Summary
描述了一种手术，该手术表明在惩罚实施禁欲后，强烈急性食物剥夺诱导海洛因复发。使用海洛因自我管理的寻找和获取链时间表成功实施了惩罚实施的禁欲模型。然后在食物剥夺应激24小时后进行海洛因寻求测试。
Abstract
惩罚施加的禁欲程序模拟了人类由于与吸毒相关的不良后果而发起的自我禁欲。该模型已在使用不同类型的滥用物质（如甲基苯丙胺，可卡因和酒精）的实验中实施。然而，在受过海洛因训练的动物中，惩罚诱导的禁欲尚未得到证实。此外，急性应激是人类和动物模型复发的关键触发因素。先前已经证明，严重的食物匮乏有力地诱发了灭绝的可卡因和海洛因的恢复寻找。这里描述的程序可用于评估急性应激暴露对在惩罚实施禁欲后寻求海洛因的影响。共8只大鼠被植入慢性静脉注射（i.v.）导管，并接受自我给药训练（0.1mg / kg /输注）18天。完成寻道链接可以访问与海洛因输注配对的取样杆。寻道杆采用可变间隔60加固时间表（VI60）进行编程，而取向杠杆则以固定比率1加固时间表（FR1）进行编程。经过自我管理培训后，对已完成的寻道链接的30%而不是取向杆的延伸，进行了轻度足部冲击。脚击强度每天增加0.1 mA，从0.2 mA增加到1.0 mA。海洛因寻求测试是在食物剥夺（FD）或饱腹条件下24小时后进行的。处于急性食物匮乏状况下的老鼠在惩罚性禁欲后强烈增加海洛因。
Introduction
复发是药物治疗中最具挑战性的问题1，2.然而，只有少数药物治疗被批准用于帮助避免人类复发3。北美目前面临的阿片类药物流行病就是一个突出的例子，它要求考虑对阿片类药物复发的动物模型采取不同的方法。
急性应激已被证明是人类复发的关键触发因素4.通常与药物成瘾相关的一个环境压力源是食物剥夺。吸毒者往往选择分配资源来获取药物而不是食物。热量缺乏已被证明与香烟5 和酒精6 的复发率较高有关。由于伦理和实际问题，在过去的几十年里，动物模型已经发展起来，以促进该领域的研究。在动物模型中，急性食物匮乏已被证明可以有力地恢复灭绝的海洛因寻求7。目前，大多数动物复发模型基于禁欲程序，这些程序要么不能代表人类禁欲（例如，基于灭绝的模型），要么仅包含由于监禁或住院治疗而被迫禁欲的一小部分吸毒者（例如，强制禁欲模型）。吸毒者选择戒毒的主要原因是与寻求毒品和服用8相关的负面后果。惩罚施加的禁欲是一种动物模型，它模仿了与寻求毒品相关的负面后果，对人类自我强加的禁欲。该模型引入了一种厌恶刺激，例如，轻度脚震，寻求或服用药物，导致动物自愿停止服用药物。另一个包含对药物寻求的负面影响的程序是药物戒毒和复发的电屏障冲突模型9。大鼠必须穿过电屏障才能执行与药物自我给药相关的操作行为。该模型被成功地用于证明自愿戒断和复发精神兴奋剂和阿片类药物10，11。然而，在电屏障程序下，寻求药物的努力总是与令人厌恶的事件有关，这与人类状况不同。此外，吸毒本身可能与电击重叠，因为动物再次穿过屏障在输液后返回安全区域。
惩罚规定的禁欲已与其他滥用药物一起使用，如可卡因12，酒精13，甲基苯丙胺14，瑞芬太尼15，但它从未应用于海洛因训练的动物。该模型已被用于研究由启动14 和药物相关线索16诱导的复发，但它没有整合到应激诱导的复发程序中。这里描述的程序用于证明急性食物匮乏诱导的海洛因复发，在雄性大鼠中强制戒酒后寻求惩罚。
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Protocol
所有大鼠都根据加拿大动物护理委员会的指导方针进行治疗。所有实验程序的批准均由康考迪亚大学动物研究伦理委员会批准。
1. 动物
- 获得体重275-300g（雄性）或225-250g（雌性）的长埃文斯大鼠。双家鼠在标准塑料笼子里，玉米棒垫料和碎纸，直到手术。
- 让老鼠保持相反的光暗循环（上午9：30熄灯，晚上9：30点亮）。
- 允许无限制地获取食物和水，但食物剥夺测试期间除外。使用普通的大鼠食物（20.9%的蛋白质，67.2%的碳水化合物和11.8%的脂肪）。
2. 静脉手术
- 建立导管并进行静脉内手术，如Sedki等人201317 中所述，具有以下差异：1）使用异氟烷2-2.5%进行麻醉，2）通过皮下注射将手术期间给予的青霉素剂量更改为60 000 IU / 大鼠，以及3）将用于冲洗导管的肝素和庆大霉素混合物中的庆大霉素的剂量增加到7.5 IU + 800μg;0.2- 0.3毫升
- 在手术后立即（从麻醉中恢复之前）和随后3天腹膜内或皮下注射酮洛芬或卡洛芬，一种抗炎镇痛药（5mg / kg）。在2天的恢复期间，给予捣碎的食物和热量（如有必要）以帮助恢复。每天称重并监督动物，以检查是否有任何突然的体重减轻或任何其他健康问题的迹象。
