Summary
يقدم البروتوكول طريقة لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من أنسجة الرئة الأولية ، وتوسيع عضويات الرئة وحث التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء 3D و 2D التي تنسخ بأمانة ظهارة مجرى الهواء البشري.
Abstract
عدم وجود نموذج قوي في المختبر للظهارة التنفسية البشرية يعيق فهم بيولوجيا وأمراض الجهاز التنفسي. نحن نصف بروتوكولا محددا لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من الخلايا الجذعية البالغة في أنسجة الرئة وتحفيز التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة. ثم يتم توسيع العضوية الرئوية على التوالي لأكثر من 1 سنة مع استقرار عالي، في حين يتم استخدام العضوية مجرى الهواء المتمايزة لمحاكاة مورفولوجيا ووظيفيا ظهارة مجرى الهواء البشري إلى مستوى شبه فسيولوجي. وبالتالي ، فإننا نؤسس نموذجا عضويا قويا لظهارة مجرى الهواء البشري. إن التوسع طويل الأجل في عضويات الرئة وعضويات مجرى الهواء المتمايزة يولد مصدرا مستقرا ومتجددا ، مما يمكن العلماء من إعادة بناء وتوسيع الخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري في أطباق الاستزراع. يوفر نظام الرئة العضوية البشرية نموذجا فريدا ونشطا من الناحية الفسيولوجية في المختبر لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك دراسة التفاعل بين الفيروس والمضيف ، واختبار الأدوية ، ونمذجة الأمراض.
Introduction
أصبحت المواد العضوية أداة قوية وعالمية لنمذجة تطور الأعضاء في المختبر ودراسة البيولوجيا والمرض. عند استزراعها في وسط استزراع محدد بعامل النمو ، يمكن توسيع الخلايا الجذعية البالغة (ASC) من مجموعة متنوعة من الأعضاء في 3 أبعاد (3D) وتجميعها ذاتيا في مجموعات خلوية تشبه الأعضاء تتكون من أنواع متعددة من الخلايا ، تسمى المواد العضوية. أبلغ مختبر كليفرز عن اشتقاق أول عضوي مشتق من ASC ، عضوي معوي بشري ، في عام 2009 1,2. بعد ذلك ، تم إنشاء عضويات مشتقة من ASC لمجموعة متنوعة من الأعضاء والأنسجة البشرية ، بما في ذلك البروستاتا3،4 ، والكبد5،6 ، والمعدة7،8،9 ، والبنكرياس 10 ، والغدة الثديية 11 ، والرئة 12،13 . احتفظت هذه المواد العضوية المشتقة من ASC بالخصائص الخلوية والهيكلية والوظيفية الحرجة للعضو الأصلي وحافظت على الاستقرار الجيني والمظهري في ثقافة التوسع طويلة الأجل14,15.
يمكن أيضا اشتقاق المواد العضوية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ES) والخلية الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS)16. في حين أن المواد العضوية المشتقة من PSC تستغل آليات تطوير الأعضاء لإنشائها ، يمكن إجبار ASCs على تكوين عضويات عن طريق إعادة بناء الظروف التي تحاكي مكانة الخلايا الجذعية أثناء التجديد الذاتي للأنسجة الفسيولوجية أو إصلاح الأنسجة. تعد المواد العضوية المشتقة من PSC نماذج مواتية لاستكشاف التطور والتكوين العضوي ، وإن كانت غير قادرة على الوصول إلى مستوى النضج المماثل للعضويات المشتقة من ASC. حالة النضج الشبيهة بالجنين للعضويات المشتقة من PSC ، والتعقيد لإنشاء هذه المواد العضوية تمنع بشكل كبير تطبيقاتها الواسعة لدراسة البيولوجيا وعلم الأمراض في الأنسجة الناضجة.
تصطف القناة التنفسية البشرية ، من الأنف إلى القصيبات الطرفية ، مع ظهارة مجرى الهواء ، وتسمى أيضا الظهارة الهدبية الزائفة الطبقية ، والتي تتكون من أربعة أنواع رئيسية من الخلايا ، أي الخلايا الهدبية ، والخلية الكأسية ، والخلية القاعدية ، وخلية النادي. أنشأنا عضوي الرئة البشري المشتق من ASC من أنسجة الرئة البشرية بالتعاون مع مختبر Clevers12,13. يتم توسيع هذه المواد العضوية الرئوية على التوالي في وسط التوسع لأكثر من عام. تختلف المدة الدقيقة بين الخطوط العضوية المختلفة التي تم الحصول عليها من متبرعين مختلفين. ومع ذلك ، بالمقارنة مع ظهارة مجرى الهواء الأصلي ، فإن هذه المواد العضوية الرئوية القابلة للتوسيع على المدى الطويل ليست ناضجة بما فيه الكفاية لأن الخلايا الهدبية ، وهي مجموعة الخلايا الرئيسية في مجرى الهواء البشري ، ممثلة تمثيلا ناقصا في هذه المواد العضوية الرئوية. وهكذا ، قمنا بتطوير بروتوكول تمايز قريب وأنشأنا عضويات مجرى الهواء 3D و 2D التي تنسخ ظاهريا مورفولوجيا ووظيفيا ظهارة مجرى الهواء إلى مستوى شبه فسيولوجي.
