Summary
Her beskrives en massespektrometribaseret proteomisk karakterisering af cellelinjer med kendte vævsskæbner i hvirveldyrets Xenopus laevis embryo.
Abstract
Karakterisering af molekylære begivenheder, når celler giver anledning til væv og organer, rejser et potentiale for bedre at forstå normal udvikling og designe effektive midler mod sygdomme. Teknologier, der muliggør nøjagtig identifikation og kvantificering af forskellige typer og et stort antal proteiner, vil give stadig manglende information om molekylære mekanismer, der orkestrerer vævs- og organismeudvikling i rum og tid. Her præsenterer vi en massespektrometribaseret protokol, der muliggør måling af tusindvis af proteiner i identificerede cellelinjer i Xenopus laevis (frø) embryoner. Tilgangen bygger på reproducerbare celleskæbnekort og etablerede metoder til at identificere, fluorescerende mærke, spore og prøve celler og deres afkom (kloner) fra denne model af hvirveldyrs udvikling. Efter indsamling af cellulært indhold ved hjælp af mikrosampling eller isolerende celler ved dissektion eller fluorescensaktiveret cellesortering ekstraheres proteiner og behandles til bottom-up proteomisk analyse. Væskekromatografi og kapillærelektroforese anvendes til at tilvejebringe skalerbar adskillelse til proteindetektion og kvantificering med massespektrometri med høj opløsning (HRMS). Repræsentative eksempler er tilvejebragt til proteomisk karakterisering af neurale vævsceller. Celleafstamningsstyret HRMS-proteomics kan tilpasses forskellige væv og organismer. Det er tilstrækkeligt følsomt, specifikt og kvantitativt til at kigge ind i proteomets rumlige-tidsmæssige dynamik under hvirveldyrs udvikling.
Introduction
Vores forståelse af celledifferentiering og vævs og organers tilblivelse er resultatet af årtiers detaljerede målrettede screeninger af gener og deres produkter. At øge vores viden om alle biomolekylerne og deres mængder under vigtige cellulære begivenheder ville hjælpe med at optrævle molekylære mekanismer, der styrer det rumlige og tidsmæssige mønster af hvirveldyrs kropsplan. Teknologier, der muliggør molekylær amplifikation og sekventering, er nu i stand til rutinemæssigt at rapportere om et stort antal gener og transkripter, hvilket understøtter hypotesedrevne undersøgelser inden for grundlæggende biologisk og translationel forskning. For at forstå udviklingssystemer går et komplekst forhold mellem transkription og oversættelse ind for direkte analyse af flere proteiner og deres posttranslationelle modifikationer. Global proteomics ved hjælp af in vitro biologiske systemer, såsom inducerede pluripotente stamceller, begyndte at afgrænse mekanismer for vævsinduktion 1,2. I komplekse organismer, såsom hvirveldyrembryoet, afhænger udviklingen af morfogengradienter i sammenhæng med rum og tid3. Det følger heraf, at det at få viden om proteomiske ændringer, når celler differentierer sig til dannelse af specialiserede væv, såsom neurale væv, giver en nøgle til at låse op for molekylære programmer, der styrer normal og defekt udvikling og guide næste generations terapi.
Hvirveldyret sydafrikansk klofrø (Xenopus laevis) er en veletableret model inden for celle- og udviklings-, neuro- og regenerativ biologi. Sir John Gurdons Nobelpris i fysiologi eller medicin 4,5 i 2012 for opdagelsen af pluripotens af den somatiske kerne fremhævede betydningen af denne model for opdagelser i grundlæggende og translationelle studier. Xenopus-embryoner udvikler sig eksternt til moderen, hvilket letter direkte manipulation af celler, cellekloner og genekspression over forskellige udviklingsstadier. Asymmetrisk pigmentering og stereotype celledelinger gjorde det muligt at kortlægge reproducerbare skæbnekort fra 16-6 og 32-celle 7,8-stadieembryoet. For proteomics baseret på massespektrometri med høj opløsning (HRMS) omfatter yderligere fordele ved modellen relativt stor størrelse (~1 mm i diameter), hvilket giver rigeligt proteinindhold til analyse (~130 μg i embryoner i tidlig spaltningsfase, ~10 μg proteinindhold i enkeltceller i det 16-cellede embryo)9,10.
På nuværende tidspunkt er HRMS den førende foretrukne teknologi til påvisning af proteiner. Denne teknologi muliggør direkte, følsom og specifik detektion og kvantificering af flere, normalt hundreder til tusinder af forskellige proteiner11. Bottom-up proteomics af HRMS involverer en række indbyrdes forbundne trin. Efter ekstraktion fra celle/vævsprøven fordøjes proteiner med et proteolytisk enzym, såsom trypsin (bottom-up proteomics). De resulterende peptider adskilles baseret på deres forskellige fysisk-kemiske egenskaber, herunder hydrofobicitet (omvendt fase væskekromatografi, LC), nettoladning (ionbytterkromatografi), størrelse (størrelseseksklusionskromatografi) eller elektroforetisk mobilitet (kapillærelektroforese, CE). Peptider lades derefter (ioniseres), typisk ved hjælp af elektrosprayionisering (ESI), og peptidioner detekteres og sekventeres via gasfasefragmentering ved tandem HRMS. De resulterende peptiddata kortlægges til proteomet af organismen, der undersøges. Med proteinspecifik (proteotypisk) peptidionsignalintensitet, der korrelerer med koncentration, kan proteinkvantificering udføres etiketfri eller etiketbaseret (multiplexingkvantificering). HRMS proteomics giver en rig ressource af information om den molekylære tilstand af det undersøgte system, hvilket giver mulighed for generering af hypoteser og opfølgende funktionelle undersøgelser.
Figur 1: Spatiotemporalt skalerbar proteomics, der muliggør celleafstamningsstyret HRMS-proteomics i det udviklende (frø) embryo. (A) Visualisering af prøven (1) ved hjælp af et stereomikroskop (2) til injektion af en identificeret celle (indsats) ved hjælp af en fabrikeret mikropipette (3) under kontrol ved hjælp af et translationstrin (4). B) Subcellulær prøveudtagning af den identificerede venstre D11-celle i et 16-cellet embryo. C) Dissektion af en hel D11-celle fra et 16-cellet embryo. (D) Fluorescerende (grøn) sporing af venstre og højre D111-afkom fra et 32-cellet embryo for at styre dissektion af neurale ektoderm (NE) i gastrula (trin 10) og isolering af det nedadgående væv fra haletudsen ved hjælp af FACS. Skalastænger: 200 μm for embryoner, 1,25 mm for hætteglasset. Tallene er tilpasset med tilladelse fra referencerne 15,19,21,59. Klik her for at se en større version af denne figur.
