Summary
Nous décrivons ici une caractérisation protéomique basée sur la spectrométrie de masse de lignées cellulaires avec des destins tissulaires connus chez l’embryon vertébré Xenopus laevis .
Abstract
La caractérisation des événements moléculaires lorsque les cellules donnent naissance à des tissus et des organes permet de mieux comprendre le développement normal et de concevoir des remèdes efficaces contre les maladies. Les technologies permettant l’identification et la quantification précises de divers types et d’un grand nombre de protéines fourniraient encore des informations manquantes sur les mécanismes moléculaires orchestrant le développement des tissus et des organismes dans l’espace et le temps. Ici, nous présentons un protocole basé sur la spectrométrie de masse qui permet de mesurer des milliers de protéines dans des lignées cellulaires identifiées dans des embryons Xenopus laevis (grenouille). L’approche s’appuie sur des cartes reproductibles du devenir cellulaire et des méthodes établies pour identifier, marquer, suivre et échantillonner par fluorescence les cellules et leur descendance (clones) à partir de ce modèle de développement des vertébrés. Après avoir recueilli le contenu cellulaire à l’aide de micro-échantillonnage ou isolé des cellules par dissection ou tri cellulaire activé par fluorescence, les protéines sont extraites et traitées pour une analyse protéomique ascendante. La chromatographie liquide et l’électrophorèse capillaire sont utilisées pour fournir une séparation évolutive pour la détection et la quantification des protéines avec la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS). Des exemples représentatifs sont fournis pour la caractérisation protéomique des cellules destinées au tissu neural. La protéomique HRMS guidée par lignée cellulaire est adaptable à différents tissus et organismes. Il est suffisamment sensible, spécifique et quantitatif pour examiner la dynamique spatio-temporelle du protéome au cours du développement des vertébrés.
Introduction
Notre compréhension de la différenciation cellulaire et de la genèse des tissus et des organes est le résultat de décennies de criblages ciblés élaborés de gènes et de leurs produits. Accroître notre connaissance de toutes les biomolécules et de leurs quantités lors d’événements cellulaires importants aiderait à démêler les mécanismes moléculaires qui contrôlent la structuration spatiale et temporelle du plan corporel des vertébrés. Les technologies permettant l’amplification moléculaire et le séquençage sont maintenant en mesure de rendre compte régulièrement d’un grand nombre de gènes et de transcrits à l’appui d’études fondées sur des hypothèses dans la recherche biologique fondamentale et translationnelle. Pour comprendre les systèmes en développement, une relation complexe entre la transcription et la traduction plaide en faveur de l’analyse directe de multiples protéines et de leurs modifications post-traductionnelles. La protéomique globale utilisant des systèmes biologiques in vitro, tels que les cellules souches pluripotentes induites, a commencé à délimiter les mécanismes d’induction tissulaire 1,2. Dans les organismes complexes, tels que l’embryon de vertébrés, le développement repose sur les gradients morphogènes dans le contexte de l’espace et du temps3. Il s’ensuit que l’acquisition de connaissances sur les changements protéomiques à mesure que les cellules se différencient pour former des tissus spécialisés, tels que les tissus neuraux, offre une clé pour débloquer des programmes moléculaires contrôlant le développement normal et défectueux et guider les thérapies de prochaine génération.
La grenouille à griffes vertébrée d’Afrique du Sud (Xenopus laevis) est un modèle bien établi en biologie cellulaire et développementale, neuro- et régénérative. Le prix Nobel de physiologie ou médecine 4,5 de Sir John Gurdon en 2012 pour la découverte de la pluripotence du noyau somatique a souligné l’importance de ce modèle pour les découvertes en études fondamentales et translationnelles. Les embryons Xenopus se développent à l’extérieur de la mère, facilitant ainsi la manipulation directe des cellules, des clones cellulaires et de l’expression génique à différents stades de développement. La pigmentation asymétrique et les divisions cellulaires stéréotypées ont permis de cartographier des cartes de devenir reproductibles à partir de l’embryon de stade 7,8 à 16-6 et 32 cellules. Pour la protéomique basée sur la spectrométrie de masse à haute résolution (SGRH), les avantages supplémentaires du modèle comprennent une taille relativement grande (~1 mm de diamètre), qui donne une teneur abondante en protéines pour l’analyse (~130 μg chez les embryons au stade de clivage précoce, ~10 μg de teneur en protéines dans les cellules individuelles de l’embryon à 16 cellules)9,10.
À l’heure actuelle, le SGRH est la principale technologie de choix pour la détection des protéines. Cette technologie permet la détection et la quantification directes, sensibles et spécifiques de multiples, généralement des centaines, voire des milliers de protéines différentes11. La protéomique ascendante du SGRH comporte une série d’étapes interconnectées. Après l’extraction de l’échantillon de cellule/tissu, les protéines sont digérées avec une enzyme protéolytique, telle que la trypsine (protéomique ascendante). Les peptides résultants sont séparés en fonction de leurs différentes propriétés physico-chimiques, y compris l’hydrophobicité (chromatographie liquide en phase inverse, LC), la charge nette (chromatographie par échange d’ions), la taille (chromatographie d’exclusion de taille) ou la mobilité électrophorétique (électrophorèse capillaire, CE). Les peptides sont ensuite chargés (ionisés), généralement à l’aide d’une ionisation par électronébulisation (ESI), et les ions peptidiques sont détectés et séquencés par fragmentation en phase gazeuse par HRMS en tandem. Les données peptidiques résultantes sont mises en correspondance avec le protéome de l’organisme étudié. Avec l’intensité du signal d’ions peptidiques spécifiques aux protéines (protéotypiques) corrélée à la concentration, la quantification des protéines peut être effectuée sans marquage ou sur la base du marquage (quantification multiplexage). La protéomique du SGRH fournit une riche source d’information sur l’état moléculaire du système à l’étude, ce qui permet de générer des hypothèses et des études fonctionnelles de suivi.
