Summary
Burada, omurgalı Xenopus laevis embriyosunda bilinen doku kaderlerine sahip hücre soylarının kütle spektrometrisine dayalı proteomik karakterizasyonu açıklanmaktadır.
Abstract
Moleküler olayların hücreler doku ve organlara yol açtıkça karakterizasyonu, normal gelişimi daha iyi anlama ve hastalıklar için etkili ilaçlar tasarlama potansiyelini artırmaktadır. Çeşitli tiplerin ve çok sayıda proteinin doğru bir şekilde tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlayan teknolojiler, uzay ve zamanda doku ve organizma gelişimini düzenleyen moleküler mekanizmalar hakkında hala eksik bilgi sağlayacaktır. Burada, Xenopus laevis (kurbağa) embriyolarında tanımlanmış hücre soylarındaki binlerce proteinin ölçülmesini sağlayan kütle spektrometrisine dayalı bir protokol sunuyoruz. Yaklaşım, tekrarlanabilir hücre-kader haritalarına ve bu omurgalı gelişim modelinden hücreleri ve soylarını (klonlarını) tanımlamak, floresan olarak etiketlemek, izlemek ve örneklemek için yöntemler üzerine kuruludur. Diseksiyon veya floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile mikro örnekleme veya izole hücreler kullanılarak hücresel içerik toplandıktan sonra, proteinler aşağıdan yukarıya proteomik analiz için ekstrakte edilir ve işlenir. Sıvı kromatografisi ve kılcal elektroforez, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) ile protein tespiti ve nicelleştirilmesi için ölçeklenebilir ayırma sağlamak için kullanılır. Nöral-doku kaderi olan hücrelerin proteomik karakterizasyonu için temsili örnekler verilmiştir. Hücre soy rehberliğinde HRMS proteomik, farklı doku ve organizmalara uyarlanabilir. Omurgalı gelişimi sırasında proteomun uzaysal-zamansal dinamiklerine bakmak için yeterince hassas, spesifik ve nicelikseldir.
Introduction
Hücre farklılaşması ve doku ve organların oluşumu hakkındaki anlayışımız, genlerin ve ürünlerinin onlarca yıllık ayrıntılı hedeflenmiş ekranlarının sonucudur. Önemli hücresel olaylar sırasında tüm biyomoleküller ve miktarları hakkındaki bilgimizi arttırmak, omurgalı vücut planının mekansal ve zamansal modellemesini kontrol eden moleküler mekanizmaların çözülmesine yardımcı olacaktır. Moleküler amplifikasyon ve dizilemeyi mümkün kılan teknolojiler artık çok sayıda gen ve transkript hakkında rutin olarak rapor verebilmekte ve temel biyolojik ve translasyonel araştırmalarda hipotez odaklı çalışmaları desteklemektedir. Gelişmekte olan sistemleri anlamak için, transkripsiyon ve çeviri arasındaki karmaşık bir ilişki, çoklu proteinlerin ve bunların çeviri sonrası modifikasyonlarının doğrudan analizini savunur. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler gibi in vitro biyolojik sistemleri kullanan küresel proteomikler, doku indüksiyon mekanizmalarını tanımlamaya başladı 1,2. Omurgalı embriyosu gibi karmaşık organizmalarda gelişim, uzay ve zaman bağlamında morfojen gradyanlarına dayanır3. Hücreler sinir dokuları gibi özel dokular oluşturmak için farklılaştıkça proteomik değişiklikler hakkında bilgi edinmenin, normal ve kusurlu gelişimi kontrol eden moleküler programların kilidini açmak ve yeni nesil terapötiklere rehberlik etmek için bir anahtar sunduğu anlaşılmaktadır.
Omurgalı Güney Afrika pençeli kurbağası (Xenopus laevis), hücre ve gelişimsel, nöro ve rejeneratif biyolojide köklü bir modeldir. Sir John Gurdon'un somatik çekirdeğin pluripotensinin keşfi için 2012 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü 4,5, bu modelin temel ve translasyonel çalışmalardaki keşifler için önemini vurguladı. Xenopus embriyoları anneye dışarıdan gelişir, böylece hücrelerin, hücre klonlarının ve gen ekspresyonunun gelişimin çeşitli aşamalarında doğrudan manipülasyonunu kolaylaştırır. Asimetrik pigmentasyon ve basmakalıp hücre bölünmeleri, 16-6 ve 32 hücreli 7,8 aşamalı embriyodan tekrarlanabilir kader haritalarının çizilmesini sağladı. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS) tabanlı proteomikler için, modelin ek avantajları, analiz için bol miktarda protein içeriği sağlayan nispeten büyük boyutu (~ 1 mm çapında) içerir (erken bölünme aşamasındaki embriyolarda ~ 130 μg, 16 hücreli embriyonun tek hücrelerinde ~ 10 μg protein içeriği)9,10.
Şu anda, HRMS, proteinleri tespit etmek için tercih edilen önde gelen teknolojidir. Bu teknoloji, çoklu, genellikle yüzlerce-binlerce farklı proteinin doğrudan, hassas ve spesifik olarak algılanmasını ve nicelleştirilmesini sağlar11. HRMS tarafından aşağıdan yukarıya proteomik, birbirine bağlı bir dizi adımı içerir. Hücre / doku örneğinden ekstraksiyonu takiben, proteinler tripsin (aşağıdan yukarıya proteomik) gibi proteolitik bir enzimle sindirilir. Elde edilen peptitler, hidrofobiklik (ters fazlı sıvı kromatografisi, LC), net yük (iyon değişim kromatografisi), boyut (boyut dışlama kromatografisi) veya elektroforetik hareketlilik (kılcal elektroforez, CE) dahil olmak üzere farklı fizikokimyasal özelliklerine göre ayrılır. Peptitler daha sonra tipik olarak elektrosprey iyonizasyonu (ESI) kullanılarak yüklenir (iyonize edilir) ve peptid iyonları tandem HRMS ile gaz fazı parçalanması yoluyla tespit edilir ve sıralanır. Elde edilen peptit verileri, incelenen organizmanın proteomu ile eşleştirilir. Proteine özgü (proteotik) peptid iyon sinyal yoğunluğu konsantrasyon ile korelasyon gösterdiğinde, protein nicelleştirmesi etiketsiz veya etiket bazlı (çoklama kantitasyonu) gerçekleştirilebilir. HRMS proteomikleri, incelenen sistemin moleküler durumu hakkında zengin bir bilgi kaynağı sunarak, hipotezlerin üretilmesine ve fonksiyonel çalışmaların izlenmesine olanak tanır.
