Summary
הפרוטוקול מציג שיטה להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מרקמות ריאה ראשוניות, הרחבת האורגנואידים של הריאה וגרימת התמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה, המנצלים בנאמנות את אפיתל דרכי הנשימה האנושיות.
Abstract
היעדר מודל חוץ גופי חזק של אפיתל הנשימה האנושי מעכב את הבנת הביולוגיה והפתולוגיה של מערכת הנשימה. אנו מתארים פרוטוקול מוגדר להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מתאי גזע בוגרים ברקמת הריאה ולגרום להתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה. האורגנואידים של הריאה מורחבים ברציפות במשך למעלה משנה עם יציבות גבוהה, בעוד שהאורגנואידים המובחנים של דרכי הנשימה משמשים כדי לדמות באופן מורפולוגי ותפקודי אפיתל דרכי הנשימה האנושי לרמה כמעט פיזיולוגית. לפיכך, אנו יוצרים מודל אורגנואידי חזק של אפיתל דרכי הנשימה האנושיות. ההתרחבות ארוכת הטווח של אורגנואידים של ריאה ואורגנואידים מובחנות של דרכי הנשימה מייצרת מקור יציב ומתחדש, ומאפשרת למדענים לשחזר ולהרחיב את תאי האפיתל של דרכי הנשימה האנושיות במנות תרבית. מערכת האורגנואידים של הריאה האנושית מספקת מודל ייחודי ופעיל מבחינה פיזיולוגית במבחנה עבור יישומים שונים, כולל חקר אינטראקציה בין נגיף למארח, בדיקות תרופות ומידול מחלות.
Introduction
אורגנואידים הפכו לכלי חזק ואוניברסלי למידול חוץ גופי של התפתחות איברים ולחקר ביולוגיה ומחלות. כאשר מתרבים בתרבית במדיום תרבית המוגדר על ידי גורם גדילה, תאי גזע בוגרים (ASC) ממגוון איברים ניתנים להרחבה בתלת-ממד (3D) ולהרכיב את עצמם לאשכולות תאיים דמויי איברים המורכבים מסוגי תאים מרובים, המכונים אורגנואידים. המעבדה של Clevers דיווחה על הנגזרת של האורגנואיד הראשון שמקורו ב-ASC, אורגנואיד מעיים אנושי, בשנת 2009 1,2. לאחר מכן, אורגנואידים שמקורם ב-ASC הוקמו עבור מגוון של איברים ורקמות אנושיות, כולל ערמונית 3,4, כבד 5,6, קיבה 7,8,9, לבלב10, בלוטת החלב11 וריאה 12,13 . אורגנואידים אלה שמקורם ב-ASC שמרו על התכונות התאית, המבנית והתפקודית הקריטיות של האיבר המקומי ושמרו על יציבות גנטית ופנוטיפית בתרבית ההתפשטות ארוכת הטווח14,15.
אורגנואידים יכולים גם להיגזר מתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC), כולל תאי גזע עובריים (ES) ותאי גזע פלוריפוטנטי מושרים (iPS)16. בעוד שאורגנואידים שמקורם ב-PSC מנצלים את מנגנוני התפתחות האיברים לצורך הקמתם, ניתן לכפות ASCs ליצור אורגנואידים על ידי בנייה מחדש של תנאים המחקים את נישת תאי הגזע במהלך חידוש עצמי של רקמות פיזיולוגיות או תיקון רקמות. אורגנואידים שמקורם ב-PSC הם מודלים נוחים לחקר ההתפתחות והאורגנוגנזה, אם כי אינם מסוגלים להגיע לרמת ההבשלה הדומה של אורגנואידים שמקורם ב-ASC. מצב ההבשלה דמוי העובר של אורגנואידים שמקורם ב-PSC, והמורכבות לביסוס אורגנואידים אלה מונעים באופן משמעותי את היישומים הרחבים שלהם לחקר ביולוגיה ופתולוגיה ברקמות בוגרות.
מערכת הנשימה האנושית, מהאף ועד הסימפונות הטרמינליים, מרופדת באפיתל דרכי הנשימה, המכונה גם אפיתל הציליאתי המדומה, המורכב מארבעה סוגי תאים עיקריים, כלומר תאים סיליים, תא גביע, תא בסיס ותא מועדון. הקמנו את אורגנואיד הריאה האנושית שמקורו ב-ASC מרקמות ריאה אנושיות בשיתוף עם המעבדה של Clevers12,13. אורגנואידים ריאה אלה מורחבים ברציפות במדיום ההתפשטות במשך למעלה משנה; משך הזמן המדויק משתנה בין קווים אורגנואידים שונים המתקבלים מתורמים שונים. עם זאת, בהשוואה לאפיתל הטבעי של דרכי הנשימה, אורגנואידי ריאה אלה הניתנים להרחבה ארוכת טווח אינם בוגרים מספיק מכיוון שתאים ציליאנטים, אוכלוסיית התאים העיקרית בדרכי הנשימה האנושיות, סובלים מתת-ייצוג באורגנואידים של ריאה אלה. לפיכך, פיתחנו פרוטוקול התמיינות פרוקסימלית ויצרנו אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה, אשר מבחינה מורפולוגית ותפקודית פנוסקופיה של אפיתל דרכי הנשימה לרמה כמעט פיזיולוגית.
