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Biology

परिपक्व वायुमार्ग ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए मानव फेफड़े के ऑर्गेनोइड और समीपस्थ भेदभाव की स्थापना

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63684
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Microbiology, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Centre for Virology, Vaccinology and Therapeutics, Hong Kong Science and Technology Park, 3State Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases, The University of Hong Kong

Summary

प्रोटोकॉल प्राथमिक फेफड़ों के ऊतकों से मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड प्राप्त करने, फेफड़ों के ऑर्गेनोइड का विस्तार करने और 3 डी और 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए समीपस्थ भेदभाव को प्रेरित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है जो मानव वायुमार्ग उपकला को ईमानदारी से फेनोकॉपी करता है।

Abstract

मानव श्वसन उपकला के एक मजबूत इन विट्रो मॉडल की कमी श्वसन प्रणाली के जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान की समझ में बाधा डालती है। हम फेफड़ों के ऊतकों में वयस्क स्टेम कोशिकाओं से मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड प्राप्त करने और परिपक्व वायुमार्ग ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए समीपस्थ भेदभाव को प्रेरित करने के लिए एक परिभाषित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। फेफड़ों के ऑर्गेनोइड को उच्च स्थिरता के साथ 1 वर्ष से अधिक समय तक लगातार विस्तारित किया जाता है, जबकि विभेदित वायुमार्ग ऑर्गेनोइड का उपयोग रूपात्मक और कार्यात्मक रूप से मानव वायुमार्ग उपकला को निकट-शारीरिक स्तर तक अनुकरण करने के लिए किया जाता है। इस प्रकार, हम मानव वायुमार्ग उपकला का एक मजबूत ऑर्गेनोइड मॉडल स्थापित करते हैं। फेफड़ों के ऑर्गेनोइड और विभेदित वायुमार्ग ऑर्गेनोइड का दीर्घकालिक विस्तार एक स्थिर और नवीकरणीय स्रोत उत्पन्न करता है, जिससे वैज्ञानिक संस्कृति व्यंजनों में मानव वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं का पुनर्निर्माण और विस्तार करने में सक्षम होते हैं। मानव फेफड़े ऑर्गेनॉइड प्रणाली वायरस-होस्ट इंटरैक्शन, ड्रग टेस्टिंग और रोग मॉडलिंग का अध्ययन करने सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए एक अद्वितीय और शारीरिक रूप से सक्रिय इन विट्रो मॉडल प्रदान करती है।

Introduction

ऑर्गेनोइड अंग विकास के इन विट्रो मॉडलिंग और जीव विज्ञान और बीमारी का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत और सार्वभौमिक उपकरण बन गए हैं। जब विकास कारक-परिभाषित संस्कृति माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है, तो विभिन्न अंगों से वयस्क स्टेम कोशिकाओं (एएससी) को 3-आयाम (3 डी) में विस्तारित किया जा सकता है और कई सेल प्रकारों से बने अंग जैसे सेलुलर समूहों में स्व-इकट्ठा किया जा सकता है, जिसे ऑर्गेनोइड कहा जाता है। चालाक प्रयोगशाला ने 2009 1,2 में पहले एएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड, मानव आंतों के ऑर्गेनोइड की व्युत्पत्तिकी सूचना दी। इसके बाद, प्रोस्टेट 3,4, यकृत5,6, पेट 7,8,9, अग्न्याशय 10, स्तन ग्रंथि 11 और फेफड़े 12,13 सहित विभिन्न प्रकार के मानव अंगों और ऊतकों के लिए एएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड स्थापित किए गए हैं . इन एएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स ने देशी अंग के महत्वपूर्ण सेलुलर, संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों को बनाए रखा और दीर्घकालिक विस्तार संस्कृति14,15 में आनुवंशिक और फेनोटाइपिक स्थिरता बनाए रखी।

ऑर्गेनोइड्स को प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) से भी प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें भ्रूण स्टेम (ईएस) कोशिकाएं और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (आईपीएस) सेल16 शामिल हैं। जबकि पीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड अपनी स्थापना के लिए अंग विकास के तंत्र का शोषण करते हैं, एएससी को शारीरिक ऊतक आत्म-नवीकरण या ऊतक की मरम्मत के दौरान स्टेम सेल आला की नकल करने वाली स्थितियों के पुनर्निर्माण द्वारा ऑर्गेनोइड बनाने के लिए मजबूर किया जा सकता है। पीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड विकास और ऑर्गेनोजेनेसिस का पता लगाने के लिए अनुकूल मॉडल हैं, हालांकि एएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड के तुलनीय परिपक्वता स्तर तक पहुंचने में असमर्थ हैं। पीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड की भ्रूण जैसी परिपक्वता की स्थिति, और इन ऑर्गेनोइड की स्थापना के लिए जटिलता परिपक्व ऊतकों में जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उनके व्यापक अनुप्रयोगों को काफी हद तक रोकती है।

नाक से टर्मिनल ब्रोंकियोल तक मानव श्वसन पथ, वायुमार्ग उपकला के साथ पंक्तिबद्ध है, जिसे स्यूडोस्ट्रेटिफाइड सिलिएटेड एपिथेलियम भी कहा जाता है, जिसमें चार प्रमुख कोशिका प्रकार होते हैं, अर्थात्, सिलिएटेड सेल, गोबलेट सेल, बेसल सेल और क्लब सेल। हमने चालाक प्रयोगशाला12,13 के सहयोग से मानव फेफड़ों के ऊतकों से एएससी-व्युत्पन्न मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड की स्थापना की। इन फेफड़ों के ऑर्गेनोइड को एक वर्ष से अधिक समय तक विस्तार माध्यम में लगातार विस्तारित किया जाता है; सटीक अवधि विभिन्न दाताओं से प्राप्त विभिन्न ऑर्गेनोइड लाइनों के बीच भिन्न होती है। हालांकि, देशी वायुमार्ग उपकला की तुलना में, ये दीर्घकालिक विस्तार योग्य फेफड़े के ऑर्गेनोइड पर्याप्त परिपक्व नहीं होते हैं क्योंकि मानव वायुमार्ग में प्रमुख कोशिका आबादी सिलिएटेड कोशिकाएं, इन फेफड़ों के ऑर्गेनोइड में कम प्रतिनिधित्व करती हैं। इस प्रकार, हमने एक समीपस्थ भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित किया और 3 डी और 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड उत्पन्न किए जो रूपात्मक और कार्यात्मक रूप से वायुमार्ग उपकला को निकट-शारीरिक स्तर तक फेनोकॉपी करते हैं।