3. 行为程序
- 操作性调节室：
- 设置操作条件反射室，如Sedki等人201317中所述。
- 习惯日：
- 手术后将大鼠安置在手术室中，并允许动物在开始任何方案之前习惯于室24小时。在整个实验过程中，将动物饲养在手术室中。
- 不要将大鼠连接到金属弹簧上，也不要启动任何实验方案（在习惯化日期间，提示光，音调和杠杆不可用）。
- 海洛因自我管理：
- 将 5 个以上的连接器连接到 Tygon 管和金属弹簧。
- 根据下述程序设置6小时海洛因自我给药（0.1mg / kg /输注）的每日训练课程。
- 在反向光周期的暗阶段开始时（在代表性结果中约为上午9：30），使用寻找杆的延伸（或在前2天使用杠杆，见下文）开始每日训练，以及关闭房灯。
- 在固定比率1（FR1; 2天）下仅提供取样杆进行自我管理
- 对每次试验进行编程，从插入取样杆开始。
- 一旦大鼠按下服用杆一次（FR1），收回服用杆，打开杠杆上方的提示灯并调音20秒超时，关闭家用灯，并允许输送海洛因输注（0.1 mg / kg在0.13 mL中）
- 对30秒的试验间隔进行编程，其中没有提示，室灯关闭，杠杆缩回。在下一次试验开始时，插入取向杆，然后打开室内灯。
- FR1 下使用寻道链进行自我管理（5 天）
- 对操作训练系统进行编程，使其仅插入寻道杆并打开室内灯以指示会话开始。取样杆处于缩回状态。
- 一旦大鼠按下一次（FR1）在寻道杆上，程序就会收回寻道杆并插入取向杆。
- 一键按下取样杆（FR1）即可收回取样杆，并启动与步骤3.3.4.2相同的程序和30秒的试验间隔。
- 对操作训练系统进行编程，在试验间隔结束时插入寻道杆，并打开室内灯以指示下一个试验的开始。
- 对操作训练系统进行编程，如果大鼠未能在10分钟内完成寻道 - 取向链（不按寻道或取样杆），则启动试验间隔，以表示试验结束并失去给药的机会。
- 在可变间隔（VI5、VI30 和 VI60）下使用寻道-取链进行自我管理
- 对第 3.3.5 节中的所有步骤进行编程，但引入 5 （VI5） 的可变间隔作为寻道杆上的新加固时间表，而不是 FR1。允许根据VI5时间表进行为期3天的自我管理培训。
- 将软件设置为允许第一次按下寻道杆以激活VI5时间表。对于VI5计划，让软件从0.1 s，5 s和10 s的列表中随机选择间隔时间，这导致平均间隔为5 s。在选定间隔过后，第一次按下寻道杆，收回寻道杆并伸出取向杆。
- 按照步骤 3.3.4.2、3.3.5.4.、3.3.5.5。用于获取杠杆和试用结束说明。
- 接下来，在VI30计划下训练大鼠5天进行寻找链接，然后在VI60计划下训练3天。
- 对于VI30计划，允许软件从15秒，30秒和45秒的列表中随机选择一个时间，平均为30秒，而对于VI60时间表，软件从45秒，60秒和75秒的列表中随机选择一个时间。
- 根据不同的强化时间表改变试验间隔。在FR1和VI5期间以30秒开始试验间隔，但在VI30和VI60期间逐渐增加到7分钟。
- 惩罚性禁欲
- 通过插入寻找杆并打开家灯来开始惩罚会话。允许8天的惩罚会议，并定期监督，以确保动物不会出现异常疼痛或任何健康问题的迹象。
- 对操作训练系统进行编程，以便在VI60下完成寻道链接后，寻道杆缩回，关闭室内灯，并在已完成的寻道链接的30%上施加轻度脚震，而不是插入取向杆。取样杆延伸到其他70%已完成的寻求链接上，就像在正常的自我管理试验中一样。
- 在插入寻道杆并打开室内灯之前，在关闭所有提示和室内灯的情况下，对试验间隔进行7分钟的间隔，以表示下一次试验的开始。
- 将脚震强度设置为0.2 mA，每个惩罚日增加0.1 mA，直到1.0 mA。
- 在大鼠按下服用杆后（在可用时进行试验），重复步骤3.3.4.2以收回杠杆，提供海洛因输注和呈现线索，然后进行7分钟的试验间隔。
- 通过插入寻道杆并打开室内灯开始下一个试验。
- 如果大鼠10分钟内没有按下任何杠杆，请按照步骤3.3.5.5操作。
- 急性食物匮乏（24小时）
- 在惩罚实施禁欲的最后一天的第二天，将大鼠分成两个匹配的组（根据体重和过去3天自我管理训练的平均寻道杆和输液次数）：食物被剥夺（FD）和Sated。
- 从腔室中取出食物料斗（上午9：30左右），用于接受食物剥夺诱导的复发测试的大鼠，并为可以无限制地获得食物的满足组保留食物料斗。为两组动物提供无限制的水源，并监督动物，以确保它们在食物匮乏期间不会出现任何健康问题。
- 食物匮乏诱发的海洛因寻求检测