Den protokol, der præsenteres her, muliggør HRMS-baseret kvantificering af et stort antal proteiner i identificerede celler/væv ved udvikling af X. laevis-embryoner. Tilgangen bygger på nøjagtig celleidentifikation, reproducerbare celleskæbnekort og etablerede metoder til at spore cellelinjer i denne biologiske model 6,7,8. Som vist i figur 1 studerer vi proteomer fra enkeltceller ved at anvende helcelledissektion eller kapillær mikrosampling til at aspirere cellulært indhold. Overvågning af en celles afstamning giver os mulighed for at studere proteomets rumlige temporale udvikling, når celler danner væv under gastrulation. Celleafkom markeres fluorescerende ved at injicere en fluorofor konjugeret til inert dextran eller mRNA til fluorescerende protein (fx grønt fluorescerende protein eller GFP). Det mærkede afkom isoleres på ønskede udviklingstidspunkter. Under gastrulation kan cellekloner, der er tæt grupperet, isoleres ved dissektion. Efter gastrulation kan cellekloner fordeles i embryoet på grund af migrationsbevægelser og kan isoleres fra dissocieret væv ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Proteiner i disse celler og væv måles via bottom-up proteomics ved hjælp af HPLC eller CE til separation og ESI tandem HRMS til identifikation. Celleafstamningsstyret HRMS-proteomics er skalerbar til forskellige cellestørrelser og slægter i embryoet og er specifik, følsom og kvantitativ. Gennem udvalgte eksempler vist her demonstrerer vi også, at denne protokol er skalerbar og bredt tilpasningsdygtig til forskellige typer celler og cellelinjer.
Figur 2: Den bioanalytiske arbejdsgang. Mikrodissektion og kapillær aspiration eller FACS lettede prøveudtagning af cellulært og klonalt proteinindhold. Udtømning af rigelige æggeblommeproteiner og adskillelse ved kapillær elektroforese (CE) eller nano-flow væskekromatografi (LC) forbedret identifikation (ID) følsomhed ved hjælp af elektrospray ionisering (ESI) massespektrometri med høj opløsning (HRMS). Kvantificering afslørede dysregulering og leverede ny information til hypotesedrevne undersøgelser i forbindelse med information tilgængelig fra genontologi (GO). Tallene er tilpasset med tilladelse fra reference15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller, der sikrer human vedligeholdelse og håndtering af Xenopus laevis voksne frøer , blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Maryland, College Park (godkendelsesnumre R-DEC-17-57 og R-FEB-21-07).
1. Forbered løsningerne
- Til embryologi
- Forbered 1x, 0,5x og 0,2x Steinbergs opløsning (SS), og autoklav dem derefter (120 °C i 20 minutter) til sterilitet efter standardprotokollerne12.
- Forbered 3% (w / v) Ficoll i steriliseret 1x SS efter standardprotokoller12.
- Til dejellying, frisklavet 2% (w / v) cysteinopløsning og juster dens pH til 8 ved at tilsætte 10 M natriumhydroxidopløsning dråbevis.
FORSIGTIG: Eksponering for cystein kan forårsage hud- og åndedrætsskader. Natriumhydroxid er et ætsende middel, der kan forårsage alvorlig skade på hud og øjne ved direkte eksponering. Brug passende personlige værnemidler (PPE) ved håndtering af disse kemikalier, såsom handsker og en laboratoriefrakke. - Til afstamningssporeren fremstilles 0,5% (v/v) af en fluorescerende dextran i sterilt deioniseret vand. Alternativt fremstilles en opløsning af 0,2 μg/μL mRNA til fluorescerende proteiner i sterilt deioniseret vand (fx GFP).
- For at dissociere celler skal du forberede Newport 2.0-buffer indeholdende 0,1 M natriumisethionat, 20 mM natriumpyrophosphat og 10 mM CAPS og derefter bringe dens pH til 10,513.
FORSIGTIG: Eksponering for natriumpyrophosphat kan forårsage hud- og øjenirritation. Brug passende personlige værnemidler ved håndtering af disse kemikalier.
- Til bottom-up-proteomik
- Forbered cellelysebufferen til at omfatte: 250 mM saccharose, 1% nonidet P-40 erstatning (w / v), 20 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA, 10 μM cytochalasin D og 10 μM combretastatin 4A. Der fremstilles en bestand på 10% (w/v) natriumdodecylsulfat14,15.
BEMÆRK: Tris-HCI blev valgt for at minimere HEPES-forurening under nano-flow LC (nanoLC)-HRMS.
FORSIGTIG: Eksponering for nonidet P-40 erstatning kan forårsage hudirritation. Cytochalasin D er teratogent, hvis det indtages, og combretastatin er akut toksisk ved direkte eksponering. Brug passende personlige værnemidler ved håndtering af disse kemikalier. - For at adskille peptider med CE fremstilles følgende opløsningsmidler (v/v): Prøveopløsningsmiddel, 75% acetonitril (ACN) indeholdende 0,05% eddikesyre (AcOH) i vand; kappeopløsning, 10% ACN indeholdende 0,05% AcOH i vand; baggrundselektrolyt (BGE), 25% ACN indeholdende 1 M myresyre (FA) i vand.
FORSIGTIG: AcOH og FA er giftige, når de indåndes eller indtages og kan forårsage alvorlig hud- og øjenskade ved direkte eksponering. Brug passende personlige værnemidler ved håndtering af disse kemikalier. - For at adskille peptider ved hjælp af omvendt fase nanoLC, præparat (v / v): Mobil fase A (vandig), vand indeholdende 0,1% FA; mobil fase B (organisk), 0,1% FA i ACN.
BEMÆRK: Alle blandinger skal fremstilles ved hjælp af opløsningsmidler af LC-MS-kvalitet for at minimere kemisk interferens under HRMS-detektion.
- Forbered cellelysebufferen til at omfatte: 250 mM saccharose, 1% nonidet P-40 erstatning (w / v), 20 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA, 10 μM cytochalasin D og 10 μM combretastatin 4A. Der fremstilles en bestand på 10% (w/v) natriumdodecylsulfat14,15.
2. Forbered værktøjerne til mikroinjektion og dissektion
- For forsigtigt at bevæge og orientere embryoner skal du lave hårløkker ved at fiksere rent hår i en Pasteur-pipette som beskrevet andetsteds16.
- Til mikroinjektion fremstilles nåle ved at trække borosilikatkapillærer (1 mm/500 μm ydre/indvendig diameter) med en pipettetrækker som beskrevet andetsteds16.
BEMÆRK: Her blev en P-1000 pipettetrækker med følgende indstillinger brugt til fremstilling af nåle: varme, 495; træk, 30, hastighed, 60; tid, 150; tryk, 200. - Med observation under et stereomikroskop skæres spidsen af kapillæret ved hjælp af et par skarpe tang for i det væsentlige at fremstille kapillæren i en (mikro) nål (f.eks. Dumont # 5)16.
FORSIGTIG: Trukket kapillærer er meget skarpe og skal håndteres med forsigtighed.
