Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir eine massenspektrometriebasierte proteomische Charakterisierung von Zelllinien mit bekannten Gewebeschicksalen im Embryo von Xenopus laevis im Wirbeltier.
Abstract
Die Charakterisierung molekularer Vorgänge bei der Entstehung von Geweben und Organen in Zellen eröffnet das Potenzial, die normale Entwicklung besser zu verstehen und effiziente Heilmittel für Krankheiten zu entwickeln. Technologien, die eine genaue Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Arten und einer großen Anzahl von Proteinen ermöglichen, würden noch fehlende Informationen über molekulare Mechanismen liefern, die die Entwicklung von Geweben und Organismen in Raum und Zeit orchestrieren. Hier stellen wir ein Massenspektrometrie-basiertes Protokoll vor, das die Messung von Tausenden von Proteinen in identifizierten Zelllinien in Xenopus laevis (Frosch) Embryonen ermöglicht. Der Ansatz baut auf reproduzierbaren Zellschicksalskarten und etablierten Methoden auf, um Zellen und ihre Nachkommen (Klone) aus diesem Modell der Wirbeltierentwicklung zu identifizieren, fluoreszierend zu markieren, zu verfolgen und zu beproben. Nach der Entnahme des Zellinhalts mittels Mikroprobenahme oder der Isolierung von Zellen durch Dissektion oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung werden Proteine extrahiert und für die Bottom-up-Proteomik-Analyse verarbeitet. Flüssigkeitschromatographie und Kapillarelektrophorese werden verwendet, um eine skalierbare Trennung für die Proteindetektion und -quantifizierung mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) zu ermöglichen. Repräsentative Beispiele werden für die proteomische Charakterisierung von Nervengewebe-Schicksalszellen angeführt. Die zellliniengesteuerte HRMS-Proteomik ist an verschiedene Gewebe und Organismen anpassbar. Es ist sensitiv, spezifisch und quantitativ genug, um in die räumlich-zeitliche Dynamik des Proteoms während der Wirbeltierentwicklung zu blicken.
Introduction
Unser Verständnis der Zelldifferenzierung und der Genese von Geweben und Organen ist das Ergebnis jahrzehntelanger aufwendiger gezielter Screenings von Genen und ihren Produkten. Ein besseres Wissen über alle Biomoleküle und ihre Mengen während wichtiger zellulärer Ereignisse würde dazu beitragen, molekulare Mechanismen zu entschlüsseln, die die räumliche und zeitliche Musterung des Körperbauplans von Wirbeltieren steuern. Technologien, die molekulare Amplifikation und Sequenzierung ermöglichen, sind nun in der Lage, routinemäßig über eine große Anzahl von Genen und Transkripten zu berichten und hypothesengestützte Studien in der biologischen und translationalen Grundlagenforschung zu unterstützen. Um sich entwickelnde Systeme zu verstehen, spricht eine komplexe Beziehung zwischen Transkription und Translation für die direkte Analyse mehrerer Proteine und ihrer posttranslationalen Modifikationen. Die globale Proteomik unter Verwendung biologischer In-vitro-Systeme, wie z. B. induzierter pluripotenter Stammzellen, begann, die Mechanismen der Gewebeinduktion zu beschreiben 1,2. In komplexen Organismen, wie dem Wirbeltierembryo, beruht die Entwicklung auf Morphogengradienten im Kontext von Raum und Zeit3. Daraus folgt, dass das Wissen über proteomische Veränderungen bei der Differenzierung von Zellen zu spezialisierten Geweben, wie z. B. Nervengeweben, einen Schlüssel zur Entschlüsselung molekularer Programme bietet, die die normale und fehlerhafte Entwicklung steuern, und um Therapeutika der nächsten Generation zu steuern.
Der südafrikanische Krallenfrosch (Xenopus laevis) ist ein etabliertes Modell in der Zell- und Entwicklungs-, Neuro- und regenerativen Biologie. Der Nobelpreisfür Physiologie oder Medizin 2012 von Sir John Gurdon 4,5 für die Entdeckung der Pluripotenz des somatischen Kerns unterstrich die Bedeutung dieses Modells für Entdeckungen in Grundlagen- und translationalen Studien. Xenopus-Embryonen entwickeln sich außerhalb der Mutter, was die direkte Manipulation von Zellen, Zellklonen und Genexpression über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg ermöglicht. Asymmetrische Pigmentierung und stereotype Zellteilungen ermöglichten die Kartierung reproduzierbarer Schicksalskarten des 16-6- und 32-zelligen Embryos im 7,8-Stadium. Für die hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS)-basierte Proteomik besteht ein weiterer Vorteil des Modells aus der relativ großen Größe (~1 mm Durchmesser), die einen hohen Proteingehalt für die Analyse liefert (~130 μg in Embryonen im frühen Spaltungsstadium, ~10 μg Proteingehalt in einzelnen Zellen des 16-zelligen Embryos)9,10.
Derzeit ist HRMS die führende Technologie der Wahl für den Nachweis von Proteinen. Diese Technologie ermöglicht den direkten, sensitiven und spezifischen Nachweis und die Quantifizierung von mehreren, in der Regel Hunderten bis Tausenden verschiedener Proteine11. Die Bottom-up-Proteomik von HRMS umfasst eine Reihe miteinander verbundener Schritte. Nach der Extraktion aus der Zell-/Gewebeprobe werden Proteine mit einem proteolytischen Enzym, wie z.B. Trypsin, verdaut (Bottom-up-Proteomik). Die resultierenden Peptide werden anhand ihrer unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften getrennt, einschließlich Hydrophobie (Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie, LC), Nettoladung (Ionenaustauschchromatographie), Größe (Größenausschlusschromatographie) oder elektrophoretische Mobilität (Kapillarelektrophorese, CE). Die Peptide werden dann aufgeladen (ionisiert), typischerweise durch Elektrospray-Ionisation (ESI), und Peptidionen werden durch Gasphasenfragmentierung mittels Tandem-HRMS detektiert und sequenziert. Die resultierenden Peptiddaten werden auf das Proteom des untersuchten Organismus abgebildet. Mit proteinspezifischer (proteotypischer) Peptidionen-Signalintensität, die mit der Konzentration korreliert, kann die Proteinquantifizierung markierungsfrei oder markierungsbasiert (Multiplexing-Quantifizierung) durchgeführt werden. Die HRMS-Proteomik liefert eine reichhaltige Informationsquelle über den molekularen Zustand des untersuchten Systems, die die Generierung von Hypothesen und anschließende funktionelle Studien ermöglicht.
Abbildung 1: Räumlich-zeitlich skalierbare Proteomik, die eine zellliniengesteuerte HRMS-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo ermöglicht. (A) Visualisierung der Probe (1) unter Verwendung eines Stereomikroskops (2) zur Injektion einer identifizierten Zelle (Inset) unter Verwendung einer hergestellten Mikropipette (3) unter Kontrolle durch einen Translationstisch (4). (B) Subzelluläre Probenahme der identifizierten linken D11-Zelle in einem 16-zelligen Embryo. (C) Präparation einer ganzenD-11-Zelle aus einem 16-zelligen Embryo. (D) Fluoreszierende (grüne) Nachverfolgung der linken und rechten D111-Nachkommen aus einem 32-zelligen Embryo zur Steuerung der Dissektion des neuralen Ektoderms (NE) in der Gastrula (Stadium 10) und Isolierung des Nachkommengewebes von der Kaulquappe mittels FACS. Maßstabsbalken: 200 μm für Embryonen, 1,25 mm für das Fläschchen. Die Abbildungen wurden mit Genehmigung der Referenzen 15,19,21,59 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die HRMS-basierte Quantifizierung einer großen Anzahl von Proteinen in identifizierten Zellen/Geweben in sich entwickelnden X. laevis-Embryonen. Der Ansatz baut auf einer genauen Zellidentifikation, reproduzierbaren Zellschicksalskarten und etablierten Methoden zur Verfolgung von Zelllinien in diesem biologischen Modell auf 6,7,8. Wie in Abbildung 1 gezeigt, untersuchen wir Proteome aus einzelnen Zellen, indem wir Ganzzelldissektion oder Kapillarmikroskopie verwenden, um zellulären Inhalt abzusaugen. Die Überwachung der Abstammungslinie einer Zelle ermöglicht es uns, die raumzeitliche Entwicklung des Proteoms zu untersuchen, wenn Zellen während der Gastrulation Gewebe bilden. Die Nachkommen der Zelle werden fluoreszenzmarkiert, indem ein Fluorophor injiziert wird, der an inertes Dextran oder mRNA für fluoreszierendes Protein (z. B. grün fluoreszierendes Protein oder GFP) konjugiert ist. Die markierten Nachkommen werden zu den gewünschten Entwicklungszeitpunkten isoliert. Während der Gastrulation können Zellklone, die eng geclustert sind, durch Dissektion isoliert werden. Nach der Gastrulation können Zellklone aufgrund von Migrationsbewegungen innerhalb des Embryos verteilt und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) aus dissoziierten Geweben isoliert werden. Proteine in diesen Zellen und Geweben werden mittels Bottom-up-Proteomik unter Verwendung von HPLC oder CE zur Trennung und ESI-Tandem-HRMS zur Identifizierung gemessen. Die zellliniengesteuerte HRMS-Proteomik ist auf verschiedene Zellgrößen und Abstammungslinien innerhalb des Embryos skalierbar und spezifisch, sensitiv und quantitativ. Anhand ausgewählter Beispiele, die hier gezeigt werden, zeigen wir auch, dass dieses Protokoll skalierbar und breit an verschiedene Zelltypen und Zelllinien anpassbar ist.
