Summary
Här beskrivs en masspektrometribaserad proteomisk karakterisering av cellinjer med kända vävnadsöden i ryggradsdjurens Xenopus laevis embryo.
Abstract
Karakterisering av molekylära händelser som celler ger upphov till vävnader och organ ökar en potential att bättre förstå normal utveckling och utforma effektiva botemedel mot sjukdomar. Teknik som möjliggör noggrann identifiering och kvantifiering av olika typer och ett stort antal proteiner skulle ge fortfarande saknad information om molekylära mekanismer som orkestrerar vävnads- och organismutveckling i rum och tid. Här presenterar vi ett masspektrometribaserat protokoll som möjliggör mätning av tusentals proteiner i identifierade cellinjer i Xenopus laevis (groda) embryon. Tillvägagångssättet bygger på reproducerbara cell-ödeskartor och etablerade metoder för att identifiera, fluorescerande etikett, spåra och provceller och deras avkomma (kloner) från denna modell av ryggradsdjurens utveckling. Efter insamling av cellulärt innehåll med hjälp av mikroprovtagning eller isolering av celler genom dissektion eller fluorescensaktiverad cellsortering extraheras proteiner och bearbetas för proteomisk analys nedifrån och upp. Vätskekromatografi och kapillärelektrofores används för att tillhandahålla skalbar separation för proteindetektion och kvantifiering med högupplösande masspektrometri (HRMS). Representativa exempel ges för proteomisk karakterisering av nervvävnadsfatade celler. Celllinjestyrd HRMS-proteomik kan anpassas till olika vävnader och organismer. Det är tillräckligt känsligt, specifikt och kvantitativt för att kika in i proteomets spatio-temporala dynamik under ryggradsdjurens utveckling.
Introduction
Vår förståelse av celldifferentiering och uppkomsten av vävnader och organ är resultatet av årtionden av utarbetade riktade skärmar av gener och deras produkter. Att öka vår kunskap om alla biomolekyler och deras kvantiteter under viktiga cellulära händelser skulle hjälpa till att avslöja molekylära mekanismer som styr det rumsliga och tidsmässiga mönstret för ryggradsdjurens kroppsplan. Teknologier som möjliggör molekylär amplifiering och sekvensering kan nu rutinmässigt rapportera om ett stort antal gener och transkript, vilket stöder hypotesdrivna studier inom grundläggande biologisk och translationell forskning. För att förstå utvecklingssystem förespråkar ett komplext förhållande mellan transkription och translation direkt analys av flera proteiner och deras posttranslationella modifieringar. Global proteomik som använder in vitro biologiska system, såsom inducerade pluripotenta stamceller, började avgränsa mekanismer för vävnadsinduktion 1,2. I komplexa organismer, såsom ryggradsdjurens embryo, är utvecklingen beroende av morfogengradienter i samband med rum och tid3. Det följer att få kunskap om proteomiska förändringar när celler differentieras för att bilda specialiserade vävnader, såsom neurala vävnader, erbjuder en nyckel för att låsa upp molekylära program som styr normal och defekt utveckling och vägleda nästa generations terapi.
Den sydafrikanska klogrodan (Xenopus laevis) är en väletablerad modell inom cell- och utvecklings-, neuro- och regenerativ biologi. Sir John Gurdons Nobelpris i fysiologi eller medicin 2012 4,5 för upptäckten av pluripotens hos den somatiska kärnan belyste vikten av denna modell för upptäckter i grundläggande och translationella studier. Xenopus-embryon utvecklas externt till modern, vilket underlättar direkt manipulation av celler, cellkloner och genuttryck över olika utvecklingsstadier. Asymmetrisk pigmentering och stereotypa celldelningar möjliggjorde kartläggning av reproducerbara ödeskartor från 16-6 och 32-celliga 7,8-stegs embryo. För högupplöst masspektrometri (HRMS) baserad proteomik inkluderar ytterligare fördelar med modellen relativt stor storlek (~ 1 mm i diameter), vilket ger rikligt proteininnehåll för analys (~ 130 μg i embryon i tidigt klyvningsstadium, ~ 10 μg proteininnehåll i enskilda celler i 16-cellembryot)9,10.
För närvarande är HRMS den ledande tekniken för att detektera proteiner. Denna teknik möjliggör direkt, känslig och specifik detektion och kvantifiering av flera, vanligtvis hundratusentals olika proteiner11. Bottom-up-proteomik av HRMS innebär en serie sammankopplade steg. Efter extraktion från cell/vävnadsprovet spjälkas proteiner med ett proteolytiskt enzym, såsom trypsin (bottom-up proteomik). De resulterande peptiderna separeras baserat på deras olika fysikalisk-kemiska egenskaper, inklusive hydrofobicitet (vätskekromatografi med omvänd fas, LC), nettoladdning (jonbyteskromatografi), storlek (storleksuteslutningskromatografi) eller elektroforetisk rörlighet (kapillärelektrofores, CE). Peptider laddas sedan (joniseras), vanligtvis med användning av elektrosprayjonisering (ESI), och peptidjoner detekteras och sekvenseras via gasfasfragmentering genom tandem HRMS. De resulterande peptiddata mappas till proteomet hos organismen som studeras. Med proteinspecifik (proteotypisk) peptidjonsignalintensitet korrelerad med koncentration kan proteinkvantifiering utföras etikettfri eller etikettbaserad (multiplexeringskvantifiering). HRMS-proteomik ger en rik resurs av information om det molekylära tillståndet i systemet som studeras, vilket möjliggör generering av hypoteser och uppföljande funktionella studier.