BEMÆRK: Spidsen af nålen skal være skarp nok (ydre diameter 10-15 μm) til at kunne gennembore cellen med minimal skade på cellemembranen, så det intracellulære indhold ikke lækker ud, og cellen kan helbrede og fortsætte med at være levedygtig. - For at holde embryoner under mikroinjektion skal du forberede brønde i en lerfyldt skål. I en 15 mm petriskål aftrykkes ~1 mm diameter x ~0,5 mm dybe brønde i ikke-giftigt plasticinler som beskrevet andetsteds16.
- Til mikrodissektion skal du forberede agaroseovertrukne retter. Lav 2% agarose i 1x SS og autoklave det for at sterilisere opløsningen (120 ° C i 20 min). Fyld 60 mm petriskåle halvvejs, og lad tallerkenerne størkne. Der fremstilles ~1 mm diameter x ~0,5 mm dybe huller ved hjælp af et Pasteur-pipetteværktøj med kugler som beskrevet tidligere16.
3. Isoler cellelinjen
BEMÆRK: Følgende trin udføres for at isolere identificerede enkeltceller og/eller deres efterkommere cellelinjer. Normalt dyrkes embryoet til 16- eller 32-cellestadiet, hvor vævsskæbnen for hver celle reproducerbart kortlægges 6,7,17. De embryonale celler identificeres ud fra morfologi, placering og med henvisning til deres skæbnekort. Til enkeltcelleanalyse isoleres identificerede celler ved manuel dissektion, eller deres intracellulære indhold opsamles i en kapillærpipette og deponeres i 5 μL 0,5 mM ammoniumbicarbonat. Den resulterende prøve opbevares ved -80 °C indtil analyse (figur 1)18,19,20,21. Til celleafstamningsanalyse injiceres identificerede celler med et afstamningsspor, og deres efterfølgende kloner isoleres på vigtige udviklingsstadier (f.eks. Under gastrulation for at studere vævsinduktion efter neurulering for at studere vævsforpligtelse). I det følgende skitseres trin til fluorescerende mærkning af afstamningen af identificerede celler til isolering ved dissektion eller FACS.
- Dyrk embryonerne
- Få embryoner via naturlig parring eller in vitro-befrugtning (IVF) efter etablerede protokoller12.
BEMÆRK: Naturlig parring er logistisk enklere, skåner de voksne mandlige frøer og giver embryoner på forskellige udviklingsstadier, mens IVF giver udviklingssynkroniserede embryoner til eksperimenter, der kræver nøjagtig iscenesættelse. - Dejelly embryonerne. Geléen omkring embryonerne fjernes via behandling med dejellying-opløsningen som beskrevet andetsteds12,16.
BEMÆRK: Mikroinjektioner og dissektion kræver adgang til celler og væv, hvilket nødvendiggør dejellying i X. laevis embryoner. - Vælg 2-cellede embryoner med stereotyp pigmentering 16,22.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at sikre nøjagtighed og reproducerbarhed i identifikationen af cellen og dens afstamning. - Kulturembryoner til det ønskede udviklingsstadium. Overfør de dejellierede embryoner til en petriskål indeholdende 1x SS og inkuber dem mellem 14-25 °C for at kontrollere udviklingshastigheden.
BEMÆRK: Udviklingens temperaturafhængighed er reproducerbar og kortlagt for X. laevis, tilgængelig på Xenbase23 (www.xenbase.org). Dyrkning af partier af embryoner ved forskellige temperaturer giver mulighed for svimlende udviklingsstadier. Dette hjælper med at fordele antallet af embryoner, der er tilgængelige på et givet tidspunkt til forsøg. - Overvåg embryonernes spaltningsmønster, og udvælg embryoner med stereotype pigmenterings- og spaltningsmønstre til mikroinjektion16.
BEMÆRK: Når du vælger 16- og 32-cellede embryoner, skal du sikre dig, at cellespaltningerne er symmetriske for reproducerbar afstamningssporing.
- Få embryoner via naturlig parring eller in vitro-befrugtning (IVF) efter etablerede protokoller12.
- Mærk de(n) celle(r), der er af interesse
- Opsæt kanylen, der indeholder afstamningssporopløsningen. Monter mikroinjektionsnålen i en mikropipetteholder, der styres af en multiakset mikromanipulator.
- Tilslut mikropipetteholderen til en mikroinjektor. Fyld nålen med afstamningssporstoffet ved at anvende undertryk som beskrevet andetsteds16. Figur 1A eksemplificerer opsætningen.
- Kalibrer nålen. Juster størrelsen på nålespidsen og injektionstiden for at levere ~ 1 nL af afstamningssporopløsningen, målt i (mineral) olie i henhold til en protokol, der er tilgængelig andetsteds16.
BEMÆRK: Kapillærer med en bredere spids har tendens til at beskadige cellemembranen, hvilket får subcellulært indhold og det injicerede afstamningssporstof til at lække ud, mens kapillærer med mindre spidser er tilbøjelige til tilstopning. Kapillærer med ~ 10 μm spids ydre diameter er ideelle, hvilket kræver en 40 psi trykpuls over ~ 300 ms for at levere ~ 1 nL. - Oversvøm mikroinjektionslerskålen med 3% Ficoll-opløsningen, og overfør ~10 embryoner til lerskålen ved hjælp af en overførselspipette. Brug en hårsløjfe til at lede hvert embryo ind i en brønd og placer dem forsigtigt, så den målrettede celle af interesse er i en ret vinkel på mikronålen.
- Identificer forløbercellen for den interessante afstamning efter X. laevis vævsskæbnekortene. For eksempel viser figur 1 mærkning af neurale ektodermale kloner baseret på injektion af dets forløberceller i 32-cellede embryoner (venstre og højre D111-celler ).
BEMÆRK: Detaljerede skæbnekort for 16-6 og 32-cellede 7,8 embryoner er tilgængelige i en interaktiv platform via Xenbase23. Det er vigtigt at sikre stereotyp pigmentering og spaltninger på embryoner, når de bruges til afstamningsforsøg. - Injicer cellen (e) af interesse med ~ 1 nL af den fluorescerende dextran eller ~ 200 pg mRNA som beskrevet tidligere16.
BEMÆRK: Brug dextrankonjugater, der er 10.000-40.000 MW. Mindre dextrankonjugater kan passere gennem mellemrumskryds, mens større dextrankonjugater muligvis ikke diffunderer jævnt ind i den injicerede celle. Planlæg at injicere celler i ~ 10 embryoner for at have tilstrækkeligt væv til proteomiske analyser. - Bekræft succesen med cellemærkning under et stereomikroskop. Sørg for, at kun den tilsigtede celle injiceres. Kassér embryoner, der indeholder skadede eller forkert mærkede celler i henhold til institutionelle politikker.
BEMÆRK: Fordi X. laevis er invasiv i mange ikke-naturlige miljøer, kan embryoner fryses for at sikre dødelighed, før embryonerne kasseres.