यहां हम प्राथमिक फेफड़ों के ऊतकों से मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड प्राप्त करने के लिए एक वीडियो प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, फेफड़ों के ऑर्गेनोइड का विस्तार करते हैं और 3 डी और 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए समीपस्थ भेदभाव को प्रेरित करते हैं।

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Protocol

अस्पताल प्राधिकरण हांगकांग वेस्ट क्लस्टर (यूडब्ल्यू 13-364 और यूडब्ल्यू 21-695) विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा यहां वर्णित मानव ऊतकों का उपयोग करके सभी प्रयोगों को मंजूरी दी गई थी। ऊतक संग्रह से पहले रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड की व्युत्पत्ति

  1. प्रायोगिक सामग्रियों की तैयारी
    1. एफ 12 माध्यम को 2 एमएम ग्लूटामाइन, 10 एमएम एचईपीईएस, पेनिसिलिन के 100 यू / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / एमएल के साथ पूरक करके बेसल माध्यम तैयार करें।
    2. 10% आर-स्पॉन्डिन 1 वातानुकूलित माध्यम, 10% नोगिन वातानुकूलित माध्यम, 1एक्स बी 27 पूरक, 1.25 एमएम एन-एसिटाइलसिस्टीन, 10 एमएम निकोटिनामाइड, वाई -27632 के 5 μM, A-83-01 के 500 एनएम, एसबी 202190 के 500 एनएम के साथ बेसल माध्यम को पूरक करके मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड विस्तार माध्यम तैयार करें
      नोट: आर-स्पॉन्डिन 1 और नोगिन वातानुकूलित माध्यम को वाणिज्यिक पुनः संयोजक आर-स्पॉन्डिन 1 (500 एनजी / एमएल) और नोगिन (100 एनजी / एमएल) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    3. एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में एक 24 अच्छी तरह से निलंबन संस्कृति प्लेट प्रीवॉर्म करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 और आर्द्र वातावरण के साथ एक मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर का उपयोग करें। एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में तहखाने मैट्रिक्स पिघलना। प्रयोग के दौरान बर्फ पर तहखाने मैट्रिक्स और संस्कृति माध्यम रखें।
  2. 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए मानव फेफड़ों के ऊतकों से सेल अलगाव
    1. विभिन्न बीमारियों के कारण सर्जिकल लकीर से गुजरने वाले रोगियों से लगभग 0.5 सेमी आकार के ताजा मानव फेफड़ों के ऊतकों की खरीद करें। कमरे के तापमान पर बेसल माध्यम के 30 मिलीलीटर में फेफड़ों के ऊतकों को परिवहन करें और जैव सुरक्षा हुड के अंदर जितनी जल्दी हो सके प्रक्रिया करें।
    2. 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान में बाँझ स्केलपेल के साथ छोटे टुकड़ों (0.5-1 मिमी) में कीमा फेफड़ों के ऊतकों। 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में ठंड बेसल माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ ऊतक के टुकड़े धो लें, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें।
    3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 2 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर कोलेजनेज के साथ पूरक बेसल माध्यम के 8 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-40 मिनट के लिए 120 आरपीएम पर ट्यूब हिलाकर ऊतक के टुकड़ों को पचाएं।
    4. एक 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग कर पच ऊतक टुकड़ों कतरनी करने के लिए 20x के लिए ऊपर और नीचे पिपेट। एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब पर एक 100 μm छलनी ढेर और निलंबन फिल्टर।
    5. बेसल माध्यम के साथ छलनी पर ऊतक के टुकड़ों को पुनर्प्राप्त करें और उन्हें 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें, इसके बाद कतरनी और फ़िल्टरिंग का दूसरा दौर हो। अतिरिक्त कतरनी-फ़िल्टरिंग को अधिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1x-2x किया जा सकता है, खासकर जब ऊतक का एक छोटा टुकड़ा (जैसे, <0.5 सेमी) खरीदा जाता है।
    6. पाचन को समाप्त करने के लिए 2% की अंतिम एकाग्रता के साथ प्रवाह-थ्रू में एफबीएस जोड़ें, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें।
    7. बेसल माध्यम के 10 मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    8. (वैकल्पिक) यदि गोली में कई एरिथ्रोसाइट्स देखे जाते हैं (गोली के रंग से अनुमानित), तो लाल रक्त कोशिका लिसिस बफर के 2 मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। फिर, ट्यूब में बेसल माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    9. ठंडे तहखाने मैट्रिक्स में गोली को फिर से निलंबित करें और बर्फ पर रखें। 0.5 सेमी के आसपास आकार के फेफड़ों के ऊतकों से बरामद कोशिकाओं के लिए तहखाने मैट्रिक्स के 80-160 μL जोड़ें; मात्रा 2-4 बूंदों को बीज करने के लिए पर्याप्त है।
    10. एक पूर्व गर्म 24 अच्छी तरह से निलंबन संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए निलंबन के 40 μL वितरण। 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेट सेते हैं। तहखाने मैट्रिक्स को एक छोटी बूंद बनाने के लिए जमने दें।
    11. प्रत्येक कुएं में हेरेगुलिन बीटा -1 के 5 एनएम के साथ पूरक मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड विस्तार माध्यम के 500 μL जोड़ें और एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेट सेते हैं।
    12. हर 3 दिनों में माध्यम को ताज़ा करें। बूंद को बरकरार रखते हुए पुराने माध्यम को हटा दें और सावधानी के साथ ताजा माध्यम जोड़ें। 10-14 दिनों के लिए इनक्यूबेशन के बाद ऑर्गेनोइड को पारित करें। पहले मार्ग से पहले केवल प्रारंभिक संस्कृति में हियरगुलिन बीटा -1 का उपयोग करें।
    13. यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऑर्गेनोइड बहुत अधिक सेल घनत्व के साथ एम्बेडेड नहीं हैं, माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड का निरीक्षण करें। यदि एक बूंद अत्यधिक उच्च सेल घनत्व के कारण विघटित हो जाती है, तो कम और वांछनीय सेल घनत्व के साथ अधिक बूंदें बनाने के लिए तहखाने मैट्रिक्स की उच्च मात्रा के साथ ऑर्गेनोइड और कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त और फिर से एम्बेड करें।

2. मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड का विस्तार

  1. एक लौ पर एक पाश्चर पिपेट की नोक को जलाकर एक पाश्चर पिपेट तैयार करें, जैसे कि बन्सन बर्नर, 1.5 मिमी से लगभग 1.0 मिमी व्यास तक उद्घाटन को संकीर्ण करने के लिए। विंदुक को ठंडा करें, इसके बाद निष्फल करने के लिए आटोक्लेविंग करें। यांत्रिक कतरनी के दौरान सेल लगाव और नुकसान से बचने के लिए बेसल माध्यम के साथ पिपेट गीला।
  2. यांत्रिक कतरनी के साथ फेफड़े के ऑर्गेनोइड मार्ग
    1. ऊपर प्राप्त बूंदों को तोड़ने के लिए 1 एमएल टिप और पिपेट का उपयोग करें। फिर, मध्यम के साथ ऑर्गेनोइड को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और ठंडे बेसल माध्यम के साथ वॉल्यूम को 10 एमएल में समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सतह पर तैरनेवाला त्यागें
    2. ऑर्गेनोइड को एक बार फिर 10 एमएल ठंडे बेसल माध्यम से धो लें। ठंड बेसल माध्यम के 2 मिलीलीटर में ऑर्गेनोइड को फिर से निलंबित करें। एक पाश्चर पिपेट के साथ छोटे टुकड़ों में ऑर्गेनोइड कतरनी करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट।
    3. 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए बेसल माध्यम के साथ पूरक, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद। 1: 3 से 1: 5 विस्तार को सक्षम करने के लिए पर्याप्त ठंडे तहखाने मैट्रिक्स के साथ ऑर्गेनोइड टुकड़ों को फिर से निलंबित करें। बर्फ पर रखो।
    4. एक पूर्व गर्म 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में ऑर्गेनोइड निलंबन के 40 μL रखें। 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेट सेते हैं। तहखाने मैट्रिक्स को जमने दें।
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से फेफड़ों के ऑर्गेनोइड विस्तार माध्यम के 500 μL जोड़ें और एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में सेते हैं। हर 3 दिनों में माध्यम को ताज़ा करें। 1: 3 से 1: 5 के अनुपात के साथ हर 2 सप्ताह में ऑर्गेनोइड पारित करें।
  3. ट्रिप्सिनाइजेशन के साथ फेफड़ों के ऑर्गेनोइड मार्ग
    नोट: ट्रिप्सिनाइजेशन को प्राथमिकता दी जाती है जब पाश्चर पिपेट का उपयोग करके फेफड़ों के ऑर्गेनोइड को छोटे टुकड़ों में कतरनी करना मुश्किल होता है, या ऑर्गेनोइड का आकार अत्यधिक परिवर्तनशील होता है, या बाद के प्रयोगों को अधिक समान आकार के ऑर्गेनोइड की आवश्यकता होती है।
    1. चरण 2.2.1 में दिखाए गए अनुसार फेफड़ों के ऑर्गेनोइड की कटाई करें। पृथक्करण एंजाइम के 1 मिलीलीटर में ऑर्गेनोइड को फिर से निलंबित करें और 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं।
    2. ट्यूब में बेसल माध्यम के 1 एमएल जोड़ें। पाश्चर पिपेट का उपयोग करके ऑर्गेनोइड को ऊपर और नीचे छोटे टुकड़ों में पाइप करके ऑर्गेनोइड को यंत्रवत् रूप से कतरनी करें। 4x आवर्धन पर एक माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड टुकड़ों के आकार की जाँच करें। फिर, पाचन को समाप्त करने के लिए एफबीएस के 40 μL जोड़ें।
      नोट: प्रयोगात्मक व्यवस्था के अनुसार माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड टुकड़ों का आकार निर्धारित करें। यदि किसी प्रयोग को अधिक समान आकार के अधिक ऑर्गेनोइड या ऑर्गेनोइड की आवश्यकता होती है, तो छोटे टुकड़ों या यहां तक कि एकल कोशिकाओं में कतरनी ऑर्गेनोइड। फिर, ऑर्गेनोइड प्रयोग के लिए तैयार होने से पहले, शायद 3 सप्ताह का समय लगता है।
    3. 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा के लिए बेसल माध्यम के साथ शीर्ष, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद। 1: 5-1: 10 के अनुपात के साथ पारित करने के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ ठंडे तहखाने मैट्रिक्स में ऑर्गेनोइड टुकड़ों को फिर से निलंबित करें। बर्फ पर रखो।
    4. एक पूर्व गर्म 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में ऑर्गेनोइड निलंबन के 40 μL रखें। 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेट सेते हैं। तहखाने मैट्रिक्स को जमने दें।
    5. अच्छी तरह से प्रति फेफड़ों के ऑर्गेनोइड विस्तार माध्यम के 500 μL के साथ पूरक और एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में सेते हैं। विस्तार माध्यम को हर 3 दिनों में ताज़ा करें। 2-3 सप्ताह के बाद ऑर्गेनोइड को पारित करें।
      नोट: तहखाने मैट्रिक्स के 40 μL छोटी बूंद के भीतर लगभग 100 ऑर्गेनोइड घुड़सवार हैं। फेफड़ों के ऑर्गेनोइड आमतौर पर अपेक्षाकृत उच्च कोशिका घनत्व के साथ बेहतर बढ़ते हैं। कम सेल घनत्व के साथ ऑर्गेनोइड को फिर से एम्बेड करें यदि बूंदें विघटित हो जाती हैं या अत्यधिक उच्च कोशिका घनत्व के कारण बढ़ते ऑर्गेनोइड एक साथ जुड़ जाते हैं।

3. परिपक्व वायुमार्ग ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए समीपस्थ भेदभाव