Figur 1: Spatiotemporalt skalbar proteomik som möjliggör cellinjestyrd HRMS-proteomik i det utvecklande (grod) embryot. (A) Visualisering av provet (1) med hjälp av ett stereomikroskop (2) för injektion av en identifierad cell (infälld) med hjälp av en tillverkad mikropipett (3) under kontroll genom ett translationssteg (4). b) Subcellulär provtagning av den identifierade vänstra D11-cellen i ett 16-celligt embryo. c) Dissektion av en hel D11-cell från ett embryo med 16 celler. (D) Fluorescerande (grön) spårning av vänster och höger D111-avkomma från ett 32-celligt embryo för att styra dissektion av neural ektoderm (NE) i gastrula (steg 10) och isolering av den nedstigande vävnaden från grodyngel med hjälp av FACS. Skalstänger: 200 μm för embryon, 1,25 mm för injektionsflaskan. Siffrorna anpassades med tillstånd från referenserna 15,19,21,59. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Protokollet som presenteras här möjliggör HRMS-baserad kvantifiering av ett stort antal proteiner i identifierade celler/vävnader i utvecklande X. laevis embryon. Tillvägagångssättet bygger på noggrann cellidentifiering, reproducerbara cellödeskartor och etablerade metoder för att spåra cellinjer i denna biologiska modell 6,7,8. Som visas i figur 1 studerar vi proteom från enskilda celler genom att använda helcellsdissektion eller kapillär mikroprovtagning för att aspirera cellulärt innehåll. Övervakning av en cells härstamning gör det möjligt för oss att studera proteomets spatiotemporala utveckling när celler bildar vävnader under gastrulation. Cellavkomman markeras fluorescerande genom att injicera en fluorofor konjugerad till inert dextran eller mRNA för fluorescerande protein (t.ex. grönt fluorescerande protein eller GFP). Den märkta avkomman isoleras vid önskade utvecklingstidpunkter. Under gastrulation kan cellkloner som är tätt grupperade isoleras genom dissektion. Efter gastrulation kan cellkloner distribueras inom embryot på grund av migrationsrörelser och kan isoleras från dissocierade vävnader genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Proteiner i dessa celler och vävnader mäts via bottom-up-proteomik som använder HPLC eller CE för separation och ESI-tandem-HRMS för identifiering. Celllinjestyrd HRMS-proteomik är skalbar till olika cellstorlekar och linjer inom embryot och är specifik, känslig och kvantitativ. Genom utvalda exempel som visas här visar vi också att detta protokoll är skalbart och i stort sett anpassningsbart till olika typer av celler och cellinjer.
Figur 2: Det bioanalytiska arbetsflödet. Mikrodissektion och kapilläraspiration, eller FACS-underlättad provtagning av cellulärt och klonalt proteininnehåll. Utarmning av rikliga äggula proteiner och separation genom kapillärelektrofores (CE) eller nano-flöde vätskekromatografi (LC), förbättrad identifiering (ID) känslighet med hjälp av elektrospray jonisering (ESI) högupplöst masspektrometri (HRMS). Kvantifiering avslöjade dysregulering, vilket gav ny information för hypotesdrivna studier i kombination med information tillgänglig från genontologi (GO). Siffrorna har anpassats med tillstånd från referens15. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll som säkerställer humant underhåll och hantering av Xenopus laevis vuxna grodor godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Maryland, College Park (godkännandenummer R-DEC-17-57 och R-FEB-21-07).
1. Förbered lösningarna
- För embryologi
- Förbered 1x, 0,5x och 0,2x Steinbergs lösning (SS) och autoklavera dem sedan (120 °C i 20 minuter) till sterilitet enligt standardprotokoll12.
- Bered 3% (w/v) Ficoll i steriliserad 1x SS enligt standardprotokoll12.
- För dejellying, bereda nyligen 2% (w/v) cysteinlösning och justera dess pH till 8 genom att tillsätta 10 M natriumhydroxidlösning droppvis.
VARNING: Exponering för cystein kan orsaka hud- och andningsskador. Natriumhydroxid är ett frätande medel som kan orsaka allvarliga skador på hud och ögon vid direkt exponering. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) vid hantering av dessa kemikalier, t.ex. handskar och en laboratorierock. - För härstamningsspårämnet, bereda 0,5% (v / v) av en fluorescerande dextran i sterilt avjoniserat vatten. Alternativt kan man bereda en lösning av 0,2 μg/μL mRNA för fluorescerande proteiner i sterilt avjoniserat vatten (t.ex. GFP).
- För att dissociera celler, förbered Newport 2.0-buffert innehållande 0,1 M natriumisetionat, 20 mM natriumpyrofosfat och 10 mM CAPS och sätt sedan dess pH till 10,513.
VARNING: Exponering för natriumpyrofosfat kan orsaka hud- och ögonirritation. Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av dessa kemikalier.
- För bottom-up proteomik
- Förbered celllysbufferten så att den inkluderar: 250 mM sackaros, 1% nonidet P-40-substitut (w/v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM cytochalasin D och 10 μM combretastatin 4A. Bered en stam på 10% (w/v) natriumdodecylsulfat14,15.
OBS: Tris-HCl valdes för att minimera HEPES-kontaminering under nanoflöde LC (nanoLC) -HRMS.
VARNING: Exponering för nonidet P-40-substitut kan orsaka hudirritation. Cytochalasin D är teratogent om det konsumeras och combretastatin är akut toxiskt vid direkt exponering. Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av dessa kemikalier. - För att separera peptider med CE, förbered följande lösningsmedel (v / v): Provlösningsmedel, 75% acetonitril (ACN) innehållande 0,05% ättiksyra (AcOH) i vatten; mantellösning, 10% ACN innehållande 0,05% AcOH i vatten; bakgrundselektrolyt (BGE), 25% ACN innehållande 1 M myrsyra (FA) i vatten.
VARNING: AcOH och FA är giftiga vid inandning eller konsumtion och kan orsaka allvarliga hud- och ögonskador vid direkt exponering. Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av dessa kemikalier. - För att separera peptider med omvänd fas nanoLC, förbered (v / v): Mobil fas A (vattenhaltig), vatten innehållande 0,1% FA; mobil fas B (organisk), 0,1% FA i ACN.
OBS: Alla blandningar bör beredas med lösningsmedel av LC-MS-kvalitet för att minimera kemiska störningar under HRMS-detektering.
- Förbered celllysbufferten så att den inkluderar: 250 mM sackaros, 1% nonidet P-40-substitut (w/v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM cytochalasin D och 10 μM combretastatin 4A. Bered en stam på 10% (w/v) natriumdodecylsulfat14,15.
2. Förbered verktygen för mikroinjektion och dissektion
- För att försiktigt flytta och orientera embryon, gör hårslingor genom att fixera rent hår i en Pasteur-pipett som beskrivs någon annanstans16.
- För mikroinjektion, tillverka nålar genom att dra borosilikatkapillärer (1 mm/500 μm yttre/inre diameter) med hjälp av en pipettdragare enligt beskrivningen på annan plats16.
OBS: Här användes en P-1000 pipettdragare med följande inställningar för tillverkning av nålar: värme, 495; dra, 30, hastighet, 60; tid, 150; tryck, 200. - Med observation under ett stereomikroskop, skär kapillärspetsen med ett par vassa pincett för att väsentligen tillverka kapillären till en (mikro) nål (t.ex. Dumont # 5)16.
VARNING: Dragna kapillärer är mycket vassa och bör hanteras med försiktighet.