כאן אנו מספקים פרוטוקול וידאו להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מרקמות הריאה הראשוניות, הרחבת האורגנואידים של הריאה וגרימת התמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים באמצעות רקמות אנושיות המתוארות כאן אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת הונג קונג / רשות בתי החולים של הונג קונג אשכול מערב הונג קונג (UW13-364 ו- UW21-695). הסכמה מדעת התקבלה מחולים לפני איסוף הרקמות.
1. גזירת אורגנואיד ריאה אנושית
- הכנת חומרים ניסיוניים
- הכן מדיום בסיסי על ידי תוספת למדיום DMEM/F12 מתקדם עם 2 mM גלוטמין, 10 mM HEPES, 100 U /mL של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין.
- הכן את מדיום התפשטות האורגנואידים של הריאה האנושית על ידי השלמת מדיום בסיסי עם 10% R-spondin 1 בינוני מותנה, 10% בינוני מותנה נוג'ין, תוסף B27 1x, 1.25 mM N-אצטילציסטאין, 10 mM ניקוטינמיד, 5 מיקרומטר של Y-27632, 500 ננומטר של A-83-01, 1 μM של SB202190, 5 ng/mL של גורם גדילה פיברובליסטי (FGF)-7, 20 ננוגרם/מ"ל של FGF-10, ו-100 מיקרוגרם/מ"ל של פרימוצין (ראו טבלת חומרים).
הערה: ניתן להחליף את המדיום המותנה R-spondin 1 ו-Noggin ב-R-spondin 1 (500 ng/mL) ונוג'ין (100 ng/mL) מסחריים מסוג R-spondin 1 (500 ng/mL) ו-Noggin (100 ng/mL). - יש לחמם מראש צלחת תרבית של 24 בארות בחממת תרביות תאים. השתמש בחממת תרביות תאים סטנדרטית עם 5% CO2 ואטמוספרה לחה בטמפרטורה של 37 °C (76 °F). להפשיר מטריצת מרתף במקרר של 4 מעלות צלזיוס. שמור את מטריצת המרתף ואת מדיום התרבות על הקרח במהלך הניסויים.
- בידוד תאים מרקמות ריאה אנושיות לתרבית אורגנואידית תלת-ממדית
- רכשו רקמות ריאה אנושיות שזה עתה נכרתו בגודל של כ-0.5 ס"מ מחולים שעברו כריתה כירורגית עקב מחלות שונות. להעביר את רקמות הריאה ב-30 מ"ל של מדיום בסיסי בטמפרטורת החדר ולעבד במהירות האפשרית בתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגית.
- רקמות ריאה טחונות לחתיכות קטנות (0.5-1 מ"מ) עם אזמל סטרילי בצלחת תרבית תאים של 10 ס"מ. לשטוף חתיכות טישו עם 10 מ"ל של בינוני בסיסי קר בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל, ואחריו צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (66 °F).
- יש להשליך את הסופרנטנט ולהחזיר את הכדור ל-8 מ"ל של מדיום בסיסי בתוספת קולגן בריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל. לעכל את חתיכות הרקמה על ידי ניעור הצינור ב 120 סל"ד במשך 30-40 דקות ב 37 °C (64 °F).
- פיפט למעלה ולמטה במשך 20x כדי לגזוז את חתיכות הרקמות המעוכלות באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. יש לערום מסננת של 100 מיקרומטר על צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ולסנן את המתלים.
- משחזרים פיסות רקמה על המסננת עם המדיום הבסיסי ומעבירים אותן לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ולאחר מכן לסיבוב שני של גזירה וסינון. ניתן לבצע סינון גזירה נוסף פי 1x-2 כדי לבודד תאים נוספים, במיוחד כאשר נרכשת פיסת רקמה קטנה (למשל, <0.5 ס"מ).
- הוסף FBS לזרימה-דרך עם ריכוז סופי של 2% כדי לסיים את העיכול, ואחריו צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (66 °F).
- בצעו החייאה של כדור התא ב-10 מ"ל של תווך בסיסי, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט.
- (אופציונלי) אם אריתרוציטים רבים נראים בכדור (מוערך על ידי צבע הכדור), החייאת כדור התא ב 2 מ"ל של חיץ תסיסה של תאי דם אדומים ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף 10 מ"ל של תווך בסיסי לצינור, ואחריו צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט.
- בצעו החייאה של הכדור במטריצת מרתף קרה והמשיכו על הקרח. הוסף 80-160 μL של מטריצת מרתף עבור תאים שהתאוששו מרקמת ריאה בגודל של כ -0.5 ס"מ; הכמות מספיקה כדי לזרוע 2-4 טיפות.
- מחלקים 40 μL של מתלים לכל באר של לוחית תרחיף המתלים המחוממת מראש של 24 בארות. הדגירה של צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. תן למטריצת המרתף להתמצק וליצור טיפה.
- מוסיפים 500 μL של אורגנואידים של אורגנואידים של ריאה אנושית למדיום הרחבה בתוספת 5 ננומטר של הרגלולין בטא-1 לכל באר ומדגרים את הצלחת בחממת תרביות תאים.