Abbildung 2: Der bioanalytische Arbeitsablauf. Die Mikrodissektion und Kapillaraspiration (FACS) erleichterte die Probenahme des zellulären und klonalen Proteingehalts. Die Depletion von reichlich vorhandenen Dotterproteinen und die Trennung durch Kapillarelektrophorese (CE) oder Nano-Flow-Flüssigkeitschromatographie (LC) verbesserte die Identifikationsempfindlichkeit (ID) unter Verwendung von hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) mit Elektrospray-Ionisation (ESI). Die Quantifizierung ergab eine Dysregulation, die neue Informationen für hypothesengetriebene Studien in Verbindung mit Informationen aus der Genontologie (GO) lieferte. Die Abbildungen wurden mit Genehmigung von Referenz15 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Protokolle, die die humane Pflege und den humanen Umgang mit erwachsenen Fröschen von Xenopus laevis gewährleisten, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Maryland, College Park, genehmigt (Zulassungsnummern R-DEC-17-57 und R-FEB-21-07).
1. Bereiten Sie die Lösungen vor
- Für die Embryologie
- Bereiten Sie 1x, 0,5x und 0,2x Steinberg-Lösung (SS) vor und autoklavieren Sie sie dann (120 °C für 20 min) bis zur Sterilität gemäß den Standardprotokollen12.
- Bereiten Sie 3% (w/v) Ficoll in sterilisiertem 1x SS gemäß den Standardprotokollen12 zu.
- Für die Entqualierung bereiten Sie 2%ige (w/v) Cysteinlösung frisch vor und stellen Sie den pH-Wert durch Zugabe von 10 M Natronlauge tropfenweise auf 8 ein.
VORSICHT: Die Exposition gegenüber Cystein kann Haut- und Atemwegsschäden verursachen. Natriumhydroxid ist ein ätzendes Mittel, das bei direkter Exposition schwere Schäden an Haut und Augen verursachen kann. Verwenden Sie beim Umgang mit diesen Chemikalien geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), z. B. Handschuhe und einen Laborkittel. - Für den Lineage Tracer werden 0,5 % (v/v) eines fluoreszierenden Dextrans in sterilem deionisiertem Wasser hergestellt. Alternativ kann eine Lösung von 0,2 μg/μl mRNA für fluoreszierende Proteine in sterilem deionisiertem Wasser (z. B. GFP) hergestellt werden.
- Um Zellen zu dissoziieren, bereiten Sie Newport 2.0-Puffer vor, der 0,1 M Natriumisethionat, 20 mM Natriumpyrophosphat und 10 mM CAPS enthält, und bringen Sie dann seinen pH-Wert auf 10,513.
VORSICHT: Die Exposition gegenüber Natriumpyrophosphat kann Haut- und Augenreizungen verursachen. Verwenden Sie beim Umgang mit diesen Chemikalien geeignete PSA.
- Für Bottom-up-Proteomik
- Bereiten Sie den Zelllysepuffer so vor, dass er Folgendes enthält: 250 mM Saccharose, 1 % Nonidet-P-40-Ersatz (w/v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM Cytochalasin D und 10 μM Combretastatin 4A. Bereiten Sie eine Brühe von 10 % (w/v) Natriumdodecylsulfat14,15 vor.
HINWEIS: Tris-HCl wurde ausgewählt, um die HEPES-Kontamination während der Nano-Flow-LC (nanoLC)-HRMS zu minimieren.
VORSICHT: Die Exposition gegenüber Nonidet P-40-Ersatz kann zu Hautreizungen führen. Cytochalasin D ist teratogen, wenn es konsumiert wird, und Combretastatin ist bei direkter Exposition akut toxisch. Verwenden Sie beim Umgang mit diesen Chemikalien geeignete PSA. - Um Peptide durch CE zu trennen, stellen Sie die folgenden Lösungsmittel (v/v) her: Probenlösungsmittel, 75 % Acetonitril (ACN) mit 0,05 % Essigsäure (AcOH) in Wasser; Schleusenlösung, 10 % ACN mit 0,05 % AcOH in Wasser; Hintergrundelektrolyt (BGE), 25% ACN mit 1 M Ameisensäure (FA) in Wasser.
VORSICHT: AcOH und FA sind giftig, wenn sie eingeatmet oder konsumiert werden, und können bei direkter Exposition schwere Haut- und Augenschäden verursachen. Verwenden Sie beim Umgang mit diesen Chemikalien geeignete PSA. - Um Peptide durch Umkehrphasen-nanoLC zu trennen, stellen Sie (v/v) her: Mobile Phase A (wässrig), Wasser mit 0,1 % FA; mobile Phase B (organisch), 0,1 % FA in ACN.
Anmerkungen: Alle Mischungen sollten mit Lösungsmitteln in LC-MS-Qualität hergestellt werden, um chemische Interferenzen während der HRMS-Detektion zu minimieren.
- Bereiten Sie den Zelllysepuffer so vor, dass er Folgendes enthält: 250 mM Saccharose, 1 % Nonidet-P-40-Ersatz (w/v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM Cytochalasin D und 10 μM Combretastatin 4A. Bereiten Sie eine Brühe von 10 % (w/v) Natriumdodecylsulfat14,15 vor.
2. Bereiten Sie die Werkzeuge für die Mikroinjektion und Dissektion vor
- Um die Embryonen sanft zu bewegen und auszurichten, machen Sie Haarschlaufen, indem Sie sauberes Haar in einer Pasteurpipette fixieren, wie an anderer Stelle beschrieben16.
- Für die Mikroinjektion werden Nadeln hergestellt, indem Borosilikatkapillaren (1 mm/500 μm Außen-/Innendurchmesser) mit einem Pipettenzieher gezogen werden, wie an anderer Stellebeschrieben 16.
HINWEIS: Hier wurde ein P-1000 Pipettenzieher mit den folgenden Einstellungen für die Herstellung von Nadeln verwendet: Hitze, 495; Zug, 30, Geschwindigkeit, 60; Zeit, 150; Druck, 200. - Schneiden Sie bei der Betrachtung unter einem Stereomikroskop die Spitze der Kapillare mit einer scharfen Pinzette ab, um die Kapillare im Wesentlichen zu einer (Mikro-)Nadel herzustellen (z. B. Dumont #5)16.
ACHTUNG: Gezogene Kapillaren sind sehr scharf und sollten mit Vorsicht behandelt werden.
HINWEIS: Die Nadelspitze sollte scharf genug sein (Außendurchmesser 10-15 μm), um die Zelle mit minimaler Schädigung der Zellmembran durchstechen zu können, damit der intrazelluläre Inhalt nicht austritt und die Zelle heilen und weiterhin lebensfähig sein kann. - Um die Embryonen während der Mikroinjektion zu halten, bereiten Sie die Vertiefungen in einer mit Ton gefüllten Schale vor. In einer 15-mm-Petrischale ~1 mm Durchmesser x ~0,5 mm tiefe Vertiefungen in ungiftige Knetmasse einprägen, wie an anderer Stelle beschrieben16.