OBS: Nålspetsen ska vara tillräckligt skarp (ytterdiameter 10-15 μm) för att kunna genomborra cellen med minimal skada på cellmembranet så att det intracellulära innehållet inte läcker ut och cellen kan läka och fortsätta att vara livskraftig. - För att hålla embryon under mikroinjektion, förbered brunnar i en lerfylld maträtt. I en 15 mm petriskål, prägla ~ 1 mm diameter x ~ 0,5 mm djupa brunnar i giftfri plasticinlera som beskrivs någon annanstans16.
- För mikrodissektion, förbered agarosbelagda rätter. Gör 2% agaros i 1x SS och autoklavera den för att sterilisera lösningen (120 ° C i 20 min). Fyll 60 mm petriskålar halvvägs och låt tallrikarna stelna. Gör ~ 1 mm diameter x ~ 0,5 mm djupa brunnar med ett kulat Pasteur-pipettverktyg som beskrivits tidigare16.
3. Isolera cellinjen
OBS: Följande steg utförs för att isolera identifierade enskilda celler och / eller deras nedstigande cellinjer. Vanligtvis odlas embryot till 16- eller 32-cellstadiet, där vävnadens öden för varje cell kartläggsreproducerbart 6,7,17. De embryonala cellerna identifieras baserat på morfologi, plats och med hänvisning till deras ödeskartor. För encellsanalys isoleras identifierade celler genom manuell dissektion, eller deras intracellulära innehåll samlas in i en kapillärpipett och deponeras i 5 μL 0,5 mM ammoniumbikarbonat. Det resulterande provet förvaras vid -80 °C fram till analysen (figur 1)18,19,20,21. För cellinjeanalys injiceras identifierade celler med ett härstamningsspårämne, och deras efterföljande kloner isoleras i viktiga utvecklingsstadier (t.ex. under gastrulation för att studera vävnadsinduktion, efter neurulation för att studera vävnadsengagemang). I det följande beskrivs steg för att fluorescerande märka härstamningen av identifierade celler för isolering genom dissektion eller FACS.
- Odla embryon
- Skaffa embryon via naturlig parning eller in vitro-fertilisering (IVF) enligt fastställda protokoll12.
OBS: Naturlig parning är logistiskt enklare, skonar de vuxna manliga grodorna och ger embryon i olika utvecklingsstadier, medan IVF ger utvecklingssynkroniserade embryon för experiment som kräver noggrann iscensättning. - Dejelly embryon. Ta bort geléskiktet som omger embryona genom behandling med avgelélösningen enligt beskrivningen på annan plats12,16.
OBS: Mikroinjektioner och dissektion kräver tillgång till celler och vävnader, vilket kräver dejellying i X. laevis embryon. - Välj 2-cellsembryon med stereotyp pigmentering16,22.
OBS: Detta steg är viktigt för att säkerställa noggrannhet och reproducerbarhet vid identifieringen av cellen och dess härstamning. - Odla embryon till önskat utvecklingsstadium. Överför de degellierade embryona till en petriskål som innehåller 1x SS och inkubera dem mellan 14-25 °C för att kontrollera utvecklingshastigheten.
OBS: Temperaturberoendet av utveckling är reproducerbart och kartlagt för X. laevis, tillgängligt på Xenbase23 (www.xenbase.org). Odling av partier av embryon vid olika temperaturer möjliggör svindlande utvecklingsstadier. Att göra det hjälper till att distribuera antalet embryon som är tillgängliga vid en viss tidpunkt för experiment. - Övervaka embryonas klyvningsmönster och välj embryon med stereotypa pigmenterings- och klyvningsmönster för mikroinjektion16.
OBS: När du väljer 16- och 32-cellsembryon, se till att cellklyvningarna är symmetriska för reproducerbar härstamningsspårning.
- Skaffa embryon via naturlig parning eller in vitro-fertilisering (IVF) enligt fastställda protokoll12.
- Märk cellen/cellerna av intresse
- Ställ in injektionsnålen som innehåller spårlösningen. Montera mikroinjektionsnålen i en mikropipetthållare som styrs av en fleraxlig mikromanipulator.
- Anslut mikropipetthållaren till en mikroinjektor. Fyll nålen med härstamningsspårämnet genom att applicera undertryck enligt beskrivningen på annan plats16. Figur 1A exemplifierar installationen.
- Kalibrera nålen. Justera nålspetsens storlek och injektionstiden för att leverera ~ 1 nL av härstamningsspårlösningen, mätt i (mineral) olja enligt ett protokoll som finns tillgängligt någon annanstans16.
OBS: Kapillärer med en bredare spets tenderar att skada cellmembranet, vilket orsakar subcellulärt innehåll och det injicerade härstamningsspårämnet läcker ut, medan kapillärer med mindre spetsar är benägna att täppa till. Kapillärer med ~ 10 μm spets ytterdiameter är idealiska, vilket kräver en 40 psi tryckpuls över ~ 300 ms för att leverera ~ 1 nL. - Översvämma mikroinjektionslerskålen med 3% Ficoll-lösningen och överför ~ 10 embryon till lerskålen med en överföringspipett. Använd en hårslinga för att styra varje embryo i en brunn och placera dem försiktigt så att den riktade cellen av intresse är i rätt vinkel mot mikronålen.
- Identifiera föregångarcellen i släktlinjen av intresse efter X. laevis vävnadens ödeskartor. Till exempel visar figur 1 märkningen av neurala ektodermala kloner baserat på injektion av dess prekursorceller i 32-cellembryon (vänster och höger D111-celler ).
OBS: Detaljerade ödeskartor för 16-6 och 32-cells 7,8 embryon finns tillgängliga i en interaktiv plattform via Xenbase23. Det är viktigt att säkerställa stereotyp pigmentering och klyvning på embryon när de används för härstamningsspårningsexperiment. - Injicera cellen/cellerna av intresse med ~1 nL av det fluorescerande dextran eller ~200 pg mRNA enligt beskrivningen tidigare16.
Använd dextrankonjugat som är 10 000-40 000 MW. Mindre dextrankonjugat kan passera genom gapkorsningar, medan större dextrankonjugat kanske inte diffunderar jämnt in i den injicerade cellen. Planera att injicera celler i ~ 10 embryon för att ha tillräckligt med vävnader för proteomiska analyser. - Bekräfta framgången med cellmärkning under ett stereomikroskop. Se till att endast den avsedda cellen injiceras. Kassera embryon som innehåller skadade eller felaktigt märkta celler i enlighet med institutionell politik.
OBS: Eftersom X. laevis är invasiv i många icke-naturliga miljöer kan embryon frysas för att säkerställa dödlighet innan embryon kasseras.