  1. 1x एयर लिक्विड इंटरफ़ेस सप्लीमेंट, 1x एयर लिक्विड इंटरफ़ेस रखरखाव पूरक, हेपरिन के 4 μg /एमएल, हाइड्रोकार्टिसोन के 1 μM, Y-27632 के 10 μM, और डीएपीटी के 10 μM के साथ एयर लिक्विड इंटरफ़ेस बेसल माध्यम को पूरक करके समीपस्थ भेदभाव माध्यम (पीडी माध्यम) तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. 3 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड
    1. यांत्रिक कतरनी के माध्यम से पारित होने के बाद 7-10 दिनों के लिए विस्तार माध्यम में फेफड़ों के ऑर्गेनोइड सेते हैं। पीडी माध्यम के साथ विस्तार माध्यम को बदलें। एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 14 दिनों के लिए पीडी माध्यम में ऑर्गेनोइड सेते हैं।
    2. प्रत्येक कुएं में पीडी माध्यम को त्यागें। आरएनए निष्कर्षण और आरटी-क्यूपीसीआर परख द्वारा सेलुलर जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए विभेदित वायुमार्ग ऑर्गेनोइड की कटाई के लिए सेल लाइसेट बफर जोड़ें।
    3. वैकल्पिक रूप से, 10 एमएम ईडीटीए के अलावा 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऑर्गेनोइड सेते हैं ताकि ऑर्गेनोइड को एकल कोशिकाओं में अलग किया जा सके, इसके बाद सेल आबादी की जांच करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण किया जा सके। ऑर्गेनोइड विभिन्न प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए तैयार हैं।
  3. 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड
    1. 2 डी भेदभाव संस्कृति के लिए पर्याप्त 3 डी फेफड़ों के ऑर्गेनोइड तैयार करें। क्रमशः 24-अच्छी तरह से पारगम्य समर्थनडालने और 12-अच्छी तरह से पारगम्य समर्थन डालने के लिए कुल 1.3 x 105 और 4.5 x 10 5 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है।
    2. 3 डी फेफड़ों के ऑर्गेनोइड 2 सप्ताह के लिए विस्तार माध्यम में बढ़ने के बाद, 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए 24-अच्छी तरह से और 12-अच्छी तरह से आवेषण में ऑर्गेनोइड को एकल कोशिकाओं और बीज में पचाएं।
    3. एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रात भर बेसल माध्यम के साथ आवेषण पूर्व सेते हैं। क्रमशः 24-अच्छी प्लेट के ऊपर और नीचे कक्ष में बेसल माध्यम के 250 μL और 500 μL जोड़ें। 12-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, क्रमशः ऊपर और नीचे कक्ष में बेसल माध्यम के 500 μL और 1,000 μL जोड़ें।
    4. चरण 2.2.1 में वर्णित के रूप में हार्वेस्ट 3 डी फेफड़े के ऑर्गेनोइड। पृथक्करण एंजाइम के 1 एमएल के साथ ऑर्गेनोइड को फिर से निलंबित करें और 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं।
    5. ट्यूब में बेसल माध्यम के 1 एमएल जोड़ें। एक पाश्चर पिपेट के साथ एकल कोशिकाओं में ऑर्गेनोइड को कतरनी करने और माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करने के लिए ऊपर और नीचे पाइप करें। फिर, पाचन को समाप्त करने के लिए एफबीएस के 40 μL जोड़ें।
    6. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 40 μm छलनी के माध्यम से कोशिकाओं फ़िल्टर। फ़िल्टर किए गए सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए बेसल माध्यम के साथ ऊपर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद।
    7. बूंदों में सेल घनत्व के आधार पर फेफड़ों के ऑर्गेनोइड विस्तार माध्यम के 1-2.5 एमएल में 24 बूंदों (40 μL) से एकत्र गोली को फिर से निलंबित करें। एक माइक्रोस्कोप के तहत एक सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। एमएल (24-अच्छी तरह से आवेषण के लिए) या 9 x10 5/एमएल (12-अच्छी तरह से आवेषण के लिए) के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें।
    8. ऊपर और नीचे कक्षों से बेसल माध्यम निकालें। क्रमशः 24-अच्छी तरह से डालने और 12-अच्छी तरह से डालने के निचले कक्ष में विस्तार माध्यम के 500 μL और 1,000 μL जोड़ें। बीज 100 μL और सेल निलंबन के 500 μL चरण 3.3.7 में 24 अच्छी तरह से डालने और 12 अच्छी तरह से डालने के शीर्ष कक्ष पर तैयार, क्रमशः।
    9. 2 दिनों के लिए एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में सेते हैं। प्लेटों के एपिकल और निचले कक्ष दोनों में पीडी माध्यम के साथ विस्तार माध्यम को बदलें। 14 दिनों के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में ऑर्गेनोइड सेते हैं और हर 3 दिनों में पीडी माध्यम को ताज़ा करते हैं।
      नोट: मोबाइल सिलिया पीडी माध्यम में इनक्यूबेशन के बाद दिन 7 से माइक्रोस्कोप के तहत 3 डी और 2 डी ऑर्गेनोइड में दिखाई देते हैं। पीडी माध्यम में भेदभाव संस्कृति के 14 दिनों के बाद, वायुमार्ग ऑर्गेनोइड विभिन्न प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए परिपक्व होते हैं।
    10. 17 में वर्णित मानक प्रोटोकॉल के अनुसार विद्युत प्रतिरोध माप प्रणाली का उपयोग करके हर दूसरे दिन ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) को मापें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल एक उच्च सफलता दर के साथ मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड की व्युत्पत्ति को सक्षम बनाता है। ताजा मानव फेफड़ों के ऊतकों को छोटे टुकड़ों में कीमा बनाया जाता है, और फिर कोलेजनेज के साथ विघटित किया जाता है। परिणामी एकल कोशिकाओं को तहखाने मैट्रिक्स में एम्बेडेड किया जाता है और उपकला स्टेम कोशिकाओं (चरण 1.1.2) के प्रकोप के लिए आला कारकों के कॉकटेल के साथ पूरक फेफड़ों के ऑर्गेनोइड विस्तार माध्यम में ऊष्मायन किया जाता है। चित्रा 1 कम विकास कारक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स टाइप 2 (बीएमई) में एम्बेडेड ताजा पृथक फेफड़ों की कोशिकाओं के माइक्रोफोटोग्राफ से पता चलता है; चित्रा 1 ए, बाएं)। सिस्टिक ऑर्गेनोइड समय के साथ दिखाई देते हैं और बढ़ते हैं (चित्रा 1 ए, दाएं)। इस बीच, असंबंधित कोशिकाएं धीरे-धीरे कोशिका मृत्यु से गुजरती हैं। फाइब्रोब्लास्ट पहले या दूसरे मार्ग के दौरान संस्कृति में मौजूद होते हैं। इसके बाद, संस्कृति में विशेष रूप से उपकला ऑर्गेनोइड होते हैं, जो प्राथमिक फेफड़ों के ऊतकों में मौजूद उपकला स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त फेफड़ों के ऑर्गेनोइड होते हैं। इन फेफड़ों के ऑर्गेनोइड को 1: 3 से 1: 5 के अनुपात में यांत्रिक कतरनी द्वारा या 1: 5 से 1: 10 (चरण 2.2-2.3) के अनुपात में ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा हर 2-3 सप्ताह में पारित किया जाता है। चौथे मार्ग के बाद फेफड़ों के ऑर्गेनोइड के प्रतिनिधि माइक्रोफोटोग्राफ चित्रा 1 बी में दिखाए गए हैं। यांत्रिक कतरनी के बाद, बीएमई में एम्बेडेड ऑर्गेनोइड टुकड़े कुछ घंटों के भीतर सिस्टिक डोमेन बनाते हैं (चित्रा 1 बी, बाएं)। दिन 5 (चित्रा 1 बी, दाएं) पर एक ही क्षेत्र का एक माइक्रोफोटोग्राफ समय के साथ बढ़ते ऑर्गेनोइड दिखाता है। ये विस्तारित मानव फेफड़े के ऑर्गेनोइड सभी चार प्रमुख वायुमार्ग उपकला कोशिका प्रकारों को बंद कर देते हैं, जिनमें एसीसीटीयूबी + या फॉक्सजे 1 + सिलिएटेड सेल, पी 63 + बेसल सेल, सीसी 10 + क्लब सेल और एमयूसी 5 एसी + गॉबलेट सेल18 (चित्रा 1 सी) शामिल हैं। विशेष रूप से, इन मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड को 1 वर्ष से अधिक समय तक लगातार और स्थिर रूप से पारित किया जा सकता है। जब तहखाने मैट्रिक्स के भीतर बनाए रखा जाता है, तो फेफड़ों के ऑर्गेनोइड एक एपिकल-इन ध्रुवीयता दिखाने की सबसे अधिक संभावना रखते हैं, 2% -3% से कम फेफड़ों के ऑर्गेनोइड एक एपिकल-आउट ध्रुवीयता13 दिखाते हैं। नतीजतन, सेल एपेक्स आसानी से सुलभ नहीं होते हैं जब तक कि 3 डी ऑर्गेनोइड खुले न हों।