- רענן את המדיום כל 3 ימים. הסר את המדיום הישן תוך שמירה על שלמות הטיפות והוסף מדיום רענן בזהירות. מעבירים את האורגנואידים לאחר הדגירה במשך 10-14 יום. השתמש ב- Heregulin beta-1 רק בתרבות הראשונית לפני הקטע הראשון.
- התבונן באורגנואידים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהאורגנואידים אינם משובצים בצפיפות תאים גבוהה מאוד. אם טיפה מתפוררת עקב צפיפות תאים גבוהה מדי, שחזרו והטמיעו מחדש את האורגנואידים והתאים עם נפח גבוה יותר של מטריצת מרתף כדי ליצור יותר טיפות עם צפיפות תאים נמוכה ורצויה יותר.
2. הרחבת האורגנואידים של הריאה האנושית
- הכינו פיפטת פסטר על ידי שריפת קצה פיפטת פסטר על להבה, כגון מבער בונזן, כדי לצמצם את הפתח מ-1.5 מ"מ לכ-1.0 מ"מ קוטר. מקררים את הפיפטות, ואחריהם את האוטוקלבינג כדי לעקר. הרטיבו את הפיפטות עם המדיום הבסיסי כדי למנוע חיבור ואובדן של תאים במהלך גזירה מכנית.
- אורגנואידים של ריאות עוברים עם גזירה מכנית
- השתמש בקצה של 1 מ"ל ובצינור למעלה ולמטה כדי לשבור את הטיפות שהתקבלו לעיל. לאחר מכן, העבירו את האורגנואידים יחד עם המדיום לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל והתאימו את הנפח ל-10 מ"ל עם תווך בסיסי קר. השליכו את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
- לשטוף את האורגנואידים עם 10 מ"ל של בינוני בסיסי קר שוב. החייאת האורגנואידים ב -2 מ"ל של תווך בסיסי קר. פיפט למעלה ולמטה כדי לגזוז את האורגנואידים לחתיכות קטנות עם פיפטת פסטר.
- תוספת עם בינוני בסיסי לנפח כולל של 10 מ"ל, ואחריו צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. החיזרו את שברי האורגנואידים עם מטריצת מרתף קרה מספיקה כדי לאפשר הרחבה של 1:3 עד 1:5. תמשיכו לקרח.
- הניחו 40 μL של תרחיף אורגנואידי בכל באר של צלחת מחוממת מראש של 24 בארות. הדגירה של צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. תנו למטריצת המרתף להתמצק.
- מוסיפים 500 μL של מדיום התפשטות אורגנואידי ריאה לכל באר ומדגרים בחממת תרביות תאים. רענן את המדיום כל 3 ימים. מעבירים את האורגנואידים כל שבועיים ביחס של 1:3 ל-1:5.
- אורגנואידים של ריאה עוברים עם טריפסיניזציה
הערה: טריפסיניזציה עדיפה כאשר קשה לגזוז את האורגנואיד של הריאה לחתיכות קטנות באמצעות פיפטת פסטר, או שגודל האורגנואידים משתנה מאוד, או שהניסויים הבאים דורשים אורגנואידים בגודל אחיד יותר.- קציר את האורגנואידים של הריאה כפי שמוצג בשלב 2.2.1. החייאת האורגנואיד ב-1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה ודגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של מדיום בסיסי לצינור. גזירה את האורגנואידים באופן מכני על ידי צנרת האורגנואידים למעלה ולמטה לחתיכות קטנות באמצעות פיפטת פסטר. בדוק את גודלם של חתיכות אורגנואידיות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 4. לאחר מכן, הוסף 40 μL של FBS כדי לסיים את העיכול.
הערה: קבע את גודל השברים האורגנואידים מתחת למיקרוסקופ בהתאם לסידור הניסוי. אם ניסוי זקוק ליותר אורגנואידים או אורגנואידים בגודל אחיד יותר, גוזזים אורגנואידים לחתיכות קטנות יותר או אפילו לתאים בודדים. לאחר מכן, לוקח זמן רב יותר, כנראה 3 שבועות, עד שהאורגנואידים מוכנים לניסויים. - מלא עם בינוני בסיסי לנפח סופי של 10 מ"ל, ואחריו צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (74 °F). החייאת החלקים האורגנואידיים במטריצת מרתף קרה עם נפח מספיק כדי לעבור ביחס של 1:5-1:10. תמשיכו לקרח.
- הניחו 40 μL של תרחיף אורגנואידי בכל באר של צלחת מחוממת מראש של 24 בארות. הדגירה של צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. תנו למטריצת המרתף להתמצק.
- יש להשלים עם 500 μL של מדיום התפשטות אורגנואידים של ריאה לכל באר ודגירה בחממת תרביות תאים. רענן את מדיום ההרחבה כל 3 ימים. מעבירים את האורגנואידים לאחר 2-3 שבועות.