Figure 1 : Protéomique spatio-temporellement évolutive permettant la protéomique HRMS guidée par lignée cellulaire dans l’embryon (grenouille) en développement. (A) Visualisation de l’échantillon (1) à l’aide d’un stéréomicroscope (2) pour l’injection d’une cellule identifiée (encadré), à l’aide d’une micropipette fabriquée (3) sous contrôle par un étage de translation (4). (B) Prélèvement subcellulaire de la cellule D 11 gauche identifiée dans un embryon à16 cellules. (C) Dissection d’une cellule D 11 entière à partir d’un embryon à16 cellules. (D) Traçage fluorescent (vert) des descendants D111 gauche et droit d’un embryon à 32 cellules pour guider la dissection de l’ectoderme neural (NE) dans la gastrule (stade 10) et isolement du tissu descendant du têtard à l’aide de FACS. Barres d’échelle : 200 μm pour les embryons, 1,25 mm pour le flacon. Les figures ont été adaptées avec la permission des références 15,19,21,59. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Le protocole présenté ici permet de quantifier un grand nombre de protéines dans des cellules/tissus identifiés dans des embryons de X. laevis en développement basés sur le SGRH. L’approche s’appuie sur une identification cellulaire précise, des cartes de destin cellulaire reproductibles et des méthodologies établies pour suivre les lignées cellulaires dans ce modèle biologique 6,7,8. Comme le montre la figure 1, nous étudions les protéomes de cellules individuelles en utilisant la dissection de cellules entières ou le microéchantillonnage capillaire pour aspirer le contenu cellulaire. Le suivi de la lignée d’une cellule nous permet d’étudier l’évolution spatio-temporelle du protéome lorsque les cellules forment des tissus pendant la gastrulation. La descendance cellulaire est marquée par fluorescence par injection d’un fluorophore conjugué à du dextrane inerte ou à l’ARNm pour la protéine fluorescente (p. ex. protéine fluorescente verte, ou GFP). La descendance marquée est isolée aux moments de développement souhaités. Pendant la gastrulation, les clones cellulaires étroitement regroupés peuvent être isolés par dissection. Après gastrulation, les clones cellulaires peuvent être distribués dans l’embryon en raison des mouvements migratoires et peuvent être isolés des tissus dissociés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Les protéines de ces cellules et tissus sont mesurées par protéomique ascendante utilisant HPLC ou CE pour la séparation et ESI tandem HRMS pour l’identification. La protéomique HRMS guidée par lignée cellulaire est évolutive à différentes tailles de cellules et lignées au sein de l’embryon et est spécifique, sensible et quantitative. À travers des exemples sélectionnés présentés ici, nous démontrons également que ce protocole est évolutif et largement adaptable à différents types de cellules et de lignées cellulaires.
Figure 2 : Le flux de travail bioanalytique. La micro-dissection et l’aspiration capillaire, ou FACS, ont facilité l’échantillonnage de la teneur en protéines cellulaires et clonales. Épuisement des protéines vitellines abondantes et séparation par électrophorèse capillaire (EC) ou chromatographie liquide à nanoflux (LC) sensibilité à l’identification améliorée (ID) à l’aide de la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) par ionisation électronébulaire (ESI). La quantification a révélé une dysrégulation, fournissant de nouvelles informations pour des études basées sur des hypothèses en conjonction avec les informations disponibles à partir de l’ontologie génique (GO). Les chiffres ont été adaptés avec la permission de la référence15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Protocol
Tous les protocoles assurant l’entretien et la manipulation sans cruauté des grenouilles adultes Xenopus laevis ont été approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Maryland, College Park (numéros d’approbation R-DEC-17-57 et R-FEB-21-07).
1. Préparer les solutions
- Pour l’embryologie
- Préparer 1x, 0,5x et 0,2x la solution de Steinberg (SS), puis autoclaver (120 °C pendant 20 min) jusqu’à stérilité selon les protocoles standard12.
- Préparer 3% (p/v) de Ficoll dans 1x SS stérilisé en suivant les protocoles standard12.
- Pour le dégel, préparer fraîchement une solution de cystéine à 2% (p / v) et ajuster son pH à 8 en ajoutant une solution d’hydroxyde de sodium à 10 M goutte à goutte.
ATTENTION : L’exposition à la cystéine peut causer des lésions cutanées et respiratoires. L’hydroxyde de sodium est un produit corrosif qui peut causer de graves dommages à la peau et aux yeux lors d’une exposition directe. Utilisez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lorsque vous manipulez ces produits chimiques, comme des gants et une blouse de laboratoire. - Pour le traceur de lignée, préparer 0,5% (v/v) d’un dextrane fluorescent dans de l’eau désionisée stérile. Vous pouvez également préparer une solution de 0,2 μg/μL d’ARNm pour les protéines fluorescentes dans de l’eau désionisée stérile (p. ex. GFP).
- Pour dissocier les cellules, préparer le tampon Newport 2.0 contenant 0,1 M d’isethionate de sodium, 20 mM de pyrophosphate de sodium et 10 mM de CAPS, puis porter son pH à 10,513.
ATTENTION : L’exposition au pyrophosphate de sodium peut provoquer une irritation de la peau et des yeux. Utilisez l’EPI approprié lors de la manipulation de ces produits chimiques.
- Pour la protéomique ascendante
- Préparer le tampon de lyse cellulaire pour inclure: 250 mM de saccharose, 1% de substitut P-40 nonidet (p / v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM cytochalasine D et 10 μM combrétastatine 4A. Préparer un stock de 10% (p/v) de dodécylsulfate de sodium14,15.
REMARQUE : Tris-HCl a été choisi pour minimiser la contamination par l’HEPES pendant le SGRH LC (nanoLC)-HRMS nano-flux.
ATTENTION : L’exposition au substitut nonidet P-40 peut provoquer une irritation cutanée. La cytochalasine D est tératogène si elle est consommée et la combrétastatine est extrêmement toxique en cas d’exposition directe. Utilisez l’EPI approprié lors de la manipulation de ces produits chimiques. - Pour séparer les peptides par CE, préparer les solvants suivants (v/v): Solvant échantillon, acétonitrile à 75% (ACN) contenant 0,05% d’acide acétique (AcOH) dans l’eau; solution de gaine, 10% ACN contenant 0,05% AcOH dans l’eau; électrolyte de fond (BGE), 25% ACN contenant 1 M d’acide formique (FA) dans l’eau.
MISE EN GARDE : L’AcOH et l’AF sont toxiques lorsqu’ils sont inhalés ou consommés et peuvent causer de graves lésions cutanées et oculaires lors d’une exposition directe. Utilisez l’EPI approprié lors de la manipulation de ces produits chimiques. - Pour séparer les peptides par nanoLC en phase inversée, préparer (v/v): Phase mobile A (aqueuse), eau contenant 0,1% FA; phase mobile B (organique), 0,1% FA dans ACN.
NOTA : Tous les mélanges doivent être préparés à l’aide de solvants de qualité LC-SM afin de minimiser les interférences chimiques lors de la détection du SGRH.
- Préparer le tampon de lyse cellulaire pour inclure: 250 mM de saccharose, 1% de substitut P-40 nonidet (p / v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM cytochalasine D et 10 μM combrétastatine 4A. Préparer un stock de 10% (p/v) de dodécylsulfate de sodium14,15.
2. Préparer les outils pour la micro-injection et la dissection
- Pour déplacer et orienter doucement les embryons, faites des boucles capillaires en fixant les cheveux propres dans une pipette Pasteur comme décrit ailleurs16.
- Pour la micro-injection, fabriquer des aiguilles en tirant des capillaires borosilicatés (1 mm/500 μm de diamètre extérieur/intérieur) à l’aide d’un extracteur de pipette comme décrit ailleurs16.
REMARQUE: Ici, un extracteur de pipettes P-1000 avec les réglages suivants a été utilisé pour la fabrication d’aiguilles: chaleur, 495; tirer, 30, vitesse, 60; temps, 150; pression, 200. - Avec l’observation au stéréomicroscope, couper l’extrémité du capillaire à l’aide d’une paire de pinces tranchantes pour essentiellement fabriquer le capillaire en une (micro)aiguille (p. ex., Dumont #5)16.