- Isolera den märkta cellavkomman
- Överför de injicerade embryona till 0,5x SS i en petriskål och odla dem mellan 14-25 ° C tills önskat utvecklingsstadium uppnås.
OBS: Konsultera etablerade protokoll för att iscensätta embryon som rapporterats på Xenbase. - Överför 3-5 embryon till en agarfat med 0,2x SS-lösning för mikrodissektioner.
OBS: Att minska saltkoncentrationen av SS-lösning från 0,5x till 0,2x hjälper till att separera celler under dissektion. - Använd två vässade pincett för att försiktigt ta bort vitellinmembranet som omger embryot.
OBS: För att skona klonen av intresse från skador, skala membranet från motsatt sida av den fluorescerande märkta klonen. - Isolera den märkta klonen genom manuell dissektion (steg 3.3.5-3.3.6) eller FACS (steg 3.3.7-3.3.8) enligt följande.
- Använd pincett för att dissekera den märkta klonen från embryot.
OBS: Andra verktyg som mikrokirurgiska saxar, volframnålar eller ögonbrynshårknivar kan användas för dissektion av den märkta klonen, som beskrivs någon annanstans16. - Samla upp den dissekerade vävnaden med en 0,5-10 μL pipett och deponera dem i en mikrocentrifugflaska. Använd en överföringspipett och aspirera mediet som omger den uppsamlade vävnaden för att begränsa salter i provet, vilket stör HRMS-analysen i senare steg.
Använd injektionsflaskor som minimerar proteinadsorption på plastytor för att minimera proteinförluster på injektionsflaskans ytor under senare steg i arbetsflödet. - För att isolera med FACS, överför ~ 5-8 devitelliserade embryon till varje brunn på en 12-brunnsplatta innehållande ~ 5 ml Newport 2.0-buffert. Dissociera embryona genom att nöta plattan vid 80 rpm i 20-30 min vid rumstemperatur13.
OBS: Embryon / larver äldre än stadium 22 har rikliga extracellulära matrisproteiner, vilket gör dissociation i separata celler svår. Ytterligare enzymatiska metoder kan anpassas för att skilja vävnader från äldre embryon som beskrivs på annan plats24. - Rena de fluorescerande märkta cellerna från suspensionen med hjälp av FACS enligt beskrivningen på annan plats24.
- Pelletceller genom centrifugering och kassera supernatanten.
OBS: Använd låg centrifugeringshastighet (400 × g) och temperatur (4 °C) för att förhindra celllys. Om du använder bovint serumalbumin (BSA) för FACS, tvätta cellpelleten för att minska BSA-störningar under HRMS-detektion. Resuspendera försiktigt cellerna i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och centrifugera igen till pelletssköljda celler. Ta bort supernatanten PBS-vätska. - Frys snabbt de isolerade cellerna genom att placera provflaskan på torris eller flytande kväve.
OBS: Håll proverna (vävnader eller celler) kylda (t.ex. på is) under bearbetningsstegen. Frys cellerna med så lite media runt provet som möjligt för att underlätta nedströms bearbetning. - Förvara proverna vid −80 °C fram till HRMS-analysen.
- Överför de injicerade embryona till 0,5x SS i en petriskål och odla dem mellan 14-25 ° C tills önskat utvecklingsstadium uppnås.
4. Analysera proteinerna med masspektrometri
Proteomisk karakterisering av isolerade vävnader eller celler baseras på en serie etablerade steg i HRMS. Figur 2 illustrerar stegen i det bioanalytiska arbetsflödet. Exempelinsamlingsprotokollet som används här är kompatibelt med bottom-up11, middle-down25 eller top-down26 arbetsflöden för proteomik. I det följande beskrivs den bottom-up-strategi som används i denna studie, som har visat sig vara känslig, kvantitativ och anpassningsbar till olika typer av masspektrometrar. Efter extraktion och enzymatiskt uppslutning av proteiner separeras de resulterande peptiderna, följt av HRMS-analys.
- Bearbeta vävnaderna/enskilda celler
- För encellsanalys med CE, värm provet till 60 °C i ~15 minuter för att denaturera proteiner och balansera sedan provet till rumstemperatur (RT, ~5 min)18,21.
OBS: Till skillnad från vid arbete med vävnader hoppas reduktions- och alkyleringsstegen över för att begränsa proteinförluster under provberedning från enskilda celler. Filterstödd provberedning (FASP)27,28, andra strategier för en kruka 29 och mikrofluidiska metoder30 kan antasför att minimera proteinförluster under provberedning. - För analys med nanoLC, lysera upp till 5 dissekerade vävnader i 50 μL lysbuffert (~ 100 μg totalt protein). Underlätta processen genom att pipettera provet upp och ner några gånger.
- Inkubera lysatet vid 4 °C i 10 minuter och pelletera sedan cellrester och guletrombocyter genom centrifugering vid 4 500 × g vid 4 °C. Överför supernatanten till en ren injektionsflaska med mikrocentrifug och tillsätt 10 % SDS för att erhålla en slutlig koncentration på 1 % SDS i lysatet (v/v).
- För vävnader, följ steg 4.1.5-4.1.7.
- Tillsätt 0,5 M ditiotreitol till lysatet för att erhålla en slutlig koncentration på ~25 mM (t.ex. 2,5 μL 0,5 M ditiotretol till 50 μL lysat) och inkubera lysatet i 30 minuter vid 60 °C för att kemiskt reducera disulfidbindningar i proteiner.
- Tillsätt 0,5 M jodacetamid för att erhålla en slutlig koncentration på ~ 75 mM i lysatet och inkubera blandningen i 15 minuter vid RT i mörkret (figur 2).
- Tillsätt 0,5 M ditiotreitol, samma som den ursprungliga volymen (t.ex. 2,5 μL 0,5 M ditiotretol till 50 μL lysat) för att släcka reaktanter som återstår från alkyleringsreaktionen.
VARNING: Jodoacetamid och ditiotreitol kan orsaka allvarliga hud- och ögonskador vid direkt exponering. Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av dessa kemikalier. - Rena proteiner via utfällning. Kloroform-metanolbaserad utfällning fungerar bra31. Detta protokoll är också anpassningsbart till andra typer av nederbördsmetoder32.
OBS: För encellsanalys, där proteinförluster är oroande, hoppa över utfällningssteget för CE-HRMS. - Torka proteinfällningen i en vakuumkoncentrator (4–37 °C) och suspendera sedan det extraherade proteomet igen i 50 μl 50 mM ammoniumbikarbonat. Uppskatta proteinkoncentrationen med hjälp av en kolorimetrisk analys av totalprotein för att bestämma mängden enzym som krävs för matsmältningen (t.ex. bicincinsyraproteinanalys).