- 在食物剥夺24小时后的第二天早上，根据VI60时间表进行3小时海洛因寻找测试，试验间隔为7分钟，没有电击或海洛因输注。在3小时后将食物斗返回给食物匮乏的大鼠。
- 在第一次海洛因寻求测试后的早晨，从第一次复发测试中放置的老鼠的腔室中取出食物料斗。在测试之前和测试期间，允许以前食物匮乏的大鼠无限制地获得食物（饱和状态）。
- 第二天（在24小时食物剥夺后）进行另一次3小时海洛因寻求测试，如步骤3.6.1所示。
- 测试后的第二天使用二氧化碳室对大鼠实施安乐死（100%CO2 ，填充率为每分钟室体积的30-70%）。
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Representative Results
雄性大鼠在训练日内随着强化时间表的增加而显示出寻找杠杆压力的增加，并且在训练日内输注海洛因的可靠，一致（图1）。在惩罚期间，随着8个惩罚日内脚震强度的增加，大鼠减少了寻找杠杆压力和输注的数量（图2）。食物匮乏状况显著增加海洛因在惩罚后强制禁欲（喂养条件：F（1， 7） = 7.12，p = .0.03， d = 1.3; 图 3A）。在喂养条件下，随着时间的推移，对时间或药物寻求没有统计学意义的影响（时间：F（2，14） = 1.029，p = .38;时间 x 进给条件： F（2， 14） = 1.347， p = .29; 图 3B）。
图1：海洛因自我给药（N = 8）。 平均±寻找杆压力机（红色）和输液次数（蓝色）的SEM，在18个训练日内逐渐增加加固计划（FR1，VI5，VI30，VI60）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：惩罚施加的禁欲（N = 8）。 平均±SEM在惩罚日寻求杠杆反应。脚击强度每天增加0.1 mA，从0.2 mA增加到1.0 mA，不包括0.9 mA。插入的图表是惩罚日内输注的平均（±SEM）。 请点击此处查看此图的大图。
图3：食物剥夺诱导的海洛因寻求试验（N = 8） （A）平均±SEM在3小时海洛因寻求试验期间，在食物匮乏和饱腹的条件下寻找杠杆压力，在灭绝条件下，没有脚震惩罚。平衡主体内部设计。* 表示统计显著性差值， p = 0.032。（B） 平均±在海洛因复发试验（1小时段）期间，在食物匮乏（FD）和饱腹条件下寻找杠杆压榨机。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本文有两个重要的演示。首先，使用寻找和获取带有海洛因的链条来验证惩罚强加的禁欲。其次，证明在惩罚实施的禁欲程序中可以观察到压力诱导的复发。这些都是重要的证明，因为（i）惩罚诱导的禁欲程序更接近于人类状况，因为它导致自愿禁欲，即不是由于寻求药物的灭绝或被迫从吸毒环境中移除18，（ii）使用生态相关的压力源证明了可靠的复发：急性食物剥夺压力。
在实施该方案时，必须注意在寻求 - 接受程序下对大鼠进行适当的训练，与使用一个“主动”杠杆的常见连续自我给药相比，该过程更为复杂。此外，惩罚阶段应仔细调整为用于防止不必要的疼痛和“过度惩罚”，这可能导致冻结反应并干扰复发测试。请注意，海洛因的镇痛作用可能会降低对脚震惩罚的反应;然而，在该协议中描述的条件下，发现了强有力的惩罚性戒除海洛因自我管理。该协议的条件旨在尽可能区分海洛因输注和脚震之间的时间（关于惩罚审判）。为了实现这一目标，该方案包括输液试验和足部休克试验之间的长试验间隔（7分钟）。
在研究复发时，在食物匮乏下寻找药物的双峰样分布并非独一无二。它反映了在具有物质使用经验的人类中观察到的个体差异19。这两个独立的亚群可能是未来研究的优势，这些研究旨在确定预测压力诱发复发的个体差异。
与更常见的主动/非主动杠杆程序下的培训相反，其中药物寻求和服用都与同一个活动杠杆相关联，寻药 - 服用链程序允许将与药物寻求和药物服用相关的特定因素作为两组单独的行动进行检查。只有寻求药物才会受到惩罚，从而避免了药物奖励性质的可能贬值20。
这项研究的一个局限性是，与使用FR1的研究相比，VI60时间表下的药物摄入量减少。此外，7分钟的长试验间隔也减少了获得药物的可用时间。今后克服这些限制的一个选择是缩短审判间隔或增加审判时间。该模型的另一个局限性是将身体压力（脚震）与寻求药物配对，而人类吸毒者大多经历心理压力。然而，在程序中设定的惩罚的概率引入下，寻求毒品由于对可能后果的恐惧而减弱，这可能被视为心理压力源。这里描述的协议中的条件设置了一个动机冲突，在惩罚阶段的每次试验中都会经历这种冲突，并且是成瘾21中决策过程的核心。