Şekil 1: Gelişmekte olan (kurbağa) embriyoda hücre-soy rehberliğinde HRMS proteomiklerini sağlayan mekansal olarak ölçeklenebilir proteomikler. (A) Numunenin (1) tanımlanmış bir hücrenin (iç kısım) enjeksiyonu için stereomikroskop (2) kullanılarak, bir çeviri aşaması (4) tarafından kontrol altında tutulan fabrikasyon bir mikropipet (3) kullanılarak görselleştirilmesi. (B) 16 hücreli bir embriyoda tanımlanan sol D11 hücresinin hücre altı örneklemesi. (C) 16 hücreli bir embriyodan bütün bir D11 hücresinin diseksiyonu. (D) Gastruladaki nöral ektodermin (NE) diseksiyonuna rehberlik etmek için 32 hücreli bir embriyodan sol ve sağ D111 döllerinin floresan (yeşil) izlenmesi (evre 10) ve FACS kullanılarak kurbağa yavrusundan inen dokunun izolasyonu. Ölçek çubukları: embriyolar için 200 μm, şişe için 1.25 mm. Rakamlar 15,19,21,59 referanslarından izin alınarak uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Burada sunulan protokol, gelişmekte olan X. laevis embriyolarında tanımlanmış hücrelerde / dokularda çok sayıda proteinin HRMS tabanlı nicelleştirilmesini sağlar. Yaklaşım, doğru hücre tanımlama, tekrarlanabilir hücre kader haritaları ve bu biyolojik model 6,7,8'deki hücre soylarını izlemek için yerleşik metodolojiler üzerine kuruludur. Şekil 1'de gösterildiği gibi, hücresel içeriği aspire etmek için tüm hücre diseksiyonu veya kılcal mikro örnekleme kullanarak tek hücrelerden proteomları inceliyoruz. Bir hücrenin soyunu izlemek, hücreler gastrulasyon sırasında dokular oluştururken proteomun uzaysal zamansal evrimini incelememize izin verir. Hücre soyunun, floresan protein (örneğin, yeşil floresan proteini veya GFP) için inert dekstran veya mRNA'ya konjuge edilmiş bir florofor enjekte edilmesiyle floresan olarak işaretlenir. Etiketli döl, istenen gelişimsel zaman noktalarında izole edilir. Gastrulasyon sırasında, sıkıca kümelenmiş hücre klonları diseksiyon ile izole edilebilir. Gastrulasyondan sonra, hücre klonları göç hareketleri nedeniyle embriyo içinde dağıtılabilir ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile ayrışmış dokulardan izole edilebilir. Bu hücre ve dokulardaki proteinler, ayırma için HPLC veya CE ve tanımlama için ESI tandem HRMS kullanılarak aşağıdan yukarıya proteomiklerle ölçülür. Hücre soyu rehberliğinde HRMS proteomikleri, embriyo içindeki farklı hücre boyutlarına ve soylarına ölçeklenebilir ve spesifik, hassas ve kantitatiftir. Burada gösterilen seçkin örnekler aracılığıyla, bu protokolün ölçeklenebilir olduğunu ve farklı hücre türlerine ve hücre soylarına geniş ölçüde uyarlanabileceğini de gösteriyoruz.
Şekil 2: Biyoanalitik iş akışı. Mikro-diseksiyon ve kılcal aspirasyon veya FACS, hücresel ve klonal protein içeriğinin örneklenmesini kolaylaştırdı. Bol miktarda yumurta sarısı proteininin tükenmesi ve kılcal elektroforez (CE) veya nano-akış sıvı kromatografisi (LC) ile ayrılması, elektrosprey iyonizasyon (ESI) yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) kullanılarak gelişmiş tanımlama (ID) hassasiyeti. Niceliklendirme, gen ontolojisinden (GO) elde edilen bilgilerle bağlantılı olarak hipotez odaklı çalışmalar için yeni bilgiler sağlayan düzensizliği ortaya çıkardı. Şekillerreferans 15'ten izin alınarak uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Xenopus laevis yetişkin kurbağalarının insancıl bakımını ve kullanımını sağlayan tüm protokoller, Maryland Üniversitesi, College Park'taki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (Onay numaraları R-DEC-17-57 ve R-FEB-21-07).
1. Çözümleri hazırlayın
- Embriyoloji için
- 1x, 0.5x ve 0.2x Steinberg çözeltisini (SS) hazırlayın, ardından standart protokoller12'yi izleyerek steriliteye kadar otoklavlayın (20 dakika boyunca 120 ° C).
- Standart protokoller12'yi izleyerek sterilize edilmiş 1x SS'de %3 (w/v) Ficoll hazırlayın.
- Jöle giderme için, taze% 2 (w / v) sistein çözeltisi hazırlayın ve damla damla 10 M sodyum hidroksit çözeltisi ekleyerek pH'ını 8'e ayarlayın.
DİKKAT: Sistein maruziyeti cilt ve solunum hasarına neden olabilir. Sodyum hidroksit, doğrudan maruz kaldığında cilde ve gözlere ciddi zarar verebilecek bir aşındırıcıdır. Bu kimyasalları kullanırken eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. - Soy izleyici için, steril deiyonize suda floresan dekstranın% 0.5'ini (v / v) hazırlayın. Alternatif olarak, steril deiyonize sudaki (örneğin, GFP) floresan proteinler için 0.2 μg / μL mRNA çözeltisi hazırlayın.
- Hücreleri ayrıştırmak için, 0.1 M sodyum isethionate, 20 mM sodyum pirofosfat ve 10 mM CAPS içeren Newport 2.0 tamponunu hazırlayın, ardından pH'ını 10.513'e getirin.
DİKKAT: Sodyum pirofosfata maruz kalmak cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Bu kimyasalları kullanırken uygun KKD'leri kullanın.
- Aşağıdan yukarıya proteomikler için
- Hücre lizis tamponunu şunları içerecek şekilde hazırlayın: 250 mM sakaroz,% 1 nonidet P-40 ikamesi (w / v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM sitokalasin D ve 10 μM kombretastatin 4A. %10 (w/v) sodyum dodesil sülfat14,15 stoğu hazırlayın.
NOT: Tris-HCl, nano-akış LC (nanoLC)-HRMS sırasında HEPES kontaminasyonunu en aza indirmek için seçilmiştir.
DİKKAT: Nonidet P-40 ikamesine maruz kalmak cilt tahrişine neden olabilir. Sitokalasin D, tüketildiğinde teratojeniktir ve combretastatin doğrudan maruz kaldığında akut toksiktir. Bu kimyasalları kullanırken uygun KKD'leri kullanın. - Peptitleri CE ile ayırmak için, aşağıdaki çözücüleri (v / v) hazırlayın: Numune çözücü, suda% 0.05 asetik asit (AcOH) içeren% 75 asetonitril (ACN); kılıf çözeltisi, suda% 0.05 AcOH içeren% 10 ACN; arka plan elektroliti (BGE), suda 1 M formik asit (FA) içeren% 25 ACN.
DİKKAT: AcOH ve FA solunduğunda veya tüketildiğinde toksiktir ve doğrudan maruz kaldığında ciddi cilt ve göz hasarına neden olabilir. Bu kimyasalları kullanırken uygun KKD'leri kullanın. - Peptitleri ters fazlı nanoLC ile ayırmak için (v / v): Mobil faz A (sulu),% 0.1 FA içeren su; mobil faz B (organik), ACN'de% 0.1 FA.
NOT: HRMS tespiti sırasında kimyasal parazitleri en aza indirmek için tüm karışımlar LC-MS sınıfı çözücüler kullanılarak hazırlanmalıdır.
- Hücre lizis tamponunu şunları içerecek şekilde hazırlayın: 250 mM sakaroz,% 1 nonidet P-40 ikamesi (w / v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM sitokalasin D ve 10 μM kombretastatin 4A. %10 (w/v) sodyum dodesil sülfat14,15 stoğu hazırlayın.
2. Aletleri mikroenjeksiyon ve diseksiyon için hazırlayın
- Embriyoları nazikçe hareket ettirmek ve yönlendirmek için, temiz saçları başka bir yerde açıklandığı gibi bir Pasteur pipetine sabitleyerek saç halkaları yapın16.
- Mikroenjeksiyon için, başka bir yerde açıklandığı gibi bir pipet çektirici kullanarak borosilikat kılcal damarları (1 mm/500 μm dış/iç çap) çekerek iğneler imal edin16.
NOT: Burada, iğne imalatı için aşağıdaki ayarlara sahip bir P-1000 Pipet Çektirici kullanılmıştır: ısı, 495; çekme, 30, hız, 60; zaman, 150; basınç, 200. - Bir stereomikroskop altında gözlem yaparak, kılcal damarı esasen bir (mikro) iğneye (örneğin, Dumont # 5) dönüştürmek için bir çift keskin forseps kullanarak kılcal damarın ucunu kesin (örneğin, Dumont # 5)16.
DİKKAT: Çekilen kılcal damarlar çok keskindir ve dikkatli kullanılmalıdır.