- Für die Mikrodissektion bereiten Sie mit Agarose überzogene Gerichte vor. Stellen Sie 2% Agarose in 1x SS her und autoklavieren Sie sie, um die Lösung zu sterilisieren (120 °C für 20 min). 60 mm Petrischalen zur Hälfte füllen und die Teller fest werden lassen. Stellen Sie ~1 mm Durchmesser x ~0,5 mm tiefe Vertiefungen mit einem geballten Pasteur-Pipettenwerkzeug her, wie zuvor beschrieben16.
3. Isolieren Sie die Zelllinie
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden durchgeführt, um identifizierte Einzelzellen und/oder ihre abkömmlichen Zelllinien zu isolieren. In der Regel wird der Embryo bis zum 16- oder 32-Zell-Stadium kultiviert, wo das Gewebeschicksal jeder Zelle reproduzierbar abgebildet wird 6,7,17. Die embryonalen Zellen werden anhand ihrer Morphologie, ihrer Lage und in Bezug auf ihre Schicksalskarten identifiziert. Für die Einzelzellanalyse werden identifizierte Zellen durch manuelle Dissektion isoliert oder ihr intrazellulärer Inhalt wird in einer Kapillarpipette gesammelt und in 5 μl 0,5 mM Ammoniumbicarbonat deponiert. Die resultierende Probe wird bis zur Analyse bei -80 °C gelagert (Abbildung 1)18,19,20,21. Für die Analyse der Zelllinie werden identifizierte Zellen mit einem Lineage-Tracer injiziert, und ihre nachfolgenden Klone werden in Schlüsselstadien der Entwicklung isoliert (z. B. während der Gastrulation, um die Gewebeinduktion zu untersuchen, nach der Neurulation, um die Gewebebindung zu untersuchen). Im Folgenden werden Schritte zur Fluoreszenzmarkierung der Abstammungslinie identifizierter Zellen für die Isolierung durch Dissektion oder FACS skizziert.
- Kultivieren Sie die Embryonen
- Gewinnung von Embryonen durch natürliche Paarung oder In-vitro-Fertilisation (IVF) nach festgelegten Protokollen12.
HINWEIS: Die natürliche Paarung ist logistisch einfacher, schont die erwachsenen männlichen Frösche und liefert Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien, während IVF entwicklungssynchronisierte Embryonen für Experimente liefert, die eine genaue Stadieneinteilung erfordern. - Entleeren Sie die Embryonen. Entfernen Sie den Geleemantel, der die Embryonen umgibt, durch Behandlung mit der Entwässerungslösung, wie an anderer Stelle beschrieben12,16.
HINWEIS: Mikroinjektionen und Dissektionen erfordern Zugang zu den Zellen und Geweben, was eine Entleerung in X. laevis-Embryonen erforderlich macht. - Selektion von 2-zelligen Embryonen mit stereotyper Pigmentierung16,22.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um Genauigkeit und Reproduzierbarkeit bei der Identifizierung der Zelle und ihrer Abstammung zu gewährleisten. - Kultivieren Sie Embryonen bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Die dejelliierten Embryonen werden in eine Petrischale mit 1x SS überführt und bei 14-25 °C inkubiert, um die Entwicklungsgeschwindigkeit zu kontrollieren.
HINWEIS: Die Temperaturabhängigkeit der Entwicklung ist reproduzierbar und für X. laevis kartiert, verfügbar auf Xenbase23 (www.xenbase.org). Die Kultivierung von Embryonen bei unterschiedlichen Temperaturen ermöglicht erstaunliche Entwicklungsstadien. Auf diese Weise wird die Anzahl der Embryonen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt für Experimente zur Verfügung stehen, verteilt. - Überwachen Sie das Spaltmuster von Embryonen und wählen Sie Embryonen mit stereotypen Pigmentierungs- und Spaltmustern für die Mikroinjektionaus 16.
HINWEIS: Achten Sie bei der Auswahl von 16- und 32-Zell-Embryonen darauf, dass die Zellspaltungen symmetrisch sind, um eine reproduzierbare Abstammungsverfolgung zu ermöglichen.
- Gewinnung von Embryonen durch natürliche Paarung oder In-vitro-Fertilisation (IVF) nach festgelegten Protokollen12.
- Beschriften Sie die Zelle(n) von Interesse
- Richten Sie die Injektionsnadel mit der Lineage-Tracer-Lösung ein. Montieren Sie die Mikroinjektionsnadel in einen Mikropipettenhalter, der von einem mehrachsigen Mikromanipulator gesteuert wird.
- Schließen Sie den Mikropipettenhalter an einen Mikroinjektor an. Füllen Sie die Nadel mit dem Lineage Tracer, indem Sie einen Unterdruck ausüben, wie an anderer Stelle beschrieben16. Abbildung 1A veranschaulicht den Aufbau.
- Kalibrieren Sie die Nadel. Passen Sie die Größe der Nadelspitze und die Injektionszeit an, um ~1 nL der Lineage-Tracer-Lösung zu liefern, gemessen in (Mineral-)Öl gemäß einem Protokoll, das an anderer Stelle verfügbar ist16.
Anmerkungen: Kapillaren mit einer breiteren Spitze neigen dazu, die Zellmembran zu beschädigen, was dazu führt, dass subzellulärer Inhalt und der injizierte Lineage Tracer auslaufen, während Kapillaren mit kleineren Spitzen anfällig für Verstopfungen sind. Kapillaren mit ~10 μm Spitzenaußendurchmesser sind ideal und erfordern einen Druckimpuls von 40 psi über ~300 ms, um ~1 nL zu liefern. - Fluten Sie die Mikroinjektionsschale mit der 3%igen Ficoll-Lösung und übertragen Sie ~10 Embryonen mit einer Transferpipette in die Tonschale. Verwenden Sie eine Haarschlaufe, um jeden Embryo in eine Vertiefung zu führen, und positionieren Sie ihn vorsichtig so, dass sich die Zielzelle im rechten Winkel zur Mikronadel befindet.
- Identifizieren Sie die Vorläuferzelle der interessierenden Linie anhand der X. laevis-Gewebeverbleibskarten . Abbildung 1 zeigt beispielsweise die Markierung von neuralen ektodermalen Klonen auf der Grundlage der Injektion ihrer Vorläuferzellen in 32-zellige Embryonen (linke und rechteD-111-Zellen ).
HINWEIS: Detaillierte Schicksalskarten für die 16-6- und 32-zelligen 7,8-Embryonen sind auf einer interaktiven Plattform über Xenbase23 verfügbar. Es ist wichtig, stereotype Pigmentierung und Spaltungen an Embryonen zu gewährleisten, wenn sie für Experimente zur Abstammungsverfolgung verwendet werden. - Injizieren Sie die interessierende(n) Zelle(n) mit ~1 nL des fluoreszierenden Dextrans oder ~200 pg mRNA, wie zuvor beschrieben16.
HINWEIS: Verwenden Sie Dextran-Konjugate mit einer Leistung von 10.000 bis 40.000 MW. Kleinere Dextran-Konjugate könnten durch Gap Junctions passieren, während größere Dextran-Konjugate möglicherweise nicht gleichmäßig in die injizierte Zelle diffundieren. Planen Sie, Zellen in ~10 Embryonen zu injizieren, um genügend Gewebe für proteomische Analysen zu haben. - Bestätigen Sie den Erfolg der Zellmarkierung unter einem Stereomikroskop. Stellen Sie sicher, dass nur die vorgesehene Zelle injiziert wird. Embryonen, die verletzte oder falsch markierte Zellen enthalten, werden gemäß den institutionellen Richtlinien verworfen.
HINWEIS: Da X. laevis in vielen nicht-natürlichen Umgebungen invasiv ist, können Embryonen eingefroren werden, um die Letalität zu gewährleisten, bevor die Embryonen verworfen werden.