هنا نقدم بروتوكول فيديو لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من أنسجة الرئة الأولية ، وتوسيع عضويات الرئة وحث التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء 3D و 2D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب باستخدام الأنسجة البشرية الموضحة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لجامعة هونغ كونغ / هيئة المستشفيات في هونغ كونغ ويست كلاستر (UW13-364 و UW21-695). تم الحصول على الموافقة المستنيرة من المرضى قبل جمع الأنسجة.
1. اشتقاق العضوية الرئة البشرية
- إعداد المواد التجريبية
- تحضير الوسط القاعدي عن طريق استكمال وسط DMEM / F12 المتقدم مع 2 mM الجلوتامين ، 10 mM HEPES ، 100 U / mL من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
- تحضير وسط توسع عضوي للرئة البشرية عن طريق استكمال الوسط القاعدي بنسبة 10٪ R-spondin 1 وسط مشروط ، و 10٪ وسط مكيف Noggin ، وملحق B27 1x ، و 1.25 mM N-acetylcysteine ، و 10 mM nicotinamide ، و 5 μM من Y-27632 ، و 500 nM من A-83-01 ، و 1 μM من SB202190 ، و 5 نانوغرام / مل من عامل النمو الليفي (FGF) -7 ، و 20 نانوغرام / مل من FGF-10 ، و 100 ميكروغرام / مل من البريموسين (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يمكن استبدال الوسط المشروط R-spondin 1 و Noggin ب R-spondin 1 المؤتلف التجاري (500 نانوغرام / مل) و Noggin (100 نانوغرام / مل). - قم بتسخين صفيحة استزراع معلقة من 24 بئرا في حاضنة زراعة الخلايا. استخدم حاضنة زراعة الخلايا القياسية مع 5٪ CO2 والغلاف الجوي الرطب عند 37 درجة مئوية. قم بإذابة مصفوفة الطابق السفلي في ثلاجة 4 درجات مئوية. حافظ على مصفوفة الطابق السفلي ووسط الاستزراع على الجليد أثناء التجريب.
- عزل الخلايا من أنسجة الرئة البشرية لثقافة العضوية 3D
- شراء أنسجة الرئة البشرية المستأصلة حديثا بحجم حوالي 0.5 سم من المرضى الذين يخضعون للاستئصال الجراحي بسبب أمراض مختلفة. نقل أنسجة الرئة في 30 مل من الوسط القاعدي في درجة حرارة الغرفة ومعالجتها في أسرع وقت ممكن داخل غطاء السلامة الأحيائية.
- افرم أنسجة الرئة إلى قطع صغيرة (0.5-1 مم) باستخدام مشرط معقم في طبق زراعة خلايا 10 سم. اغسل قطع الأنسجة ب 10 مل من الوسط القاعدي البارد في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، يليه الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات في 8 مل من الوسط القاعدي المكمل بالكولاجيناز بتركيز نهائي قدره 2 ملغم / مل. هضم قطع الأنسجة عن طريق هز الأنبوب عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 30-40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- قم بتحريك أعلى وأسفل لمدة 20 ضعفا لقص قطع الأنسجة المهضومة باستخدام ماصة مصلية 10 مل. قم بتكديس مصفاة 100 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتصفية التعليق.
- استعادة قطع الأنسجة على المصفاة مع الوسط القاعدي ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل ، تليها جولة ثانية من القص والترشيح. يمكن إجراء تصفية قص إضافية 1x-2x لعزل المزيد من الخلايا ، خاصة عند شراء قطعة صغيرة من الأنسجة (على سبيل المثال ، <0.5 سم).
- أضف FBS إلى التدفق من خلال تركيز نهائي قدره 2٪ لإنهاء الهضم ، يليه الطرد المركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من الوسط القاعدي ، تليها الطرد المركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
- (اختياري) إذا شوهدت العديد من كريات الدم الحمراء في الكريات (تقدر بلون الكرية) ، فأعد تعليق بيليه الخلية في 2 مل من مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء وحضانتها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم أضف 10 مل من الوسط القاعدي إلى الأنبوب ، متبوعا بالطرد المركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
- أعد تعليق الكريات في مصفوفة الطابق السفلي البارد واحتفظ بها على الجليد. إضافة 80-160 ميكرولتر من مصفوفة الطابق السفلي للخلايا المستردة من أنسجة الرئة بحجم حوالي 0.5 سم ؛ المبلغ يكفي لزرع 2-4 قطرات.
- قم بتوزيع 40 ميكرولتر من التعليق على كل بئر من لوحة مستنبتة التعليق 24 بئرا التي تم تسخينها مسبقا. احتضان لوحة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. دع مصفوفة الطابق السفلي تتصلب لتشكيل قطرة.
- أضف 500 ميكرولتر من وسط تمدد عضويات الرئة البشرية مع 5 نانومتر من هيريجولين بيتا-1 إلى كل بئر واحتضن الصفيحة في حاضنة زراعة الخلايا.
- قم بتحديث الوسط كل 3 أيام. قم بإزالة الوسط القديم مع الحفاظ على القطرة سليمة وأضف الوسط الطازج بحذر. مرور المواد العضوية بعد الحضانة لمدة 10-14 يوما. استخدم Heregulin beta-1 فقط في الثقافة الأولية قبل المقطع الأول.