NOT: İğnenin ucu, hücre içi içeriğin sızmaması ve hücrenin iyileşebilmesi ve canlı olmaya devam edebilmesi için hücreyi hücre zarına en az hasarla delebilecek kadar keskin (dış çap 10-15 μm) olmalıdır. - Mikroenjeksiyon sırasında embriyoları tutmak için, kil dolu bir tabakta kuyucuklar hazırlayın. 15 mm'lik bir Petri kabında, ~1 mm çap x ~ 0,5 mm derinliğinde, başka bir yerde tarif edildiği gibi toksik olmayan hamuru kiline kuyu kaplar16.
- Mikrodiseksiyon için agaroz kaplı yemekler hazırlayın. 1x SS'de% 2 agaroz yapın ve çözeltiyi sterilize etmek için otoklavlayın (20 dakika boyunca 120 ° C). 60 mm Petri kaplarını yarıya kadar doldurun ve plakaların katılaşmasına izin verin. Daha önce16'da açıklandığı gibi bilyalı bir Pasteur pipet aleti kullanarak ~1 mm çap x ~0,5 mm derinliğinde kuyucuklar açın.
3. Hücre soyunu izole edin
NOT: Aşağıdaki adımlar, tanımlanmış tek hücreleri ve/veya bunların alt hücre soylarını izole etmek için gerçekleştirilir. Genellikle, embriyo, her hücrenin doku kaderlerinin 6,7,17 olarak tekrarlanabilir şekilde haritalandırıldığı 16 veya 32 hücreli aşamaya kültürlenir. Embriyonik hücreler morfolojiye, konumlarına ve kader haritalarına göre tanımlanır. Tek hücreli analiz için, tanımlanan hücreler manuel diseksiyon ile izole edilir veya hücre içi içerikleri bir kılcal pipet halinde toplanır ve 5 μL 0.5 mM amonyum bikarbonat içinde biriktirilir. Elde edilen numune, analize kadar -80 °C'de saklanır (Şekil 1)18,19,20,21. Hücre soy analizi için, tanımlanan hücrelere bir soy izleyici enjekte edilir ve sonraki klonları gelişimin kilit aşamalarında izole edilir (örneğin, doku indüksiyonunu incelemek için gastrulasyon sırasında, doku bağlılığını incelemek için nörülasyonu takiben). Aşağıda, diseksiyon veya FACS ile izolasyon için tanımlanmış hücrelerin soyunu floresan olarak etiketlemek için adımlar özetlenmiştir.
- Embriyoların kültürü
- Belirlenmiş protokolleri izleyerek doğal çiftleşme veya in vitro fertilizasyon (IVF) yoluyla embriyo elde edin12.
NOT: Doğal çiftleşme lojistik olarak daha basittir, yetişkin erkek kurbağaları ayırır ve farklı gelişim aşamalarında embriyolar verirken, IVF doğru evreleme gerektiren deneyler için gelişimsel olarak senkronize embriyolar sağlar. - Embriyoları dejelye edin. Embriyoları çevreleyen jöle tabakasını, başka bir yerde tarif edildiği gibi jelleştirme çözeltisi ile tedavi yoluyla çıkarın12,16.
NOT: Mikroenjeksiyonlar ve diseksiyonlar, X. laevis embriyolarında dejelizasyonu gerektiren hücrelere ve dokulara erişim gerektirir. - Basmakalıp pigmentasyonlu 2 hücreli embriyoları seçin16,22.
NOT: Bu adım, hücrenin ve soyunun tanımlanmasında doğruluk ve tekrarlanabilirliği sağlamak için önemlidir. - Kültür embriyoları istenen gelişim aşamasına getirir. Dejelifiye edilmiş embriyoları 1x SS içeren bir Petri kabına aktarın ve gelişim hızını kontrol etmek için 14-25 ° C arasında inkübe edin.
NOT: Geliştirmenin sıcaklığa bağımlılığı tekrarlanabilir ve Xenbase23'te (www.xenbase.org) bulunan X. laevis için grafiklendirilmiştir. Embriyo gruplarının farklı sıcaklıklarda kültürlenmesi, şaşırtıcı gelişim aşamalarına izin verir. Bunu yapmak, deney için belirli bir zamanda mevcut embriyo sayısını dağıtmaya yardımcı olur. - Embriyoların bölünme paternini izleyin ve mikroenjeksiyon için basmakalıp pigmentasyon ve bölünme paternlerine sahip embriyoları seçin16.
NOT: 16 ve 32 hücreli embriyoları seçerken, tekrarlanabilir soy takibi için hücre bölünmelerinin simetrik olduğundan emin olun.
- Belirlenmiş protokolleri izleyerek doğal çiftleşme veya in vitro fertilizasyon (IVF) yoluyla embriyo elde edin12.
- İlgilendiğiniz hücreleri etiketleme
- Soy izleyici çözeltisini içeren enjeksiyon iğnesini ayarlayın. Mikroenjeksiyon iğnesini, çok eksenli bir mikromanipülatör tarafından kontrol edilen bir mikropipet tutucuya monte edin.
- Mikropipet tutucuyu bir mikro enjektöre bağlayın. Başka bir yerde tarif edildiği gibi negatif basınç uygulayarak iğneyi soy izleyici ile doldurun16. Şekil 1A , kurulumu örneklemektedir.
- İğneyi kalibre edin. İğne ucunun boyutunu ve enjeksiyon süresini, başka bir yerde bulunan bir protokolü takiben (mineral) yağda ölçülen ~ 1 nL soy izleyici çözeltisini vermek için ayarlayın16.
NOT: Daha geniş uçlu kılcal damarlar hücre zarına zarar verme eğilimindedir, bu da hücre altı içeriklerin ve enjekte edilen soy izleyicinin sızmasına neden olurken, daha küçük uçlu kılcal damarlar tıkanmaya eğilimlidir. Uç dış çapı ~10 μm olan kılcal damarlar idealdir ve ~1 nL sağlamak için ~300 ms'nin üzerinde 40 psi basınç darbesi gerektirir. - Mikroenjeksiyon kil kabını% 3 Ficoll çözeltisi ile doldurun ve bir transfer pipeti kullanarak kil kabına ~ 10 embriyo aktarın. Her embriyoyu bir kuyuya yönlendirmek için bir saç halkası kullanın ve hedeflenen ilgili hücrenin mikroiğneye dik açıda olması için yavaşça konumlandırın.
- X. laevis doku kader haritalarını takiben ilgilenilen soyun öncü hücresini tanımlayın. Örneğin, Şekil 1, öncü hücrelerinin 32 hücreli embriyolara (sol ve sağ D111 hücreleri) enjekte edilmesine dayanarak nöral ektodermal klonların etiketlenmesini göstermektedir.
NOT: 16-6 ve 32 hücreli 7,8 embriyo için detaylı kader haritaları Xenbase23 üzerinden interaktif bir platformda mevcuttur. Soy izleme deneyleri için kullanırken embriyolar üzerinde basmakalıp pigmentasyon ve bölünmelerin sağlanması önemlidir. - İlgilenilen hücrelere, daha önce tarif edildiği gibi ~ 1 nL floresan dekstran veya ~ 200 pg mRNA enjekte edin16.
NOT: 10.000-40.000 MW olan dekstran konjugatları kullanın. Daha küçük dekstran konjugatları boşluk kavşaklarından geçebilirken, daha büyük dekstran konjugatları enjekte edilen hücreye eşit şekilde yayılmayabilir. Proteomik analizler için yeterli dokuya sahip olmak için ~ 10 embriyoya hücre enjekte etmeyi planlayın. - Stereomikroskop altında hücre etiketlemenin başarısını onaylayın. Yalnızca amaçlanan hücrenin enjekte edildiğinden emin olun. Kurumsal politikalara uyarak yaralı veya yanlış etiketlenmiş hücreler içeren embriyoları atın.
NOT: X. laevis doğal olmayan birçok ortamda invaziv olduğundan, embriyoları atmadan önce ölümcüllüğü sağlamak için embriyolar dondurulabilir.