即使在长时间禁欲22之后，海洛因也可能复发。未来的研究应调查在更长的惩罚实施的禁欲期后暴露于食物剥夺压力的影响。此外，本文的重点是复发的证明，而不是对惩罚反应的个体差异的研究（“抗惩罚”和“惩罚敏感”23）。因此，脚震强度增加到1.0 mA，以保证所有大鼠都达到自愿禁欲。通过将脚震保持在较低强度（例如，0.4 mA）来探索海洛因训练的大鼠个体差异的发展将是很有趣的。
这里提出了一个复发程序，其中由于负面后果而达到自愿禁欲，并且复发是由生态相关的环境压力源引起的。食物匮乏引起的复发是健壮的，很容易复制。该程序将使人们更好地了解自愿戒烟后海洛因复发的机制。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了自然科学与工程委员会发现计划（美国：RGPIN-2016-06694）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anafen Injection 100 mg/mL Vial/50 mL | MERIAL Canada, Inc. | 1938126 | anti-inflammatory drug |
| Balance arm | Coulbourn Instruments | H29-01 | |
| Cannulae (22 G, 5-up) | Plastics One | C313G-5up | |
| Environment connection board & Linc cable | Coulbourn Instruments | H03-04 | |
| Fixed speed infusion pump (3.3 RPM) | Coulbourn Instruments | A73-01-3.3 | |
| GE Marine Silicon | GE | SE-1134 | |
| Graphic State Notation 3 | Coulbourn Instruments | GS3 | Software |
| Habitest universal Linc | Coulbourn Instruments | H02-08 | |
| Heroin HCl | National Institute for Drug Abuse, Research Triangle Park, NC, USA | ||
| House light-Rat | Coulbourn Instruments | H11-01R | |
| Isofluorane USP 99.9% Vial/250 mL | Fresenius Kabi Canada Ltd | 2237518 | |
| Liquid Swivels, Plastic, 22 G | Lomir Biomedical, Inc. | RSP1 | |
| Rat test cage | Coulbourn Instruments | H10-11R-TC | Operant conditioning chambers |
| Retractable lever-Rat | Coulbourn Instruments | H23-17RA | |
| Silastic tubing (ID 0.02, OD 0.037) | Fisher Scientific (Canada) | 1118915A | |
| Single high-bright cue-Rat | Coulbourn Instruments | H11-03R | |
| Sound attenuation boxes | Concordia University | Home made | |
| Stainless steal grid floor | Coulbourn Instruments | H10-11R-TC-SF | |
| System controller 2 | Coulbourn Instruments | SYS CTRL 2 | |
| System power base | Coulbourn Instruments | H01-01 | |
| Tone module 2.9 KHz | Coulbourn Instruments | H12-02R-2.9 | |
| Tygon tubing (ID 0.02, OD 0.060) | VWR | 63018-044 |
References
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