- Isoler det mærkede celleafkom
- Overfør de injicerede embryoner til 0,5x SS i en petriskål og dyrk dem mellem 14-25 °C, indtil det ønskede udviklingsstadium er nået.
BEMÆRK: Se etablerede protokoller for stadiering af embryoner, der rapporteres om Xenbase. - Overfør 3-5 embryoner til en agarskål med 0,2x SS-opløsning til mikrodissektioner.
BEMÆRK: Reduktion af saltkoncentrationen af SS-opløsning fra 0,5x til 0,2x hjælper med at adskille celler under dissektion. - Brug to skærpede pincet til forsigtigt at fjerne vitellinmembranen, der omgiver embryoet.
BEMÆRK: For at skåne klonen af interesse fra skader, skræl membranen fra den modsatte side af den fluorescerende mærkede klon. - Den mærkede klon isoleres ved manuel dissektion (trin 3.3.5-3.3.6) eller FACS (trin 3.3.7-3.3.8) som følger.
- Brug tang til at dissekere den mærkede klon fra embryoet.
BEMÆRK: Andre værktøjer såsom mikrokirurgisk saks, wolframnåle eller øjenbrynshårknive kan bruges til dissektion af den mærkede klon, som beskrevet andetsteds16. - Det dissekerede væv opsamles med en 0,5-10 μL pipette og deponeres i et hætteglas med mikrocentrifuge. Brug en overførselspipette til at aspirere mediet omkring det opsamlede væv for at begrænse salte i prøven, hvilket forstyrrer HRMS-analysen i senere trin.
BEMÆRK: Brug hætteglas, der minimerer proteinadsorption på plastoverflader for at minimere proteintab på hætteglassets overflader under senere trin i arbejdsgangen. - For at isolere ved hjælp af FACS overføres ~ 5-8 afvitelliserede embryoner til hver brønd i en 12-brøndplade indeholdende ~ 5 ml Newport 2.0-buffer. Afbryd embryonerne ved at møtrikere pladen ved 80 rpm i 20-30 min ved stuetemperatur13.
BEMÆRK: Embryoner / larver ældre end trin 22 har rigelige ekstracellulære matrixproteiner, hvilket gør dissociation i separate celler vanskelig. Yderligere enzymatiske tilgange kan tilpasses til adskillelse af væv fra ældre embryoner som beskrevet andetsteds24. - De fluorescerende mærkede celler renses fra suspensionen ved hjælp af FACS som beskrevet andetsteds24.
- Pilleceller ved centrifugering og supernatanten kasseres.
BEMÆRK: Brug lav centrifugeringshastighed (400 × g) og temperatur (4 °C) for at forhindre cellelyse. Hvis du bruger bovin serumalbumin (BSA) til FACS, skal du vaske cellepillen for at reducere BSA-interferens under HRMS-detektion. Resuspender forsigtigt cellerne i 1x fosfatbufret saltvand (PBS) og centrifuger igen til pelletskyllede celler. Supernatant PBS-væsken fjernes. - De isolerede celler fryses hurtigt ved at lægge hætteglasset på tøris eller flydende nitrogen.
BEMÆRK: Hold prøverne (væv eller celler) afkølet (f.eks. på is) under forarbejdningstrinnene. Frys cellerne med så lidt medie omkring prøven som muligt for at lette nedstrømsbehandlingen. - Prøverne opbevares ved -80 °C indtil HRMS-analyse.
- Overfør de injicerede embryoner til 0,5x SS i en petriskål og dyrk dem mellem 14-25 °C, indtil det ønskede udviklingsstadium er nået.
4. Analyser proteinerne ved massespektrometri
Proteomisk karakterisering af de isolerede væv eller celler er baseret på en række etablerede trin i HRMS. Figur 2 illustrerer trinnene i den bioanalytiske arbejdsgang. Prøveindsamlingsprotokollen, der bruges her, er kompatibel med bottom-up11, middle-down25 eller top-down26 arbejdsgange for proteomics. I det følgende beskrives bottom-up-strategien, der anvendes i denne undersøgelse, som har vist sig at være følsom, kvantitativ og tilpasningsdygtig til forskellige typer massespektrometre. Efter ekstraktion og enzymatisk fordøjelse af proteiner adskilles de resulterende peptider efterfulgt af HRMS-analyse.
- Behandl vævene/enkeltcellerne
- Til enkeltcelleanalyse med CE opvarmes prøven til 60 °C i ~15 minutter for at denaturere proteiner, hvorefter prøven afbalanceres til stuetemperatur (RT, ~5 min)18,21.
BEMÆRK: I modsætning til under arbejde med væv springes reduktions- og alkyleringstrinnene over for at begrænse proteintab under prøveforberedelse fra enkeltceller. Filterstøttet prøveforberedelse (FASP)27,28, andre enkeltpottestrategier 29 og mikrofluidiske tilgange30 kan vedtages for at minimere proteintab under prøveforberedelse. - Til analyse med nanoLC lyseres op til 5 dissekerede væv i 50 μL lysisbuffer (~ 100 μg total protein). Facilitere processen ved at pipettere prøven op og ned et par gange.
- Lysatet inkuberes ved 4 °C i 10 minutter, hvorefter celleaffaldet og æggeblommeblodpladerne centrifugeres ved 4 500 × g ved 4 °C. Supernatanten overføres til et rent hætteglas med mikrocentrifuge, og der tilsættes 10 % SDS for at opnå en slutkoncentration på 1 % SDS i lysatet (v/v).
- For væv skal du følge trin 4.1.5-4.1.7.
- Tilsæt 0,5 M dithiothreitol til lysatet for at opnå en slutkoncentration på ~25 mM (f.eks. 2,5 μL 0,5 M dithiothretol til 50 μL lysat) og inkuber lysatet i 30 minutter ved 60 °C for kemisk at reducere disulfidbindinger i proteiner.
- Der tilsættes 0,5 M iodoacetamid for at opnå en slutkoncentration på ~75 mM i lysatet og inkuberes blandingen i 15 minutter ved RT i mørke (figur 2).
- Tilsæt 0,5 M dithiothreitol, det samme som det oprindelige volumen (fx 2,5 μL 0,5 M dithiothretol til 50 μL lysat) for at slukke reaktanter, der er tilbage fra alkyleringsreaktionen.
FORSIGTIG: Iodoacetamid og dithiothreitol kan forårsage alvorlig hud- og øjenskade ved direkte eksponering. Brug passende personlige værnemidler ved håndtering af disse kemikalier. - Rens proteiner via nedbør. Chloroform-methanol-baseret nedbør klarer sig godt31. Denne protokol kan også tilpasses andre typer nedbørsmetoder32.