ATTENTION : Les capillaires tirés sont très tranchants et doivent être manipulés avec précaution.
REMARQUE: La pointe de l’aiguille doit être suffisamment tranchante (diamètre extérieur 10-15 μm) pour pouvoir percer la cellule avec un minimum de dommages à la membrane cellulaire afin que le contenu intracellulaire ne fuie pas et que la cellule puisse guérir et continuer à être viable. - Pour conserver les embryons pendant la micro-injection, préparez les puits dans un plat rempli d’argile. Dans une boîte de Petri de 15 mm, imprimer ~1 mm de diamètre x ~0,5 mm de profondeur dans de l’argile à pâte à modeler non toxique comme décrit ailleurs16.
- Pour la microdissection, préparez des plats enrobés d’agarose. Faire 2% d’agarose dans 1x SS et l’autoclaver pour stériliser la solution (120 °C pendant 20 min). Remplissez des boîtes de Petri de 60 mm à mi-chemin et laissez les assiettes se solidifier. Fabriquer des puits de ~1 mm de diamètre x ~0,5 mm de profondeur à l’aide d’une pipette Pasteur à bille, comme décrit précédemment16.
3. Isoler la lignée cellulaire
REMARQUE: Les étapes suivantes sont effectuées pour isoler les cellules individuelles identifiées et / ou leurs lignées cellulaires descendantes. Habituellement, l’embryon est cultivé au stade de 16 ou 32 cellules, où le destin tissulaire de chaque cellule est cartographié de manière reproductible 6,7,17. Les cellules embryonnaires sont identifiées en fonction de la morphologie, de l’emplacement et en référence à leurs cartes de destin. Pour l’analyse unicellulaire, les cellules identifiées sont isolées par dissection manuelle, ou leur contenu intracellulaire est recueilli dans une pipette capillaire et déposé dans 5 μL de bicarbonate d’ammonium 0,5 mM. L’échantillon obtenu est conservé à -80 °C jusqu’à l’analyse (Figure 1)18,19,20,21. Pour l’analyse de la lignée cellulaire, les cellules identifiées sont injectées avec un traceur de lignée et leurs clones ultérieurs sont isolés à des étapes clés du développement (par exemple, pendant la gastrulation pour étudier l’induction tissulaire, après la neurulation pour étudier l’engagement tissulaire). Dans ce qui suit, les étapes sont décrites pour marquer par fluorescence la lignée des cellules identifiées pour l’isolement par dissection ou FACS.
- Culture des embryons
- Obtenir des embryons par accouplement naturel ou fécondation in vitro (FIV) selon les protocoles établis12.
REMARQUE: L’accouplement naturel est plus simple sur le plan logistique, épargne les grenouilles mâles adultes et produit des embryons à différents stades de développement, tandis que la FIV fournit des embryons synchronisés sur le plan du développement pour des expériences nécessitant une stadification précise. - Dégelez les embryons. Enlevez la couche de gelée entourant les embryons par traitement avec la solution dégelante décrite ailleurs12,16.
REMARQUE : Les microinjections et la dissection nécessitent l’accès aux cellules et aux tissus, ce qui nécessite un déjelling dans les embryons de X. laevis. - Sélectionnez des embryons à 2 cellules avec pigmentation stéréotypée16,22.
NOTE: Cette étape est importante pour assurer la précision et la reproductibilité dans l’identification de la cellule et de sa lignée. - Culture d’embryons jusqu’au stade de développement souhaité. Transférer les embryons dégelés dans une boîte de Petri contenant 1x SS et les incuber entre 14-25 °C pour contrôler la vitesse de développement.
REMARQUE : La dépendance de la température du développement est reproductible et cartographiée pour X. laevis, disponible sur Xenbase23 (www.xenbase.org). La culture de lots d’embryons à différentes températures permet d’échelonner les stades de développement. Cela permet de répartir le nombre d’embryons disponibles à un moment donné pour l’expérimentation. - Surveiller le clivage des embryons et sélectionner les embryons présentant des pigmentations et des motifs de clivage stéréotypés pour la micro-injection16.
REMARQUE: Lors de la sélection d’embryons de 16 et 32 cellules, assurez-vous que les clivages cellulaires sont symétriques pour un traçage reproductible de la lignée.
- Obtenir des embryons par accouplement naturel ou fécondation in vitro (FIV) selon les protocoles établis12.
- Étiquetez la ou les cellules d’intérêt
- Installez l’aiguille d’injection contenant la solution de traceur de lignée. Montez l’aiguille de micro-injection dans un support de micropipette contrôlé par un micromanipulateur multiaxes.
- Connectez le support de micropipette à un micro-injecteur. Remplir l’aiguille avec le traceur de lignée en appliquant une pression négative comme décrit ailleurs16. La figure 1A illustre la configuration.
- Calibrez l’aiguille. Ajuster la taille de l’extrémité de l’aiguille et le temps d’injection pour délivrer ~1 nL de la solution de traceur de la lignée, mesurée dans de l’huile (minérale) suivant un protocole disponible ailleurs16.
REMARQUE: Les capillaires avec une pointe plus large ont tendance à endommager la membrane cellulaire, provoquant une fuite du contenu subcellulaire et du traceur de lignée injecté, tandis que les capillaires avec des extrémités plus petites sont sujets au colmatage. Les capillaires avec ~10 μm de diamètre extérieur de pointe sont idéaux, nécessitant une impulsion de pression de 40 psi sur ~300 ms pour fournir ~1 nL. - Inonder le plat d’argile de micro-injection avec la solution de Ficoll à 3% et transférer ~10 embryons dans le plat d’argile à l’aide d’une pipette de transfert. Utilisez une boucle pilaire pour guider chaque embryon dans un puits et positionnez-les doucement de manière à ce que la cellule ciblée d’intérêt soit perpendiculaire à la micro-aiguille.
- Identifier la cellule précurseur de la lignée d’intérêt en suivant les cartes du devenir tissulaire de X. laevis. Par exemple, la figure 1 illustre le marquage de clones ectodermiques neuraux basés sur l’injection de ses cellules précurseurs dans des embryons de 32 cellules (cellules D111 gauche et droite).
REMARQUE: Des cartes détaillées du devenir des embryons 16-6 et 32 cellules 7,8 sont disponibles sur une plate-forme interactive via Xenbase23. Il est important de s’assurer d’une pigmentation et d’un clivage stéréotypés sur les embryons lors de leur utilisation pour des expériences de traçage de la lignée. - Injecter la ou les cellules d’intérêt avec ~1 nL de dextrane fluorescent ou ~200 pg d’ARNm comme décrit précédemment16.