- Etiketli hücre dölünü izole edin
- Enjekte edilen embriyoları bir Petri kabında 0.5x SS'ye aktarın ve istenen gelişim aşamasına ulaşana kadar 14-25 ° C arasında kültürleyin.
NOT: Xenbase'de bildirilen embriyoları evrelemek için belirlenmiş protokollere danışın. - Mikrodiseksiyonlar için 0.2x SS çözeltisi içeren bir agar kabına 3-5 embriyo aktarın.
NOT: SS çözeltisinin tuz konsantrasyonunun 0,5x'ten 0,2x'e düşürülmesi, diseksiyon sırasında hücrelerin ayrılmasına yardımcı olur. - Embriyoyu çevreleyen vitelin zarını nazikçe çıkarmak için iki keskinleştirilmiş forseps kullanın.
NOT: İlgilenilen klonu hasardan korumak için, floresan etiketli klonun karşı tarafındaki zarı soyun. - Etiketli klonu manuel diseksiyon (adım 3.3.5-3.3.6) veya FACS (adım 3.3.7-3.3.8) ile aşağıdaki gibi izole edin.
- Etiketli klonu embriyodan diseke etmek için forseps kullanın.
NOT: Mikrocerrahi makas, tungsten iğneleri veya kaş kılı bıçakları gibi diğer aletler,16'nın başka bir yerinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, etiketli klonun diseksiyonu için kullanılabilir. - Disseke edilmiş dokuyu 0,5-10 μL pipetle toplayın ve bir mikrosantrifüj şişesine koyun. Bir transfer pipeti kullanarak, numunedeki tuzları sınırlamak için toplanan dokuyu çevreleyen ortamı aspire edin, bu da sonraki adımlarda HRMS analizine müdahale eder.
NOT: İş akışının sonraki adımlarında flakon yüzeylerindeki protein kayıplarını en aza indirmek için plastik yüzeylere protein adsorpsiyonunu en aza indiren şişeler kullanın. - FACS ile izole etmek için, ~5 mL Newport 2.0 tamponu içeren 12 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna ~5-8 devitellize embriyo aktarın. Plakayı 80 rpm'de 20-30 dakika oda sıcaklığında13 dakika boyunca somunlaştırarak embriyoları ayırın.
NOT: Evre 22'den daha yaşlı embriyolar / larvalar bol miktarda hücre dışı matriks proteinine sahiptir ve bu da ayrı hücrelere ayrışmayı zorlaştırır. Ek enzimatik yaklaşımlar, başka bir yerde tarif edildiği gibi eski embriyolardan dokuları ayırmak için uyarlanabilir24. - Floresan olarak etiketlenmiş hücreleri, başka bir yerde açıklandığı gibi FACS kullanarak süspansiyondan arındırın24.
- Pelet hücreleri santrifüjleme ile süpernatutanı atar.
NOT: Hücre lizisini önlemek için düşük santrifüjleme hızı (400 × g) ve sıcaklık (4 °C) kullanın. FACS için sığır serum albümini (BSA) kullanıyorsanız, HRMS tespiti sırasında BSA parazitini azaltmak için hücre peletini yıkayın. Hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde nazikçe yeniden askıya alın ve tekrar pelet durulanmış hücrelere santrifüj yapın. Supernatant PBS sıvısını çıkarın. - Numune şişesini kuru buz veya sıvı azot üzerine yerleştirerek izole edilmiş hücreleri hızlı bir şekilde dondurun.
NOT: İşleme adımları sırasında numuneleri (dokular veya hücreler) soğutulmuş (örneğin buz üzerinde) saklayın. Aşağı akış işlemeyi kolaylaştırmak için hücreleri numunenin etrafında mümkün olduğunca az ortamla dondurun. - HRMS analizine kadar numuneleri -80 °C'de saklayın.
- Enjekte edilen embriyoları bir Petri kabında 0.5x SS'ye aktarın ve istenen gelişim aşamasına ulaşana kadar 14-25 ° C arasında kültürleyin.
4. Proteinleri kütle spektrometresi ile analiz edin
İzole edilmiş dokuların veya hücrelerin proteomik karakterizasyonu, HRMS'de bir dizi yerleşik adıma dayanmaktadır. Şekil 2 , biyoanalitik iş akışının adımlarını göstermektedir. Burada kullanılan örnek toplama protokolü, proteomiklerin aşağıdan yukarıya11, orta-aşağı25 veya yukarıdan aşağıya26 iş akışıyla uyumludur. Aşağıda, bu çalışmada kullanılan aşağıdan yukarıya strateji, hassas, nicel ve çeşitli kütle spektrometrelerine uyarlanabilir olduğu kanıtlanmıştır. Proteinlerin ekstrakte edilmesinden ve enzimatik olarak sindirilmesinden sonra, elde edilen peptitler ayrılır, ardından HRMS analizi yapılır.
- Dokuları/tek hücreleri işleyin
- CE ile tek hücreli analiz için, proteinleri denatüre etmek için numuneyi ~ 15 dakika boyunca 60 ° C'ye ısıtın, ardından numuneyi oda sıcaklığına (RT, ~ 5 dakika) dengeleyin18,21.
NOT: Dokularla çalışmanın aksine, tek hücrelerden numune hazırlama sırasında protein kayıplarını sınırlamak için indirgeme ve alkilasyon adımları atlanır. Numune hazırlama sırasında protein kayıplarını en aza indirmek için filtre destekli numune hazırlama (FASP)27,28, diğer tek hazneli stratejiler29 ve mikroakışkan yaklaşımlar30 benimsenebilir. - NanoLC ile analiz için, 50 μL lizis tamponunda (~ 100 μg toplam protein) 5 disseke dokuya kadar lize edin. Numuneyi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek işlemi kolaylaştırın.
- Lizatı 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin, daha sonra hücre kalıntılarını ve yumurta sarısı trombositlerini 4 ° C'de 4.500 × g'da santrifüjleme yoluyla pelet haline getirin. Süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj şişesine aktarın ve lizatta (v / v) nihai %1 SDS konsantrasyonu elde etmek için %10 SDS ekleyin.
- Dokular için 4.1.5-4.1.7 adımlarını izleyin.
- ~ 25 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için lizata 0.5 M ditiyotreitol ekleyin (örneğin, 50 μL lizata 0.5 M ditiyotretolü 2.5 μL) ve proteinlerdeki disülfit bağlarını kimyasal olarak azaltmak için lizatı 60 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Lizatta ~ 75 mM'lik nihai bir konsantrasyon elde etmek için 0.5 M iyodoasetamid ekleyin ve karışımı karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin (Şekil 2).
- Alkilasyon reaksiyonundan kalan reaktanları söndürmek için başlangıç hacmiyle aynı olan 0,5 M ditiyotreitol ekleyin (örneğin, 2,5 μL 0,5 M ditiyotretolü, 50 μL lizat).
DİKKAT: İyodoasetamid ve ditiyotreitol, doğrudan maruz kaldığında ciddi cilt ve göz hasarına neden olabilir. Bu kimyasalları kullanırken uygun KKD'leri kullanın. - Proteinleri çökeltme yoluyla saflaştırın. Kloroform-metanol bazlı yağış iyi performans gösterir31. Bu protokol aynı zamanda diğer yağış yaklaşımlarına da uyarlanabilir32.
NOT: Protein kayıplarının endişe verici olduğu tek hücreli analiz için, CE-HRMS için çökeltme adımını atlayın. - Protein çökeltisini bir vakum yoğunlaştırıcısında (4-37 ° C) kurutun, ardından ekstrakte edilen proteomu 50 μL 50 mM amonyum bikarbonat içinde yeniden askıya alın. Sindirim için gerekli enzim miktarını belirlemek için toplam protein kolorimetrik bir tahlil kullanarak protein konsantrasyonunu tahmin edin (örneğin, bikinkoninik asit protein testi).