- راقب المواد العضوية تحت المجهر للتأكد من أن المواد العضوية ليست جزءا لا يتجزأ من كثافة الخلايا العالية جدا. إذا تفككت قطرة بسبب كثافة الخلايا العالية بشكل مفرط ، فقم باستعادة وإعادة تضمين المواد العضوية والخلايا ذات الحجم الأكبر من مصفوفة الطابق السفلي لصنع المزيد من القطرات ذات كثافة الخلايا الأقل والمرغوبة.
2. توسيع العضوية الرئوية البشرية
- قم بإعداد ماصة باستور عن طريق حرق طرف ماصة باستور على لهب ، مثل موقد بنسن ، لتضييق الفتحة من 1.5 مم إلى حوالي 1.0 مم في القطر. قم بتبريد الماصات ، تليها التعقيم للتعقيم. بلل الماصات بالوسط القاعدي لتجنب التعلق الخلوي وفقدانه أثناء القص الميكانيكي.
- مرور عضويات الرئة مع القص الميكانيكي
- استخدم طرف 1 مل وماصة لأعلى ولأسفل لكسر القطرات التي تم الحصول عليها أعلاه. ثم ، انقل المواد العضوية مع الوسط إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل واضبط الحجم إلى 10 مل مع وسط قاعدي بارد. تخلص من المادة الفائقة بعد الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية
- اغسل المواد العضوية ب 10 مل من الوسط القاعدي البارد مرة أخرى. إعادة تعليق المواد العضوية في 2 مل من الوسط القاعدي البارد. ضع لأعلى ولأسفل لقص المواد العضوية إلى قطع صغيرة باستخدام ماصة باستور.
- تكملة مع المتوسطة القاعدية إلى حجم إجمالي من 10 مل، تليها الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الشظايا العضوية باستخدام مصفوفة قبو باردة كافية لتمكين التوسع من 1:3 إلى 1:5. حافظ على الجليد.
- ضع 40 ميكرولتر من التعليق العضوي في كل بئر من صفيحة 24 بئرا تم تسخينها مسبقا. احتضان لوحة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. دع مصفوفة الطابق السفلي تتصلب.
- أضف 500 ميكرولتر من وسط تمدد الرئة العضوي إلى كل بئر واحتضنه في حاضنة زراعة الخلايا. قم بتحديث الوسط كل 3 أيام. مرور المواد العضوية كل أسبوعين بنسبة 1: 3 إلى 1: 5.
- مرور عضويات الرئة مع التربسين
ملاحظة: يفضل التربسين عندما يكون من الصعب قص عضوي الرئة إلى قطع صغيرة باستخدام ماصة باستور ، أو يكون حجم المواد العضوية متغيرا للغاية ، أو تتطلب التجارب اللاحقة عضويات ذات حجم أكثر اتساقا.- حصاد المواد العضوية الرئوية كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. أعد تعليق العضو العضوي في 1 مل من إنزيم التفكك واحتضنه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
- أضف 1 مل من الوسط القاعدي إلى الأنبوب. قص المواد العضوية ميكانيكيا عن طريق سحب المواد العضوية لأعلى ولأسفل إلى قطع صغيرة باستخدام ماصة باستور. تحقق من حجم القطع العضوية تحت المجهر عند تكبير 4x. ثم أضف 40 ميكرولتر من FBS لإنهاء عملية الهضم.
ملاحظة: تحديد حجم الشظايا العضوية تحت المجهر وفقا للترتيب التجريبي. إذا كانت التجربة تحتاج إلى المزيد من المواد العضوية أو المواد العضوية ذات الحجم الأكثر اتساقا ، فقم بقص المواد العضوية إلى قطع أصغر أو حتى خلايا مفردة. بعد ذلك ، يستغرق الأمر وقتا أطول ، ربما 3 أسابيع ، قبل أن تكون المواد العضوية جاهزة للتجريب. - قم بتعبئة الرصيد بوسط قاعدي إلى حجم نهائي يبلغ 10 مل ، يليه الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق القطع العضوية في مصفوفة الطابق السفلي البارد بحجم كاف للمرور بنسبة 1:5-1:10. حافظ على الجليد.
- ضع 40 ميكرولتر من التعليق العضوي في كل بئر من صفيحة 24 بئرا تم تسخينها مسبقا. احتضان لوحة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. دع مصفوفة الطابق السفلي تتصلب.
- تكملة مع 500 ميكرولتر من وسط توسع الرئة العضوي لكل بئر وحضانة في حاضنة زراعة الخلايا. قم بتحديث وسيط التمدد كل 3 أيام. مرور المواد العضوية بعد 2-3 أسابيع.
ملاحظة: يتم تركيب حوالي 100 مادة عضوية داخل قطرة 40 ميكرولتر من مصفوفة الطابق السفلي. عادة ما تنمو عضويات الرئة بشكل أفضل مع كثافة خلايا عالية نسبيا. أعد تضمين المواد العضوية بكثافة خلايا أقل إذا تفككت القطرات أو التقت المواد العضوية المتنامية معا بسبب كثافة الخلايا العالية للغاية.
3. التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة
- قم بإعداد وسط التمايز القريب (وسط PD) عن طريق استكمال الوسط القاعدي للواجهة السائلة الهوائية بملحق واجهة سائلة هوائية 1x ، وملحق صيانة واجهة سائل الهواء 1x ، و 4 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 1 ميكرومتر من الهيدروكورتيزون ، و 10 ميكرومتر من Y-27632 ، و 10 ميكرومتر من DAPT (انظر جدول المواد).
- 3D مجرى الهواء العضوية
- احتضان عضويات الرئة في وسط التمدد لمدة 7-10 أيام بعد المرور عن طريق القص الميكانيكي. استبدل وسيط التوسيع بوسيط PD. احتضان المواد العضوية في وسط PD لمدة 14 يوما في حاضنة زراعة الخلايا.
- تخلص من وسيط PD في كل بئر. أضف المخزن المؤقت للخلايا لحصاد المجرى الهوائي العضوي المتمايز لاستخراج الحمض النووي الريبي والكشف عن التعبير الجيني الخلوي عن طريق فحص RT-qPCR.
- بدلا من ذلك ، احتضن المواد العضوية عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة بعد إضافة 10 mM EDTA لفصل المواد العضوية إلى خلايا مفردة ، تليها تحليل التدفق الخلوي لفحص مجموعات الخلايا. المواد العضوية جاهزة للتلاعبات التجريبية المختلفة.
- 2D مجرى الهواء العضوي
- إعداد ما يكفي من المواد العضوية الرئوية 3D لثقافة التمايز 2D. مطلوب ما مجموعه 1.3 × 10 5 و 4.5 × 105 خلايا لإدراج دعم قابل للنفاذ 24 بئرا وإدراج دعم قابل للنفاذ 12 بئرا ، على التوالي.
- بعد أن تنمو عضويات الرئة ثلاثية الأبعاد في وسط التمدد لمدة أسبوعين ، هضم المواد العضوية إلى خلايا مفردة والبذور في إدراج 24 بئرا و 12 بئرا لتوليد عضويات مجرى الهواء ثنائية الأبعاد.
- قبل احتضان الإدخالات مع الوسط القاعدي بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الخلايا. أضف 250 ميكرولتر و 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي في الغرفة العلوية والسفلية للوحة ذات 24 بئرا ، على التوالي. للحصول على لوحة من 12 بئرا ، أضف 500 ميكرولتر و 1000 ميكرولتر من الوسط القاعدي في الغرفة العلوية والسفلية ، على التوالي.
- حصاد العضوية الرئوية ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. أعد تعليق المواد العضوية مع 1 مل من إنزيم التفكك واحتضنها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
- أضف 1 مل من الوسط القاعدي إلى الأنبوب. قم بتحريك الخلايا العضوية لأعلى ولأسفل لقص المواد العضوية إلى خلايا مفردة باستخدام ماصة باستور والتحقق من الخلايا تحت المجهر. ثم أضف 40 ميكرولتر من FBS لإنهاء عملية الهضم.
- قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. انقل تعليق الخلية المصفى إلى أنبوب 15 مل. قم بتعبئة المزيج بوسط قاعدي إلى حجم إجمالي يبلغ 10 مل ، يليه الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق الكريات ، التي تم جمعها من 24 قطرة (40 ميكرولتر) ، في 1-2.5 مل من وسط تمدد الرئة العضوي اعتمادا على كثافة الخلايا في القطرات. عد عدد الخلايا التي تحتوي على عداد خلايا تحت المجهر. اضبط تركيز الخلية على 1.3 × 106/مل (لإدراج 24 بئرا) أو 9 × 105/مل (لإدراج 12 بئرا).
- قم بإزالة الوسط القاعدي من الغرف العلوية والسفلية. أضف 500 ميكرولتر و 1000 ميكرولتر من وسط التمدد في الغرفة السفلية لإدراج 24 بئرا وإدراج 12 بئرا ، على التوالي. البذور 100 ميكرولتر و 500 ميكرولتر من تعليق الخلية المحضرة في الخطوة 3.3.7 على الغرفة القمية لإدراج 24 بئرا و 12 بئرا ، على التوالي.
- احتضان في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 2 أيام. استبدل وسط التمدد بوسط PD في كل من الغرفة القمية والسفلية للألواح. احتضان المواد العضوية في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 14 يوما وتحديث وسط PD كل 3 أيام.