- Isolieren Sie die markierten Zellnachkommen
- Die injizierten Embryonen werden in einer Petrischale auf 0,5x SS übertragen und bei 14-25 °C kultiviert, bis das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist.
HINWEIS: Konsultieren Sie die etablierten Protokolle zur Einstufung von Embryonen, die auf Xenbase gemeldet werden. - Übertragen Sie 3-5 Embryonen in eine Agarschale mit 0,2x SS-Lösung für Mikrodissektionen.
Anmerkungen: Die Reduzierung der Salzkonzentration der SS-Lösung von 0,5x auf 0,2x hilft bei der Trennung der Zellen während der Dissektion. - Verwenden Sie zwei angespitzte Pinzetten, um die Vitellinmembran, die den Embryo umgibt, vorsichtig zu entfernen.
HINWEIS: Um den interessierenden Klon vor Beschädigungen zu schützen, ziehen Sie die Membran von der gegenüberliegenden Seite des fluoreszenzmarkierten Klons ab. - Isolieren Sie den markierten Klon durch manuelle Präparation (Schritte 3.3.5-3.3.6) oder FACS (Schritte 3.3.7-3.3.8) wie folgt.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um den markierten Klon aus dem Embryo zu sezieren.
Anmerkungen: Andere Hilfsmittel wie mikrochirurgische Scheren, Wolframnadeln oder Augenbrauenhaarmesser können zum Sezieren des markierten Klons verwendet werden, wie an anderer Stellebeschrieben 16. - Sammeln Sie das präparierte Gewebe mit einer 0,5-10 μl Pipette und geben Sie es in ein Mikrozentrifugenfläschchen. Saugen Sie mit einer Transferpipette das Medium ab, das das gesammelte Gewebe umgibt, um Salze in der Probe zu begrenzen, die die HRMS-Analyse in späteren Schritten beeinträchtigen.
Anmerkungen: Verwenden Sie Fläschchen, die die Proteinadsorption auf Kunststoffoberflächen minimieren, um Proteinverluste auf den Oberflächen der Fläschchen in späteren Schritten des Arbeitsablaufs zu minimieren. - Um mittels FACS zu isolieren, werden ~5-8 devitellisierte Embryonen in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte transferiert, die ~5 ml Newport 2.0-Puffer enthält. Dissoziieren Sie die Embryonen, indem Sie die Platte bei 80 U/min für 20-30 Minuten bei Raumtemperaturnutieren 13.
HINWEIS: Embryonen/Larven, die älter als Stadium 22 sind, haben reichlich extrazelluläre Matrixproteine, was die Dissoziation in separate Zellen erschwert. Zusätzliche enzymatische Ansätze können für die Dissoziation von Geweben älterer Embryonen angepasst werden, wie an anderer Stelle beschrieben24. - Reinigen Sie die fluoreszenzmarkierten Zellen aus der Suspension unter Verwendung von FACS, wie an anderer Stelle beschrieben24.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwerfen Sie den Überstand.
Anmerkungen: Verwenden Sie eine niedrige Zentrifugationsgeschwindigkeit (400 × g) und Temperatur (4 °C), um eine Zelllyse zu verhindern. Wenn Sie Rinderserumalbumin (BSA) für FACS verwenden, waschen Sie das Zellpellet, um die BSA-Interferenz während des HRMS-Nachweises zu reduzieren. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und zentrifugieren Sie erneut, um gespülte Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie die überstehende PBS-Flüssigkeit. - Frieren Sie die isolierten Zellen schnell ein, indem Sie das Probenfläschchen auf Trockeneis oder flüssigen Stickstoff legen.
Anmerkungen: Halten Sie die Proben (Gewebe oder Zellen) während der Verarbeitungsschritte gekühlt (z. B. auf Eis). Frieren Sie die Zellen mit so wenig Medien wie möglich um die Probe herum ein, um die nachgelagerte Verarbeitung zu erleichtern. - Lagern Sie die Proben bis zur HRMS-Analyse bei −80 °C.
- Die injizierten Embryonen werden in einer Petrischale auf 0,5x SS übertragen und bei 14-25 °C kultiviert, bis das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist.
4. Analyse der Proteine mittels Massenspektrometrie
Die proteomische Charakterisierung der isolierten Gewebe oder Zellen basiert auf einer Reihe von etablierten Schritten in der HRMS. Abbildung 2 veranschaulicht die Schritte des bioanalytischen Arbeitsablaufs. Das hier verwendete Probenentnahmeprotokoll ist mit Bottom-up-11-, Middle-down-25- oder Top-down-26-Workflows der Proteomik kompatibel. Im Folgenden wird die in dieser Studie verwendete Bottom-up-Strategie beschrieben, die sich als sensitiv, quantitativ und anpassungsfähig an verschiedene Arten von Massenspektrometern erwiesen hat. Nach der Extraktion und enzymatischen Verdauung von Proteinen werden die resultierenden Peptide abgetrennt, gefolgt von einer HRMS-Analyse.
- Verarbeiten Sie die Gewebe/Einzelzellen
- Für die Einzelzellanalyse mittels CE wird die Probe ~15 min lang auf 60 °C erhitzt, um Proteine zu denaturieren, und dann die Probe auf Raumtemperatur (RT, ~5 min) äquilibriert18,21.
HINWEIS: Anders als bei der Arbeit mit Geweben werden die Reduktions- und Alkylierungsschritte übersprungen, um Proteinverluste bei der Probenvorbereitung aus einzelnen Zellen zu begrenzen. Filtergestützte Probenvorbereitung (FASP)27,28, andere Eintopfstrategien29 und mikrofluidische Ansätze30 können angewendet werden, um Proteinverluste während der Probenvorbereitung zu minimieren. - Für die Analyse mittels nanoLC werden bis zu 5 präparierte Gewebe in 50 μl Lysepuffer (~100 μg Gesamtprotein) lysiert. Erleichtern Sie den Vorgang, indem Sie die Probe einige Male auf und ab pipettieren.
- Das Lysat wird 10 Minuten lang bei 4 °C inkubiert, dann werden die Zelltrümmer und die Eigelbplättchen durch Zentrifugieren bei 4.500 × g bei 4 °C pelletiert. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenfläschchen und fügen Sie 10 % SDS hinzu, um eine Endkonzentration von 1 % SDS im Lysat (v/v) zu erhalten.
- Befolgen Sie für Taschentücher die Schritte 4.1.5-4.1.7.
- Fügen Sie dem Lysat 0,5 M Dithiothreitol hinzu, um eine Endkonzentration von ~25 mM zu erhalten (z. B. 2,5 μl 0,5 M Dithiothretol auf 50 μl Lysat) und inkubieren Sie das Lysat 30 Minuten lang bei 60 °C, um Disulfidbrücken in Proteinen chemisch zu reduzieren.
- Fügen Sie 0,5 M Iodacetamid hinzu, um eine Endkonzentration von ~75 mM im Lysat zu erhalten, und inkubieren Sie das Gemisch 15 Minuten lang bei RT im Dunkeln (Abbildung 2).
- Fügen Sie 0,5 M Dithiothreitol hinzu, das dem ursprünglichen Volumen entspricht (z. B. 2,5 μl 0,5 M Dithiothretol auf 50 μl Lysat), um die von der Alkylierungsreaktion verbleibenden Reaktanten zu löschen.
VORSICHT: Iodoacetamid und Dithiothreitol können bei direkter Exposition schwere Haut- und Augenschäden verursachen. Verwenden Sie beim Umgang mit diesen Chemikalien geeignete PSA. - Reinigen Sie Proteine durch Fällung. Die Fällung auf Chloroform-Methanol-Basis schneidet gutab 31. Dieses Protokoll ist auch an andere Arten von Niederschlagsansätzen anpassbar32.
HINWEIS: Für Einzelzellanalysen, bei denen Proteinverluste von Bedeutung sind, überspringen Sie den Fällungsschritt für CE-HRMS. - Trocknen Sie den Proteinniederschlag in einem Vakuumkonzentrator (4-37 °C) und resuspendieren Sie dann das extrahierte Proteom in 50 μL 50 mM Ammoniumbicarbonat. Schätzen Sie die Proteinkonzentration mit einem kolorimetrischen Gesamtprotein-Assay, um die Menge an Enzym zu bestimmen, die für die Verdauung benötigt wird (z. B. Bicinchoninsäure-Protein-Assay).