हालांकि, देशी मानव वायुमार्ग उपकला की तुलना में, ये दीर्घकालिक विस्तार योग्य फेफड़े के ऑर्गेनोइड पर्याप्त रूप से परिपक्व नहीं हैं क्योंकि देशी मानव वायुमार्ग उपकला, सिलिएटेड सेल में प्रमुख कोशिका आबादी फेफड़ों के ऑर्गेनोइड में कम प्रतिनिधित्व करती है। फिर हमने मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड की परिपक्वता स्थिति में सुधार के लिए एक समीपस्थ भेदभाव (पीडी) माध्यम को परिभाषित किया। विस्तार माध्यम में ऊष्मायन किए गए ऑर्गेनोइड और पीडी माध्यम ने समय के साथ अलग-अलग आकृति विज्ञान विकसित किया (चित्रा 2 ए)। विस्तार माध्यम की तुलना में पीडी माध्यम में ऑर्गेनोइड में मोटाइल सिलिया अधिक प्रचुर मात्रा में थे। पीडी माध्यम में भेदभाव संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद, मोटाइल सिलिया हर एक ऑर्गेनोइड (चित्रा 2 बी और पूरक वीडियो 1) में दिखाई देता है। दिलचस्प बात यह है कि पिटाई सिलिया सेल मलबे और ऑर्गेनोइड लुमेन के अंदर उत्सर्जित म्यूसिन को यूनिडायरेक्शनली घूमने के लिए चलाती है, जो साँस के कणों को हटाने के लिए म्यूकोसिलरी एस्केलेटर को पर्याप्त रूप से दोहराती है (पूरक वीडियो 1), मानव वायुमार्ग का एक महत्वपूर्ण आत्म-समाशोधन तंत्र। हम प्रदर्शित करते हैं कि मूल फेफड़ों के ऑर्गेनोइड की तुलना में विभेदित ऑर्गेनोइड में सिलिएटेड कोशिकाएं नाटकीय रूप से लगभग 50% तक बढ़ गईं। चार प्रकार की उपकला कोशिकाओं के प्रतिशत का आकलन करने के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड का विश्लेषण किया गया था। संक्षेप में, ऑर्गेनोइड को 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 10 एमएम ईडीटीए के साथ अलग किया गया था, 4% पीएफए के साथ तय किया गया था, और 0.1% सर्फेक्टेंट के साथ पारगम्य किया गया था। इसके बाद, कोशिकाओं को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें) 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने के बाद। नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक एफएसीएस प्रणाली का उपयोग किया गया था। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण ने विभेदित ऑर्गेनोइड का प्रदर्शन किया जिसमें चार वायुमार्ग उपकला सेल प्रकार (चित्रा 2 सी) को समायोजित किया गया है। इसलिए, हमने वायुमार्ग ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक समीपस्थ भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित किया है जो मानव वायुमार्ग उपकला को निकट-शारीरिक स्तर पर ईमानदारी से अनुकरण कर सकता है।

ऑर्गेनोइड एपिकल सतह को आसानी से सुलभ बनाने और श्वसन रोगजनकों के लिए मानव वायुमार्ग उपकला जोखिम को बेहतर ढंग से मॉडल करने के लिए सक्षम करने के लिए, हमने वायुमार्ग ऑर्गेनोइड के 2 डी मोनोलेयर उत्पन्न किए। भेदभाव संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद, 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड ने एक बरकरार उपकला बाधा (चित्रा 3 ए, बी) विकसित की। हमने 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड में गठित उपकला बाधा की अखंडता का आकलन करने के लिए एक डेक्सट्रान रुकावट परख भी की। ट्रांसवेल आवेषण में संस्कृति के बाद 10 वें दिन, फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट-डेक्सट्रान (मेगावाट 10,000) को शीर्ष कक्ष के माध्यम में जोड़ा गया था और 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। ऊपर और नीचे कक्षों में मीडिया एक प्रतिदीप्ति परख के लिए काटा गया था। डेक्सट्रान रुकावट सूचकांक शीर्ष कक्ष में माध्यम की प्रतिदीप्ति तीव्रता को संदर्भित करता है बनाम नीचे कक्ष (चित्रा 3 बी) में। इन 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड में प्रचुर मात्रा में सिलिएटेड कोशिकाएं (चित्रा 3 सी) भी होती हैं। सिलिएटेड कोशिकाओं को एंटी-β-ट्यूबुलिन चतुर्थ एंटीबॉडी (एसीसीटीयूबी) और बकरी एंटी-माउस 488 माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा लेबल किया गया था। कॉन्फोकल छवियों को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था। डीएपीआई के लिए लेजर 405 एनएम, एसीसीटीयूबी के लिए 488 एनएम और फालोइडिन के लिए 633/640 एनएम का उपयोग करके मल्टी-चैनल छवियों का अधिग्रहण किया गया था। इमेजिंग मापदंडों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोगकर्ता मैनुअल के अनुसार समायोजित किया गया था। संक्षेप में, पिनहोल आकार 1 एयू पर सेट किया गया था, मास्टर लाभ 1.0 के डिजिटल लाभ के साथ 650 वी से 750 वी पर सेट किया गया था, और लेजर पावर को 0.2% से 5% की सीमा के भीतर प्रत्येक चैनल के लिए समायोजित किया गया था। प्रदान किए गए विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण किया गया था।