BEMÆRK: For enkeltcelleanalyse, hvor proteintab er bekymrende, skal du springe udfældningstrinnet over for CE-HRMS. - Proteinbundfaldet tørres i en vakuumkoncentrator (4-37 °C), og det ekstraherede proteom resuspenderes derefter i 50 μL 50 mM ammoniumbicarbonat. Proteinkoncentrationen estimeres ved hjælp af et kolorimetrisk assay med totalprotein for at bestemme den mængde enzym, der kræves til fordøjelsen (f.eks. Bicinchoninsyreproteinassay).
- Fordøje proteinerne til peptider. Der tilsættes trypsin (1 μg/μl stam) for at opnå et protease:protein-forhold på 1:50, og blandingen inkuberes ved 37 °C i op til 5 timer for enkeltcelleprøver og op til 14 timer for vævsprøver. Se leverandørspecifikke anbefalinger for reaktionen.
BEMÆRK: Fordøjelse med trypsin i mere end 14 timer eller højere koncentrationer kan introducere spaltninger, der ikke er specifikke for proteinsekvensen, hvilket udfordrer proteinidentifikationer33. - Kvantificer den totale peptidkoncentration ved hjælp af et kolorimetrisk assay.
- VALGFRIT: Til multiplexkvantificering mærkes peptiderne fra hver prøve med et andet isobarisk massemærke efter leverandørspecifikke instruktioner. Bland de stregkodede peptider i lige store mængder pr. peptidprøve.
BEMÆRK: Sørg for nøjagtig mærkning og blanding for at undgå kvantitative skævheder. For mængdebegrænsede prøver eller enkeltcelleprøver kan en TMT-baseret bærerkanal bestående af poolede væv / celler inkluderes for at minimere prøvetab under efterfølgende separationstrin og for at øge følsomheden af proteiner med lavere rigelige34. - VALGFRIT: Afsaltpeptider for at fjerne salte og forurenende stoffer (f.eks. ureagerede isobariske massemærkereagenser) på en C18-omvendt fase spinsøjle/spids for at beskytte LC-MS-systemet.
- VALGFRIT: Fraktionere (f.eks. medium- eller høj-pH-fraktionering med omvendt fase) peptidblandingen til dybere påvisning af proteomet via manuelle eller automatiske platforme. Brug C18 stationær fase, der indeholder spidser til fraktionering af lave mængder (1-10 μg) peptidfordøjelser.
- Peptidblandingen tørres ved 60 °C i en vakuumkoncentrator.
- Peptidblandingen opbevares ved -80 °C indtil måling.
- Til enkeltcelleanalyse med CE opvarmes prøven til 60 °C i ~15 minutter for at denaturere proteiner, hvorefter prøven afbalanceres til stuetemperatur (RT, ~5 min)18,21.
- Adskil peptiderne
BEMÆRK: Efter ekstraktion og enzymatisk fordøjelse af proteiner separeres de resulterende peptider med nanoLC eller CE og ioniseres af ESI til sekventering ved tandem HRMS. Omvendt fase nanoLC-separation er ideel til peptider, der samler ~ 150 ng til ~ 1 μg pr. Analyse. CE giver komplementær følsomhed for peptider, der spænder fra femtogrammer til <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 og bruges i stigende grad til enkeltcelleanalyse18,36,37.- Følg trin 4.2.2-4.2.7 for at adskille ved hjælp af CE.
BEMÆRK: I det følgende beskrives brugen af den specialbyggede CE-platform til måling af peptiderne. Protokoller til at bygge og bruge dette CE-instrument blev leveret tidligere38 sammen med et visualiseret eksperiment om brug af små molekyler20. Alternativt kan disse målinger udføres på et kommercielt CE-system, såsom AB SCIEX CESI, Agilent 7100 eller tilsvarende. - Rekonstituer proteinfordøjelsen i 1-2 μL af prøveopløsningsmidlet, hvirvelstrømmen for at blande prøven, og centrifuger den ved 10.000 x g i 2 minutter for at pelletcellerester.
BEMÆRK: Fjernelse af cellerester minimerer sandsynligheden for tilstopning af CE-kapillærrøret, hvilket forlænger separationssystemets levetid og øger målegennemstrømningen. - Initialiser CE-ESI-instrumentet ved at skylle CE-kapillæret med BGE.
- Valider instrumentel ydeevne ved hjælp af en kendt standard (f.eks. cytokrom C eller BSA-fordøjelse, angiotensinpeptider).
BEMÆRK: Det anbefales at evaluere instrumentet med hensyn til massenøjagtighed, detektionsfølsomhed, reproducerbarhed og lineært dynamisk kvantificeringsområde før måling af dyrebare prøver. Yderligere bemærkninger om validering og fejlfinding af CE-ESI-MS-ydeevne er anført andetsteds18,20,38. - Der injiceres ~1-10 nL af prøven i CE-separationskapillærrøret.
BEMÆRK: Denne undersøgelse bruger ~ 1 m lang smeltet silicakapillær (40/110 μm indvendig / ydre diameter) med den elektrokinetisk pumpede kappe-flow-opsætning. Kommercielle CE-instrumenter kræver normalt præsentation af 5-10 μL prøve i et mikrohætteglas til injektion. Den specialbyggede CE-platform18,38 er kompatibel med ~ 250 nL til 1 μL prøve deponeret i et prøveindlæsningsmikrovial. - Indløbsetenden af CE-separationskapillæren overføres til BGE.
- Start elektroforetisk adskillelse ved gradvist at øge CE-separationsspændingen fra jordjorden (f.eks. Trinvis over 1 min). Potentialer på 20-28 kV med strøm under ~10 μA sikrer stabil og reproducerbar instrumentel ydeevne til analyse.
- Følg trin 4.2.9-4.2.12 for at adskille ved hjælp af nanoLC.
- Peptidprøven resuspenderes i mobil fase A. Koncentrationen af prøven og dens volumen til injektion afhænger af det tilgængelige LC-system og kolonne. I denne undersøgelse injiceres ~ 250 ng-1 μg proteinfordøjelse i 1-20 μL prøvevolumen på en C18-pakkesøjle (75 μm indvendig diameter, 2 μm partikelstørrelse med 100 Å porer, 25 cm længde separationskolonne).
- Overfør prøven til et LC-hætteglas.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er luftbobler i hætteglasset, som kan beskadige analysekolonnen. Hætteglas med indlæg kan anvendes til lavvolumenvævs- eller enkeltcelleprøver. - Der lægges ~200 ng til 2 μg peptidprøve på C18-analysekolonnen.
BEMÆRK: Eventuelt kan peptiderne lægges på en fældesøjle til afsaltning inden analytisk adskillelse. For eksempel en C18 fældesøjle med 0,1 mm indvendig diameter, 5 μm partikelstørrelse, 100 Å porestørrelse, 20 mm længde. Afsaltpeptider med 100% buffer A ved en strømningshastighed på 5 μL/min i 5 minutter, før separationsgradienten begynder. - Adskil peptiderne ved hjælp af gradienteluering. Ved en strømningshastighed på 300 nL/min er den 120-minutters gradient, der anvendes i denne undersøgelse, som følger: 0-5 min 2% B, 5-85 min 2-35% B, 86-90 min 70% B, 91-120 min 2% B.