- Verdauen Sie die Proteine zu Peptiden. Fügen Sie Trypsin (1 μg/μl Stamm) hinzu, um ein Protease:Protein-Verhältnis von 1:50 zu erhalten, und inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für bis zu 5 h für Einzelzellproben und bis zu 14 h für Gewebeproben. Konsultieren Sie die herstellerspezifischen Empfehlungen für die Reaktion.
HINWEIS: Eine Verdauung mit Trypsin über einen Zeitraum von mehr als 14 h oder höheren Konzentrationen kann zu Spaltungen führen, die unspezifisch für die Sequenz des Proteins sind, wodurch die Proteinidentifizierung erschwertwird 33. - Quantifizieren Sie die Gesamtpeptidkonzentration mit einem kolorimetrischen Assay.
- OPTIONAL: Markieren Sie für die Multiplexing-Quantifizierung die Peptide aus jeder Probe mit einem anderen isobaren Massen-Tag gemäß den herstellerspezifischen Anweisungen. Mischen Sie die barcodierten Peptide zu gleichen Anteilen pro Peptidprobe.
HINWEIS: Achten Sie auf eine genaue Kennzeichnung und Mischung, um quantitative Verzerrungen zu vermeiden. Für Proben mit begrenzter Menge oder Einzelzellproben kann ein TMT-basierter Trägerkanal aus gepoolten Geweben/Zellen einbezogen werden, um Probenverluste bei nachfolgenden Trennschritten zu minimieren und die Empfindlichkeit von Proteinen mit geringerer Häufigkeit zu erhöhen34. - OPTIONAL: Entsalzung von Peptiden zur Entfernung von Salzen und Verunreinigungen (z. B. nicht umgesetzte isobare Massenmarkierungsreagenzien) auf einer C18-Umkehrphasen-Spinsäule/-spitze zum Schutz des LC-MS-Systems.
- OPTIONAL: Fraktionieren Sie die Peptidmischung (z. B. Reversed-Phase-Fraktionierung mit mittlerem oder hohem pH-Wert) für eine tiefere Detektion des Proteoms über manuelle oder automatische Plattformen. Verwenden Sie die stationäre C18-Phase, die Spitzen enthält, um geringe Mengen (1-10 μg) Peptidverdauen zu fraktionieren.
- Trocknen Sie die Peptidmischung bei 60 °C in einem Vakuumkonzentrator.
- Lagern Sie die Peptidmischung bis zur Messung bei −80 °C.
- Für die Einzelzellanalyse mittels CE wird die Probe ~15 min lang auf 60 °C erhitzt, um Proteine zu denaturieren, und dann die Probe auf Raumtemperatur (RT, ~5 min) äquilibriert18,21.
- Trennen Sie die Peptide
HINWEIS: Nach der Extraktion und enzymatischen Verdauung von Proteinen werden die resultierenden Peptide durch nanoLC oder CE getrennt und durch ESI ionisiert, um sie mittels Tandem-HRMS zu sequenzieren. Die Umkehrphasen-NanoLC-Trennung ist ideal für Peptide mit einer Anhäufung von ~150 ng bis ~1 μg pro Analyse. CE bietet eine komplementäre Sensitivität für Peptide von Femtogrammen bis hin zu <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 und werden zunehmend für die Einzelzellanalyse eingesetzt18,36,37.- Um mit CE zu trennen, führen Sie die Schritte 4.2.2-4.2.7 aus.
HINWEIS: Im Folgenden wird die Verwendung der speziell angefertigten CE-Plattform zur Messung der Peptide beschrieben. Protokolle zum Aufbau und zur Verwendung dieses CE-Instruments wurden früherbereitgestellt 38, zusammen mit einem visualisierten Experiment zur Verwendung für kleine Moleküle20. Alternativ können diese Messungen auch mit einem handelsüblichen CE-System durchgeführt werden, z. B. AB SCIEX CESI, Agilent 7100 oder einem gleichwertigen System. - Rekonstituieren Sie den Proteinaufschluss in 1-2 μl des Probenlösungsmittels, wirbeln Sie die Probe durch, um sie zu mischen, und zentrifugieren Sie sie bei 10.000 x g für 2 Minuten, um Zellreste zu pelletieren.
HINWEIS: Durch die Entfernung der Zelltrümmer wird die Wahrscheinlichkeit einer Verstopfung der CE-Kapillare minimiert, wodurch die Lebensdauer des Trennsystems verlängert und der Messdurchsatz erhöht wird. - Initialisieren Sie das CE-ESI-Gerät, indem Sie die CE-Kapillare mit dem BGE spülen.
- Validierung der instrumentellen Leistung anhand eines bekannten Standards (z. B. Cytochrom-C- oder BSA-Digest, Angiotensin-Peptide).
HINWEIS: Es wird empfohlen, das Gerät in Bezug auf Massengenauigkeit, Detektionsempfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und linearen dynamischen Quantifizierungsbereich zu bewerten, bevor wertvolle Proben gemessen werden. Weitere Hinweise zur Validierung und Fehlerbehebung der CE-ESI-MS-Leistung sind an anderer Stelle aufgeführt18,20,38. - Injizieren Sie ~1-10 nL der Probe in die CE-Trennkapillare.
HINWEIS: In dieser Studie wird eine ~1 m lange Quarzglaskapillare (40/110 μm Innen-/Außendurchmesser) mit dem elektrokinetisch gepumpten Mantelstromaufbau verwendet. Kommerzielle CE-Geräte erfordern in der Regel die Präsentation von 5-10 μl Probe in einem Mikrofläschchen zur Injektion. Die speziell angefertigte CE-Plattform18,38 ist kompatibel mit ~250 nL bis 1 μL Probe, die in ein mikrofläschiges Probengefäß abgelegt werden. - Übertragen Sie das Einlaufende der CE-Trennkapillare in die BGE.
- Beginnen Sie mit der elektrophoretischen Trennung, indem Sie die CE-Trennspannung von der Erderde aus allmählich erhöhen (z. B. schrittweise über 1 min). Potentiale von 20-28 kV mit einem Strom unter ~10 μA gewährleisten eine stabile und reproduzierbare Geräteleistung für die Analyse.
- Um mit nanoLC zu trennen, folgen Sie den Schritten 4.2.9-4.2.12.
- Resuspendieren Sie die Peptidprobe in der mobilen Phase A. Die Konzentration der Probe und ihr Volumen für die Injektion hängen vom verfügbaren LC-System und der Säule ab. In dieser Studie werden ~250 ng-1 μg Proteinaufschluss in 1-20 μl Probenvolumen auf einer C18-Packbettsäule (75 μm Innendurchmesser, 2 μm Partikelgröße mit 100 Å Poren, 25 cm Länge Trennsäule) injiziert.
- Übertragen Sie die Probe in ein LC-Fläschchen.
Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Durchstechflasche befinden, die die Analysesäule beschädigen könnten. Fläschchen mit Einsätzen können für Gewebeproben mit geringem Volumen oder Einzelzellproben verwendet werden. - Laden Sie ~200 ng bis 2 μg Peptidprobe auf die C18-Analysesäule.
HINWEIS: Optional können die Peptide vor der analytischen Trennung zur Entsalzung auf eine Fallensäule geladen werden. Zum Beispiel eine C18-Fallensäule mit 0,1 mm Innendurchmesser, 5 μm Partikelgröße, 100 Å Porengröße, 20 mm Länge. Entsalzen Sie Peptide mit 100% Puffer A bei einer Flussrate von 5 μL/min für 5 min, bevor der Trenngradient beginnt. - Trennen Sie die Peptide mittels Gradientenelution. Bei einer Flussrate von 300 nL/min ist der in dieser Studie verwendete 120-Minuten-Gradient wie folgt: 0-5 min 2 % B, 5-85 min 2-35 % B, 86-90 min 70 % B, 91-120 min 2 % B.
- Um mit CE zu trennen, führen Sie die Schritte 4.2.2-4.2.7 aus.