मानव श्वसन पथ दो अलग-अलग प्रकार के उपकलाओं के साथ पंक्तिबद्ध है, अर्थात्, वायुमार्ग उपकला और वायुकोशीय उपकला। पूर्व नाक गुहा से टर्मिनल ब्रोंकियोल तक वायुमार्ग को रेखांकित करता है और इसमें चार प्रमुख प्रकार के उपकला कोशिका होते हैं, अर्थात्, सिलिएटेड सेल, गोबलेट सेल, क्लब सेल और बेसल सेल। इसके अलावा, समीपस्थ और डिस्टल वायुमार्ग को अस्तर करने वाला वायुमार्ग उपकला समीपस्थ-डिस्टल अक्ष के साथ एक चर सेलुलर संरचना दिखाता है। समीपस्थ वायुमार्ग उपकला छद्म स्तरीकृत है, जिसमें प्रचुर मात्रा में सिलिएटेड कोशिकाएं और बलगम-स्रावित गोबलेट कोशिकाएं शामिल हैं; जबकि डिस्टल वायुमार्ग उपकला घनाभ सिलिएटेड और क्लब कोशिकाओं की एक एकल परत है जिसमें कम बेसल और गोबलेट कोशिकाएं19 होती हैं। फेफड़ों के ऑर्गेनोइड प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानव फेफड़ों के ऊतकों को उन रोगियों से खरीदा गया है जिन्होंने विभिन्न बीमारियों के कारण सर्जिकल रिसेक्शन किया था। हम ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए रोगग्रस्त ऊतकों से सटे सामान्य फेफड़ों के ऊतकों का उपयोग करते हैं। इन फेफड़ों के ऊतकों में आमतौर पर वायुकोशीय थैली से घिरे चर आकार के ब्रोंकिओल्स होते हैं। प्रारंभिक संस्कृति के दौरान, फेफड़ों के ऊतकों में वायुमार्ग उपकला स्टेम कोशिकाएं या वायुमार्ग पूर्वज कोशिकाएं विस्तार माध्यम में आला कारकों के कारण जीवित रहती हैं और फैलती हैं। विस्तार माध्यम एक अपरिपक्व अवस्था की ओर ऑर्गेनोइड को निर्देशित करके फेफड़ों के ऑर्गेनोइड के प्रारंभिक व्युत्पत्ति और दीर्घकालिक विस्तार को सक्षम बनाता है, जबकि वायुमार्ग भेदभाव प्रोटोकॉल देशी वायुमार्ग उपकला को रूपात्मक और कार्यात्मक रूप से उत्पन्न करता है। मॉडल प्रणाली, जिसमें व्युत्पन्न, विस्तार और फेफड़ों के ऑर्गेनोइड के भेदभाव शामिल हैं, चित्रा 4 में उल्लिखित है। समीपस्थ और डिस्टल वायुमार्ग उपकला में सेलुलर संरचना भी चित्रा 4 में सचित्र है।