- Proteinleri peptitlere sindirin. 1:50'lik bir proteaz: protein oranı elde etmek için tripsin (1 μg / μL stok) ekleyin ve karışımı tek hücreli numuneler için 5 saate kadar ve doku örnekleri için 14 saate kadar 37 ° C'de inkübe edin. Reaksiyon için satıcıya özel önerilere başvurun.
NOT: 14 saatten daha uzun veya daha yüksek konsantrasyonlarda tripsin ile sindirim, protein dizisine özgü olmayan bölünmelere neden olabilir, bu nedenle protein tanımlamalarına meydan okuyabilir33. - Kolorimetrik bir tahlil kullanarak toplam peptit konsantrasyonunu ölçün.
- İSTEĞE BAĞLI: Çoklama nicelemesi için, satıcıya özgü talimatları izleyerek her numunedeki peptitleri farklı bir izobarik kütle etiketi ile etiketleyin. Barkodlu peptitleri, peptid numunesi başına eşit oranlarda karıştırın.
NOT: Kantitatif önyargıları önlemek için doğru etiketleme ve karıştırma işlemlerinden emin olun. Miktar sınırlı numuneler veya tek hücreli numuneler için, sonraki separasyon adımları sırasında numune kayıplarını en aza indirmek ve daha düşük miktarda proteinin hassasiyetini artırmak için havuzlanmış dokulardan/hücrelerden oluşan TMT bazlı bir taşıyıcı kanal dahil edilebilir34. - İSTEĞE BAĞLI: LC-MS sistemini korumak için bir C18 ters faz spin sütunu/ucu üzerindeki tuzları ve kirleticileri (örneğin, reaksiyona girmemiş izobarik kütle etiketi reaktifleri) gidermek için tuzdan arındırma peptitleri.
- İSTEĞE BAĞLI: Proteomun manuel veya otomatik platformlar aracılığıyla daha derin tespiti için peptid karışımını fraksiyone edin (örneğin, orta veya yüksek pH'lı ters faz fraksiyonasyonu). Düşük miktarlarda (1-10 μg) peptid sindirimlerini fraksiyone etmek için uçlar içeren C18 sabit fazını kullanın.
- Peptit karışımını bir vakum konsantratöründe 60 ° C'de kurutun.
- Peptit karışımını ölçüme kadar -80 ° C'de saklayın.
- CE ile tek hücreli analiz için, proteinleri denatüre etmek için numuneyi ~ 15 dakika boyunca 60 ° C'ye ısıtın, ardından numuneyi oda sıcaklığına (RT, ~ 5 dakika) dengeleyin18,21.
- Peptitleri ayırın
NOT: Proteinlerin ekstrakte edilmesinden ve enzimatik olarak sindirilmesinden sonra, elde edilen peptitler nanoLC veya CE ile ayrılır ve tandem HRMS ile dizileme için ESI tarafından iyonize edilir. Ters fazlı nanoLC separasyonu, analiz başına ~ 150 ng ila ~ 1 μg toplayan peptitler için idealdir. CE, femtogramlardan femtonlara kadar değişen peptitler için tamamlayıcı duyarlılık sağlar. <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 ve tek hücreli analiz için giderek daha fazla kullanılmaktadır18,36,37.- CE kullanarak ayırmak için 4.2.2-4.2.7 adımlarını izleyin.
NOT: Aşağıda, peptitleri ölçmek için özel yapım CE platformunun kullanımı açıklanmaktadır. Bu CE cihazını oluşturmak ve kullanmak için protokollerdaha önce 38 ve küçük moleküller20 için kullanım üzerine görselleştirilmiş bir deney ile birlikte sağlanmıştır. Alternatif olarak, bu ölçümler AB SCIEX CESI, Agilent 7100 veya eşdeğeri gibi ticari bir CE sisteminde gerçekleştirilebilir. - Protein sindirimini numune çözücüsünün 1-2 μL'sinde yeniden oluşturun, numuneyi karıştırmak için vorteks yapın ve pelet hücresi kalıntılarına 2 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj edin.
NOT: Hücre kalıntılarının uzaklaştırılması, CE kılcal damarının tıkanma olasılığını en aza indirir, böylece ayırma sisteminin ömrünü uzatır ve ölçüm verimini artırır. - CE kılcal damarını BGE ile yıkayarak CE-ESI cihazını başlatın.
- Bilinen bir standart kullanarak enstrümantal performansı doğrulayın (örneğin, sitokrom C veya BSA özeti, anjiyotensin peptitleri).
NOT: Değerli numuneleri ölçmeden önce cihazın kütle doğruluğu, algılama hassasiyeti, tekrarlanabilirlik ve doğrusal dinamik niceleme aralığı açısından değerlendirilmesi önerilir. CE-ESI-MS performansının doğrulanması ve sorun giderme ile ilgili ek notlar başka bir yerde listelenmiştir18,20,38. - Numunenin ~1-10 nL'sini CE ayırma kılcal damarına enjekte edin.
NOT: Bu çalışmada, elektrokinetik olarak pompalanan kılıf akış kurulumu ile ~ 1 m uzunluğunda kaynaşmış silika kılcal damar (40/110 μm iç/dış çap) kullanılmıştır. Ticari CE cihazları genellikle enjeksiyon için bir mikroflakon içinde 5-10 μL numunenin sunumunu gerektirir. Özel yapım CE platformu18,38, numune yükleme mikroviline bırakılan ~ 250 nL ila 1 μL numune ile uyumludur. - CE ayırma kılcal damarının giriş ucunu BGE'ye aktarın.
- CE ayırma voltajını Toprak toprağından kademeli olarak artırarak elektroforetik ayırmaya başlayın (örneğin, 1 dakikadan fazla adım atarak). ~ 10 μA'nın altındaki akımla 20-28 kV'luk potansiyeller, analiz için kararlı ve tekrarlanabilir enstrümantal performans sağlar.
- nanoLC kullanarak ayırmak için, 4.2.9-4.2.12 adımlarını izleyin.
- Peptid örneğini Mobil Faz A'da yeniden askıya alın. Numunenin konsantrasyonu ve enjeksiyon hacmi, mevcut LC sistemine ve kolona bağlıdır. Bu çalışmada, bir C18 paketlenmiş yataklı kolon üzerinde 1-20 μL numune hacmine ~250 ng-1 μg protein sindirimi enjekte edilmiştir (75 μm iç çap, 100 şgözenekli 2 μm partikül boyutu, 25 cm uzunluk ayırma kolonu).
- Numuneyi bir LC şişesine aktarın.
NOT: Flakonun içinde analitik kolona zarar verebilecek hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kesici uçlu şişeler, düşük hacimli doku veya tek hücreli numuneler için kullanılabilir. - C18 analitik sütununa ~200 ng ila 2 μg peptid numunesi yükleyin.
NOT: İsteğe bağlı olarak, peptitler analitik separasyondan önce tuzdan arındırma için bir tuzak sütununa yüklenebilir. Örneğin, 0,1 mm iç çapa, 5 μm partikül boyutuna, 100 şgözenek boyutuna, 20 mm uzunluğa sahip bir C18 tuzak sütunu. Ayırma gradyanı başlamadan önce 5 dakika boyunca 5 μL/dak akış hızında %100 tampon A içeren tuzdan arındırma peptitleri. - Peptitleri gradyan elüsyonu kullanarak ayırın. 300 nL/dk debide bu çalışmada kullanılan 120 dk'lık gradyan şu şekildedir: 0-5 dk %2 B, 5-85 dk %2-35 B, 86-90 dk %70 B, 91-120 dk %2 B.
- CE kullanarak ayırmak için 4.2.2-4.2.7 adımlarını izleyin.