ملاحظة: يمكن تمييز الأهداب المتنقلة في المواد العضوية 3D و 2D تحت المجهر من اليوم 7 بعد الحضانة في وسط PD. بعد 14 يوما من ثقافة التمايز في وسط PD ، تنضج عضويات مجرى الهواء لمختلف التلاعبات التجريبية. - قم بقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER) كل يومين باستخدام نظام قياس المقاومة الكهربائية وفقا لبروتوكول قياسي موضح في17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتيح هذا البروتوكول اشتقاق عضويات الرئة البشرية بمعدل نجاح مرتفع. يتم فرم أنسجة الرئة البشرية الطازجة إلى قطع صغيرة ، ثم تتحلل مع الكولاجيناز. يتم تضمين الخلايا المفردة الناتجة في مصفوفة الطابق السفلي ويتم تحضينها في وسط التوسع العضوي الرئوي مع استكمال مزيج من العوامل المتخصصة لنمو الخلايا الجذعية الظهارية (الخطوة 1.1.2). ويبين الشكل 1 الصورة المصغرة لخلايا الرئة المعزولة حديثا المضمنة في مصفوفة الغشاء السفلي لعامل النمو المنخفض من النوع 2 (BME; الشكل 1 ألف، إلى اليسار). تظهر المواد العضوية الكيسية وتتضخم بمرور الوقت (الشكل 1A ، على اليمين). وفي الوقت نفسه ، تخضع الخلايا غير ذات الصلة لموت الخلايا تدريجيا. توجد الخلايا الليفية في الثقافة خلال الممرات الأولى أو الثانية. بعد ذلك ، تحتوي الثقافة على عضويات ظهارية حصريا ، وهي عضويات رئوية مشتقة من الخلايا الجذعية الظهارية الموجودة في أنسجة الرئة الأولية. يتم تمرير هذه المواد العضوية الرئوية كل 2-3 أسابيع عن طريق القص الميكانيكي بنسبة 1: 3 إلى 1: 5 أو عن طريق التربسين بنسبة 1: 5 إلى 1: 10 (الخطوات 2.2-2.3). تظهر الصور الميكروفوتوغرافية التمثيلية للعضويات الرئوية بعد المقطع الرابع في الشكل 1B. بعد القص الميكانيكي ، تشكل الشظايا العضوية المضمنة في BME مجالات كيسية في غضون ساعتين (الشكل 1B ، اليسار). تظهر صورة مصغرة لنفس الحقل في اليوم 5 (الشكل 1B ، على اليمين) المواد العضوية التي تنمو بمرور الوقت. هذه الخلايا العضوية الرئوية البشرية المتوسعة تؤوي جميع أنواع الخلايا الظهارية الرئيسية الأربعة في مجرى الهواء ، بما في ذلك الخلايا الهدبية ACCTUB + أو FOXJ1 + ، والخلية القاعدية P63 + ، وخلية نادي CC10 + ، وخلية الكأس MUC5AC +18 (الشكل 1C) ، في حالة سابقة لأوانها. والجدير بالذكر أن هذه المواد العضوية الرئوية البشرية يمكن أن تمر على التوالي وبثبات لأكثر من 1 سنة. عند الاحتفاظ بها داخل مصفوفة الطابق السفلي ، من المرجح أن تظهر عضويات الرئة قطبية قطبية قمية ، وأقل من 2٪ -3٪ من عضويات الرئة تظهر قطبية قطبية قمية13. ونتيجة لذلك ، لا يمكن الوصول بسهولة إلى قمم الخلايا ما لم يتم قص المواد العضوية 3D مفتوحة.
ومع ذلك ، بالمقارنة مع ظهارة مجرى الهواء البشري الأصلي ، فإن هذه المواد العضوية الرئوية القابلة للتوسيع على المدى الطويل ليست ناضجة بما فيه الكفاية لأن مجموعة الخلايا المهيمنة في ظهارة مجرى الهواء البشري الأصلي ، الخلية الهدبية ، ممثلة تمثيلا ناقصا في العضوية الرئوية. ثم حددنا وسيط التمايز القريب (PD) لتحسين حالة نضج عضويات الرئة البشرية. طورت المواد العضوية المحتضنة في وسط التمدد ووسط PD مورفولوجيا متميزة بمرور الوقت (الشكل 2A). كانت الأهداب المتحركة أكثر وفرة في المواد العضوية في وسط PD من تلك الموجودة في وسط التمدد. بعد أسبوعين من ثقافة التمايز في وسط PD ، يمكن تمييز الأهداب المتحركة في كل عضوي واحد (الشكل 2B والفيديو التكميلي 1). ومن المثير للاهتمام أن الأهداب الضاربة تدفع حطام الخلية وتفرز الميوسين داخل التجويف العضوي لتدور في اتجاه واحد ، مما يلخص بشكل كاف السلم المتحرك المخاطي الهدبي لإزالة الجسيمات المستنشقة (الفيديو التكميلي 1) ، وهي آلية مهمة للتطهير الذاتي للممرات الهوائية البشرية. لقد أظهرنا أن الخلايا الهدبية زادت بشكل كبير إلى حوالي 50٪ في المواد العضوية المتباينة مقارنة بعضويات الرئة الأصلية. لتقييم النسب المئوية لأربعة أنواع من الخلايا الظهارية ، تم تحليل عضويات مجرى الهواء 2D عن طريق قياس التدفق الخلوي. باختصار ، تم فصل المواد العضوية مع 10 mM EDTA لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ثابتة مع 4٪ PFA ، وتتخلل مع 0.1٪ السطحي. في وقت لاحق ، تم احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد) لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية تليها تلطيخ بالأجسام المضادة الثانوية. واستخدم نظام FACS لتحليل العينات. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن المواد العضوية المتباينة تستوعب أربعة أنواع من الخلايا الظهارية في مجرى الهواء (الشكل 2C). لذلك ، طورنا بروتوكول تمايز قريب لتوليد عضويات مجرى الهواء يمكنها محاكاة ظهارة مجرى الهواء البشري بأمانة إلى مستوى شبه فسيولوجي.