- Ionisieren Sie die Peptide durch ESI
HINWEIS: Die CE- oder nanoLC-Kapillare wird in der Regel zur Ionisation in eine ESI-Quelle eingekoppelt. CE-ESI-Schnittstellen für die ultraempfindliche Detektion wurden bereits zuvor CE-ESI-Schnittstellen mit Mikrofluss (stumpfe Spitze) und Nanoströmung (konische Spitze39 und elektrokinetisch gepumpte Mantelströmung36 ) für die hochempfindliche Detektion entwickelt.- Geben Sie die trennenden Peptide zur Ionisation über eine kommerzielle oder kundenspezifische ESI-Schnittstelle in eine Elektrospray-Ionenquelle. Für die Einzelzell-CE-ESI-MS-Analyse in Xenopus-Embryonen wird eine elektrokinetisch gepumpte Low-Flow-Grenzfläche verwendet, bei der der CE-Kapillarauslass von einem gezogenen Borosilikatstrahler umschlossen ist.
- Überprüfen Sie den Flüssigkeitsfluss durch den Elektrospray-Strahler mit einer Kamera und inspizieren Sie den Aufbau visuell auf mögliche Lecks.
- Stellen Sie die Elektrospray-Spannung auf ~2,5 kV ein, um die ESI-Quelle zu starten (im Gegensatz zur Erdung).
- Sorgen Sie für ein stabiles Nanospray für die HRMS-Analyse, indem Sie den Gesamtionenstrom überwachen. Stellen Sie die Elektrospray-Spannung und den Abstand des Emitters zum HRMS-Einlass ein, um einen stabilen Sprühnebel zu erzielen (<15 % relative Standardabweichung in der Gesamtintensität).
- Nachweis der Peptide
HINWEIS: Die Detektion von Peptiden folgt unterschiedlichen instrumentellen Überlegungen für isobare, massenmarkierte und nicht markierte Peptide und hängt vom Typ des verfügbaren Massenspektrometers ab. In dieser Studie wird ein Orbitrap-Tribrid-Massenspektrometer gemäß den folgenden Schritten verwendet.- Erfassen Sie MS1-Ereignisse mit den Einstellungen: Analyzer, orbitrap; Spektrale Auflösung, 120.000 volle Breite bei halbem Maximum (FWHM); maximale Injektionszeit (IT), 50 ms; automatische Verstärkungsregelung (AGC), 4 x 105 Counts; Mikroscans, 1.
- Um Peptide zu sequenzieren, fragmentieren Sie Vorläuferionen für den Nachweis im Ionenfallenanalysator mit den folgenden Einstellungen: Fragmentierungsmodus, Kollisionsdissoziation mit höherer Energie (HCD); Kollisionsgas, Stickstoff; Kollisionsenergie, 32 % normalisierte Kollisionsenergie (NCE); maximale IT, 70 ms; AGC, 1 x 104 Zählungen; Mikroscans, 1.
- OPTIONAL: Quantifizierung von TMT-markierten Peptiden mittels Tandem-/mehrstufigem HRMS (MS2/MS3). Für MS3 mit synchroner Vorläuferauswahl sind die typischen Instrumentaleinstellungen wie folgt. Einstufige (MS1) Scans, die die am häufigsten vorkommenden Ionen untersuchen, werden durch datenabhängige Erfassung mit den Parametern dissoziiert: MS 2-Fragmentierungsmodus, kollisionsinduzierte Dissoziation (CID); Kollisionsgas, Helium; Kollisionsenergie, 35% NCE; Analysator für Fragmentionen, Ionenfalle folgende Einstellungen: maximale IT, 50 ms; AGC, 5 x 104 Zählungen; Mikroscans, 1. Wählen Sie 10 MS2-Fragmentionen aus und fragmentieren Sie sie mit HCD in Stickstoff (65% NCE). Nachweis von MS3-Fragmentionen mit den folgenden Einstellungen: Orbitrap-Auflösung 15.000 FWHM, maximale IT, 120 ms; AGC, 1 × 105 Zählungen; Mikroscans, 1.
HINWEIS: Unterschiedliche MS-Erfassungsmethoden und -parameter können für markierte Proben gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet werden, wie an anderer Stellebeschrieben 11,40.
- Analysieren der Daten
HINWEIS: Proteine werden mit Hilfe fortschrittlicher bioinformatischer Pakete identifiziert und quantifiziert. Die Genauigkeit der Identifizierungen wird mit Hilfe einer Köderdatenbank berechnet, ausgedrückt als False Discovery Rate (FDR) auf der Ebene von Peptiden und Proteinen.- Verarbeiten Sie die Daten mit kommerziellen oder Open-Source-Softwarepaketen (siehe Referenz41). Gleichen Sie die Rohdaten mit einer Datenbank ab, die durch Verkettung des Xenopus-Proteoms 9.2 mit der von mRNA abgeleiteten PHROG-Datenbank42 erstellt wurde.
HINWEIS: Die Suchparameter sind: Verdauungsenzym, Trypsin; verpasste Dekolletés, bis zu 2; variable Modifikation, Methioninoxidation; statische Modifikation, Cysteincarbamidomethylierung; Massentoleranz der Vorläufer, 10 ppm; Toleranz der Fragmentmasse, 0,6 Da; minimale Peptidlänge, 5; Identifikationstreue, <1% FDR für Peptide und Proteine. Ohne Alkylierung zu Peptiden wird die Carbamidomethylierung als statische Modifikation bei der Datenbanksuche (z.B. für die Einzelzellanalyse) ausgeschlossen. - Quantifizieren Sie die Proteinhäufigkeiten über markierungsfreie43- oder markierungsbasierte Strategien44,45.
- OPTIONAL: Proteine für die Genontologie annotieren. PantherDB46, Reactome47 oder Xenbase23 können verwendet werden.
- OPTIONAL: Quantifizieren Sie die Proteinhäufigkeit und Unterschiede in der Proteinhäufigkeit zwischen Zell-/Gewebetypen mithilfe von Softwarepaketen/Webtools, wie z. B. der Trans-Proteomic Pipeline48, Perseus49 und Orange50.
HINWEIS: Zusätzliche Überlegungen zur Versuchsplanung und zu Softwareoptionen wurden an anderer Stelle überprüft41,51. - OPTIONAL: Werten Sie die Ergebnisse anhand von Wissensdatenbanken wie STRING52 und BioPlex Display 53 für bekannte Protein-Protein-Interaktionen und PhosphoSiteplus54 für Phosphorylierungen weiter aus. Für die Analyse von Motiven und Domänen, die im Proteom repräsentiert sind, verwenden Sie Webtools wie Simple Modular Architecture Research (SMART)55.
- Verarbeiten Sie die Daten mit kommerziellen oder Open-Source-Softwarepaketen (siehe Referenz41). Gleichen Sie die Rohdaten mit einer Datenbank ab, die durch Verkettung des Xenopus-Proteoms 9.2 mit der von mRNA abgeleiteten PHROG-Datenbank42 erstellt wurde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieses Protokoll ermöglichte die Untersuchung von Proteinen in einzelnen Zellen und ihrer Abstammungslinien bei der Etablierung von Geweben in X. laevis-Embryonen. Abbildung 1 veranschaulicht eine solche Anwendung des Ansatzes zur Untersuchung von Proteinen in Zellen mit dem Schicksal von Nervengewebe und des neu induzierten neuralen Ektoderms im Embryo. Wie in Abbildung 1A dargestellt, integrierte der bioanalytische Arbeitsablauf traditionelle Werkzeuge der Zell- und Entwicklungsbiologie zur Identifizierung, Injektion/Absaugung von Zellen und zur Entnahme von Proben. Abbildung 1B zeigt die Mikrosondenentnahme der linken dorsalen Tierzelle (D11) im 16-zelligen Embryo in vivo unter Verwendung eines Mikroinjektors; Nach dem Experiment entwickelten sich die Embryonen erfolgreich zu Kaulquappen mit normaler Anatomie56. Große embryonale Zellen (~100-250 μm Durchmesser) waren ebenfalls für die manuelle Mikrodissektion geeignet. Die Dissektion einer rechten dorsalen tierischen Mittellinienzelle (D11) ist anhand des 16-zelligen Embryos in Abbildung 1C dargestellt. Der Aufbau ermöglichte auch die Verfolgung einer klonalen Trajektorie durch Injektion eines fluoreszierenden Tracers in den identifizierten Vorläufer. Wie in Abbildung 1D gezeigt, erlaubte der Ansatz die Isolierung von Klonen aus den linken und rechtenD-111-Zellen durch Gewebedissektion oder durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Die hier beschriebenen Strategien zur Probenentnahme sind räumlich und zeitlich ausreichend skalierbar, um die Embryonalentwicklung in neuen Details zu untersuchen.