- Smält proteinerna till peptider. Tillsätt trypsin (1 μg/μl stam) för att erhålla ett proteas/proteinförhållande på 1:50 och inkubera blandningen vid 37 °C i upp till 5 timmar för encellsprover och upp till 14 timmar för vävnadsprover. Läs leverantörsspecifika rekommendationer för reaktionen.
OBS: Matsmältning med trypsin längre än 14 timmar eller högre koncentrationer kan införa klyvningar som är ospecifika för proteinets sekvens, vilket utmanar proteinidentifieringar33. - Kvantifiera den totala peptidkoncentrationen med hjälp av en kolorimetrisk analys.
- VALFRITT: För multiplexeringskvantifiering, märk peptiderna från varje prov med en annan isobarisk masstagg enligt leverantörsspecifika instruktioner. Blanda de streckkodade peptiderna i lika stora proportioner per peptidprov.
OBS: Säkerställ korrekt märkning och blandning för att undvika kvantitativa fördomar. För kvantitetsbegränsade prover eller encellsprover kan en TMT-baserad bärarkanal bestående av poolade vävnader / celler inkluderas för att minimera provförluster under efterföljande separationssteg och för att öka känsligheten hos lägre rikliga proteiner34. - VALFRITT: Avsalta peptider för att avlägsna salter och föroreningar (t.ex. oreagerade isobariska masstaggreagens) på en C18-rotationskolonn / spets med omvänd fas för att skydda LC-MS-systemet.
- VALFRITT: Fraktionera (t.ex. fraktionering med medelhögt eller högt pH-omvänt fas) peptidblandningen för djupare detektion av proteomet via manuella eller automatiska plattformar. Använd C18 stationär fas som innehåller tips för att fraktionera låga mängder (1-10 μg) peptid smälter.
- Torka peptidblandningen vid 60 °C i en vakuumkoncentrator.
- Förvara peptidblandningen vid −80 °C tills mätning.
- För encellsanalys med CE, värm provet till 60 °C i ~15 minuter för att denaturera proteiner och balansera sedan provet till rumstemperatur (RT, ~5 min)18,21.
- Separera peptiderna
OBS: Efter extraktion och enzymatiskt uppslutning av proteiner separeras de resulterande peptiderna med nanoLC eller CE och joniseras av ESI för sekvensering med tandem HRMS. Omvänd fas nanoLC-separation är idealisk för peptider som samlar ~ 150 ng till ~ 1 μg per analys. CE ger kompletterande känslighet för peptider som sträcker sig från femtogram till <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 och används alltmer för encellsanalys18,36,37.- Om du vill separera med CE följer du steg 4.2.2–4.2.7.
OBS: I det följande beskrivs användningen av den specialbyggda CE-plattformen för mätning av peptiderna. Protokoll för att bygga och använda detta CE-instrument tillhandahölls tidigare38, tillsammans med ett visualiserat experiment om användning för små molekyler20. Alternativt kan dessa mätningar utföras på ett kommersiellt CE-system, såsom AB SCIEX CESI, Agilent 7100 eller motsvarande. - Bered proteinuppslutningen i 1-2 μL av provlösningsmedlet, virvel för att blanda provet och centrifugera det vid 10 000 x g i 2 minuter till pelletscellskräp.
OBS: Avlägsnande av cellskräp minimerar sannolikheten för igensättning av CE-kapillären, vilket förlänger separationssystemets livslängd och ökar mätgenomströmningen. - Initiera CE-ESI-instrumentet genom att spola CE-kapillären med BGE.
- Validera instrumentell prestanda med hjälp av en känd standard (t.ex. cytokrom C eller BSA-smältning, angiotensinpeptider).
OBS: Utvärdering av instrumentet med avseende på massnoggrannhet, detektionskänslighet, reproducerbarhet och linjärt dynamiskt kvantifieringsområde rekommenderas innan värdefulla prover mäts. Ytterligare anmärkningar om validering och felsökning av CE-ESI-MS-prestanda finns på annan plats18,20,38. - Injicera ~ 1-10 nL av provet i CE-separationskapillären.
OBS: Denna studie använder ~ 1 m lång smält kiseldioxidkapillär (40/110 μm inner/yttre diameter) med den elektrokinetiskt pumpade mantelflödesinställningen. Kommersiella CE-instrument kräver vanligtvis presentation av 5-10 μL prov i ett mikrorör för injektion. Den specialbyggda CE-plattformen18,38 är kompatibel med ~ 250 nL till 1 μL prov deponerat i ett provladdande mikrorör. - Överför inloppsänden på CE-separationskapillären till BGE.
- Starta elektroforetisk separation genom att gradvis rampa CE-separationsspänningen från jordjord (t.ex. stegvis över 1 min). Potentialer på 20-28 kV med ström under ~ 10 μA säkerställer stabil och reproducerbar instrumentell prestanda för analys.
- För att separera med nanoLC, följ steg 4.2.9-4.2.12.
- Resuspendera peptidprovet i mobil fas A. Provets koncentration och volym för injektion beror på tillgängligt LC-system och kolonn. I denna studie injiceras ~250 ng-1 μg proteinröta i 1-20 μL provvolym på en C18-kolonn med packbädd (75 μm innerdiameter, 2 μm partikelstorlek med 100 Å porer, 25 cm lång separationskolonn).
- Överför provet till en LC-injektionsflaska.
Observera: Se till att det inte finns några luftbubblor i injektionsflaskan som kan skada analyskolonnen. Injektionsflaskor med inlägg kan användas för vävnads- eller encellsprover med låg volym. - Fyll ~200 ng till 2 μg peptidprov på C18-analyskolonnen.
OBS: Eventuellt kan peptiderna laddas på en fällkolonn för avsaltning före analytisk separation. Till exempel en C18-fällkolonn med 0,1 mm innerdiameter, 5 μm partikelstorlek, 100 Å porstorlek, 20 mm längd. Avsalta peptider med 100% buffert A med en flödeshastighet på 5 μl/min i 5 min innan separationsgradienten börjar. - Separera peptiderna med gradienteluering. Vid ett flöde på 300 nL/min är den 120 minuter långa gradienten som används i denna studie följande: 0-5 min 2% B, 5-85 min 2-35% B, 86-90 min 70% B, 91-120 min 2% B.
- Om du vill separera med CE följer du steg 4.2.2–4.2.7.