הערה: כ-100 אורגנואידים מותקנים בתוך טיפה של 40 μL של מטריצת מרתף. האורגנואידים של הריאות גדלים בדרך כלל טוב יותר עם צפיפות תאים גבוהה יחסית. הטבעה מחדש של האורגנואידים עם צפיפות תאים נמוכה יותר אם הטיפות מתפרקות או שהאורגנואידים הגדלים מתחברים זה לזה בשל צפיפות התאים הגבוהה מדי.
3. התמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה
- הכן מדיום התמיינות פרוקסימלית (מדיום PD) על ידי השלמת הממשק הנוזלי באוויר עם תוסף ממשק נוזלי אוויר 1x, תוסף תחזוקת ממשק נוזלי אוויר 1x, 4 מיקרוגרם/מ"ל של הפרין, 1 μM של הידרוקורטיזון, 10 μM של Y-27632, ו-10 μM של DAPT (ראה טבלת חומרים).
- אורגנואידים תלת-ממדיים של דרכי הנשימה
- הדגירה של אורגנואידים של הריאות במדיום ההתפשטות למשך 7-10 ימים לאחר המעבר באמצעות גזירה מכנית. החלף את מדיום ההרחבה במדיום PD. דגירה של האורגנואידים במדיום PD במשך 14 יום בחממת תרביות תאים.
- יש להשליך את מדיום ה-PD בכל באר. הוסיפו חיץ ליזאט תאי כדי לקצור את האורגנואיד המובחן של דרכי הנשימה לצורך מיצוי RNA וזיהוי ביטוי גנים תאיים על ידי בדיקת RT-qPCR.
- לחלופין, הדגירה של האורגנואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לאחר הוספת 10 mM EDTA כדי לנתק את האורגנואידים לתאים בודדים, ולאחר מכן ניתוח ציטומטריה של זרימה כדי לבחון את אוכלוסיות התאים. האורגנואידים מוכנים למניפולציות ניסיוניות שונות.
- אורגנואיד דו-ממדי של דרכי הנשימה
- הכינו מספיק אורגנואידים של ריאה תלת-ממדית לתרבית התמיינות דו-ממדית. בסך הכל נדרשים 1.3 x 105 ו- 4.5 x 105 תאים עבור תוספת תמיכה חדירה של 24 בארות ותוספת תמיכה חדירה של 12 בארות, בהתאמה.
- לאחר שהאורגנואידים של הריאה התלת-ממדית גדלים במדיום ההתפשטות במשך שבועיים, מעכלים את האורגנואידים לתאים בודדים וזורעים לתוך ה-24-בארות וה-12-בארות כדי ליצור אורגנואידים דו-ממדיים של דרכי הנשימה.
- קדם הדגירה של התוספות עם המדיום הבסיסי למשך הלילה בחממת תרביות תאים. הוסף 250 μL ו- 500 μL של תווך בסיסי בתא העליון והתחתון של לוח 24 בארות, בהתאמה. עבור צלחת של 12 בארות, הוסף 500 μL ו- 1,000 μL של תווך בסיסי בתא העליון והתחתון, בהתאמה.
- קציר אורגנואידים של ריאה תלת-ממדית כמתואר בשלב 2.2.1. החייאת האורגנואידים עם 1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה ודגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של מדיום בסיסי לצינור. פיפט למעלה ולמטה כדי לגזוז את האורגנואידים לתאים בודדים עם צינור פסטר ולבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, הוסף 40 μL של FBS כדי לסיים את העיכול.
- סנן את התאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. העבר את תרחיף התא המסונן לצינור של 15 מ"ל. השלם עם בינוני בסיסי לנפח כולל של 10 מ"ל, ואחריו צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- החייאת הכדור, שנאסף מ-24 טיפות (40 μL), ב-1-2.5 מ"ל של מדיום התפשטות האורגנואידים של הריאה, בהתאם לצפיפות התאים בטיפות. ספרו את מספר התאים עם מונה תאים מתחת למיקרוסקופ. התאם את ריכוז התא ל- 1.3 x 106/מ"ל (עבור תוספות של 24 בארות) או 9 x 105/מ"ל (עבור תוספות של 12 בארות).
- הסר את המדיום הבסיסי מהתאים העליונים והתחתונים. הוסף 500 μL ו- 1,000 μL של מדיום הרחבה בתא התחתון של התוספת של 24 בארות ותוספת 12 בארות, בהתאמה. זרעים 100 μL ו-500 μL של תרחיף התא שהוכנו בשלב 3.3.7 על התא האפיקלי של התוספת של 24 בארות וההוספה של 12 בארות, בהתאמה.
- דגירה בחממת תרביות תאים למשך יומיים. החלף את מדיום ההרחבה במדיום PD הן בתא האפיקלי והן בתא התחתון של הלוחות. דגירה של האורגנואידים בחממת תרביות תאים למשך 14 יום ורענן את מדיום הפרקינסון כל 3 ימים.
