबीबी और एलआरपी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (LC-MS-grade) Fisher Scientific A955
Agarose ThermoFisher Scientific R0492
Ammonium bicarbonate Fisher Scientific A643-500
Analytical Column Thermo Scientific 164941
Analytical microbalance Mettler-Toledo XSE105DU
Automatic peptide fractionation platform Agilent 1260 Infinity II
Borosilicate Capillaries Sutter Instruments Co. B100-50-10
Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) Sutter Instruments B100-75-10
C18 spin columns (for desalting) ThermoFisher Scientific 89870
Camera ro monitor electrospray Edmund Optics Inc. EO-2018C
Combretastatin A4 Millipore Sigma C7744
Commercial CESI system AB SCIEX CESI
(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) VWR 97061-492
Cytochalasin D Millipore Sigma C8273
Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable ThermoFisher Scientific D22910
Diothiothreitol Fisher Scientific FERR0861
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-30
EDTA Fisher Scientific AAJ62786AP
Epifluorescence light source Lumencore AURA III
Eppendorf LoBing microcentrifuge  tubes: protein Fisher Scientific 13-698-793
Formic acid (LC-MS-grade) Fisher Scientific A117-50
Freezer (-20 °C) Fisher Scientific 97-926-1 
Freezer (-80 °C) Thermo Scientific TSX40086A
Fused silica capillary Molex 1088150596
Heat Block Benchmark BSH300
High pressure liquid Chromatography System ThermoFisher Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem
High voltage power supply Spellman CZE1000R
High-resolution Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer
HPLC caps Thermo Scientific C4013-40A
HPLC Vials Thermo Scientific C4013-11
Illuminator e.g. Goosenecks Nikon C-FLED2
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122275000
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456-4
Microcapillary puller Suttor Instruments P-2000
Microinjector Warner Instrument, Handem, CT PLI-100A
Micropippette puller Sutter Instruments Co. P-1000
MS data analysis software, commercial ProteomeDiscoverer
MS data analysis software, opensource MaxQuant
non-idet 40 substitute Millipore Sigma 11754599001
Petri dish 60 mm and 80 mm Fisher Scientific S08184
Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) ThermoFisher Scientific 87782
Pierce bicinchoninic acid protein assay kit ThermoFisher Scientific 23225
Pierce quantitative colorimetric peptide assay ThermoFisher Scientific 23275
Pierce Trypsin Protease (MS Grade) Fisher Scientific PI90058
Protein LoBind vials Eppendorf 0030108434
, 0030108442
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5430R
Refrigerated Incubator Thermo Scientific PR505755R/3721
sodium isethionate Millipore Sigma 220078
sodium pyrophosphate Sigma Aldrich 221368-100G
Stainless steel BGE vial Custom-Built
Stainless steel sample vials Custom-Built
Stereomicroscope (objective 10x) Nikon SMZ 1270, SZX18
Sucrose VWR 97063-790
Syringe pumps (2) Harvard Apparatus 704506
Syringes (gas-tight): 500–1000 µL Hamilton 1750TTL
Transfer pipettes (Plastic, disposable) Fisher Scientific 13-711-7M
Trap Column Thermo Scientific 164750
Tris-HCl (1 M solution) Fisher Scientific AAJ22638AP
Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C Labconco 7310022
Vortex-mixer Benchmark BS-VM-1000
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
XYZ translation stage Thorlabs PT3
XYZ translation stage Custom-Built

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References

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Baxi, A. B., Pade, L. R., Nemes, P. Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo. J. Vis. Exp. (182), e63586, doi:10.3791/63586 (2022).

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