REMARQUE : Utilisez des conjugués de dextrane de 10 000 à 40 000 MW. Les conjugués de dextrane plus petits peuvent passer à travers des jonctions lacunaires, tandis que les conjugués de dextrane plus grands peuvent ne pas diffuser uniformément dans la cellule injectée. Prévoyez d’injecter des cellules dans ~10 embryons pour avoir suffisamment de tissus pour les analyses protéomiques. - Confirmer le succès du marquage cellulaire au stéréomicroscope. Assurez-vous que seule la cellule prévue est injectée. Jeter les embryons contenant des cellules blessées ou mal étiquetées conformément aux politiques institutionnelles.
REMARQUE: Parce que X. laevis est envahissant dans de nombreux environnements non naturels, les embryons peuvent être congelés pour assurer la létalité avant de jeter les embryons.
- Isoler la descendance cellulaire marquée
- Transférer les embryons injectés dans 0,5x SS dans une boîte de Pétri et les cultiver entre 14 et 25 °C jusqu’à ce que le stade de développement souhaité soit atteint.
REMARQUE: Consultez les protocoles établis pour les embryons de stade signalés sur Xenbase. - Transférer 3 à 5 embryons dans une boîte de gélose avec 0,2x solution de SS pour les microdissections.
REMARQUE: La réduction de la concentration en sel de la solution de SS de 0,5x à 0,2x aide à séparer les cellules pendant la dissection. - Utilisez deux pinces affûtées pour enlever délicatement la membrane vitelline entourant l’embryon.
REMARQUE: Pour éviter que le clone d’intérêt ne soit endommagé, décollez la membrane du côté opposé du clone marqué par fluorescence. - Isoler le clone étiqueté par dissection manuelle (étapes 3.3.5-3.3.6) ou FACS (étapes 3.3.7-3.3.8) comme suit.
- Utilisez une pince pour disséquer le clone marqué de l’embryon.
REMARQUE: D’autres outils tels que des ciseaux microchirurgicaux, des aiguilles en tungstène ou des couteaux à sourcils peuvent être utilisés pour la dissection du clone étiqueté, comme détaillé ailleurs16. - Prélever le tissu disséqué avec une pipette de 0,5 à 10 μL et le déposer dans un flacon de microcentrifugeuse. À l’aide d’une pipette de transfert, aspirer le milieu entourant le tissu prélevé pour limiter la présence de sels dans l’échantillon, qui interfèrent avec l’analyse du SGRH dans les étapes ultérieures.
REMARQUE: Utilisez des flacons qui minimisent l’adsorption de protéines sur les surfaces en plastique pour minimiser les pertes de protéines sur les surfaces des flacons au cours des étapes ultérieures du flux de travail. - Pour isoler par FACS, transférer ~5-8 embryons dévitellisés dans chaque puits d’une plaque de 12 puits contenant ~5 mL de tampon Newport 2.0. Dissocier les embryons en nutifiant la plaque à 80 rpm pendant 20-30 min à température ambiante13.
NOTE: Les embryons / larves âgés que le stade 22 ont des protéines de matrice extracellulaire abondantes, ce qui rend difficile la dissociation en cellules séparées. D’autres approches enzymatiques peuvent être adaptées pour dissocier les tissus des embryons plus âgés, comme décrit ailleurs24. - Purifier les cellules marquées par fluorescence de la suspension à l’aide de FACS, comme décrit ailleurs24.
- Cellules à granulés par centrifugation et élimination du surnageant.
REMARQUE: Utilisez une faible vitesse de centrifugation (400 × g) et une température (4 ° C) pour prévenir la lyse cellulaire. Si vous utilisez de l’albumine sérique bovine (BSA) pour la FACS, laver la pastille cellulaire pour réduire les interférences BSA pendant la détection du SGRH. Remettez doucement les cellules en suspension dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et centrifugez à nouveau pour rincer les cellules rincées. Retirez le liquide PBS surnageant. - Congelez rapidement les cellules isolées en plaçant le flacon d’échantillon sur de la glace sèche ou de l’azote liquide.
REMARQUE : Conserver les échantillons (tissus ou cellules) refroidis (p. ex. sur de la glace) pendant les étapes de traitement. Congeler les cellules avec le moins de milieu possible autour de l’échantillon pour faciliter le traitement en aval. - Conserver les échantillons à −80 °C jusqu’à l’analyse du SGRH.
- Transférer les embryons injectés dans 0,5x SS dans une boîte de Pétri et les cultiver entre 14 et 25 °C jusqu’à ce que le stade de développement souhaité soit atteint.
4. Analyser les protéines par spectrométrie de masse
La caractérisation protéomique des tissus ou cellules isolés est basée sur une série d’étapes établies dans le SGRH. La figure 2 illustre les étapes du flux de travail bioanalytique. Le protocole de collecte d’échantillons utilisé ici est compatible avec les flux de travail de protéomiqueascendants 11,25 ou descendants26 . Dans ce qui suit, la stratégie ascendante utilisée dans cette étude est décrite, qui s’est avérée sensible, quantitative et adaptable à divers types de spectromètres de masse. Après avoir extrait et digéré enzymatiquement les protéines, les peptides résultants sont séparés, suivis d’une analyse HRMS.
- Traiter les tissus/cellules individuelles
- Pour l’analyse unicellulaire par CE, chauffer l’échantillon à 60 °C pendant ~15 min pour dénaturer les protéines, puis équilibrer l’échantillon à température ambiante (RT, ~5 min)18,21.
REMARQUE: Contrairement au travail avec les tissus, les étapes de réduction et d’alkylation sont ignorées pour limiter les pertes de protéines lors de la préparation des échantillons à partir de cellules individuelles. La préparation d’échantillons assistée par filtre (FASP)27,28, d’autres stratégies à pot unique 29 et des approches microfluidiques30 peuvent être adoptées pour minimiser les pertes de protéines pendant la préparation des échantillons. - Pour analyse par nanoLC, lyser jusqu’à 5 tissus disséqués dans 50 μL de tampon de lyse (~100 μg de protéines totales). Facilitez le processus en pipetant l’échantillon de haut en bas plusieurs fois.
- Incuber le lysat à 4 °C pendant 10 min, puis enduire les débris cellulaires et les plaquettes vitellines par centrifugation à 4 500 × g à 4 °C. Transférer le surnageant dans un flacon de microcentrifugation propre et ajouter 10% de SDS pour obtenir une concentration finale de 1% de SDS dans le lysat (v/v).
- Pour les tissus, suivez les étapes 4.1.5-4.1.7.
- Ajouter 0,5 M dithiothréitol au lysat pour obtenir une concentration finale de ~25 mM (par exemple, 2,5 μL de dithiothrétol 0,5 M pour 50 μL de lysat) et incuber le lysat pendant 30 minutes à 60 °C pour réduire chimiquement les liaisons disulfure dans les protéines.
- Ajouter 0,5 M d’iodoacétamide pour obtenir une concentration finale de ~75 mM dans le lysat et incuber le mélange pendant 15 min à TA dans l’obscurité (Figure 2).
- Ajouter 0,5 M de dithiothréitol, identique au volume initial (p. ex. 2,5 μL de dithiothrétol 0,5 M à 50 μL de lysat) pour éteindre les réactifs restants de la réaction d’alkylation.