- Følg trin 4.2.2-4.2.7 for at adskille ved hjælp af CE.
- Ioniser peptiderne ved hjælp af ESI
BEMÆRK: CE- eller nanoLC-kapillæren kobles typisk til en ESI-kilde til ionisering. Micro-flow (stump spids) og nano-flow (konisk spids39 og elektrokinetisk pumpet kappe-flow36 design) CE-ESI-grænseflader til ultrafølsom detektion er tidligere blevet udviklet.- Tilfør de adskillende peptider i en elektrosprayionkilde til ionisering ved hjælp af en kommerciel eller specialbygget ESI-grænseflade. Til enkeltcelle CE-ESI-MS-analyse i Xenopus-embryoner skal du bruge en elektrokinetisk pumpet lavstrømsgrænseflade, hvor CE-kapillærudløbet er indesluttet i en trukket borosilikatemitter.
- Kontroller væskestrømmen gennem elektrospraysenderen ved hjælp af et kamera, og inspicer visuelt opsætningen for mulige lækager.
- Indstil elektrosprayspændingen til ~ 2,5 kV for at starte ESI-kilden (vs. jordjord).
- Sørg for en stabil nanospray til HRMS-analyse ved at overvåge den samlede ionstrøm. Juster elektrosprayspændingen og emitterens afstand til HRMS-indløbet for at opnå en stabil spray (<15% relativ standardafvigelse i total intensitet).
- Registrer peptiderne
BEMÆRK: Påvisning af peptider følger forskellige instrumentelle overvejelser for isobariske massemærkede og umærkede peptider og afhænger af typen af tilgængeligt massespektrometer. Denne undersøgelse bruger et orbitrap tribrid-massespektrometer i henhold til følgende trin.- Få MS1-begivenheder med indstillingerne: Analysator, orbitrap; Spektralopløsning, 120.000 fuld bredde ved halv maksimum (FWHM); maksimal injektionstid (IT), 50 ms; automatisk forstærkningskontrol (AGC), 4 x 105 tæller; mikroscanninger, 1.
- For at sekvensere peptider, fragmentforløberioner til detektion i ionfældeanalysatoren ved hjælp af indstillingerne: fragmenteringstilstand, højere energikollisionsdissociation (HCD); kollisionsgas, nitrogen; kollisionsenergi, 32% normaliseret kollisionsenergi (NCE); maksimal IT, 70 ms; AGC, 1 x 104 tæller; mikroscanninger, 1.
- VALGFRIT: Kvantificer TMT-mærkede peptider ved hjælp af tandem/flertrins HRMS (MS2/MS3). For MS3, der anvender synkron prækursorvalg, er de typiske instrumentale indstillinger som følger. Ettrinsscanninger (MS1), der måler de mest rigelige ioner, dissocieres via dataafhængig erhvervelse ved hjælp af parametrene: MS 2-fragmenteringstilstand, kollisionsinduceret dissociation (CID); kollisionsgas, helium; kollisionsenergi, 35% NCE; analysator til fragmentioner, ionfælde følgende indstillinger: maksimal IT, 50 ms; AGC, 5 x 104 tæller; mikroscanninger, 1. Vælg 10 MS2 fragmentioner og fragmenter dem med HCD i nitrogen (65% NCE). Registrer MS 3-fragmentioner ved hjælp af følgende indstillinger: Orbitrap-opløsning 15.000 FWHM, maksimal IT, 120 ms; AGC, 1 × 105 tæller; mikroscanninger, 1.
BEMÆRK: Forskellige MS-anskaffelsesmetoder og parametre kan bruges til mærkede prøver efter leverandøranbefalinger som beskrevet andetsteds11,40.
- Analysér dataene
BEMÆRK: Proteiner identificeres og kvantificeres ved hjælp af avancerede bioinformatiske pakker. Troskaben af identifikationer beregnes ved hjælp af en lokkedatabase, udtrykt som den falske opdagelseshastighed (FDR) på niveauet af peptider og proteiner.- Behandl dataene ved hjælp af kommercielle eller open source-softwarepakker (gennemgået i reference41). Match rådataene med en database, der blev udarbejdet ved at sammenkæde Xenopus-proteomet 9.2 med den mRNA-afledte PHROG-database42.
BEMÆRK: Søgeparametrene er: fordøjelsesenzym, trypsin; ubesvarede spaltninger, op til 2; variabel modifikation, methioninoxidation; statisk modifikation, cysteincarbamidomethylering; forløbermassetolerance, 10 ppm; fragment massetolerance, 0,6 Da; mindste peptidlængde, 5; identifikation troskab, <1% FDR for peptider og proteiner. Uden alkylering til peptider er carbamidomethylering som en statisk modifikation udelukket under databasesøgning (f.eks. Til enkeltcelleanalyse). - Kvantificer proteinmængder via etiketfri43 eller etiketbaserede strategier44,45.
- VALGFRIT: Anmærk proteiner til genontologi. PantherDB46, Reactome47 eller Xenbase23 kan bruges.
- VALGFRIT: Kvantificer proteinoverflod og forskelle i proteinmængder på tværs af celle-/vævstyper ved hjælp af softwarepakker/webværktøjer, såsom Trans-Proteomic Pipeline48, Perseus49 og Orange50.
BEMÆRK: Yderligere overvejelser om eksperimentelt design og softwaremuligheder blev gennemgået andetsteds41,51. - VALGFRIT: Evaluer resultaterne yderligere ved hjælp af vidensbaser, såsom STRING52 og BioPlex Display53 for kendte protein-proteininteraktioner og PhosphoSiteplus54 for phosphoryleringer. Til analyse af motiver og domæner, der er repræsenteret i proteomet, skal du bruge webværktøjer som Simple Modular Architecture Research (SMART)55.
- Behandl dataene ved hjælp af kommercielle eller open source-softwarepakker (gennemgået i reference41). Match rådataene med en database, der blev udarbejdet ved at sammenkæde Xenopus-proteomet 9.2 med den mRNA-afledte PHROG-database42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol muliggjorde undersøgelsen af proteiner i enkeltceller og deres slægter, da de etablerer væv i X. laevis embryoner. Figur 1 illustrerer en sådan anvendelse af tilgangen til at studere proteiner i neurale vævsskæbneceller og den nyligt inducerede neurale ektoderm i embryoet. Som vist i figur 1A integrerede den bioanalytiske arbejdsgang traditionelle værktøjer inden for celle- og udviklingsbiologi til at identificere, injicere / aspirere celler og indsamle prøver. Figur 1B viser mikroprobeprøveudtagning af venstre dorsaldyrcelle (D11) i 16-celleembryoet in vivo ved hjælp af en mikroinjektor; Efter forsøget udviklede embryoner sig med succes til haletudser med normal anatomi56. Store embryonale celler (~ 100-250 μm i diameter) var også befordrende for manuel mikrodissektion. Dissektion af en højre dorsal-dyr midterlinje (D11) celle er illustreret fra det 16-cellede embryo i figur 1C. Opsætningen tillod også sporing af en klonbane ved at injicere et fluorescerende sporstof i den identificerede prækursor. Som vist i figur 1D tillod tilgangen at isolere kloner, der opstår fra venstre og højre D111-celler via vævsdissektion eller ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). De prøveindsamlingsstrategier, der er beskrevet her, er tilstrækkeligt skalerbare i rum og tid til at studere embryonal udvikling i nye detaljer.