הערה: ניתן להבחין בריסונים ניידים באורגנואידים התלת-ממדיים והדו-ממדיים תחת מיקרוסקופ מהיום ה-7 לאחר הדגירה במדיום ה-PD. לאחר 14 יום של תרבית התמיינות במדיום PD, האורגנואידים של דרכי הנשימה בוגרים למניפולציות ניסיוניות שונות. - מדוד את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית (TEER) אחת ביומיים באמצעות מערכת למדידת התנגדות חשמלית, בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי שתוארב-17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מאפשר נגזרת של אורגנואידים של ריאה אנושית עם שיעור הצלחה גבוה. רקמת ריאה אנושית טרייה טחונה לחתיכות קטנות, ולאחר מכן מתפרקת עם קולגן. התאים הבודדים המתקבלים מוטמעים במטריצת המרתף ומודגרים במדיום התפשטות האורגנואידים של הריאה בתוספת קוקטייל של גורמי נישה לצמיחת תאי גזע אפיתליאליים (שלב 1.1.2). איור 1 מראה את המיקרו-צילום של תאי ריאה שזה עתה בודדו, המוטמעים במטריצת ממברנת מרתף של גורם גדילה מופחת מסוג 2 (BME; איור 1A, משמאל). אורגנואידים ציסטיים מופיעים ומתרחבים עם הזמן (איור 1A, מימין). בינתיים, התאים שאינם קשורים עוברים מוות תאי בהדרגה. פיברובלסטים נמצאים בתרבות במהלך הקטע הראשון או השני. לאחר מכן, התרבית מכילה אורגנואידים אפיתליאליים באופן בלעדי, שהם אורגנואידים של ריאות שמקורם בתאי גזע אפיתליאליים הנמצאים ברקמות הריאה הראשוניות. אורגנואידים ריאתיים אלה מועברים כל 2-3 שבועות על ידי גזירה מכנית ביחס של 1:3 עד 1:5 או על ידי טריפסיניזציה ביחס של 1:5 עד 1:10 (שלבים 2.2-2.3). המיקרו-צילומים המייצגים של אורגנואידים של ריאה לאחר הקטע הרביעי מוצגים באיור 1B. לאחר גזירה מכנית, השברים האורגנואידים המוטבעים ב-BME יוצרים תחומים ציסטיים תוך מספר שעות (איור 1B, משמאל). מיקרו-צילום של אותו שדה ביום 5 (איור 1B, מימין) מראה אורגנואידים גדלים עם הזמן. האורגנואידים המתרחבים האלה של הריאה האנושית מכילים את כל ארבעת סוגי תאי האפיתל העיקריים של דרכי הנשימה, כולל תאי ACCTUB+ או FOXJ1+, תאי בסיס P63+, תא מועדון CC10+ ותאי גביע MUC5AC+18 (איור 1C), במצב מוקדם מדי. יש לציין כי אורגנואידים אלה של הריאות האנושיות ניתנים למעבר רציף וביציבות במשך למעלה משנה. כאשר הם נשמרים בתוך מטריצת המרתף, האורגנואידים של הריאה הם בעלי הסבירות הגבוהה ביותר להראות קוטביות אפית-ב- , פחות מ-2%-3% מהאורגנואידים של הריאה מראים קוטביות אפיקלית-אאוט13. כתוצאה מכך, עליות התאים אינן נגישות בקלות, אלא אם כן האורגנואידים התלת-ממדיים פתוחים.
עם זאת, בהשוואה לאפיתל דרכי הנשימה האנושיות המקומיות, אורגנואידי ריאה אלה הניתנים להרחבה ארוכת טווח אינם בוגרים מספיק מכיוון שאוכלוסיית התאים הדומיננטית באפיתל דרכי הנשימה האנושית המקומית, תא תתי-ייצוג, סובלת מתת-ייצוג באורגנואיד הריאה. לאחר מכן הגדרנו מדיום דיפרנציאציה פרוקסימלית (PD) כדי לשפר את מצב ההבשלה של אורגנואידים של ריאה אנושית. האורגנואידים שהודגרו במדיום ההתפשטות ובמדיום PD פיתחו מורפולוגיה מובחנת לאורך זמן (איור 2A). ריסונים תנועתיים היו נפוצים יותר באורגנואידים במדיום PD מאשר אלה שבמדיום ההתפשטות. לאחר שבועיים של תרבית הבחנה במדיום PD, ניתן להבחין בריסונים תנועתיים בכל אורגנואיד (איור 2B וסרטון משלים 1). באופן מעניין, הריסונים הפועמים מניעים את פסולת התאים ואת המוצין המופרש בתוך לומן האורגנואידי כדי לסובב באופן חד-כיווני, מה שמשחזר כראוי את המדרגות הנעות הריריות כדי להסיר את החלקיקים השאפויים (סרטון משלים 1), מנגנון חשוב לניקוי עצמי של דרכי הנשימה האנושיות. אנו מדגימים כי התאים הציליים גדלו באופן דרמטי לכ-50% באורגנואידים הממוינים בהשוואה לאורגנואידים המקוריים של הריאה. כדי להעריך את האחוזים של ארבעה סוגים של תאי אפיתל, האורגנואידים הדו-ממדיים של דרכי הנשימה נותחו על ידי ציטומטריה של זרימה. בקצרה, האורגנואידים נותקו עם 10 mM EDTA במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, קבוע עם 4% PFA, ו permeabilized עם 0.1% פעילי שטח. לאחר מכן, התאים דוגרו עם נוגדנים ראשוניים (ראו טבלת חומרים) במשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הוכתמו בנוגדנים משניים. מערכת FACS שימשה לניתוח הדגימות. ניתוח ציטומטריה של זרימה הדגים אורגנואידים מובחנים המתאימים לארבעה סוגי תאי אפיתל של דרכי הנשימה (איור 2C). לכן, פיתחנו פרוטוקול התמיינות פרוקסימלית כדי ליצור אורגנואידים של דרכי הנשימה שיכולים לדמות בנאמנות את אפיתל דרכי הנשימה האנושיות לרמה כמעט פיזיולוגית.