ATTENTION : L’iodoacétamide et le dithiothréitol peuvent causer de graves lésions cutanées et oculaires lors d’une exposition directe. Utilisez l’EPI approprié lors de la manipulation de ces produits chimiques. - Purifier les protéines par précipitation. Les précipitations à base de chloroforme-méthanol donnent de bons résultats31. Ce protocole est également adaptable à d’autres types d’approches de précipitations32.
REMARQUE : Pour l’analyse d’une seule cellule, lorsque les pertes de protéines sont préoccupantes, sautez l’étape de précipitation pour le SGRH-CE. - Sécher le précipité protéique dans un concentrateur sous vide (4-37 °C), puis remettre en suspension le protéome extrait dans 50 μL de bicarbonate d’ammonium 50 mM. Estimer la concentration de protéines à l’aide d’un test colorimétrique des protéines totales pour déterminer la quantité d’enzyme nécessaire à la digestion (p. ex. dosage des protéines de l’acide bicinchoninique).
- Digérer les protéines en peptides. Ajouter de la trypsine (1 μg/μL de stock) pour obtenir un rapport protéase/protéine de 1:50 et incuber le mélange à 37 °C jusqu’à 5 h pour les échantillons unicellulaires et jusqu’à 14 h pour les échantillons de tissus. Consultez les recommandations spécifiques au fournisseur pour connaître la réaction.
NOTE: La digestion avec la trypsine pendant plus de 14 heures ou des concentrations supérieures peut introduire des clivages qui ne sont pas spécifiques à la séquence de la protéine, ce qui rend difficile l’identification des protéines33. - Quantifier la concentration totale de peptides à l’aide d’un test colorimétrique.
- FACULTATIF : Pour la quantification du multiplexage, étiqueter les peptides de chaque échantillon avec une étiquette de masse isobare différente en suivant les instructions spécifiques au fournisseur. Mélanger les peptides à code-barres dans des proportions égales par échantillon de peptide.
REMARQUE: Assurez-vous d’un étiquetage et d’un mélange précis pour éviter les biais quantitatifs. Pour les échantillons à quantité limitée ou les échantillons unicellulaires, un canal porteur basé sur TMT composé de tissus/cellules mélangées peut être inclus pour minimiser les pertes d’échantillons lors des étapes de séparation ultérieures et pour augmenter la sensibilité des protéines moins abondantes34. - FACULTATIF : Dessaler les peptides pour éliminer les sels et les contaminants (p. ex., les réactifs isobariques d’étiquette de masse n’ayant pas réagi) sur une colonne/pointe de spin en phase inverse C18 pour protéger le système LC-MS.
- FACULTATIF : Fractionner (p. ex., fractionnement en phase inverse à pH moyen ou élevé) le mélange peptidique pour une détection plus profonde du protéome via des plates-formes manuelles ou automatiques. Utilisez des embouts en phase stationnaire C18 pour fractionner de faibles quantités (1-10 μg) de digestions peptidiques.
- Sécher le mélange peptidique à 60 °C dans un concentrateur sous vide.
- Conserver le mélange peptidique à -80 °C jusqu’à la mesure.
- Pour l’analyse unicellulaire par CE, chauffer l’échantillon à 60 °C pendant ~15 min pour dénaturer les protéines, puis équilibrer l’échantillon à température ambiante (RT, ~5 min)18,21.
- Séparer les peptides
NOTE: Après extraction et digestion enzymatique des protéines, les peptides résultants sont séparés par nanoLC ou CE et ionisés par ESI pour le séquençage par HRMS en tandem. La séparation nanoLC en phase inversée est idéale pour les peptides accumulant ~150 ng à ~1 μg par analyse. CE fournit une sensibilité complémentaire pour les peptides allant des femtogrammes aux <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 et sont de plus en plus utilisés pour l’analyse unicellulaire18,36,37.- Pour séparer à l’aide de CE, suivez les étapes 4.2.2-4.2.7.
REMARQUE: Dans ce qui suit, l’utilisation de la plate-forme CE sur mesure pour mesurer les peptides est décrite. Les protocoles pour construire et utiliser cet instrument CE ont été fournis plus tôt38, ainsi qu’une expérience visualisée sur l’utilisation des petites molécules20. Alternativement, ces mesures peuvent être effectuées sur un système CE commercial, tel que l’AB SCIEX CESI, Agilent 7100 ou équivalent. - Reconstituer la protéine digérée dans 1-2 μL du solvant de l’échantillon, vortex pour mélanger l’échantillon, et centrifuger à 10 000 x g pendant 2 min pour granuler les débris cellulaires.
REMARQUE: L’élimination des débris cellulaires minimise la probabilité de colmatage du capillaire CE, prolongeant ainsi la durée de vie du système de séparation et augmentant le débit de mesure. - Initialisez l’instrument CE-ESI en rinçant le capillaire CE avec le BGE.
- Valider la performance instrumentale à l’aide d’un étalon connu (p. ex., cytochrome C ou BSA digest, peptides d’angiotensine).
REMARQUE: Il est recommandé d’évaluer l’instrument en termes de précision de masse, de sensibilité de détection, de reproductibilité et de plage dynamique linéaire de quantification avant de mesurer des échantillons précieux. Des notes supplémentaires sur la validation et le dépannage des performances CE-ESI-MS sont énumérées ailleurs18,20,38. - Injecter ~1-10 nL de l’échantillon dans le capillaire de séparation CE.
REMARQUE: Cette étude utilise un capillaire de silice fondue de ~1 m de long (40/110 μm de diamètre intérieur / extérieur) avec la configuration d’écoulement de gaine pompée électrocinétiquement. Les instruments CE commerciaux nécessitent généralement la présentation de 5 à 10 μL d’échantillon dans un microflacon pour injection. La plate-forme CE18,38 sur mesure est compatible avec ~250 nL à 1 μL d’échantillon déposé dans un microflacon de chargement d’échantillons. - Transférer l’extrémité d’entrée du capillaire de séparation CE dans le BGE.
- Commencez la séparation électrophorétique en augmentant progressivement la tension de séparation CE à partir de la terre (par exemple, par étapes sur 1 min). Des potentiels de 20-28 kV avec un courant inférieur à ~10 μA garantissent des performances instrumentales stables et reproductibles pour l’analyse.
- Pour séparer à l’aide de nanoLC, suivez les étapes 4.2.9-4.2.12.
- Remettez en suspension l’échantillon de peptide en phase mobile A. La concentration de l’échantillon et son volume d’injection dépendent du système et de la colonne LC disponibles. Dans cette étude, ~250 ng-1 μg de digestion de protéines sont injectés dans 1-20 μL de volume d’échantillon sur une colonne à lit garni C18 (75 μm de diamètre intérieur, taille de particule de 2 μm avec pores de 100 Å, colonne de séparation de 25 cm de longueur).
- Transférer l’échantillon dans un flacon LC.
REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le flacon, ce qui pourrait endommager la colonne d’analyse. Les flacons avec inserts pourraient être utilisés pour les échantillons de tissus ou unicellulaires de faible volume. - Charger ~200 ng à 2 μg d’échantillon peptidique sur la colonne analytique C18.