Den bioanalytiske arbejdsgang integrerede HRMS-teknologier for at forbedre følsomhed og kvantificering (figur 2). De indsamlede proteiner blev målt via en bottom-up proteomisk tilgang. Valgfri fraktionering af prøver baseret på ortogonal kemi (f.eks. høj pH og derefter lav pH omvendt fase LC) hjalp detektionsfølsomhed. For at adskille peptider blev CE valgt til spormængder af prøver (<<~100 ng)) og nanoLC for begrænsede mængder materialer (>>150 ng). Peptider blev sekventeret under anvendelse af ESI-HRMS. De påviste proteiner blev kvantificeret ved hjælp af etiketfri og etiketbaserede strategier. Forenkling af prøvebehandling til enkeltcelleanalyse, såsom eliminering af de typiske trin til reduktion og alkylering efterfulgt af CE-analyse, lettede identifikationen af ~ 400-800 forskellige proteiner. Blandt de rapporterede proteiner var mange med vigtige funktionelle roller, såsom chaperonin indeholdende TCP1-underenhed 3 (Cct3), spændingsafhængig ionkanal (Vdac2) og kreatinkinasehjerne (Ckb). Multivariate og statistiske datamodeller hjalp os10,57 og andre 9,58 med at finde tidligere ukendte forskelle i den proteomiske sammensætning af udvalgte celler og væv ved hjælp af de tilgange, der er opsummeret i denne protokol. Især krævede disse HRMS-målinger ingen fungerende sonder eller viden om sammensætningen af prøverne på forhånd, hvilket understøttede opdagelser.
I en række undersøgelser blev den proteomiske tilstand af identificerede celler i udvikling af embryoner af X. laevis (fig. 3) kvantificeret21. Figur 3A viser påvisning af gentranslationelle forskelle mellem D11-celler , der blev dissekeret fra forskellige embryoner10. Mikroprøveudtagning CE-ESI-HRMS gjorde det muligt for os at identificere og kvantificere op til ~700 proteiner fra enkeltceller21. De repræsentative primære HRMS-MS/MS-data om identifikation af ~400 kumulative proteiner fra tekniske duplikatmålinger på en D11-celle i embryoet blev deponeret hos PRIDE. Tilgangen var skalerbar til mindre celler og embryoner fra andre modelorganismer, såsom zebrafisk21. Skalerbarhed til mindre cellestørrelser gjorde det muligt for os at udforske den rumlige tidsmæssige reorganisering af D11-afkom fra et levende embryo, da det udviklede sig i tide. Figur 3B viser brugen af denne protokol til at udføre subcellulær kvantitativ proteomics af identificerede celler i 16-, 32-, 64- og 128-cellede embryoner. Proteiner blev opdelt i fire grupper, der viste forskellige overflodsprofiler over klonal udvikling21.
Figur 3: Protokolskalerbarhed fra det subcellulære rum til klonalt væv i X. laevis embryo. (A) Måling af proteomiske forskelle mellem identificerede hele D11-celler, der afslører celle-celle-heterogenitet. Gennavne vist for udvalgte proteiner. (B) Reorganisering af det cellulære proteom i den udviklende D11-celleklon. Fuzzy C-betyder klyngeanalyse (GProx) af proteindynamik, gruppering af proteiner baseret på lignende ekspressionsmønstre. Grå tal viser antallet af forskellige proteiner, der blev kvantificeret i hver klynge. Tallene er tilpasset med tilladelse fra referencerne 21,57. Klik her for at se en større version af denne figur.
Denne protokol tillod os at udføre rumlig og tidsmæssig proteomik i identificerede, udviklende cellekloner (figur 4). Figur 4A viser anvendelsen af tilgangen til mærkning og isolering af cellekloner, der udgør to væv med vigtige roller i udvikling af neuralt væv og mønster af embryoet. Størstedelen af Spemann-organisatoren (SO) blev sporet ved at mærke venstre og højre D 112- og D212-celler via injektion af fluorescerende dextran. Parallelt blev de nærliggende dorsal-dyr (D111) celler mærket for at markere størstedelen af den neurale ektoderm (NE). Vævene blev dissekeret, og deres proteinindhold blev analyseret efter denne protokol. nanoLC-ESI-HRMS returnerede op til 2.000 forskellige proteiner fra vævene, herunder signalering, såsom Wnt-, Fgf- og Tgfβ-veje. De repræsentative primære HRMS-MS/MS-data om identifikation af ~1.800 kumulative proteiner fra tekniske duplikatmålinger på en pulje af dissekeret SO-væv blev deponeret hos PRIDE. Wnt-vejliganden Wnt10a og Wntless (Wls), et membranprotein dedikeret til udskillelsen af Wnt-ligander, blev kun påvist i NØ-proteomet. Wnt-vejen blev fundet undertrykt i SO og kan forklare mangel på Wnt-interagerende proteiner påvist i SO. Disse resultater viser anvendeligheden af denne protokol til undersøgelse af afstamningsspecifikke forskelle i embryoet.
Figur 4: Eksempel på dataanalyse fra rumlig vævsproteomics i X. laevis embryoner. (A) Differentiel mærkning af Spemann's Organizer (SO) og neurale ectoderm (NE) væv ved injektion af fluorescerende protein mRNA i forgængeren D 112 og D212 i henholdsvis 32-celleembryoet. (B) Top 5 overrepræsenterede biologiske processer i SO-proteomet (rød) og NE (grøn), der viser påviselige forskelle. Pathway overrepræsentationsanalyse viser biologiske processer ved hjælp af Bonferroni-korrektion. (C) Proteindomæneberigelsesanalyse (SMART), der afslører berigelse af DNA- og RNA-bindende motivholdige proteiner i SO. D) STRING-analyse, der forudsiger kanoniske protein-protein-interaktioner baseret på det påviste SO-proteom. Klik her for at se en større version af denne figur.