Der bioanalytische Workflow integrierte HRMS-Technologien, um die Sensitivität und Quantifizierung zu verbessern (Abbildung 2). Die gesammelten Proteine wurden mittels eines Bottom-up-Proteom-Ansatzes gemessen. Die optionale Fraktionierung von Proben auf der Grundlage orthogonaler Chemie (z. B. LC mit hohem und niedrigem pH-Wert in umgekehrter Phase) unterstützte die Detektionsempfindlichkeit. Um Peptide zu trennen, wurde CE für Spuren von Proben (<<~100 ng)) und nanoLC für begrenzte Materialmengen (>>150 ng) ausgewählt. Die Peptide wurden mittels ESI-HRMS sequenziert. Die detektierten Proteine wurden mit markierungsfreien und markierungsbasierten Strategien quantifiziert. Die Vereinfachung der Probenverarbeitung für die Einzelzellanalyse, wie z. B. der Wegfall der typischen Schritte der Reduktion und Alkylierung mit anschließender CE-Analyse, erleichterte die Identifizierung von ~400-800 verschiedenen Proteinen. Unter den beschriebenen Proteinen befanden sich viele mit wichtigen funktionellen Funktionen, wie z.B. Chaperonin-haltige TCP1-Untereinheit 3 (Cct3), spannungsabhängiger Ionenkanal (Vdac2) und Kreatinkinase-Gehirn (Ckb). Multivariate und statistische Datenmodelle halfen uns10,57 und anderen 9,58 dabei, bisher unbekannte Unterschiede in der proteomischen Zusammensetzung ausgewählter Zellen und Gewebe zu finden, indem wir die in diesem Protokoll zusammengefassten Ansätze verwendeten. Bemerkenswert ist, dass diese HRMS-Messungen keine funktionierenden Sonden oder Kenntnisse über die Zusammensetzung der Proben im Voraus erforderten, was die Entdeckungen unterstützte.
In einer Reihe von Studien wurde der proteomische Zustand identifizierter Zellen in sich entwickelnden Embryonen von X. laevis (Abb. 3) quantifiziert21. Abbildung 3A zeigt die Detektion von Gentranslationsunterschieden zwischen D11 Zellen, die aus verschiedenen Embryonen seziert wurden10. Das Microsampling CE-ESI-HRMS ermöglichte es uns, bis zu ~700 Proteine aus einzelnen Zellen zu identifizieren und zu quantifizieren21. Die repräsentativen primären HRMS-MS/MS-Daten zur Identifizierung von ~400 kumulativen Proteinen aus technischen Doppelmessungen an einer D11-Zelle im Embryo wurden bei PRIDE hinterlegt. Der Ansatz war skalierbar auf kleinere Zellen und Embryonen anderer Modellorganismen, wie z.B. Zebrafische21. Die Skalierbarkeit auf kleinere Zellgrößen ermöglichte es uns, die räumlich-zeitliche Reorganisation der D11-Nachkommen aus einem lebenden Embryo zu untersuchen, während er sich im Laufe der Zeit entwickelte. Abbildung 3B zeigt die Verwendung dieses Protokolls zur Durchführung subzellulärer quantitativer Proteomik identifizierter Zellen in den 16-, 32-, 64- und 128-Zell-Embryonen. Die Proteine wurden in vier Gruppen eingeteilt, die unterschiedliche Häufigkeitsprofile über die klonale Entwicklung aufwiesen21.
Abbildung 3: Skalierbarkeit des Protokolls vom subzellulären Raum bis zum klonalen Gewebe im Embryo von X. laevis . (A) Messung von proteomischen Unterschieden zwischen identifizierten ganzenD-11-Zellen, die die Zell-Zell-Heterogenität aufzeigen. Gennamen werden für ausgewählte Proteine angezeigt. (B) Reorganisation des zellulären Proteoms im sich entwickelnden D11-Zellklon. Fuzzy-C-Means-Clusteranalyse (GProx) der Proteindynamik, bei der Proteine auf der Grundlage ähnlicher Expressionsmuster gruppiert werden. Graue Zahlen zeigen die Anzahl der verschiedenen Proteine, die in jedem Cluster quantifiziert wurden. Die Abbildungen wurden mit Genehmigung der Referenzen21,57 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Dieses Protokoll ermöglichte es uns, räumliche und zeitliche Proteomik in identifizierten, sich entwickelnden Zellklonen durchzuführen (Abbildung 4). Abbildung 4A zeigt die Anwendung des Ansatzes zur Markierung und Isolierung von Zellklonen, die zwei Gewebe bilden, die eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des neuronalen Gewebes und der Strukturierung des Embryos spielen. Der Großteil des Spemann-Organizers (SO) wurde durch Markierung der linken und rechten D112- undD212-Zellen mittels Injektion von fluoreszierendem Dextran nachvollzogen. Parallel dazu wurden die benachbarten dorsalen tierischen (D111) Zellen markiert, um den Großteil des neuralen Ektoderms (NE) zu markieren. Die Gewebe wurden präpariert und ihr Proteingehalt nach diesem Protokoll analysiert. nanoLC-ESI-HRMS lieferte bis zu 2.000 verschiedene Proteine aus dem Gewebe zurück, einschließlich Signalwegen, wie z. B. der Wnt-, Fgf- und Tgfβ-Signalwege. Die repräsentativen primären HRMS-MS/MS-Daten zur Identifizierung von ~1.800 kumulativen Proteinen aus technischen Doppelmessungen an einem Pool von präpariertem SO-Gewebe wurden bei PRIDE hinterlegt. Der Wnt-Signalweg-Ligand Wnt10a und Wntless (Wls), ein Membranprotein, das für die Sekretion von Wnt-Liganden zuständig ist, wurden nur im NE-Proteom nachgewiesen. Der Wnt-Signalweg wurde im SO unterdrückt und könnte einen Mangel an Wnt-interagierenden Proteinen erklären, die im SO nachgewiesen wurden. Diese Ergebnisse zeigen die Anwendbarkeit dieses Protokolls für die Untersuchung linienspezifischer Unterschiede innerhalb des Embryos.
Abbildung 4: Beispiel für eine Datenanalyse aus der räumlichen Gewebeproteomik in den X. laevis-Embryonen . (A) Differentielle Markierung des Spemann'schen Organizers (SO) und des neuronalen Ektoderms (NE) Gewebes durch Injektion von fluoreszierender Protein-mRNA in den Vorgänger D 112 bzw. D212 in den 32-zelligen Embryo. (B) Top 5 der überrepräsentierten biologischen Prozesse im SO- (rot) und NE- (grün) Proteom, die nachweisbare Unterschiede aufweisen. Die Überrepräsentationsanalyse des Signalwegs zeigt biologische Prozesse mit Hilfe der Bonferroni-Korrektur. (C) Proteindomänenanreicherungsanalyse (SMART), die die Anreicherung von DNA- und RNA-Bindungsmotiv-enthaltenden Proteinen im SO aufdeckt. (D) STRING-Analyse zur Vorhersage kanonischer Protein-Protein-Interaktionen auf der Grundlage des detektierten SO-Proteoms. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die vielfältigen proteomischen Daten dienen als wertvolle Informationen für die Beurteilung der Funktion. Die proteomischen Daten können mit Hilfe von kanonischen Wissensbasen ausgewertet werden. Wie in Abbildung 4B gezeigt, zeigte die Signalwegsanalyse von fehlregulierten Proteinen in unseren jüngsten Studien eine überrepräsentierte Translation und einen überrepräsentierten Energiestoffwechsel sowohl in den SO- als auch in den NE-Datensätzen. Das NE-Proteom war mit Proteinen angereichert, die mit dem nukleären Transport von Proteinfracht in der Zelle assoziiert sind, was wahrscheinlich auf nachgeschaltete Ereignisse nach der Signalübertragung im neu etablierten NE hinweist (Abbildung 4C). Die Anreicherungsanalyse in Abbildung 4D ergab eine Hochregulation der Translationsinitiierung, der RNA-Bindung und der Bindung im Proteasomkomplex, was auf eine Rolle für den dynamischen Proteinumsatz bei der Entwicklung von SO hindeutet. Die zellliniengesteuerte HRMS-Proteomik ist räumlich und zeitlich skalierbar und empfindlich genug, um die molekulare Organisation von Zellen während der normalen und beeinträchtigten Entwicklung besser zu verstehen.