REMARQUE: En option, les peptides peuvent être chargés sur une colonne piège pour le dessalage avant la séparation analytique. Par exemple, une colonne piège C18 de 0,1 mm de diamètre intérieur, taille de particules de 5 μm, taille des pores de 100 Å, longueur de 20 mm. Dessaler les peptides avec 100% de tampon A à un débit de 5 μL/min pendant 5 min avant le début du gradient de séparation. - Séparer les peptides en utilisant l’élution de gradient. À un débit de 300 nL/min, le gradient de 120 min utilisé dans cette étude est le suivant : 0-5 min 2 % B, 5-85 min 2-35 % B, 86-90 min 70 % B, 91-120 min 2 % B.
- Pour séparer à l’aide de CE, suivez les étapes 4.2.2-4.2.7.
- Ioniser les peptides par ESI
REMARQUE: Le capillaire CE ou nanoLC est le plus souvent couplé à une source ESI pour l’ionisation. Les interfaces CE-ESI à micro-flux (pointe émoussée) et nano-flux (pointe conique39 et électrocinétique à gaine pompée36 ) pour la détection ultrasensible ont été développées précédemment.- Fournir les peptides de séparation dans une source d’ions électrospray pour l’ionisation à l’aide d’une interface ESI commerciale ou personnalisée. Pour l’analyse CE-ESI-MS unicellulaire chez les embryons Xenopus , utiliser une interface à faible débit pompée électroniquement dans laquelle la sortie capillaire CE est enfermée dans un émetteur borosilicaté tiré.
- Vérifiez le débit de liquide à travers l’émetteur d’électrospray à l’aide d’une caméra et inspectez visuellement la configuration pour détecter d’éventuelles fuites.
- Réglez la tension d’électropulvérisation sur ~2,5 kV pour démarrer la source ESI (par rapport à la terre).
- Assurer une nanopulvérisation stable pour l’analyse HRMS en surveillant le courant ionique total. Ajuster la tension d’électropulvérisation et la distance de l’émetteur à l’entrée du SGRH pour obtenir une pulvérisation stable (écart type relatif de <15 % de l’intensité totale).
- Détecter les peptides
NOTE: La détection des peptides suit différentes considérations instrumentales pour les peptides marqués et non marqués en masse isobare et dépend du type de spectromètre de masse disponible. Cette étude utilise un spectromètre de masse orbitrap tribride selon les étapes suivantes.- Acquérir des événements MS1 avec les paramètres: Analyseur, orbitrap; Résolution spectrale, 120 000 pleine largeur à la moitié maximum (FWHM); temps d’injection maximal (IT), 50 ms; contrôle automatique du gain (AGC), 4 x 105 comptes; microscans, 1.
- Pour séquencer les peptides, fragmenter les ions précurseurs pour la détection dans l’analyseur de piège à ions en utilisant les paramètres: mode de fragmentation, dissociation par collision à haute énergie (HCD); gaz de collision, azote; énergie de collision, énergie de collision normalisée (NCE) de 32 %; IT maximum, 70 ms; AGC, 1 x 104 comptes; microscans, 1.
- FACULTATIF : Quantifier les peptides marqués TMT à l’aide du SGRH en tandem/à plusieurs stades (MS2/MS3). Pour MS3 utilisant la sélection synchrone des précurseurs, les paramètres instrumentaux typiques sont les suivants. Les balayages à un étage (MS1) surveillant les ions les plus abondants sont dissociés par acquisition dépendante des données à l’aide des paramètres suivants: mode de fragmentation MS2 , dissociation induite par collision (CID); gaz de collision, hélium; énergie de collision, 35 % des RCE; analyseur pour ions fragments, piège à ions paramètres suivants: IT maximum, 50 ms; AGC, 5 x 104 comptes; microscans, 1. Sélectionnez 10 ions fragments MS2 et fragmentez-les avec HCD dans de l’azote (65% NCE). Détectez les ions fragments MS3 en utilisant les paramètres suivants : résolution Orbitrap 15 000 FWHM, IT maximum, 120 ms ; AGC, 1 × 105 chefs d’accusation; microscans, 1.
REMARQUE : Différentes méthodes et paramètres d’acquisition de MS peuvent être utilisés pour les échantillons marqués conformément aux recommandations du fournisseur, comme décrit ailleurs11,40.
- Analyser les données
NOTE: Les protéines sont identifiées et quantifiées à l’aide de progiciels bioinformatiques avancés. La fidélité des identifications est calculée à l’aide d’une base de données leurre, exprimée en taux de fausses découvertes (FDR) au niveau des peptides et des protéines.- Traiter les données à l’aide de progiciels commerciaux ou open source (voir référence41). Faites correspondre les données brutes à une base de données préparée en concaténant le protéome Xenopus 9.2 avec la base de données PHROG dérivée de l’ARNm42.
NOTE: Les paramètres de recherche sont: enzyme de digestion, trypsine; clivages manqués, jusqu’à 2; modification variable, oxydation de la méthionine; modification statique, carbamidométhylation de cystéine; tolérance massique des précurseurs, 10 ppm; tolérance de masse des fragments, 0,6 Da; longueur minimale du peptide, 5; fidélité d’identification, <1% FDR pour les peptides et les protéines. Sans alkylation en peptides, la carbamidométhylation en tant que modification statique est exclue lors de la recherche dans la base de données (par exemple, pour l’analyse unicellulaire). - Quantifier l’abondance des protéines au moyen de stratégies sans marquage43 ou basées sur l’étiquette44,45.
- FACULTATIF : Annoter les protéines pour l’ontologie des gènes. PantherDB46, Reactome47 ou Xenbase23 peuvent être utilisés.
- FACULTATIF : Quantifier l’abondance des protéines et les différences d’abondance des protéines entre les types de cellules/tissus à l’aide de progiciels/outils Web, tels que Trans-Proteomic Pipeline48, Perseus49 et Orange50.
REMARQUE : D’autres considérations sur la conception expérimentale et les options logicielles ont été examinées ailleurs41,51. - FACULTATIF : Évaluez davantage les résultats à l’aide de bases de connaissances, telles que STRING52 et BioPlex Display 53 pour les interactions protéine-protéine connues et PhosphoSiteplus54 pour les phosphorylations. Pour analyser les motifs et les domaines représentés dans le protéome, utilisez des outils Web tels que Simple Modular Architecture Research (SMART)55.
- Traiter les données à l’aide de progiciels commerciaux ou open source (voir référence41). Faites correspondre les données brutes à une base de données préparée en concaténant le protéome Xenopus 9.2 avec la base de données PHROG dérivée de l’ARNm42.