- Jonisera peptiderna med ESI
CE- eller nanoLC-kapillären är oftast kopplad till en ESI-källa för jonisering. CE-ESI-gränssnitt för ultrakänslig detektion har tidigare utvecklats för mikroflöde (trubbig spets) och nanoflöde (konisk spets39 och elektrokinetisk pumpad mantelflöde36 ).- Tillför separeringspeptiderna till en elektrosprayjonkälla för jonisering med hjälp av ett kommersiellt eller specialbyggt ESI-gränssnitt. För encells CE-ESI-MS-analys i Xenopus-embryon , använd ett elektrokinetiskt pumpat lågflödesgränssnitt där CE-kapillärutloppet är inneslutet i en dragen borosilikatemitter.
- Kontrollera vätskeflödet genom elektrospraysändaren med hjälp av en kamera och inspektera inställningen visuellt för eventuella läckor.
- Ställ in elektrosprayspänningen på ~ 2,5 kV för att starta ESI-källan (jämfört med jordjord).
- Säkerställ en stabil nanospray för HRMS-analys genom att övervaka den totala jonströmmen. Justera elektrosprayspänningen och sändarens avstånd till HRMS-inloppet för att uppnå en stabil spray (<15% relativ standardavvikelse i total intensitet).
- Upptäck peptiderna
OBS: Detektion av peptider följer olika instrumentella överväganden för isobarisk massa taggade och omärkta peptider och beror på typen av tillgänglig masspektrometer. Denna studie använder en orbitrap tribrid masspektrometer enligt följande steg.- Hämta MS1-händelser med inställningarna: Analyzer, orbitrap; Spektral upplösning, 120 000 full bredd vid halv maximum (FWHM); maximal injektionstid (IT), 50 ms; automatisk förstärkningskontroll (AGC), 4 x 105 räkningar; mikroskanningar, 1.
- För att sekvensera peptider, fragmentera prekursorjoner för detektion i jonfällanalysatorn med hjälp av inställningarna: fragmenteringsläge, kollisionsdissociation med högre energi (HCD); kollisionsgas, kväve; kollisionsenergi, 32% normaliserad kollisionsenergi (NCE); maximal IT, 70 ms; AGC, 1 x 104 räkningar; mikroskanningar, 1.
- VALFRITT: Kvantifiera TMT-märkta peptider med tandem/flerstegs HRMS (MS2/MS3). För MS3 som använder synkront prekursorval är de typiska instrumentinställningarna följande. Enstegsskanningar (MS1) som kartlägger de vanligaste jonerna dissocieras via databeroende insamling med hjälp av parametrarna: MS 2-fragmenteringsläge, kollisionsinducerad dissociation (CID); kollisionsgas, helium; kollisionsenergi, 35% NCE; analysator för fragmentjoner, jonfälla följande inställningar: maximal IT, 50 ms; AGC, 5 x 104 räkningar; mikroskanningar, 1. Välj 10 MS2 fragmentjoner och fragmentera dem med HCD i kväve (65% NCE). Detektera MS 3-fragmentjoner med följande inställningar: Orbitrap-upplösning 15 000 FWHM, maximal IT, 120 ms; AGC, 1 × 105 räkningar; mikroskanningar, 1.
OBS: Olika MS-förvärvsmetoder och parametrar kan användas för taggade prover enligt leverantörens rekommendationer som beskrivs någon annanstans11,40.
- Analysera data
OBS: Proteiner identifieras och kvantifieras med hjälp av avancerade bioinformatiska paket. Identifieringarnas trohet beräknas med hjälp av en lockdatabas, uttryckt som falsk upptäcktshastighet (FDR) på nivån av peptider och proteiner.- Bearbeta data med hjälp av kommersiella programvarupaket eller programvarupaket med öppen källkod (granskad i referens41). Matcha rådata mot en databas som förbereddes genom att sammanfoga Xenopus-proteomet 9.2 med den mRNA-härledda PHROG-databasen42.
OBS: Sökparametrarna är: matsmältningsenzym, trypsin; missade klyvningar, upp till 2; variabel modifiering, metioninoxidation; statisk modifiering, cysteinkarbamidometylering; prekursormasstolerans, 10 ppm; fragmentmasstolerans, 0,6 Da; minsta peptidlängd, 5; identifiering trohet, <1% FDR för peptider och proteiner. Utan alkylering till peptider utesluts karbamidometylering som statisk modifiering under databassökning (t.ex. för encellsanalys). - Kvantifiera proteinöverflöd via etikettfria43 eller etikettbaserade strategier44,45.
- VALFRITT: Kommentera proteiner för genontologi. PantherDB46, Reactome47 eller Xenbase23 kan användas.
- VALFRITT: Kvantifiera proteinöverflöd och skillnader i proteinöverflöd mellan cell- / vävnadstyper med hjälp av mjukvarupaket / webbverktyg, såsom Trans-Proteomic Pipeline48, Perseus49 och Orange50.
OBS: Ytterligare överväganden om experimentell design och programvarualternativ granskades någon annanstans41,51. - VALFRITT: Utvärdera resultaten ytterligare med hjälp av kunskapsbaser, såsom STRING52 och BioPlex Display 53 för kända protein-proteininteraktioner och PhosphoSiteplus54 för fosforyleringar. För att analysera motiv och domäner som representeras i proteomet, använd webbverktyg som Simple Modular Architecture Research (SMART)55.
- Bearbeta data med hjälp av kommersiella programvarupaket eller programvarupaket med öppen källkod (granskad i referens41). Matcha rådata mot en databas som förbereddes genom att sammanfoga Xenopus-proteomet 9.2 med den mRNA-härledda PHROG-databasen42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll möjliggjorde studier av proteiner i enskilda celler och deras härstamningar när de etablerar vävnader i X. laevis embryon. Figur 1 illustrerar en sådan tillämpning av metoden att studera proteiner i neuralvävnadsödesdigra celler och den nyligen inducerade neurala ektodermen i embryot. Som visas i figur 1A integrerade det bioanalytiska arbetsflödet traditionella verktyg för cell- och utvecklingsbiologi för att identifiera, injicera / aspirera celler och samla prover. Figur 1B visar mikrosondprovtagning av vänster dorsal-djurcell (D11) i 16-cellsembryot in vivo med hjälp av en mikroinjektor; Efter experimentet utvecklades embryon framgångsrikt till grodyngel med normal anatomi56. Stora embryonala celler (~ 100-250 μm i diameter) bidrog också till manuell mikrodissektion. Dissektion av en höger dorsal-animal mittlinje (D11) cell illustreras från 16-cellembryot i figur 1C. Installationen gjorde det också möjligt att spåra en klonal bana genom att injicera ett fluorescerande spårämne i den identifierade prekursorn. Som visas i figur 1D tillät metoden att isolera kloner som härrör från vänster och höger D111-celler via vävnadsdissektion eller genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). De provinsamlingsstrategier som beskrivs här är tillräckligt skalbara i tid och rum för att studera embryonal utveckling i nya detaljer.