لتمكين السطح القمي العضوي من الوصول إليه بسهولة ونمذجة أفضل لتعرض ظهارة مجرى الهواء البشري لمسببات الأمراض التنفسية ، قمنا بإنشاء طبقات أحادية 2D من المواد العضوية في مجرى الهواء. بعد أسبوعين من ثقافة التمايز ، طورت عضويات مجرى الهواء 2D حاجزا ظهاريا سليما (الشكل 3A ، B). أجرينا أيضا فحص انسداد ديكستران لتقييم سلامة الحاجز الظهاري المتشكل في عضويات مجرى الهواء 2D. في اليوم 10 بعد الزراعة في إدراج ترانسويل ، تمت إضافة الفلوريسين إيزوثيوسيانات ديكستران (MW 10,000) في وسط الغرفة العلوية وحضانتها عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تم حصاد وسائل الإعلام في الغرف العلوية والسفلية لإجراء فحص فلوري. يشير مؤشر انسداد ديكستران إلى شدة التألق للوسط في الغرفة العلوية مقابل تلك الموجودة في الغرفة السفلية (الشكل 3B). تحتوي هذه المواد العضوية ثنائية الأبعاد في مجرى الهواء أيضا على خلايا هدبية وفيرة (الشكل 3C). تم تصنيف الخلايا المذبذبة بواسطة الأجسام المضادة β-Tubulin IV (ACCTUB) والأجسام المضادة الثانوية للماعز المضادة للفأر 488. تم الحصول على صور متحدة البؤرة باستخدام المجهر البؤري. تم الحصول على صور متعددة القنوات باستخدام أشعة الليزر 405 نانومتر ل DAPI ، و 488 نانومتر ل ACCTOB ، و 633/640 نانومتر ل Phalloidin. تم تعديل معلمات التصوير وفقا لدليل المستخدم الخاص بالمجهر البؤري. باختصار ، تم تعيين حجم الثقب إلى 1 وحدة فلكية ، وتم تعيين الكسب الرئيسي على 650 فولت إلى 750 فولت مع كسب رقمي قدره 1.0 ، وتم ضبط طاقة الليزر لكل قناة في نطاق 0.2٪ إلى 5٪. تم تنفيذ معالجة الصور باستخدام برنامج التحليل المقدم.
تصطف القناة التنفسية البشرية مع نوعين متميزين من الظهارة ، أي ظهارة مجرى الهواء والظهارة السنخية. الأول يبطن الشعب الهوائية من تجويف الأنف إلى القصيبات الطرفية ويتكون من أربعة أنواع رئيسية من الخلايا الظهارية ، أي الخلية الهدبية ، خلية الكأس ، خلية النادي ، والخلية القاعدية. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر ظهارة مجرى الهواء المبطنة للممرات الهوائية القريبة والبعيدة تركيبة خلوية متغيرة على طول المحور القريب البعيد. ظهارة مجرى الهواء القريب زائفة ، تتكون من خلايا هدبية وفيرة وخلايا كأسية تفرز المخاط. في حين أن ظهارة مجرى الهواء البعيد هي طبقة واحدة من الخلايا الهدبية المكعبة والخلايا الهاربية مع خلايا قاعدية وكأسية أقل19. تم شراء أنسجة الرئة البشرية المستخدمة لاشتقاق عضويات الرئة من المرضى الذين خضعوا لعمليات استئصال جراحية بسبب أمراض مختلفة. نحن نستخدم أنسجة الرئة الطبيعية المجاورة للأنسجة المريضة للزراعة العضوية. تحتوي أنسجة الرئة هذه عادة على قصيبات ذات حجم متغير تحيط بها الأكياس السنخية. خلال الثقافة الأولية ، تبقى الخلايا الجذعية الظهارية في مجرى الهواء أو الخلايا السلفية للمجرى الهوائي في أنسجة الرئة وتتكاثر بسبب العوامل المتخصصة في وسط التمدد. يتيح وسيط التمدد الاشتقاق الأولي والتوسع طويل الأجل للعضويات الرئوية عن طريق توجيه المواد العضوية نحو حالة غير ناضجة ، في حين أن بروتوكول تمايز مجرى الهواء يولد عضويات مجرى الهواء التي تنسخ ظهارة مجرى الهواء الأصلية من الناحية المورفولوجية والوظيفية. النظام النموذجي، بما في ذلك اشتقاق وتوسيع وتمايز عضويات الرئة، موضحة في الشكل 4. كما يوضح الشكل 4 التركيب الخلوي في ظهارة مجرى الهواء القريب والبعيد.