De forskellige proteomiske data tjener som værdifuld information til vurdering af funktion. De proteomiske data kan evalueres ved hjælp af kanoniske vidensbaser. Som vist i figur 4B viste pathway-analyse af dysregulerede proteiner overrepræsenteret translation og energimetabolisme i både SO- og NE-datasættene i vores nylige undersøgelser. NE-proteomet blev beriget med proteiner forbundet med nuklear transport af proteinlast i cellen, hvilket sandsynligvis indikerer nedstrøms begivenheder efter signalering i den nyetablerede NE (figur 4C). Berigelsesanalysen i figur 4D fandt opregulering i translationsinitiering, RNA-binding, binding i proteasomkomplekset, hvilket tyder på en rolle for dynamisk proteinomsætning, der udvikler SO. Celleafstamningsstyret HRMS-proteomics er skalerbar i rum og tid og tilstrækkelig følsom til bedre at forstå cellernes molekylære organisation under normal og nedsat udvikling.
Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol muliggør karakterisering af proteinekspression i identificerede cellelinjer i embryoner af Xenopus-arten . Metoden stammer fra HRMS og kombinerer udsøgt specificitet i molekylær identifikation, evne til multiproteindetektion uden molekylære sonder (normalt hundreder til tusinder af forskellige proteiner) og en evne til kvantificering. Tilpasningsevne til klassiske værktøjer og arbejdsgange inden for celle- og udviklingsmæssig (neuro)biologi udvider HRMS-proteomics til spændende anvendelser, herunder holistisk karakterisering af stamcelledifferentiering i hvirveldyrets X. laevis-embryo .
Trinene beskriver celleafstamningsvejledt proteomics i X. laevis embryoet. Som eksempler demonstrerer vi analysen af neural-skæbnesvangre enkeltceller og deres slægter og leverer de tilsvarende CE- og nanoLC HRMS-datasæt gennem et offentligt datalager (se PRIDE). Denne tilgang kan let tilpasses undersøgelser af den rumlige tidsmæssige regulering af proteiner i flere celletyper (og slægter). Spatiotemporalt vejledt proteomics i det udviklende embryo kan også udvides til transkriptomiske og metabolomiske undersøgelser for at fremme molekylære systemers biologiske forståelse af celledifferentiering og udvikling af nøgleorganer, såsom nervesystemet.
Denne protokol tilføjer nye dimensioner til bioanalyse. Cellekulturer, såsom de inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er)1,2, letter målingen af tidsmæssig proteomdynamik under celledifferentiering. Den tilgang, der er beskrevet i denne undersøgelse, kigger ind i induktion af celleskæbne i det 3-dimensionelle levende embryo, hvor komplekse morfogengradienter, parallelle signalveje og konvergerende udvidelsesprocesser samarbejder for at skabe vævsinduktion og morfogenese. At studere proteomdynamik i forbindelse med et embryo kan give information om parallelle mekanismer, der styrer celledifferentiering, en spændende retning for at uddybe forståelsen af differentiering og udvikling.
Den her beskrevne fremgangsmåde låner de eksperimentelle fordele ved Xenopus-arterne til dette formål, især X. laevis. Hver celle i det tidlige 16- og 32-celle X. laevis embryo er kortlagt til reproducerbare vævsskæbner i den voksne organisme, i det væsentlige en rumlig projektion af celler i spaltningsstadiet embryoner. Reproducerbarhed for cellestyret proteomics bygger på nøjagtig celletypning. Vi hjælper succes ved at legitimere embryoner til stereotyp pigmentering og spaltning, inden vi fortsætter med eksperimenter, der beskriver celledissektion og afstamningssporing16,20. Det er vigtigt at bemærke, at celler i spaltningsstadium embryoner ofte bidrager til dannelsen af forskellige vævstyper i forskellige grader; Detaljerne om deres niveaubidrag til hver vævstype er tilgængelige på Xenbase23. Det embryonale stadium og prækursorcellerne, der skal spores, bør derfor vælges ud fra det foreliggende biologiske spørgsmål. Ved dyrkning af embryoner over længere tid (f.eks. >1 d) bør man sørge for at fjerne beskadigede/døde embryoner, hvilket igen kan mindske levedygtigheden for de andre embryoner i befolkningen.
For vellykket HRMS-proteomik skal der lægges stor vægt på det analytiske grundlag for celle-/vævsindsamling, proteinekstraktion og HRMS-måling. Da Xenopus-embryoner dyrkes i medier, der indeholder høje koncentrationer af ikke-flygtige salte, der vides at reducere HRMS-følsomheden, anbefales det at reducere de aspirerede medier ved indsamling af celler og væv til proteomiske undersøgelser. Det er en god praksis at undersøge afsaltning for at fremme identifikation og kvantificering af proteinerne. Før HRMS-måling skal CE- og LC-ESI-HRMS-instrumenternes analytiske ydeevne evalueres, herunder separation, ionisering, reproducerbarhed og lineært dynamisk kvantificeringsområde. Med gode analytiske målinger hjælper denne protokol med at reducere brugen af dyr i biologisk forskning, hjælper følsomheden til at opnå mere kraftfulde sæt biokemiske data og forbedrer kraften i statistisk dataanalyse til at fortolke resultater. Som standard analyserer vi hver biologisk replikat i mindst 3 tekniske replikater ved hjælp af CE eller LC-HRMS, som bruges til at evaluere teknisk reproducerbarhed og uddybe dækningen af det detekterbare proteom. Strømanalyse hjælper med at estimere statistisk magt og design af den biologiske replikat størrelse. Brug af forskellige sæt forældrefrøer anbefales for at tage højde for naturligt forekommende biologisk variabilitet blandt embryoner.
SUPPLERENDE OPLYSNINGER
HRMS-MS/MS proteomics-data og relaterede behandlingsfiler blev deponeret til ProteomeExchange Consortium via PRIDE 60-partnerlageret med datasætidentifikatoren PXD030059.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Jie Li (University of Maryland, College Park) for værdifulde diskussioner om embryonal dissociation og FACS. Vi takker Vi M. Quach og Camille Lombard-Banek for hjælp med prøveforberedelse og dataindsamling i tidligere undersøgelser, der eksemplificerer de proteomiske anvendelser, der er fremhævet i denne protokol. Dele af dette arbejde blev støttet af National Science Foundation under tildelingsnummer IOS-1832968 CAREER (til P.N.), National Institutes of Health under tildelingsnummer R35GM124755 (til P.N.), University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (til P.N.) og COSMOS Club Foundation forskningspriser (til ABB og LRP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
References
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560 (2021).
- Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
- Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2000).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. Vleminckx, K. 1865, Humana Press Inc. NY. 175-194 (2018).
- Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
- Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
- Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P. Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. 628, 263-292 (2019).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11 (2016).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956 (2017).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Developmental Biology. 120 (1), 299-304 (1987).
- Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
- Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
- Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
- Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
- Wisniewski, J. R. Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. Becher, D. 1841, Humana Press Inc. NY. 3-10 (2018).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882 (2018).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
- Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
- Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161 (2018).
- Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
- Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21 (2019).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
- Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
- Pino, L. K., Rose, J., O'Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
- Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25 (2020).
- Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
- Schmidt, E., et al. On the Move Federated Workshops. , Springer, Verlag. Berlin. 710-719 (2006).
- Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
- Jensen, L. J., et al. STRING 8 - a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
- Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
- Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
- Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
- Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
- Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
- Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