Figure 1
चित्रा 1: मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड की व्युत्पत्ति, विस्तार और लक्षण वर्णन (ए) एक प्रतिनिधि माइक्रोफोटोग्राफ दिन 0 (बाएं) पर फेफड़ों के ऊतकों से अलगाव के बाद तहखाने मैट्रिक्स में एम्बेडेड एकल कोशिकाओं को दिखाता है। 5 वें दिन, सिस्टिक ऑर्गेनोइड बढ़ रहे हैं (दाएं)। स्केल बार 0.5 मिमी है (बी) चौथे मार्ग के दिन और पारित होने के बाद दिन 5 पर फेफड़ों के ऑर्गेनोइड का एक प्रतिनिधि माइक्रोफोटोग्राफ। स्केल बार 0.5 मिमी है। पी 1 और पी 4 पहले और चौथे मार्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं। छवियों को 10x आवर्धन पर लिया गया था। (सी) मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड में चार वायुमार्ग उपकला कोशिका प्रकारों की कॉन्फोकल छवियां। वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के चार वंश फेफड़ों के ऑर्गेनोइड में मौजूद हैं, जिनमें एसीसीयूबी + और फॉक्सजे 1 + सिलिएटेड कोशिकाएं, पी 63 + बेसल कोशिकाएं, सीसी 10 + क्लब कोशिकाएं और एमयूसी 5 एसी + गोबलेट कोशिकाएं शामिल हैं। नाभिक और सेलुलर एक्टिन फिलामेंट्स क्रमशः डीएपीआई (नीले) और फालोइडिन -647 (बैंगनी) के साथ काउंटरस्टेन किए जाते हैं। स्केल बार 10 μm है। यह आंकड़ा13 से अपनाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड का समीपस्थ भेदभाव(ए) मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड को पीडी माध्यम या विस्तार (एक्सपी) माध्यम में 16 दिनों के लिए समानांतर में सुसंस्कृत किया गया था। संकेतित दिनों में ऑर्गेनोइड के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोफोटोग्राफ दिखाए जाते हैं। स्केल बार 0.4 मिमी है (बी) विभेदित वायुमार्ग ऑर्गेनोइड में सिलिया दिखाया गया है (काला तीर)। (सी) पीडी माध्यम (शीर्ष) और विस्तार माध्यम (नीचे) में ऊष्मायन किए गए ऑर्गेनोइड में व्यक्तिगत सेल प्रकारों का प्रतिशत जैसा कि एफएसीएस विश्लेषण द्वारा पता लगाया गया है। एक ऑर्गेनोइड लाइन के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम दिखाए जाते हैं। प्रयोग तीन अलग-अलग ऑर्गेनोइड लाइनों में किया गया था। यह आंकड़ा13 से अपनाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: 2 डी विभेदित वायुमार्ग ऑर्गेनोइड की पीढ़ी। (ए) ट्रांस-एपिथेलियल इलेक्ट्रॉनिक प्रतिरोध (टीईईआर) पीडी माध्यम में इनक्यूबेशन के बाद संकेतित दिन में मापा गया था। डेटा 10 आवेषण में 2 डी मोनोलेयर के मानक विचलन (एसडी) के ± मतलब दिखाता है। (बी) पारगम्य समर्थन प्लेटों में संस्कृति के बाद 10 दिन, फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट-डेक्सट्रान जोड़ा गया था और ऊपर और नीचे के कक्षों में मीडिया को 4 घंटे के बाद प्रतिदीप्ति परख के लिए काटा गया था। डेक्सट्रान रुकावट सूचकांक शीर्ष कक्ष में माध्यम की प्रतिदीप्ति तीव्रता को संदर्भित करता है जो नीचे के कक्ष में होता है। हमारे प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले पारगम्य समर्थन आवेषण का व्यास 0.4 μm है। किसी भी कोशिकाओं को बोने के बिना, डेक्सट्रान स्वतंत्र रूप से सामान्य 2 डी आवेषण में प्रवेश कर सकता है। इस प्रकार, एक सामान्य 2 डी (रिक्त के साथ लेबल की गई पट्टी) का डेक्सट्रान रुकावट सूचकांक 1 होना चाहिए। डेटा 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड (2 डी ऑर्गेनोइड) और दो रिक्त आवेषण (रिक्त) के साथ वरीयता प्राप्त 10 आवेषण के औसत ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड में प्रचुर मात्रा में एसीसीटीयूबी + सिलिएटेड कोशिकाओं (हरे) की कॉन्फोकल छवियां। सेलुलर एक्टिन फिलामेंट्स को फालोइडिन -647 (बैंगनी) के साथ काउंटरस्टेन किया जाता है। स्केल बार 20 μm है। यह आंकड़ा13 से अपनाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड की व्युत्पत्ति, विस्तार और भेदभाव का योजनाबद्ध चित्रण। मानव फेफड़ों के ऊतकों से पृथक एकल कोशिकाएं सीधे तहखाने मैट्रिक्स में एम्बेडेड होती हैं और फेफड़ों के ऑर्गेनोइड विस्तार माध्यम में ऊष्मायन करती हैं। व्युत्पन्न मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड को उच्च स्थिरता के साथ दीर्घकालिक विस्तारित किया जा सकता है और क्रायोप्रिजर्व्ड स्टॉक से आसानी से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। भेदभाव पर, उत्पन्न वायुमार्ग ऑर्गेनोइड मानव वायुमार्ग उपकला का ईमानदारी से अनुकरण कर सकते हैं। विभिन्न प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए 2 डी और 3 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड विकसित किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो 1. तुल्यकालिक रूप से पिटाई सिलिया सेल मलबे को विभेदित वायुमार्ग ऑर्गेनोइड में यूनिडायरेक्शनल रूप से घूमने के लिए ड्राइव करती है13. इस वीडियो को13 से अपनाया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मानव वायुमार्ग वायुमार्ग उपकला के साथ पंक्तिबद्ध हैं, जिसे स्यूडोस्ट्रेटिफाइड सिलिएटेड एपिथेलियम के रूप में भी जाना जाता है। ऊपरी वायुमार्ग उपकला के प्रमुख कोशिका प्रकार सिलिएटेड कोशिकाएं हैं जो वायुमार्ग से बलगम और साँस के कणों को निष्कासित करने के लिए अपने एपिकल सिलिया के समन्वित आंदोलन को सक्षम करती हैं, गोबलेट कोशिकाएं जो बलगम का उत्पादन और स्राव करती हैं, और बेसल कोशिकाएं जो तहखाने की झिल्ली को लाइन करती हैं और पुनर्जनन में फंस जाती हैं। ब्रोंकिओल्स जैसे छोटे वायुमार्ग में, घनाभ वायुमार्ग उपकला में स्रावी क्लब कोशिकाएं और ऊपरी वायुमार्ग क्षेत्रों की तुलना में कम सिलिएटेड कोशिकाएं होती हैं। हम मानव फेफड़ों के ऊतकों में उपकला स्टेम कोशिकाओं से मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड प्राप्त करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इन मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड को विस्तार माध्यम में बनाए रखा जाता है और उच्च स्थिरता के साथ 1 वर्ष से अधिक समय तक लगातार पारित किया जाता है। विस्तार माध्यम में प्रमुख विकास कारकों में आर-स्पॉन्डिन, एक डब्ल्यूएनटी एगोनिस्ट20 शामिल हैं; और नोगिन, जो बीएमपी सिग्नलिंग21 का अवरोधक है, साथ ही एफजीएफ 7 और एफजीएफ 10 भी है। पूर्व अध्ययनों से श्वसन उपकला22,23,24 के होमोस्टैसिस में डब्ल्यूएनटी, एफजीएफ और बीएमपी सिग्नलिंग की एक महत्वपूर्ण भूमिका का पता चला है। विस्तार माध्यम एक अपरिपक्व अवस्था की ओर ऑर्गेनोइड को निर्देशित करके फेफड़ों के ऑर्गेनोइड के प्रारंभिक व्युत्पत्ति और दीर्घकालिक विस्तार को सक्षम बनाता है। हम आगे 3 डी और 2 डी वायुमार्ग ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक समीपस्थ भेदभाव विधि विकसित करते हैं, जो चार प्रमुख वायुमार्ग सेल प्रकारों को समायोजित करते हैं और मानव वायुमार्ग उपकला को निकट-शारीरिक स्तर पर अनुकरण करते हैं। प्रारंभिक व्युत्पत्ति, दीर्घकालिक विस्तार और समीपस्थ भेदभाव सहित पूरी प्रक्रिया के दौरान, न तो थकाऊ सेल शुद्धिकरण और न ही फीडर और स्ट्रोमल कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, हम मानव वायुमार्ग उपकला का एक ऑर्गेनोइड मॉडल स्थापित करते हैं। संस्कृति, विस्तार संस्कृति और भेदभाव संस्कृति के दो चरण पारस्परिक रूप से अनन्य हैं। फेफड़े के ऑर्गेनोइड दीर्घकालिक विस्तार के लिए एक स्थिर स्रोत प्रदान करते हैं, जबकि विभेदित वायुमार्ग ऑर्गेनोइड ईमानदारी से मानव वायुमार्ग उपकला को फेनोकॉपी करते हैं। ये ऑर्गेनोइड इमेजिंग, आरएनए अनुक्रमण, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण, आनुवंशिक संपादन, आदि सहित विभिन्न प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए उत्तरदायी हैं।