- Peptitleri ESI ile iyonize edin
NOT: CE veya nanoLC kılcal damar en tipik olarak iyonizasyon için bir ESI kaynağına bağlanır. Ultra hassas algılama için mikro akışlı (kör uçlu) ve nano akışlı (konik uçlu39 ve elektrokinetik pompalı kılıf akışı36 tasarımı) CE-ESI arayüzleri daha önce geliştirilmiştir.- Ayırıcı peptitleri, ticari veya özel yapım bir ESI arabirimi kullanarak iyonizasyon için bir elektrosprey iyon kaynağına tedarik edin. Xenopus embriyolarında tek hücreli CE-ESI-MS analizi için, CE kılcal çıkışının çekilmiş bir borosilikat yayıcı içine alındığı elektrokinetik olarak pompalanan düşük akışlı bir arayüz kullanın.
- Bir kamera kullanarak elektrosprey yayıcıdan sıvı akışını kontrol edin ve kurulumu olası sızıntılara karşı görsel olarak inceleyin.
- ESI kaynağını başlatmak için elektrosprey voltajını ~2,5 kV'a ayarlayın (Toprak toprağına kıyasla).
- Toplam iyon akımını izleyerek HRMS analizi için kararlı bir nanosprey sağlayın. Kararlı bir sprey elde etmek için elektrosprey voltajını ve vericinin HRMS girişine olan mesafesini ayarlayın (toplam yoğunlukta %<15 bağıl standart sapma).
- Peptitleri tespit edin
NOT: Peptitlerin tespiti, izobarik kütle etiketli ve etiketsiz peptitler için farklı enstrümantal hususları izler ve mevcut kütle spektrometresinin tipine bağlıdır. Bu çalışma, aşağıdaki adımlara göre bir orbitrap tribrid kütle spektrometresi kullanmaktadır.- MS1 olaylarını şu ayarlarla edinin: Analizör, orbitrap; Spektral çözünürlük, yarım maksimumda 120.000 tam genişlik (FWHM); maksimum enjeksiyon süresi (IT), 50 ms; otomatik kazanç kontrolü (AGC), 4 x 105 sayım; mikrotaramalar, 1.
- Peptitleri sıralamak için, iyon tuzağı analizöründe algılama için fragman öncü iyonları: parçalanma modu, daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması (HCD); çarpışma gazı, azot; çarpışma enerjisi,% 32 normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE); maksimum BT, 70 ms; AGC, 1 x 104 sayım; mikrotaramalar, 1.
- İSTEĞE BAĞLI: TMT etiketli peptitleri tandem/çok aşamalı HRMS (MS2/MS3) kullanarak sayısallaştırın. Senkron öncü seçimi kullanan MS3 için, tipik enstrümantal ayarlar aşağıdaki gibidir. En bol iyonları araştıran tek aşamalı (MS1) taramalar, parametreler kullanılarak veriye bağımlı edinim yoluyla ayrıştırılır: MS2 parçalanma modu, çarpışma kaynaklı ayrışma (CID); çarpışma gazı, helyum; çarpışma enerjisi,% 35 NCE; parça iyonları için analizör, iyon tuzağı aşağıdaki ayarlar: maksimum BT, 50 ms; AGC, 5 x 104 sayım; mikrotaramalar, 1. 10 MS2 fragman iyonu seçin ve bunları azot içinde HCD ile parçalayın (%65 NCE). Aşağıdaki ayarları kullanarak MS3 parça iyonlarını tespit edin: Orbitrap çözünürlüğü 15.000 FWHM, maksimum BT, 120 ms; AGC, 1 × 105 sayım; mikrotaramalar, 1.
NOT:11,40 numaralı bölümde açıklandığı gibi satıcı tavsiyelerini takiben etiketli numuneler için farklı MS alım yöntemleri ve parametreleri kullanılabilir.
- Verileri analiz edin
NOT: Proteinler gelişmiş biyoinformatik paketler kullanılarak tanımlanır ve ölçülür. Tanımlamaların doğruluğu, peptitler ve proteinler düzeyinde yanlış keşif oranı (FDR) olarak ifade edilen bir aldatıcı veritabanı kullanılarak hesaplanır.- Verileri ticari veya açık kaynaklı yazılım paketleri kullanarak işleyin (referans41'de gözden geçirilmiştir). Ham verileri, Xenopus proteome 9.2'yi mRNA'dan türetilmiş PHROG veritabanı42 ile birleştirerek hazırlanan bir veritabanıyla eşleştirin.
NOT: Arama parametreleri şunlardır: sindirim enzimi, tripsin; kaçırılan bölünmeler, 2'ye kadar; değişken modifikasyon, metiyonin oksidasyonu; statik modifikasyon, sistein karbamidometilasyon; öncü kütle toleransı, 10 ppm; parça kütle toleransı, 0.6 Da; minimum peptit uzunluğu, 5; tanımlama doğruluğu, peptitler ve proteinler için% <1 FDR. Peptitlere alkilasyon olmadan, statik bir modifikasyon olarak karbamidometilasyon, veritabanı araması sırasında hariç tutulur (örneğin, tek hücreli analiz için). - Protein bolluklarını etiketsiz43 veya etiket tabanlı stratejiler44,45 ile sayısallaştırın.
- İSTEĞE BAĞLI: Gen ontolojisi için proteinlere açıklama ekleyin. PantherDB46, Reactome47 veya Xenbase23 kullanılabilir.
- İSTEĞE BAĞLI: Trans-Proteomik Boru Hattı48, Perseus49 ve Orange50 gibi yazılım paketlerini / web araçlarını kullanarak protein bolluğunu ve hücre / doku tiplerindeki protein bolluklarındaki farklılıkları ölçün.
NOT: Deneysel tasarım ve yazılım seçenekleriyle ilgili ek hususlar başka bir yerde gözden geçirilmiştir41,51. - İSTEĞE BAĞLI: Bilinen protein-protein etkileşimleri için STRING52 ve BioPlex Display 53 ve fosforilasyonlar için PhosphoSiteplus54 gibi bilgi tabanlarını kullanarak sonuçları daha fazla değerlendirin. Proteomda temsil edilen motifleri ve alanları analiz etmek için, Basit Modüler Mimari Araştırması (SMART)55 gibi web araçlarını kullanın.
- Verileri ticari veya açık kaynaklı yazılım paketleri kullanarak işleyin (referans41'de gözden geçirilmiştir). Ham verileri, Xenopus proteome 9.2'yi mRNA'dan türetilmiş PHROG veritabanı42 ile birleştirerek hazırlanan bir veritabanıyla eşleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, X. laevis embriyolarında doku oluştururken tek hücrelerdeki proteinlerin ve soylarının incelenmesini sağlamıştır. Şekil 1, nöral-doku-kader hücrelerindeki proteinleri ve embriyodaki yeni indüklenen nöral ektodermi incelemek için yaklaşımın böyle bir uygulamasını göstermektedir. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, biyoanalitik iş akışı, hücreleri tanımlamak, enjekte etmek / aspire etmek ve örnekleri toplamak için geleneksel hücre ve gelişim biyolojisi araçlarını entegre etti. Şekil 1B, bir mikroenjektör kullanılarak 16 hücreli embriyodaki sol dorsal-hayvan (D11) hücresinin in vivo mikroprob örneklemesini göstermektedir; Deneyden sonra, embriyolar normal anatomiye sahip kurbağa yavrularına başarıyla gelişti56. Büyük embriyonik hücreler (~ 100-250 μm çapında) manuel mikrodiseksiyona da elverişliydi. Sağ dorsal-hayvan orta hattı (D11) hücresinin diseksiyonu, Şekil 1C'deki 16 hücreli embriyodan gösterilmiştir. Kurulum ayrıca, tanımlanan öncüye bir floresan izleyici enjekte ederek klonal bir yörüngenin izlenmesine izin verdi. Şekil 1D'de gösterildiği gibi, yaklaşım, sol ve sağ D111 hücrelerinden kaynaklanan klonların doku diseksiyonu veya floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) yoluyla izole edilmesine izin verdi. Burada açıklanan örnek toplama stratejileri, embriyonik gelişimi yeni ayrıntılarla incelemek için uzay ve zamanda yeterince ölçeklenebilir.