Ergänzende Datei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung der Proteinexpression in identifizierten Zelllinien in Embryonen der Xenopus-Spezies . Die Methodik, die auf HRMS zurückgeht, kombiniert eine hervorragende Spezifität bei der molekularen Identifizierung, die Fähigkeit zur Detektion mehrerer Proteine ohne molekulare Sonden (in der Regel Hunderte bis Tausende verschiedener Proteine) und die Fähigkeit zur Quantifizierung. Die Anpassungsfähigkeit an klassische Werkzeuge und Arbeitsabläufe in der Zell- und Entwicklungs-(Neuro-)Biologie erweitert die HRMS-Proteomik auf spannende Anwendungen, einschließlich der ganzheitlichen Charakterisierung der Stammzelldifferenzierung im Embryo von X. laevis im Wirbeltier.
Die Schritte beschreiben die zellliniengesteuerte Proteomik im X. laevis-Embryo. Beispielhaft demonstrieren wir die Analyse von neuronalen Einzelzellen und deren Abstammungslinien und stellen die entsprechenden CE- und nanoLC HRMS-Datensätze über ein öffentliches Datenrepositorium zur Verfügung (siehe PRIDE). Dieser Ansatz lässt sich leicht auf Studien zur raumzeitlichen Regulation von Proteinen in verschiedenen Zelltypen (und Abstammungslinien) übertragen. Die räumlich-zeitlich gesteuerte Proteomik im sich entwickelnden Embryo kann auch auf transkriptomische und metabolomische Studien ausgeweitet werden, um das molekulare systembiologische Verständnis der Zelldifferenzierung und der Entwicklung von Schlüsselorganen wie dem Nervensystem zu fördern.
Dieses Protokoll fügt der Bioanalytik neue Dimensionen hinzu. Zellkulturen, wie die induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)1,2, erleichtern die Messung der zeitlichen Proteomdynamik während der Zelldifferenzierung. Der in dieser Studie beschriebene Ansatz befasst sich mit der Induktion des Zellschicksals im 3-dimensionalen lebenden Embryo, wo komplexe Morphogengradienten, parallele Signalwege und konvergente Verlängerungsprozesse zusammenarbeiten, um Gewebeinduktion und Morphogenese herbeizuführen. Die Untersuchung der Proteomdynamik im Kontext eines Embryos kann Informationen über parallele Mechanismen liefern, die die Zelldifferenzierung steuern, eine spannende Richtung, um das Verständnis von Differenzierung und Entwicklung zu vertiefen.
Der hier beschriebene Ansatz greift dazu die experimentellen Vorteile der Xenopus-Arten, insbesondere von X. laevis, auf. Jede Zelle des frühen 16- und 32-zelligen X. laevis-Embryos wird auf reproduzierbare Gewebeschicksale im erwachsenen Organismus abgebildet, im Wesentlichen eine räumliche Projektion von Zellen im Spaltungsstadium. Die Reproduzierbarkeit der zellgesteuerten Proteomik beruht auf einer genauen Zelltypisierung. Wir unterstützen den Erfolg, indem wir Embryonen auf stereotype Pigmentierung und Spaltung prüfen, bevor wir mit Experimenten fortfahren, die die Zelldissektion und die Abstammungsverfolgung beschreiben16,20. Es ist wichtig zu beachten, dass Zellen von Embryonen im Spaltungsstadium oft in unterschiedlichem Maße zur Bildung verschiedener Gewebetypen beitragen; Die Details ihres Beitrags zu jedem Gewebetyp sind auf Xenbase23 verfügbar. Das Embryonalstadium und die Vorläuferzellen, die nachvollzogen werden sollen, sollten daher auf der Grundlage der vorliegenden biologischen Fragestellung ausgewählt werden. Bei der Kultivierung von Embryonen über längere Zeiträume (z. B. >1 d) sollte darauf geachtet werden, beschädigte/tote Embryonen zu entfernen, die wiederum die Lebensfähigkeit der anderen Embryonen in der Population verringern können.
Für eine erfolgreiche HRMS-Proteomik sollten die analytischen Grundlagen der Zell-/Gewebesammlung, der Proteinextraktion und der HRMS-Messung sorgfältig beachtet werden. Da Xenopus-Embryonen in Medien kultiviert werden, die hohe Konzentrationen an nichtflüchtigen Salzen enthalten, von denen bekannt ist, dass sie die HRMS-Empfindlichkeit verringern, wird empfohlen, die aspirierten Medien bei der Entnahme der Zellen und Gewebe für Proteomstudien zu reduzieren. Es ist eine gute Praxis, die Entsalzung zu erforschen, um die Identifizierung und Quantifizierung der Proteine voranzutreiben. Vor der HRMS-Messung sollte die analytische Leistung der CE- und LC-ESI-HRMS-Geräte bewertet werden, einschließlich Trennung, Ionisation, Reproduzierbarkeit und linearer dynamischer Quantifizierungsbereich. Mit guten analytischen Metriken trägt dieses Protokoll dazu bei, den Einsatz von Tieren in der biologischen Forschung zu reduzieren, die Sensitivität für die Gewinnung aussagekräftigerer biochemischer Daten zu erhöhen und die Leistungsfähigkeit der statistischen Datenanalyse zur Interpretation der Ergebnisse zu verbessern. Standardmäßig analysieren wir jedes biologische Replikat in mindestens 3 technischen Replikaten mit CE oder LC-HRMS, die zur Bewertung der technischen Reproduzierbarkeit und zur Vertiefung der Abdeckung des nachweisbaren Proteoms verwendet werden. Die Power-Analyse hilft bei der Abschätzung der statistischen Trennschärfe und beim Design der biologischen Replikatgröße. Die Verwendung verschiedener Elternfrösche wird empfohlen, um der natürlich vorkommenden biologischen Variabilität zwischen den Embryonen Rechnung zu tragen.
ERGÄNZENDE INFORMATIONEN
Die HRMS-MS/MS-Proteomik-Daten und die zugehörigen Verarbeitungsdateien wurden über das PRIDE60-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD030059 beim ProteomeExchange-Konsortium hinterlegt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Jie Li (University of Maryland, College Park) für die wertvollen Diskussionen über embryonale Dissoziation und FACS. Wir danken Vi M. Quach und Camille Lombard-Banek für die Unterstützung bei der Probenvorbereitung und Datenerhebung in früheren Studien, die beispielhaft für die proteomischen Anwendungen stehen, die in diesem Protokoll hervorgehoben werden. Teile dieser Arbeit wurden von der National Science Foundation unter der Fördernummer IOS-1832968 CAREER (an P.N.), den National Institutes of Health unter der Fördernummer R35GM124755 (an P.N.), dem University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (an P.N.) und den Forschungspreisen der COSMOS Club Foundation (an A.B.B. und L.R.P.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
References
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560 (2021).
- Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
- Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2000).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. Vleminckx, K. 1865, Humana Press Inc. NY. 175-194 (2018).
- Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
- Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
- Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P. Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. 628, 263-292 (2019).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11 (2016).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956 (2017).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Developmental Biology. 120 (1), 299-304 (1987).
- Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
- Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
- Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
- Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
- Wisniewski, J. R. Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. Becher, D. 1841, Humana Press Inc. NY. 3-10 (2018).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882 (2018).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
- Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
- Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161 (2018).
- Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
- Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21 (2019).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
- Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
- Pino, L. K., Rose, J., O'Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
- Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25 (2020).
- Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
- Schmidt, E., et al. On the Move Federated Workshops. , Springer, Verlag. Berlin. 710-719 (2006).
- Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
- Jensen, L. J., et al. STRING 8 - a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
- Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
- Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
- Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
- Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
- Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
- Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