फेफड़ों के ऑर्गेनोइड प्राप्त करने के लिए उच्च दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, विस्तार माध्यम को सटीक और सावधानीपूर्वक पुनर्गठित किया जाना चाहिए, जो प्रोटोकॉल द्वारा सक्षम उच्च स्थापना दर के लिए आवश्यक है। इस ऑर्गेनोइड मॉडल की एक प्रमुख सीमा शुद्ध उपकला संरचना, स्ट्रोमल कोशिकाओं की कमी और मानव श्वसन श्लेष्म में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं, जिससे वायुमार्ग ऑर्गेनोइड कुछ हद तक देशी वायुमार्ग उपकला से विचलित हो सकते हैं। इस प्रकार, हम अपने वर्तमान ऑर्गेनोइड मॉडल में प्रतिरक्षा कोशिकाओं और अन्य जैविक रूप से प्रासंगिक घटकों को शामिल करके श्वसन ऑर्गेनोइड की अगली पीढ़ी उत्पन्न करने का प्रयास करते हैं।

वायुमार्ग ऑर्गेनोइड हमने देशी मानव श्वसन उपकला की बहु-सेलुलर संरचना और कार्यक्षमता को निकट-शारीरिक स्तर तक ईमानदारी से अनुकरण किया है, जो किसी भी समरूप सेल लाइनों में असंभव है। हमारे ऑर्गेनोइड मॉडल वैज्ञानिकों को संस्कृति प्लेटों में देशी मानव वायुमार्ग उपकला का पुनर्निर्माण और स्थिर रूप से विस्तार करने में सक्षम बनाते हैं। ये वायुमार्ग ऑर्गेनोइड मानव वायुमार्ग के जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक सार्वभौमिक उपकरण हैं। अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली प्राथमिक वायुमार्ग उपकला कोशिकाएं सीमित प्रतिकृति क्षमता के कारण विस्तार योग्य नहीं हैं और शायद ही एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और आसानी से सुलभ अनुसंधान उपकरण के रूप में काम करती हैं।

मानव श्वसन ऑर्गेनोइड सहित ऑर्गेनोइड ने सार्स-सीओवी-2 28,29,30,31,32,33,34 सहित मानव रोगजनकों के अध्ययन के लिए अपनी विशिष्टता और ताकत का खुलासा किया है। एक सार्वभौमिक और शारीरिक-सक्रिय उपकरण के रूप में, मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड का व्यापक रूप से मानव श्वसन पथ के जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

जेजेड, सीएल, और एमसीसी को वायुमार्ग ऑर्गेनोइड के पेटेंट पर आविष्कारकों के रूप में सूचीबद्ध किया गया है (प्रकाशन संख्या: यूएस -2021-0207081-ए 1)। अन्य लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम कन्फोकल इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री में सहायता के लिए सेंटर ऑफ पैनोरोमिक साइंसेज एंड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप यूनिट, ली का शिंग फैकल्टी ऑफ मेडिसिन, हांगकांग विश्वविद्यालय का शुक्रिया अदा करते हैं। इस काम को आंशिक रूप से खाद्य और स्वास्थ्य ब्यूरो के स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान कोष (एचएमआरएफ, 17161272 और 19180392) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था; अनुसंधान अनुदान परिषद के सामान्य अनुसंधान कोष (जीआरएफ, 17105420); और Health@InnoHK, नवाचार और प्रौद्योगिकी आयोग, हांगकांग विशेष प्रशासनिक क्षेत्र की सरकार।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents for lung organoid culture
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634010 -
A8301 Tocris 2939 500nM
B27 supplement Invitrogen 17504-044 1x
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) Trevigen 3533-010-0 70-80%
FGF-10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF-7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMAX (glutamine) Invitrogen 35050061 1x
HEPES 1M Invitrogen 15630-056 10 mM
Heregulin β-1 Peprotech 100-03 5 nM
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165 1.25 mM
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 10 mM
Noggin (conditional medium) home made - 10x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Invitrogen 15140-122 1x
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
Rspondin1 (conditional medium) home made - 10x
SB202190 Sigma-Aldrich S7067 1 µM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM
Proximal differentiation medium
DAPT Tocris 2634 10 µM
Heparin Solution StemCell Technology 7980 4 µg/mL
Hydrocortisone Stock Solution StemCell Technology 7925 1 µM
PneumaCult-ALI 10X Supplement air liquid interface supplement
PneumaCult-ALI Basal Medium StemCell Technology 05001 air liquid interface basal medium
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement air liquid interface maintenance supplement
Y-27632 Tocris 1254 10 µM
Equipment
Biological safety cabinet Baker 1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 or 800 Zeiss confocal microscope
CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 42093483
Stereo-microscope Olympus Corporation CKX31SF
Centrifuge Eppendorf 5418BG040397
Serological pipettor Eppendorf
Micropipette Eppendorf
ZEN black or ZEN blue software Zeiss analysis software
Consumables
12mm Trans-well StemCell Technology #38023
12-well cell culture plate Cellstar 665970
15- and 50 ml conical tubes Thermo Fisher Scientific L6BF5Z8118
24-well cell culture plate Cellstar 662160
6.5mm Trans-well StemCell Technology #38024
Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm Sigma-Aldrich SLGPR33RB
Microfuge tubes Eppendorf
Micropipette tips Thermo Fisher Scientific TFLR140-200-Q21190531
Pasteur pipette glass Thermo Fisher Scientific 22-378893
Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) Thermo Fisher Scientific BA08003, 08004, 08005
Antibodies
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 Invitrogen A11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A11034
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 Invitrogen A11037
Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 Invitrogen A11007
Mouse Anti-Cytokeratin 5 Abcam ab128190
Mouse Anti-FOX J1 Invitrogen 14-9965-82
Mouse Anti-Mucin 5AC Abcam ab3649
Mouse Anti-β-tubulin 4 Sigma T7941
Rabbit Anti-p63 Abcam ab124762
Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 R&D Systems MAB4218-SP
Other reagent
TrypLE Select Enzyme (10X) Thermo Fisher Scientific A1217701 dissociation enzyme

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References

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जीव विज्ञान अंक 181
परिपक्व वायुमार्ग ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए मानव फेफड़े के ऑर्गेनोइड और समीपस्थ भेदभाव की स्थापना
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Li, C., Chiu, M. C., Yu, Y., Liu, X., Xiao, D., Huang, J., Wan, Z., Zhou, J. Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids. J. Vis. Exp. (181), e63684, doi:10.3791/63684 (2022).

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