Biyoanalitik iş akışı, duyarlılığı ve niceliği artırmak için HRMS teknolojilerini entegre etmiştir (Şekil 2). Toplanan proteinler aşağıdan yukarıya proteomik bir yaklaşımla ölçüldü. Ortogonal kimyaya dayalı numunelerin isteğe bağlı fraksiyonasyonu (örneğin, yüksek pH'lı ardından düşük pH'lı ters fazlı LC) algılama hassasiyetine yardımcı oldu. Peptitleri ayırmak için, eser miktarda numune (<<~100 ng)) için CE ve sınırlı miktarda malzeme (>>150 ng) için nanoLC seçildi. Peptitler ESI-HRMS kullanılarak sıralandı. Tespit edilen proteinler, etiketsiz ve etiket tabanlı stratejiler kullanılarak ölçüldü. Tipik indirgeme ve alkilasyon adımlarının ortadan kaldırılması ve ardından CE analizi gibi tek hücreli analiz için numune işlemenin basitleştirilmesi, ~ 400-800 farklı proteinin tanımlanmasını kolaylaştırmıştır. Bildirilen proteinler arasında, TCP1 alt birimi 3 (Cct3) içeren chaperonin, voltaja bağımlı iyon kanalı (Vdac2) ve kreatin kinaz-beyin (Ckb) gibi önemli fonksiyonel rolleri olan birçok protein vardı. Çok değişkenli ve istatistiksel veri modelleri, bu protokolde özetlenen yaklaşımları kullanarak10,57 ve diğerleri 9,58'in seçilmiş hücrelerin ve dokuların proteomik bileşiminde daha önce bilinmeyen farklılıkları bulmamıza yardımcı oldu. Özellikle, bu HRMS ölçümleri, keşifleri destekleyen, önceden örneklerin bileşimi hakkında hiçbir işleyen prob veya bilgi gerektirmiyordu.
Bir dizi çalışmada, X. laevis'in gelişmekte olan embriyolarında tanımlanan hücrelerin proteomik durumu (Şekil 3)21 olarak ölçülmüştür. Şekil 3A , farklı embriyolardan diseke edilen D11 hücreleri arasındaki gen translasyonel farklılıkların tespitini göstermektedir10. Mikro örnekleme CE-ESI-HRMS, tek hücreli21'den ~ 700'e kadar proteini tanımlamamıza ve ölçmemize izin verdi. Embriyodaki bir D11 hücresi üzerindeki teknik kopya ölçümlerden ~ 400 kümülatif proteinin tanımlanmasına ilişkin temsili birincil HRMS-MS / MS verileri PRIDE'a bırakıldı. Yaklaşım, zebra balığı21 gibi diğer model organizmalardan daha küçük hücrelere ve embriyolara ölçeklenebilirdi. Daha küçük hücre boyutlarına ölçeklenebilirlik, D11 soyunun zaman içinde geliştikçe canlı bir embriyodan mekansal zamansal yeniden yapılanmasını keşfetmemize izin verdi. Şekil 3B , 16, 32, 64 ve 128 hücreli embriyolarda tanımlanmış hücrelerin hücre altı kantitatif proteomiklerini gerçekleştirmek için bu protokolün kullanımını sunmaktadır. Proteinler, klonal gelişim21 üzerinde farklı bolluk profilleri gösteren dört gruba ayrıldı.
Şekil 3: X. laevis embriyosunda hücre altı uzaydan klonal dokulara protokol ölçeklenebilirliği. (A) Tanımlanmış bütün D11 hücreleri arasındaki proteomik farklılıkların ölçülmesi, hücre-hücre heterojenliğinin ortaya çıkarılması. Seçilmiş proteinler için gösterilen gen isimleri. (B) Gelişmekte olan D11 hücre klonunda hücresel proteomun yeniden düzenlenmesi. Bulanık C-protein dinamiklerinin küme analizi (GProx) anlamına gelir ve proteinleri benzer ekspresyon kalıplarına göre gruplandırır. Gri sayılar, her kümede nicelleştirilen farklı proteinlerin sayısını gösterir. Rakamlar21,57 referanslarından izin alınarak uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Bu protokol, tanımlanmış, gelişmekte olan hücre klonlarında uzamsal ve zamansal proteomikleri yürütmemize izin verdi (Şekil 4). Şekil 4A , embriyonun sinir dokusu gelişiminde ve modellenmesinde önemli rolleri olan iki dokuyu oluşturan hücre klonlarının etiketlenmesi ve izole edilmesi yaklaşımının uygulanmasını göstermektedir. Spemann organizatörünün (SO) çoğunluğu, floresan dekstran enjeksiyonu yoluyla sol ve sağ D 112 ve D212 hücrelerinin etiketlenmesiyle izlendi. Paralel olarak, komşu dorsal-hayvan (D111) hücreleri, nöral ektodermin (NE) çoğunluğunu işaretlemek için etiketlendi. Dokular diseke edildi ve protein içerikleri bu protokolü takiben analiz edildi. nanoLC-ESI-HRMS, Wnt, Fgf ve Tgfβ yolları gibi sinyalizasyon da dahil olmak üzere dokulardan 2.000'e kadar farklı protein döndürdü. Disseke edilmiş SO dokularından oluşan bir havuzdaki teknik kopya ölçümlerden ~ 1.800 kümülatif proteinin tanımlanmasına ilişkin temsili birincil HRMS-MS / MS verileri PRIDE'a yatırıldı. Wnt yolağı ligandı Wnt10a ve Wntless (Wls), Wnt ligandlarının salgılanmasına adanmış bir membran proteini, sadece NE proteomunda tespit edildi. Wnt yolu SO'da baskılanmış olarak bulundu ve SO'da tespit edilen Wnt ile etkileşime giren proteinlerin eksikliğini açıklayabilir. Bu sonuçlar, embriyo içindeki soya özgü farklılıkları incelemek için bu protokolün uygulanabilirliğini göstermektedir.
Şekil 4: X. laevis embriyolarındaki uzamsal doku proteomiklerinden veri analizi örneği. (A) Spemann'ın Organizatörü (SO) ve nöral ektoderm (NE) dokularının, 32 hücreli embriyoda sırasıyla önceki D 112 ve D212'de floresan protein mRNA enjeksiyonu ile diferansiyel etiketlenmesi. (B) SO (kırmızı) ve NE (yeşil) proteomunda saptanabilir farklılıklar gösteren ilk 5 aşırı temsil edilen biyolojik proses. Yol aşırı temsil analizi, Bonferroni düzeltmesini kullanarak biyolojik süreçleri gösterir. (C) Protein alanı zenginleştirme analizi (SMART), SO'daki DNA ve RNA bağlayıcı motif içeren proteinlerin zenginleştirilmesini ortaya koymaktadır. (D) Tespit edilen SO proteomuna dayanan kanonik protein-protein etkileşimlerini öngören STRING analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Çeşitli proteomik veriler, fonksiyonun değerlendirilmesi için değerli bilgiler olarak hizmet eder. Proteomik veriler kanonik bilgi tabanları kullanılarak değerlendirilebilir. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, düzensiz proteinlerin yol analizi, son çalışmalarımızda hem SO hem de NE veri kümelerinde aşırı temsil edilen translasyon ve enerji metabolizmasını göstermiştir. NE proteomu, hücredeki protein yükünün nükleer taşınması ile ilişkili proteinlerle zenginleştirilmiştir, bu da muhtemelen yeni kurulan NE'deki sinyallemeyi takiben aşağı akış olaylarını göstermektedir (Şekil 4C). Şekil 4D'deki zenginleştirme analizi, translasyon başlatma, RNA bağlanma, proteazom kompleksinde bağlanmada yukarı regülasyon buldu ve SO'yu geliştiren dinamik protein döngüsü için bir rol düşündürdü. Hücre soyu rehberliğinde HRMS proteomikleri, uzay ve zamanda ölçeklenebilir ve normal ve bozulmuş gelişim sırasında hücrelerin moleküler organizasyonunu daha iyi anlamaya yardımcı olmak için yeterince hassastır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, Xenopus türlerinin embriyolarında tanımlanmış hücre soylarında protein ekspresyonunun karakterizasyonunu sağlar. HRMS'den kaynaklanan metodoloji, moleküler tanımlamada mükemmel özgüllüğü, moleküler problar (genellikle yüzlerce ila binlerce farklı protein) olmadan çoklu protein tespiti yeteneğini ve niceleme yeteneğini birleştirir. Hücre ve gelişimsel (nöro) biyolojideki klasik araçlara ve iş akışlarına uyarlanabilirlik, HRMS proteomiklerini, omurgalı X. laevis embriyosunda kök hücre farklılaşmasının bütünsel karakterizasyonu da dahil olmak üzere heyecan verici uygulamalara genişletir.