Det bioanalytiska arbetsflödet integrerade HRMS-teknik för att förbättra känslighet och kvantifiering (figur 2). De insamlade proteinerna mättes via en bottom-up proteomisk metod. Valfri fraktionering av prover baserat på ortogonal kemi (t.ex. högt pH och sedan lågt pH omvänd fas LC) underlättade detektionskänsligheten. För att separera peptider valdes CE för spårmängder av prover (<< ~ 100 ng)) och nanoLC för begränsade mängder material (>>150 ng). Peptider sekvenserades med ESI-HRMS. De detekterade proteinerna kvantifierades med hjälp av etikettfria och etikettbaserade strategier. Förenkling av provbearbetning för encellsanalys, såsom eliminering av de typiska stegen för reduktion och alkylering följt av CE-analys, underlättade identifieringen av ~ 400-800 olika proteiner. Bland de rapporterade proteinerna fanns många med viktiga funktionella roller, såsom chaperonin innehållande TCP1 subenhet 3 (Cct3), spänningsberoende jonkanal (Vdac2) och kreatinkinashjärna (Ckb). Multivariata och statistiska datamodeller hjälpte oss10,57 och andra 9,58 att hitta tidigare okända skillnader i den proteomiska sammansättningen av utvalda celler och vävnader med hjälp av de metoder som sammanfattas i detta protokoll. I synnerhet krävde dessa HRMS-mätningar inga fungerande sonder eller kunskap om provernas sammansättning i förväg, vilket stöder upptäckter.
I en serie studier kvantifierades det proteomiska tillståndet hos identifierade celler i utvecklande embryon av X. laevis (fig. 3)21. Figur 3A visar detektion av gentranslationella skillnader mellan D11-celler som dissekerades från olika embryon10. Mikroprovtagning CE-ESI-HRMS gjorde det möjligt för oss att identifiera och kvantifiera upp till ~ 700 proteiner från enskilda celler21. De representativa primära HRMS-MS/MS-data för identifiering av ~400 kumulativa proteiner från tekniska dubbla mätningar på en D11-cell i embryot deponerades till PRIDE. Tillvägagångssättet var skalbart till mindre celler och embryon från andra modellorganismer, såsom zebrafisk21. Skalbarhet till mindre cellstorlekar gjorde det möjligt för oss att utforska den spatiotemporala omorganisationen av D11-avkomman från ett levande embryo som det utvecklades i tid. Figur 3B visar användningen av detta protokoll för att utföra subcellulär kvantitativ proteomik av identifierade celler i 16-, 32-, 64- och 128-cellembryon. Proteiner delades in i fyra grupper som visade distinkta överflödsprofiler över klonal utveckling21.
Figur 3: Protokollets skalbarhet från det subcellulära utrymmet till klonala vävnader i X. laevis embryo. (A) Mätning av proteomiska skillnader mellan identifierade hela D11-celler, vilket avslöjar cell-cell heterogenitet. Gennamn visas för utvalda proteiner. (B) Omorganisation av det cellulära proteomet i den utvecklande D11-cellklonen. Fuzzy C-means cluster analysis (GProx) av proteindynamik, gruppering av proteiner baserat på liknande uttrycksmönster. Grå siffror visar antalet olika proteiner som kvantifierades i varje kluster. Siffrorna anpassades med tillstånd från referenserna 21,57. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Detta protokoll gjorde det möjligt för oss att genomföra rumslig och temporal proteomik i identifierade, utvecklande cellkloner (figur 4). Figur 4A visar tillämpningen av metoden för märkning och isolering av cellkloner som utgör två vävnader med viktiga roller i nervvävnadsutveckling och mönstring av embryot. Majoriteten av Spemann-organisatören (SO) spårades genom att märka vänster och höger D 112 och D212-celler via injektion av fluorescerande dextran. Parallellt märktes de närliggande dorsala djurcellerna (D111) för att markera majoriteten av neural ektoderm (NE). Vävnaderna dissekerades och deras proteininnehåll analyserades enligt detta protokoll. nanoLC-ESI-HRMS returnerade upp till 2,000 olika proteiner från vävnaderna, inklusive signalering, såsom Wnt-, Fgf- och Tgfβ-vägarna. De representativa primära HRMS-MS/MS-data för identifiering av ~1 800 kumulativa proteiner från tekniska duplikatmätningar på en pool av dissekerade SO-vävnader deponerades till PRIDE. Wnt-vägliganden Wnt10a och Wntless (Wls), ett membranprotein dedikerat till utsöndringen av Wnt-ligander, detekterades endast i NE-proteomet. Wnt-vägen hittades undertryckt i SO och kan förklara en brist på Wnt-interagerande proteiner som detekteras i SO. Dessa resultat visar tillämpligheten av detta protokoll för att studera härstamningsspecifika skillnader inom embryot.
Figur 4: Exempel på dataanalys från rumslig vävnadsproteomik i X. laevis embryon. (A) Differentiell märkning av vävnaderna Spemann's Organizer (SO) och neural ektoderm (NE) genom injektion av fluorescerande protein mRNA i föregångaren D 112 respektive D212 i 32-cellembryot. (B) Topp 5 överrepresenterade biologiska processer i SO (rött) och NE (grönt) proteom som visar påvisbara skillnader. Pathway overrepresentationsanalys visar biologiska processer med Bonferroni-korrigering. (C) Proteindomänanrikningsanalys (SMART), som avslöjar anrikning av DNA- och RNA-bindande motivinnehållande proteiner i SO. (D) STRING-analys som förutsäger kanoniska protein-proteininteraktioner baserat på det detekterade SO-proteomet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
De olika proteomiska uppgifterna fungerar som värdefull information för bedömning av funktion. Proteomiska data kan utvärderas med hjälp av kanoniska kunskapsbaser. Som visas i figur 4B visade väganalys av dysreglerade proteiner överrepresenterad översättning och energimetabolism i både SO- och NE-dataseten i våra senaste studier. NE-proteomet anrikades i proteiner associerade med kärntransport av proteinlast i cellen, vilket sannolikt indikerar nedströms händelser efter signalering i den nyetablerade NE (figur 4C). Anrikningsanalysen i figur 4D fann uppreglering i translationsinitiering, RNA-bindning, bindning i proteasomkomplexet, vilket tyder på en roll för dynamisk proteinomsättning som utvecklar SO. Celllinjestyrd HRMS-proteomik är skalbar i rum och tid och tillräckligt känslig för att bättre förstå den molekylära organisationen av celler under normal och nedsatt utveckling.
Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll möjliggör karakterisering av proteinuttryck i identifierade cellinjer i embryon av Xenopus-arten. Metoden bygger på HRMS och kombinerar utsökt specificitet i molekylär identifiering, förmåga för multiproteindetektion utan molekylära sonder (vanligtvis hundratals till tusentals olika proteiner) och en förmåga till kvantifiering. Anpassningsförmåga till klassiska verktyg och arbetsflöden inom cell- och utvecklingsbiologi (neuro) utökar HRMS-proteomiken till spännande tillämpningar, inklusive holistisk karakterisering av stamcellsdifferentiering i ryggradsdjurens X. laevis-embryo.
Stegen beskriver celllinjestyrd proteomik i X. laevis-embryot. Som exempel demonstrerar vi analysen av neurala ödesdigra enskilda celler och deras härstamningar och tillhandahåller motsvarande CE- och nanoLC HRMS-dataset genom ett offentligt datalager (se PRIDE). Detta tillvägagångssätt är lätt anpassningsbart till studier om spatiotemporal reglering av proteiner i flera celltyper (och linjer). Spatiotemporalt styrd proteomik i det utvecklande embryot kan också utvidgas till transkriptomiska och metabolomiska studier för att främja molekylärsystembiologins förståelse av celldifferentiering och utveckling av nyckelorgan, såsom nervsystemet.
Detta protokoll lägger till nya dimensioner till bioanalysen. Cellkulturer, såsom inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)1,2, underlättar mätningen av temporal proteomdynamik under celldifferentiering. Tillvägagångssättet som beskrivs i denna studie är inriktat på cellödesinduktion i det 3-dimensionella levande embryot, där komplexa morfogengradienter, parallella signalvägar och konvergerande förlängningsprocesser samarbetar för att åstadkomma vävnadsinduktion och morfogenes. Att studera proteomdynamik i samband med ett embryo kan ge information om parallella mekanismer som styr celldifferentiering, en spännande riktning för att fördjupa förståelsen av differentiering och utveckling.
Det tillvägagångssätt som beskrivs här lånar de experimentella fördelarna med Xenopus-arterna för detta ändamål, särskilt X. laevis. Varje cell i det tidiga 16- och 32-celliga X. laevis-embryot kartläggs till reproducerbara vävnadsöden i den vuxna organismen, i huvudsak en rumslig projektion av celler i klyvningsstadiets embryon. Reproducerbarhet för cellstyrd proteomik bygger på noggrann celltypning. Vi hjälper framgång genom att legitimera embryon för stereotyp pigmentering och klyvning innan vi fortsätter till experiment som beskriver celldissektion och härstamning som spårar16,20. Det är viktigt att notera att celler av klyvningsstadium embryon ofta bidrar till bildandet av olika vävnadstyper i olika grad; Information om deras nivåbidrag till varje vävnadstyp finns på Xenbase23. Det embryonala stadiet och prekursorceller som ska härstamas bör därför väljas utifrån den aktuella biologiska frågan. Vid odling av embryon under längre tidsperioder (t.ex. >1 d) bör man vara noga med att avlägsna skadade/döda embryon, vilket i sin tur kan minska livsdugligheten för de andra embryona i populationen.
För framgångsrik HRMS-proteomik bör noggrann uppmärksamhet ägnas åt de analytiska grunderna för cell-/vävnadsinsamling, proteinextraktion och HRMS-mätning. Eftersom Xenopus-embryon odlas i media som innehåller höga koncentrationer av icke-flyktiga salter som är kända för att minska HRMS-känsligheten, rekommenderas att minska aspirerade medier när cellerna och vävnaderna samlas in för proteomiska studier. Det är en bra praxis att utforska avsaltning för att främja identifieringen och kvantifieringen av proteinerna. Före HRMS-mätning bör den analytiska prestandan hos CE- och LC-ESI-HRMS-instrumenten utvärderas, inklusive separation, jonisering, reproducerbarhet och linjärt dynamiskt kvantifieringsområde. Med bra analytiska mätvärden hjälper detta protokoll till att minska djuranvändningen i biologisk forskning, hjälper känsligheten för att få mer kraftfulla uppsättningar biokemiska data och förbättrar kraften i statistisk dataanalys för att tolka resultat. Som standard analyserar vi varje biologisk replikat i minst 3 tekniska replikat med hjälp av CE eller LC-HRMS, som används för att utvärdera teknisk reproducerbarhet och fördjupa täckningen av det detekterbara proteomet. Effektanalys hjälper uppskattningen av statistisk styrka och design av den biologiska replikatstorleken. Användning av olika uppsättningar av föräldragrodor rekommenderas för att ta hänsyn till naturligt förekommande biologisk variation bland embryon.
KOMPLETTERANDE INFORMATION
HRMS-MS/MS-proteomikdata och relaterade bearbetningsfiler deponerades till ProteomeExchange-konsortiet via PRIDE60-partnerdatabasen med datauppsättningsidentifieraren PXD030059.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Jie Li (University of Maryland, College Park) för värdefulla diskussioner om embryonal dissociation och FACS. Vi tackar Vi M. Quach och Camille Lombard-Banek för hjälp med provberedning och datainsamling i tidigare studier som exemplifierar de proteomiska tillämpningar som lyfts fram i detta protokoll. Delar av detta arbete stöddes av National Science Foundation under prisnummer IOS-1832968 KARRIÄR (till P.N.), National Institutes of Health under prisnummer R35GM124755 (till P.N.), University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (till PN) och COSMOS Club Foundation forskningspriser (till A.B.B. och L.R.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
References
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560 (2021).
- Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
- Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2000).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. Vleminckx, K. 1865, Humana Press Inc. NY. 175-194 (2018).
- Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
- Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
- Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P. Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. 628, 263-292 (2019).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11 (2016).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956 (2017).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Developmental Biology. 120 (1), 299-304 (1987).
- Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
- Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
- Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
- Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
- Wisniewski, J. R. Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. Becher, D. 1841, Humana Press Inc. NY. 3-10 (2018).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882 (2018).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
- Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
- Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161 (2018).
- Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
- Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21 (2019).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
- Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
- Pino, L. K., Rose, J., O'Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
- Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25 (2020).
- Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
- Schmidt, E., et al. On the Move Federated Workshops. , Springer, Verlag. Berlin. 710-719 (2006).
- Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
- Jensen, L. J., et al. STRING 8 - a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
- Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
- Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
- Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
- Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
- Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
- Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