الشكل 1: اشتقاق وتوسيع وتوصيف عضويات الرئة البشرية. (أ) تظهر صورة مصغرة تمثيلية خلايا مفردة مدمجة في مصفوفة الطابق السفلي بعد عزلها عن أنسجة الرئة في اليوم 0 (يسار). في اليوم 5 ، تنمو المواد العضوية الكيسية (يمين). شريط المقياس هو 0.5 مم. (B) صورة ميكروفوتوغرافية تمثيلية للعضويات الرئوية في يوم المقطع الرابع واليوم 5 بعد المرور. شريط الميزان 0.5 مم. يمثل P1 و P4 المقطعين الأول والرابع. تم التقاط الصور بتكبير 10x. (ج) صور متحدة البؤرة لأربعة أنواع من الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في عضويات الرئة البشرية. توجد أربعة سلالات من الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في الخلايا العضوية الرئوية ، بما في ذلك الخلايا الهدبية ACCUB + و FOXJ1 + ، والخلايا القاعدية P63 + ، وخلايا نادي CC10 + ، وخلايا الكأس MUC5AC +. يتم تلطيخ النوى وخيوط الأكتين الخلوية ب DAPI (أزرق) و Phalloidin-647 (أرجواني) ، على التوالي. شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. وقد اعتمد هذا الرقم من13 عضوا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التمايز القريب من عضويات الرئة البشرية. (أ) تم استزراع عضويات الرئة البشرية في وسط PD أو وسط التمدد (Exp) بالتوازي لمدة 16 يوما. يتم عرض الصور الدقيقة ذات المجال الساطع للعضويات في الأيام المشار إليها. شريط المقياس هو 0.4 مم. (B) تظهر الأهداب في عضويات مجرى الهواء المتمايزة (السهم الأسود). شريط المقياس هو 20 ميكرومتر (C) النسب المئوية لأنواع الخلايا الفردية في المواد العضوية المحتضنة في وسط PD (أعلى) ووسط تمدد (أسفل) كما تم اكتشافه بواسطة تحليل FACS. يتم عرض المدرج التكراري التمثيلي لخط عضوي واحد. تم إجراء التجربة في ثلاثة خطوط عضوية مختلفة. وقد اعتمد هذا الرقم من13 عضوا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توليد عضويات مجرى الهواء المتمايزة ثنائية الأبعاد. (أ) تم قياس المقاومة الإلكترونية عبر الظهارية (TEER) في اليوم المشار إليه بعد الحضانة في وسط PD. تظهر البيانات متوسط الانحراف المعياري ± (SD) للطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد في 10 إدراجات. (ب) في اليوم 10 بعد الاستزراع في ألواح دعم قابلة للنفاذ، أضيفت فلوريسين إيزوثيوسيانات - ديكستران وتم حصاد الوسائط في الغرف العلوية والسفلية لإجراء فحص التألق بعد 4 ساعات. يشير مؤشر انسداد ديكستران إلى شدة التألق للوسط في الغرفة العلوية مقابل تلك الموجودة في الغرفة السفلية. يبلغ قطر إدخالات الدعم القابلة للنفاذ المستخدمة في تجربتنا 0.4 ميكرومتر. دون بذر أي خلايا ، يمكن للديكستران اختراق إدراج 2D الطبيعي بحرية. وبالتالي ، يجب أن يكون مؤشر انسداد dextran ل 2D العادي (الشريط المسمى بفارغ) 1. تمثل البيانات متوسط ± SD من 10 إدخالات مصنفة مع عضويات مجرى الهواء 2D (2D organoid) وتلك الموجودة في إدراجين فارغين (فارغ). (ج) صور متحدة البؤرة للخلايا الهدبية ACCTUB+ الوفيرة (الخضراء) في عضويات مجرى الهواء 2D. يتم تلطيخ خيوط الأكتين الخلوية مع Phalloidin-647 (الأرجواني). شريط المقياس هو 20 ميكرومتر. وقد اعتمد هذا الرقم من13 عضوا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: رسم تخطيطي لاشتقاق وتوسع وتمايز عضويات الرئة البشرية. يتم تضمين الخلايا المفردة المعزولة من أنسجة الرئة البشرية مباشرة في مصفوفة الطابق السفلي ويتم تحضينها في وسط التمدد العضوي للرئة. يمكن توسيع عضويات الرئة البشرية المشتقة على المدى الطويل مع استقرار عال واستعادتها بسهولة من المخزونات المحفوظة بالتبريد. عند التمايز ، يمكن للعضويات المولدة في مجرى الهواء محاكاة ظهارة مجرى الهواء البشري بأمانة. تم تطوير عضويات مجرى الهواء 2D و 3D لمختلف التلاعب التجريبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو تكميلي 1. تدفع الأهداب الضاربة بشكل متزامن حطام الخلية إلى الدوران أحادي الاتجاه في عضويات مجرى الهواء المتمايزة13. تم اعتماد هذا الفيديو من13. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصطف الشعب الهوائية البشرية مع ظهارة مجرى الهواء ، والمعروفة أيضا باسم الظهارة الهدبية الزائفة. أنواع الخلايا الرئيسية في ظهارة مجرى الهواء العلوي هي الخلايا الهدبية التي تمكن الحركة المنسقة لأهداب قمية لطرد المخاط والجسيمات المستنشقة من الشعب الهوائية ، والخلايا الكأسية التي تنتج وتفرز المخاط ، والخلايا القاعدية التي تبطن الغشاء السفلي وتشارك في التجديد. في مجرى الهواء الصغير مثل القصيبات الهوائية ، تحتوي ظهارة مجرى الهواء التكعيبي على خلايا نادي إفرازية وخلايا هدبية أقل من مناطق مجرى الهواء العلوي. نحن نصف بروتوكولا قويا لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من الخلايا الجذعية الظهارية في أنسجة الرئة البشرية. يتم الحفاظ على هذه العضوية الرئة البشرية في وسط التوسع وتمر على التوالي لأكثر من 1 سنة مع استقرار عالي. تشمل عوامل النمو الرئيسية في وسط التوسع R-spondin ، ناهض Wnt20 ؛ و Noggin ، وهو مثبط لإشارات BMP21 ، وكذلك FGF7 و FGF10. كشفت دراسات سابقة عن دور حاسم لإشارات Wnt و FGF و BMP في توازن ظهارة الجهاز التنفسي 22،23،24. يتيح وسيط التمدد الاشتقاق الأولي والتوسع طويل الأجل للعضويات الرئوية عن طريق توجيه المواد العضوية نحو حالة غير ناضجة. نحن نطور أيضا طريقة تمايز قريبة لتوليد عضويات مجرى الهواء 3D و 2D ، والتي تستوعب أربعة أنواع رئيسية من خلايا مجرى الهواء وتحاكي ظهارة مجرى الهواء البشري إلى مستوى شبه فسيولوجي. خلال الإجراء بأكمله ، بما في ذلك الاشتقاق الأولي ، والتوسع طويل الأجل ، والتمايز القريب ، لا يلزم تنقية الخلايا المملة ولا الخلايا المغذية واللحمية. وبالتالي ، فإننا نؤسس نموذجا عضويا لظهارة مجرى الهواء البشري. مرحلتا الثقافة ، ثقافة التوسع وثقافة التمايز ، يستبعد أحدهما الآخر. توفر عضويات الرئة مصدرا مستقرا للتوسع على المدى الطويل ، في حين أن المواد العضوية المتباينة في مجرى الهواء تنسخ بأمانة ظهارة مجرى الهواء البشري. هذه المواد العضوية قابلة للتلاعبات التجريبية المختلفة ، بما في ذلك التصوير ، وتسلسل الحمض النووي الريبي ، وتحليل قياس التدفق الخلوي ، والتحرير الجيني ، وما إلى ذلك 13،14،25،26،27.
لضمان كفاءة عالية لاشتقاق المواد العضوية الرئوية ، يجب إعادة تشكيل وسط التمدد بدقة ودقة ، وهو أمر ضروري لمعدل التأسيس المرتفع الذي يتيحه البروتوكول. أحد القيود الرئيسية لهذا النموذج العضوي هو التركيب الظهاري النقي ، ونقص الخلايا اللحمية ، والخلايا المناعية الموجودة في الغشاء المخاطي التنفسي البشري ، مما قد يتسبب في انحراف عضويات مجرى الهواء عن ظهارة مجرى الهواء الأصلية إلى حد ما. وبالتالي ، فإننا نسعى جاهدين لتوليد الجيل التالي من المواد العضوية التنفسية من خلال دمج الخلايا المناعية والمكونات الأخرى ذات الصلة بيولوجيا في نموذجنا العضوي الحالي.
تحاكي عضويات مجرى الهواء التي أنشأناها بأمانة التركيب متعدد الخلايا ووظائف ظهارة الجهاز التنفسي البشري الأصلي إلى مستوى شبه فسيولوجي ، وهو أمر مستحيل في أي خطوط خلايا متجانسة. تمكن نماذجنا العضوية العلماء من إعادة بناء ظهارة مجرى الهواء البشري الأصلي وتوسيعها بشكل مستقر في ألواح الاستزراع. هذه المواد العضوية في مجرى الهواء هي أداة عالمية لدراسة بيولوجيا وأمراض الشعب الهوائية البشرية. الخلايا الظهارية الأولية في مجرى الهواء المستخدمة في مختبرات الأبحاث غير قابلة للتوسع بسبب القدرة المحدودة على النسخ المتماثل وبالكاد تعمل كأداة بحثية قابلة للتكرار ويمكن الوصول إليها بسهولة.
كشفت المواد العضوية ، بما في ذلك المواد العضوية التنفسية البشرية ، عن تفردها وقوتها لدراسة مسببات الأمراض البشرية ، بما في ذلك SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34. كأداة عالمية ونشطة فسيولوجيا ، يمكن استخدام عضويات الرئة البشرية على نطاق واسع لاستكشاف بيولوجيا وأمراض الجهاز التنفسي البشري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تم إدراج J. Z. ، C.L. ، و M.C.C. كمخترعين في براءة اختراع المواد العضوية في مجرى الهواء (المنشور رقم: US-2021-0207081-A1). ولا يعلن المؤلفون الآخرون عن أي مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر مركز PanorOmic Sciences ووحدة المجهر الإلكتروني ، كلية لي كا شينغ للطب ، جامعة هونغ كونغ ، للمساعدة في التصوير البؤري وقياس التدفق الخلوي. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من صندوق البحوث الصحية والطبية (HMRF و 17161272 و 19180392) التابع لمكتب الأغذية والصحة. الصندوق العام للبحوث (GRF، 17105420) التابع لمجلس المنح البحثية؛ Health@InnoHK، لجنة الابتكار والتكنولوجيا، حكومة منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M.
- Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F (2021).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H.
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