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Representative Results
Ce protocole a permis l’étude des protéines dans des cellules individuelles et leurs lignées lorsqu’elles établissent des tissus dans des embryons de X. laevis. La figure 1 illustre l’une de ces applications de l’approche pour étudier les protéines dans les cellules du tissu neural et l’ectoderme neural nouvellement induit dans l’embryon. Comme le montre la figure 1A, le flux de travail bioanalytique a intégré les outils traditionnels de la biologie cellulaire et du développement pour identifier, injecter / aspirer des cellules et collecter des échantillons. La figure 1B montre l’échantillonnage par microsonde de la cellule dorsale de l’animal gauche (D 11) dans l’embryon de16 cellules in vivo à l’aide d’un micro-injecteur; Après l’expérience, les embryons se sont développés avec succès en têtards avec une anatomie normale56. Les grandes cellules embryonnaires (~100-250 μm de diamètre) étaient également propices à la microdissection manuelle. La dissection d’une cellule médiane dorso-animale droite (D11) est illustrée à partir de l’embryon à 16 cellules de la figure 1C. La configuration a également permis de tracer une trajectoire clonale en injectant un traceur fluorescent dans le précurseur identifié. Comme le montre la figure 1D, l’approche a permis d’isoler des clones provenant des cellules D111 gauche et droite par dissection tissulaire ou par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Les stratégies de collecte d’échantillons décrites ici sont suffisamment évolutives dans l’espace et dans le temps pour étudier le développement embryonnaire dans de nouveaux détails.
Le flux de travail bioanalytique intégrait les technologies du SGRH pour améliorer la sensibilité et la quantification (figure 2). Les protéines collectées ont été mesurées via une approche protéomique ascendante. Le fractionnement facultatif des échantillons basé sur la chimie orthogonale (p. ex. LC à pH élevé puis à pH faible en phase inversée) a facilité la sensibilité de détection. Pour séparer les peptides, CE a été sélectionné pour des traces d’échantillons (<<~100 ng)) et nanoLC pour des quantités limitées de matériaux (>>150 ng). Les peptides ont été séquencés à l’aide de l’ESI-HRMS. Les protéines détectées ont été quantifiées à l’aide de stratégies sans marquage et basées sur le marquage. La simplification du traitement des échantillons pour l’analyse unicellulaire, telle que l’élimination des étapes typiques de réduction et d’alkylation suivies d’une analyse CE, a facilité l’identification de ~400-800 protéines différentes. Parmi les protéines rapportées, il y en avait beaucoup avec des rôles fonctionnels importants, tels que la chaperonine contenant la sous-unité 3 TCP1 (Cct3), le canal ionique voltage-dépendant (Vdac2) et la créatine kinase-cerveau (Ckb). Des modèles de données multivariées et statistiques nous ont aidés10,57 et d’autres 9,58 à trouver des différences jusque-là inconnues dans la composition protéomique de cellules et de tissus sélectionnés en utilisant les approches résumées dans ce protocole. Notamment, ces mesures du SGRH ne nécessitaient aucune sonde fonctionnelle ou connaissance préalable de la composition des spécimens, ce qui appuyait les découvertes.
Dans une série d’études, l’état protéomique des cellules identifiées dans les embryons en développement de X. laevis (Fig. 3) a été quantifié21. La figure 3A montre la détection des différences de traduction des gènes entre les cellules D11 qui ont été disséquées à partir de différents embryons10. Le microéchantillonnage CE-ESI-HRMS nous a permis d’identifier et de quantifier jusqu’à ~700 protéines à partir de cellules individuelles21. Les données primaires représentatives du SMS-SM/MS sur l’identification de ~400 protéines cumulatives à partir de mesures techniques en double sur une cellule D11 dans l’embryon ont été déposées dans PRIDE. L’approche était évolutive pour des cellules plus petites et des embryons provenant d’autres organismes modèles, tels que le poisson zèbre21. L’évolutivité à des cellules de plus petite taille nous a permis d’explorer la réorganisation spatio-temporelle de la descendance D11 à partir d’un embryon vivant au fur et à mesure de son développement dans le temps. La figure 3B présente l’utilisation de ce protocole pour effectuer une protéomique quantitative subcellulaire des cellules identifiées dans les embryons de 16, 32, 64 et 128 cellules. Les protéines ont été séparées en quatre groupes qui présentaient des profils d’abondance distincts au cours du développement clonal21.
Figure 3 : Évolutivité du protocole de l’espace subcellulaire aux tissus clonaux chez l’embryon de X. laevis . (A) Mesure des différences protéomiques entre les cellules D11 entières identifiées, révélant l’hétérogénéité cellule-cellule. Noms de gènes affichés pour certaines protéines. (B) Réorganisation du protéome cellulaire dans le clone de cellules D11 en développement. Analyse en grappes C-moyennes floues (GProx) de la dynamique des protéines, regroupant les protéines en fonction de modèles d’expression similaires. Les nombres gris montrent le nombre de protéines différentes qui ont été quantifiées dans chaque groupe. Les chiffres ont été adaptés avec la permission des références21,57. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Ce protocole nous a permis de mener une protéomique spatiale et temporelle dans des clones cellulaires identifiés et en développement (Figure 4). La figure 4A illustre l’application de l’approche de marquage et d’isolement des clones cellulaires constituant deux tissus jouant un rôle important dans le développement du tissu neural et la structuration de l’embryon. La majorité de l’organisateur Spemann (SO) a été tracée en marquant les cellules gauche et droite D 112 et D212 par injection de dextran fluorescent. En parallèle, les cellules dorso-animales voisines (D111) ont été marquées pour marquer la majorité de l’ectoderme neural (NE). Les tissus ont été disséqués et leur teneur en protéines a été analysée selon ce protocole. nanoLC-ESI-HRMS a renvoyé jusqu’à 2 000 protéines différentes des tissus, y compris la signalisation, telles que les voies Wnt, Fgf et Tgfβ. Les données primaires représentatives du SGRH-SM/SM sur l’identification de ~1 800 protéines cumulatives à partir de mesures techniques en double sur un ensemble de tissus SO disséqués ont été déposées dans PRIDE. Le ligand Wnt10a et Wntless (Wls), une protéine membranaire dédiée à la sécrétion des ligands Wnt, n’ont été détectés que dans le protéome NE. La voie Wnt a été jugée supprimée dans l’OS et peut expliquer un manque de protéines interagissant Wnt détectées dans le SO. Ces résultats montrent l’applicabilité de ce protocole pour étudier les différences spécifiques à la lignée au sein de l’embryon.