Adımlar, X. laevis embriyosundaki hücre soyağacı rehberliğindeki proteomikleri tanımlamaktadır. Örnek olarak, nöral kaderli tek hücrelerin ve soylarının analizini gösteriyoruz ve karşılık gelen CE- ve nanoLC HRMS veri kümelerini halka açık bir veri deposu aracılığıyla sağlıyoruz (bkz. Bu yaklaşım, çoklu hücre tiplerinde (ve soylarda) proteinlerin mekansal zamansal düzenlemesi üzerine yapılan çalışmalara kolayca uyarlanabilir. Gelişmekte olan embriyodaki mekansal olarak yönlendirilen proteomikler, moleküler sistem biyolojisini, hücre farklılaşmasının anlaşılmasını ve sinir sistemi gibi kilit organların gelişimini teşvik etmek için transkriptomik ve metabolomik çalışmalara da genişletilebilir.
Bu protokol biyoanalize yeni boyutlar katmaktadır. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler)1,2 gibi hücre kültürleri, hücre farklılaşması sırasında temporal proteom dinamiklerinin ölçümünü kolaylaştırır. Bu çalışmada detaylandırılan yaklaşım, karmaşık morfojen gradyanlarının, paralel sinyal yolaklarının ve yakınsak uzatma süreçlerinin doku indüksiyonu ve morfogenezi sağlamak için işbirliği yaptığı 3 boyutlu canlı embriyodaki hücre kaderi indüksiyonuna bakmaktadır. Bir embriyo bağlamında proteom dinamiklerini incelemek, hücre farklılaşmasına rehberlik eden paralel mekanizmalar hakkında bilgi sağlayabilir, farklılaşma ve gelişim anlayışını derinleştirmek için heyecan verici bir yön.
Burada açıklanan yaklaşım, Xenopus türlerinin deneysel faydalarını, özellikle X. laevis'i bu amaçla ödünç almaktadır. Erken 16 ve 32 hücreli X. laevis embriyosunun her hücresi, yetişkin organizmadaki çoğaltılabilir doku kaderlerine, esasen bölünme aşaması embriyolarındaki hücrelerin mekansal bir projeksiyonuna eşlenir. Hücre kılavuzlu proteomikler için tekrarlanabilirlik, doğru hücre tiplemesine dayanır. Hücre diseksiyonu ve soy takibini tanımlayan deneylere geçmeden önce embriyoları basmakalıp pigmentasyon ve bölünme için doğrulayarak başarıya yardımcı oluyoruz 16,20. Bölünme aşaması embriyolarının hücrelerinin genellikle çeşitli derecelerde farklı doku tiplerinin oluşumuna katkıda bulunduğunu belirtmek önemlidir; Her doku tipine seviye katkılarının ayrıntıları Xenbase23'te mevcuttur. Bu nedenle, soyağacının izleneceği embriyonik evre ve öncü hücreler, eldeki biyolojik soruya göre seçilmelidir. Embriyoları daha uzun süreler boyunca (örneğin, >1 d) kültürlendirirken, hasarlı / ölü embriyoların çıkarılmasına özen gösterilmelidir, bu da popülasyondaki diğer embriyoların yaşayabilirliğini azaltabilir.
Başarılı HRMS proteomikleri için, hücre / doku toplama, protein ekstraksiyonu ve HRMS ölçümünün analitik temellerine dikkat edilmelidir. Xenopus embriyoları, HRMS duyarlılığını azalttığı bilinen yüksek konsantrasyonlarda uçucu olmayan tuzlar içeren ortamlarda kültürlendiğinden, proteomik çalışmalar için hücreleri ve dokuları toplarken aspire edilen ortamın azaltılması önerilir. Proteinlerin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini ilerletmek için tuzdan arındırmayı araştırmak iyi bir uygulamadır. HRMS ölçümünden önce, CE- ve LC-ESI-HRMS cihazlarının analitik performansı, ayırma, iyonizasyon, tekrarlanabilirlik ve doğrusal dinamik niceleme aralığı dahil olmak üzere değerlendirilmelidir. İyi analitik metriklerle bu protokol, biyolojik araştırmalarda hayvan kullanımını azaltmaya yardımcı olur, daha güçlü biyokimyasal veri setleri elde etmek için duyarlılığa yardımcı olur ve sonuçları yorumlamak için istatistiksel veri analizinin gücünü arttırır. Varsayılan olarak, her biyolojik replikayı, teknik tekrarlanabilirliği değerlendirmek ve tespit edilebilir proteomun kapsamını derinleştirmek için kullanılan CE veya LC-HRMS kullanarak en az 3 teknik kopyada analiz ediyoruz. Güç analizi, istatistiksel gücün tahmin edilmesine ve biyolojik replikat boyutunun tasarımına yardımcı olur. Embriyolar arasında doğal olarak oluşan biyolojik değişkenliği hesaba katmak için farklı ebeveyn kurbağa setlerinin kullanılması tavsiye edilir.
EK BİLGİLER
HRMS-MS/MS proteomik verileri ve ilgili işleme dosyaları, PXD030059 veri seti tanımlayıcısı ile PRIDE60 ortak deposu aracılığıyla ProteomeExchange Konsorsiyumu'na yatırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Jie Li'ye (Maryland Üniversitesi, College Park) embriyonik ayrışma ve FACS hakkındaki değerli tartışmalar için minnettarız. Vi M. Quach ve Camille Lombard-Banek'e, bu protokolde vurgulanan proteomik uygulamaları örnekleyen önceki çalışmalarda numune hazırlama ve veri toplama konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışmanın bazı bölümleri IOS-1832968 KARİYER (P.N.'ye) ödül numarası altında Ulusal Bilim Vakfı, R35GM124755 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri (P.N.'ye), Maryland Üniversitesi-Ulusal Kanser Enstitüsü Ortaklık Programı (P.N.'ye) ve COSMOS Club Vakfı araştırma ödülleri (A.B.B. ve L.R.P.'ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
References
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560 (2021).
- Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
- Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2000).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. Vleminckx, K. 1865, Humana Press Inc. NY. 175-194 (2018).
- Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
- Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
- Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P. Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. 628, 263-292 (2019).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11 (2016).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956 (2017).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Developmental Biology. 120 (1), 299-304 (1987).
- Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
- Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
- Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
- Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
- Wisniewski, J. R. Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. Becher, D. 1841, Humana Press Inc. NY. 3-10 (2018).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882 (2018).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
- Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
- Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161 (2018).
- Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
- Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21 (2019).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
- Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
- Pino, L. K., Rose, J., O'Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
- Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25 (2020).
- Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
- Schmidt, E., et al. On the Move Federated Workshops. , Springer, Verlag. Berlin. 710-719 (2006).
- Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
- Jensen, L. J., et al. STRING 8 - a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
- Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
- Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
- Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
- Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
- Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
- Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