כדי לאפשר למשטח האפיקלי האורגנואידי להיות נגיש בקלות ולדגום טוב יותר את החשיפה לאפיתל של דרכי הנשימה האנושיות לפתוגנים נשימתיים, יצרנו מונו-שכבות דו-ממדיות של אורגנואידים של דרכי הנשימה. לאחר שבועיים של תרבית התמיינות, אורגנואידים דו-ממדיים של דרכי הנשימה פיתחו מחסום אפיתל שלם (איור 3A,B). ביצענו גם בדיקת חסימה של דקסטרן כדי להעריך את שלמות מחסום האפיתל שנוצר באורגנואידים דו-ממדיים של דרכי הנשימה. ביום ה-10 לאחר התרבית בהכנסות טרנסוול, פלואורסצין איזותיוציאנט-דקסטרן (MW 10,000) נוסף במדיום של החדר העליון ודגגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. המדיה בתאים העליונים והתחתונים נקטפה לצורך בדיקת פלואורסצנציה. מדד החסימה של דקסטרן מתייחס לעוצמת הפלואורסצנציה של המדיום בתא העליון לעומת זו שבתא התחתון (איור 3B). האורגנואידים הדו-ממדיים האלה של דרכי הנשימה מכילים גם תאים מצומדים בשפע (איור 3C). התאים הציליים סומנו על ידי נוגדן אנטי-β-טובולין IV (ACCTUB) ונוגדן משני נגד עכבר עזים 488. תמונות קונפוקליות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. תמונות רב-ערוציות נרכשו באמצעות לייזרים 405 ננומטר עבור DAPI, 488 ננומטר עבור ACCTUB ו-633/640 ננומטר עבור פלואידין. פרמטרי ההדמיה הותאמו על פי מדריך המשתמש של המיקרוסקופ הקונפוקלי. בקצרה, גודל חור הפין נקבע על 1 AU, הרווח הראשי נקבע על 650 V עד 750 V עם רווח דיגיטלי של 1.0, ואת כוח הלייזר הותאם עבור כל ערוץ בטווח של 0.2% עד 5%. עיבוד התמונה בוצע באמצעות תוכנת הניתוח שסופקה.
דרכי הנשימה האנושיות מרופדות בשני סוגים שונים של אפיתל, כלומר אפיתל דרכי הנשימה ואפיתל נאדי. הראשון קו את דרכי הנשימה מחלל האף לסמפונות הטרמינליים ומורכב מארבעה סוגים עיקריים של תאי אפיתל, כלומר תא סילאי, תא גביע, תא מועדון ותא בסיס. בנוסף, אפיתל דרכי הנשימה המרפד את דרכי הנשימה הפרוקסימליות והדיסטליות מראה הרכב תאי משתנה לאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי. אפיתל דרכי הנשימה הפרוקסימליות הוא פסאודו-סטראטרציה, המורכב משפע של תאים סיליים ותאי גביע מפרישי ריר; ואילו אפיתל דרכי הנשימה הדיסטליות הוא שכבה אחת של תאי ציד קובידליים ותאי מועדון עם פחות תאי בסיס וגביע19. רקמות ריאה אנושיות המשמשות להפקת אורגנואידים של ריאה נרכשו מחולים שעברו כריתה כירורגית עקב מחלות שונות. אנו משתמשים ברקמות ריאה רגילות הסמוכות לרקמות החולות לתרבית אורגנואידית. רקמות ריאה אלה מכילות בדרך כלל ברונכיוליות בגודל משתנה המוקפות בשקיות נאדיות. במהלך התרבית הראשונית, תאי גזע אפיתליאליים של דרכי הנשימה או תאי אב של דרכי הנשימה ברקמות הריאה שורדים ומתרבים בשל גורמי הנישה במדיום ההתפשטות. מדיום ההתפשטות מאפשר נגזרת ראשונית והתפשטות ארוכת טווח של אורגנואידים של הריאה על ידי הפניית האורגנואידים למצב לא בשל, בעוד שפרוטוקול התמיינות דרכי הנשימה יוצר פנוגרפיות של אורגנואידים של דרכי הנשימה הטבעיות באופן מורפולוגי ותפקודי. מערכת המודל, הכוללת נגזרת, הרחבה והבחנה של אורגנואידים של ריאה, מתוארת באיור 4. ההרכב התאי באפיתל דרכי הנשימה הפרוקסימלי והדיסטלי מודגם גם באיור 4.