Figure 4 : Exemple d’analyse de données issues de la protéomique tissulaire spatiale chez les embryons de X. laevis . (A) Marquage différentiel des tissus de l’organisateur de Spemann (SO) et de l’ectoderme neural (NE) par injection d’ARNm de protéine fluorescente dans les prédécesseurs D 112 et D212 dans l’embryon à32 cellules, respectivement. (B) Les 5 principaux processus biologiques surreprésentés dans le protéome SO (rouge) et NE (vert) montrant des différences détectables. L’analyse de la surreprésentation des voies montre des processus biologiques utilisant la correction de Bonferroni. (C) Analyse d’enrichissement du domaine protéique (SMART), révélant l’enrichissement de l’ADN et des protéines contenant des motifs de liaison à l’ARN dans le SO. (D) Analyse STRING prédisant les interactions protéine-protéine canoniques sur la base du protéome SO détecté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les diverses données protéomiques constituent des informations précieuses pour l’évaluation de la fonction. Les données protéomiques peuvent être évaluées à l’aide de bases de connaissances canoniques. Comme le montre la figure 4B, l’analyse des voies des protéines dérégulées a montré une traduction et un métabolisme énergétique surreprésentés dans les ensembles de données SO et NE de nos études récentes. Le protéome de l’entérite nécrotique a été enrichi en protéines associées au transport nucléaire de la cargaison de protéines dans la cellule, ce qui indique probablement des événements en aval suivant la signalisation dans l’entérite nécrotique nouvellement établie (figure 4C). L’analyse d’enrichissement de la figure 4D a révélé une régulation positive dans l’initiation de la traduction, la liaison à l’ARN, la liaison dans le complexe protéasome, suggérant un rôle pour le renouvellement dynamique des protéines développant SO. La protéomique HRMS guidée par lignée cellulaire est évolutive dans l’espace et le temps et suffisamment sensible pour aider à mieux comprendre l’organisation moléculaire des cellules au cours du développement normal et altéré.
Dossier supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ce protocole permet de caractériser l’expression des protéines dans les lignées cellulaires identifiées chez les embryons de l’espèce Xenopus . Issue du SGRH, la méthodologie combine une spécificité exquise dans l’identification moléculaire, une capacité de détection multi-protéines sans sondes moléculaires (généralement des centaines à des milliers de protéines différentes) et une capacité de quantification. L’adaptabilité aux outils et flux de travail classiques en (neuro)biologie cellulaire et développementale étend la protéomique du SGRH à des applications passionnantes, y compris la caractérisation holistique de la différenciation des cellules souches dans l’embryon de X. laevis vertébré.
Les étapes décrivent la protéomique guidée par la lignée cellulaire dans l’embryon de X. laevis. À titre d’exemple, nous démontrons l’analyse de cellules uniques à destin neuronal et de leurs lignées et fournissons les ensembles de données HRMS CE et nanoLC correspondants via un référentiel de données public (voir PRIDE). Cette approche est facilement adaptable aux études sur la régulation spatio-temporelle des protéines dans plusieurs types cellulaires (et lignées). La protéomique guidée spatio-temporellement dans l’embryon en développement peut également être étendue aux études transcriptomiques et métabolomiques pour promouvoir la compréhension de la biologie des systèmes moléculaires de la différenciation cellulaire et du développement d’organes clés, tels que le système nerveux.
Ce protocole ajoute de nouvelles dimensions à la bioanalyse. Les cultures cellulaires, telles que les cellules souches pluripotentes induites (CSPi)1,2, facilitent la mesure de la dynamique du protéome temporel pendant la différenciation cellulaire. L’approche détaillée dans cette étude examine l’induction du destin cellulaire dans l’embryon vivant à 3 dimensions, où des gradients morphogènes complexes, des voies de signalisation parallèles et des processus d’extension convergents collaborent pour provoquer l’induction tissulaire et la morphogenèse. L’étude de la dynamique du protéome dans le contexte d’un embryon peut fournir des informations sur les mécanismes parallèles qui guident la différenciation cellulaire, une direction passionnante pour approfondir la compréhension de la différenciation et du développement.
L’approche décrite ici emprunte les bénéfices expérimentaux de l’espèce Xenopus à cette fin, X. laevis en particulier. Chaque cellule de l’embryon précoce de X. laevis à 16 et 32 cellules est cartographiée pour obtenir des destins tissulaires reproductibles dans l’organisme adulte, essentiellement une projection spatiale des cellules dans les embryons au stade de clivage. La reproductibilité pour la protéomique guidée par les cellules repose sur un typage cellulaire précis. Nous contribuons au succès en accréditant les embryons pour la pigmentation et le clivage stéréotypés avant de procéder à des expériences décrivant la dissection cellulaire et le traçage de la lignée16,20. Il est important de noter que les cellules embryonnaires au stade de clivage contribuent souvent à la formation de différents types de tissus à des degrés divers; les détails de leur contribution de niveau à chaque type de tissu sont disponibles sur Xenbase23. Le stade embryonnaire et les cellules précurseurs à tracer doivent donc être choisis en fonction de la question biologique à poser. Lors de la culture d’embryons sur de longues périodes (p. ex., >1 d), il faut prendre soin d’enlever les embryons endommagés ou morts, ce qui peut, à son tour, diminuer la viabilité des autres embryons de la population.
Pour une protéomique du SGRH réussie, une attention particulière doit être accordée aux fondements analytiques de la collecte de cellules et de tissus, de l’extraction des protéines et de la mesure du SGRH. Étant donné que les embryons Xenopus sont cultivés dans des milieux contenant de fortes concentrations de sels non volatils connus pour réduire la sensibilité du SGRH, il est recommandé de réduire le milieu aspiré lors de la collecte des cellules et des tissus pour les études protéomiques. C’est une bonne pratique d’explorer le dessalage pour faire progresser l’identification et la quantification des protéines. Avant la mesure du SGRH, le rendement analytique des instruments CE- et LC-ESI-HRMS doit être évalué, y compris la séparation, l’ionisation, la reproductibilité et la plage dynamique linéaire de quantification. Avec de bonnes mesures analytiques, ce protocole aide à réduire l’utilisation des animaux dans la recherche biologique, facilite la sensibilité pour obtenir des ensembles plus puissants de données biochimiques et améliore la puissance de l’analyse des données statistiques pour interpréter les résultats. Par défaut, nous analysons chaque réplication biologique dans au moins 3 réplicats techniques à l’aide de CE ou LC-HRMS, qui sont utilisés pour évaluer la reproductibilité technique et approfondir la couverture du protéome détectable. L’analyse de puissance aide à estimer la puissance statistique et à concevoir la taille de la réplication biologique. L’utilisation de différents ensembles de grenouilles mères est conseillée pour tenir compte de la variabilité biologique naturelle entre les embryons.
RENSEIGNEMENTS SUPPLÉMENTAIRES
Les données protéomiques HRMS-MS/MS et les fichiers de traitement connexes ont été déposés au ProteomeExchange Consortium via le référentiel partenaire PRIDE60 avec l’identifiant d’ensemble de données PXD030059.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Jie Li (Université du Maryland, College Park) pour ses précieuses discussions sur la dissociation embryonnaire et le FACS. Nous remercions Vi M. Quach et Camille Lombard-Banek pour leur aide à la préparation des échantillons et à la collecte de données dans les études antérieures illustrant les applications protéomiques mises en évidence dans ce protocole. Certaines parties de ce travail ont été soutenues par la National Science Foundation sous le numéro d’attribution IOS-1832968 CAREER (à P.N.), les National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R35GM124755 (à P.N.), le programme de partenariat entre l’Université du Maryland et le National Cancer Institute (à P.N.) et les bourses de recherche de la COSMOS Club Foundation (à A.B.B. et L.R.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
References
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560 (2021).
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