איור 1: גזירה, הרחבה ואפיון של אורגנואידים של ריאות אנושיות. ביום החמישי גדלים האורגנואידים הציסטיים (מימין). סרגל קנה המידה הוא 0.5 מ"מ. (B) מיקרופוטוגרף מייצג של אורגנואידים ריאה ביום המעבר הרביעי וביום 5 לאחר המעבר. סרגל קנה המידה הוא 0.5 מ"מ. P1 ו-P4 מייצגים את הקטע הראשון והרביעי. התמונות צולמו בהגדלה של פי 10. (C) תמונות קונפוקליות של ארבעה סוגי תאי אפיתל בדרכי הנשימה באורגנואידים של ריאה אנושית. ארבע שושלות של תאי אפיתל של דרכי הנשימה נמצאות באורגנואידים של הריאה, כולל תאי ACCUB+ ו-FOXJ1+, תאי בסיס P63+, תאי מועדון CC10+ ותאי גביע MUC5AC+. גרעינים וחוטים אקטין תאיים מוכתמים באופן נגדי עם DAPI (כחול) ו-Phalloidin-647 (סגול), בהתאמה. סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. נתון זה אומץ מתוך13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: התמיינות פרוקסימלית של אורגנואידים של ריאה אנושית. מוצגים מיקרו-פוטוגרפים בשדה בהיר של אורגנואידים בימים המצוינים. סרגל קנה המידה הוא 0.4 מ"מ. (B) ריסונים באורגנואידים המובחנים של דרכי הנשימה מוצגים (חץ שחור). סרגל קנה המידה הוא 20 μm. (C) האחוזים של סוגי תאים בודדים באורגנואידים מודגרים במדיום PD (למעלה) ובמדיום התפשטות (למטה) כפי שזוהו על ידי ניתוח FACS. ההיסטוגרמות המייצגות של קו אורגנואידי אחד מוצגות. הניסוי בוצע בשלושה קווים אורגנואידיים שונים. נתון זה אומץ מתוך13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: יצירת אורגנואידים דו-ממדיים מובחנים של דרכי הנשימה. (A) התנגדות אלקטרונית טרנס-אפיתל (TEER) נמדדה ביום המצוין לאחר הדגירה במדיום PD. הנתונים מראים סטיית תקן ממוצעת ± (SD) של חד-שכבתיים דו-ממדיים ב-10 תוספות. (B) ביום 10 לאחר התרבית בלוחות תמיכה חדירים, נוספה פלואורסצין איזותיוציאנט-דקסטרן והתקשורת בתאים העליונים והתחתונים נקטפה לצורך בדיקת פלואורסצנציה לאחר 4 שעות. מדד החסימה של דקסטרן מתייחס לעוצמת הפלואורסצנציה של המדיום בתא העליון לעומת זו שבתא התחתון. הקוטר של תוספות תמיכה חדירות המשמשות בניסוי שלנו הוא 0.4 מיקרומטר. ללא זריעת תאים כלשהם, הדקסטרן יכול לחדור בחופשיות לתוספות הדו-ממדיות הרגילות. לפיכך, מדד החסימה dextran של דו-ממד רגיל (הסרגל המסומן ב-Blank) צריך להיות 1. הנתונים מייצגים את הממוצע ± SD של 10 תוספות שנזרעו עם אורגנואידים דו-ממדיים של דרכי הנשימה (אורגנואידים דו-ממדיים) ואלה בשתי תוספות ריקות (ריקות). (C) תמונות קונפוקליות של תאים מצומדים ACCTUB+ שופעים (ירוק) באורגנואידים דו-ממדיים של דרכי הנשימה. חוטי אקטין תאיים מוכתמים באופן נגדי עם פאלואידין-647 (סגול). סרגל קנה המידה הוא 20 מיקרומטר. נתון זה אומץ מתוך13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: המחשה סכמטית של נגזרת, הרחבה והבחנה של אורגנואידים של ריאה אנושית. תאים בודדים המבודדים מרקמות הריאה האנושיות מוטמעים ישירות במטריצת המרתף ומדגרים במדיום התפשטות האורגנואידים של הריאה. האורגנואידים של הריאה האנושית הנגזרים ניתנים להרחבה ארוכת טווח עם יציבות גבוהה ולהתאושש בקלות ממלאי בהקפאה. עם התמיינות, האורגנואידים הנוצרים בדרכי הנשימה יכולים לדמות בנאמנות אפיתל דרכי הנשימה האנושיות. אורגנואידים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של דרכי הנשימה פותחו למניפולציות ניסיוניות שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
סרטון משלים 1. הריסונים המכים באופן סינכרוני גורמים לפסולת התאים להסתובב באופן חד-כיווני באורגנואידים המובחנים של דרכי הנשימה13. סרטון זה אומץ מתוך13. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דרכי הנשימה האנושיות מרופדות באפיתל דרכי הנשימה, הידוע גם בשם אפיתל הציליאתי המדומה. סוגי התאים העיקריים של אפיתל דרכי הנשימה העליונות הם תאים מצומדים המאפשרים לתנועה מתואמת של הריסונים האפיקליים שלהם לגרש ריר וחלקיקים בשאיפה מדרכי הנשימה, תאי גביע המייצרים ומפרישים ריר, ותאי בסיס התוחמים את קרום המרתף ומעורבים בהתחדשות. בדרכי הנשימה הקטנות כמו ברונכיולס, אפיתל דרכי הנשימה הקובואידלי מכיל תאי מועדון מפרישים ופחות תאים מצומדים מאשר באזורי דרכי הנשימה העליונים. אנו מתארים פרוטוקול חזק להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מתאי הגזע של האפיתל ברקמות הריאה האנושיות. אורגנואידים ריאה אנושיים אלה נשמרים במדיום ההתפשטות ועוברים ברציפות במשך למעלה משנה עם יציבות גבוהה. גורמי צמיחה מרכזיים במדיום ההתרחבות כוללים את R-spondin, אגוניסט Wnt20; ונוג'ין, שהוא מעכב של BMP המאותת21, כמו גם FGF7 ו- FGF10. מחקרים קודמים חשפו תפקיד מכריע של איתות Wnt, FGF ו-BMP בהומאוסטזיס של אפיתל נשימתי 22,23,24. מדיום ההתפשטות מאפשר נגזרת ראשונית והתפשטות ארוכת טווח של אורגנואידים בריאים על ידי הפניית האורגנואידים למצב לא בשל. אנו מפתחים גם שיטת התמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה, המתאימים לארבעה סוגי תאי דרכי אוויר עיקריים ומדמים את אפיתל דרכי הנשימה האנושי לרמה כמעט פיזיולוגית. במהלך כל ההליך, כולל נגזרת ראשונית, התרחבות ארוכת טווח והתמיינות פרוקסימלית, לא נדרשות טיהור תאים מייגעות ולא תאי הזנה וסטרומליים. לפיכך, אנו מקימים מודל אורגנואידי של אפיתל דרכי הנשימה האנושיות. שני שלבי התרבות, תרבות ההתרחבות ותרבות ההבחנה, הם הדדיים זה לזה. האורגנואידים של הריאה מספקים מקור יציב להתרחבות ארוכת טווח, בעוד אורגנואידים מובחנות של דרכי הנשימה מבצעים פנוסקופיה נאמנה של אפיתל דרכי הנשימה האנושיות. אורגנואידים אלה מקובלים על מניפולציות ניסיוניות שונות, כולל הדמיה, ריצוף RNA, ניתוח ציטומטריה של זרימה, עריכה גנטית וכו '13,14,25,26,27.
על מנת להבטיח יעילות גבוהה להפקת אורגנואידים של ריאה, יש לשחזר את מדיום ההרחבה בצורה מדויקת וקפדנית, החיונית לקצב ההקמה הגבוה המתאפשר על ידי הפרוטוקול. מגבלה עיקרית של מודל אורגנואידי זה היא הרכב אפיתל טהור, מחסור בתאים סטרומליים ותאי מערכת החיסון הנמצאים ברירית הנשימה האנושית, מה שעלול לגרום לאורגנואידים של דרכי הנשימה לסטות מאפיתל דרכי הנשימה הטבעי במידה מסוימת. לפיכך, אנו שואפים ליצור את הדור הבא של אורגנואידים נשימתיים על ידי שילוב תאים חיסוניים ורכיבים רלוונטיים ביולוגית אחרים במודל האורגנואידים הנוכחי שלנו.
האורגנואידים של דרכי הנשימה שיצרנו מדמים נאמנה את ההרכב הרב-תאי והפונקציונליות של אפיתל הנשימה האנושי המקומי לרמה כמעט פיזיולוגית, דבר שאינו אפשרי בשום קווי תאים הומוגניים. המודלים האורגנואידיים שלנו מאפשרים למדענים לשחזר ולהרחיב ביציבות את אפיתל דרכי הנשימה האנושיות הטבעיות בלוחות תרבית. אורגנואידים אלה של דרכי הנשימה הם כלי אוניברסלי לחקר הביולוגיה והפתולוגיה של דרכי הנשימה האנושיות. תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה המשמשים במעבדות מחקר אינם ניתנים להרחבה בשל יכולת השכפול המוגבלת וכמעט ואינם משמשים ככלי מחקר בר-שחזור ונגיש בקלות.
אורגנואידים, כולל אורגנואידים נשימתיים אנושיים, חשפו את ייחודם ועוצמתם לחקר פתוגנים אנושיים, כולל SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34. ככלי אוניברסלי ופיזיולוגי-פעיל, ניתן להשתמש באופן נרחב באורגנואידים של ריאות אנושיות כדי לחקור את הביולוגיה והפתולוגיה של דרכי הנשימה האנושיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J. Z., C.L., ו- M.C.C. רשומים כממציאים בפטנט של אורגנואידים של דרכי הנשימה (פרסום מס': US-2021-0207081-A1). המחברים האחרים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים למרכז למדעי PanorOmic וליחידת מיקרוסקופ אלקטרונים, הפקולטה לרפואה ע"ש לי קה שינג, אוניברסיטת הונג קונג, על הסיוע בהדמיה קונפוקלית ובציטומטריית זרימה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון מקרן המחקר לבריאות ורפואה (HMRF, 17161272 ו-19180392) של לשכת המזון והבריאות; קרן המחקר הכללית (GRF, 17105420) של המועצה למענקי מחקר; Health@InnoHK, ועדת החדשנות והטכנולוגיה, ממשלת האזור המנהלי המיוחד של הונג קונג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M.
- Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F (2021).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H.
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
