Summary
В протоколе представлен метод получения органоидов легких человека из первичных легочных тканей, расширения органоидов легких и индуцирования проксимальной дифференцировки для генерации 3D и 2D органоидов дыхательных путей, которые точно фенокопируют эпителий дыхательных путей человека.
Abstract
Отсутствие надежной in vitro модели респираторного эпителия человека препятствует пониманию биологии и патологии дыхательной системы. Мы описываем определенный протокол для получения органоидов легких человека из взрослых стволовых клеток в легочной ткани и индуцирования проксимальной дифференцировки для генерации зрелых органоидов дыхательных путей. Затем органоиды легких последовательно расширяются в течение более 1 года с высокой стабильностью, в то время как дифференцированные органоиды дыхательных путей используются для морфологического и функционального моделирования эпителия дыхательных путей человека до почти физиологического уровня. Таким образом, мы устанавливаем надежную органоидную модель эпителия дыхательных путей человека. Долгосрочное расширение легочных органоидов и дифференцированных органоидов дыхательных путей создает стабильный и возобновляемый источник, позволяющий ученым реконструировать и расширять эпителиальные клетки дыхательных путей человека в культуральных чашках. Органоидная система легких человека обеспечивает уникальную и физиологически активную модель in vitro для различных применений, включая изучение взаимодействия вируса и хозяина, тестирование лекарств и моделирование заболеваний.
Introduction
Органоиды стали надежным и универсальным инструментом для моделирования in vitro развития органов и изучения биологии и болезней. При культивировании в культуральной среде, определяемой фактором роста, взрослые стволовые клетки (ASC) из различных органов могут быть расширены в 3-мерном (3D) и самособраны в органоподобные клеточные кластеры, состоящие из нескольких типов клеток, называемых органоидами. Лаборатория Клеверса сообщила о происхождении первого органоида, полученного из САС, органоида кишечника человека, в 2009 году 1,2. После этого были установлены органоиды, полученные из САС, для различных органов и тканей человека, включая простату 3,4, печень 5,6, желудок 7,8,9, поджелудочную железу10, молочную железу11 и легкие 12,13 . Эти органоиды, полученные из ASC, сохраняли критические клеточные, структурные и функциональные свойства нативного органа и поддерживали генетическую и фенотипическую стабильность в культуре долгосрочного расширения14,15.
Органоиды также могут быть получены из плюрипотентных стволовых клеток (PSC), включая эмбриональные стволовые (ES) клетки и индуцированную плюрипотентную стволовую (iPS) клетку16. В то время как органоиды, полученные из PSC, используют механизмы развития органов для своего создания, ИСС могут быть принуждены к образованию органоидов путем восстановления условий, которые имитируют нишу стволовых клеток во время физиологического самообновления тканей или восстановления тканей. Органоиды, полученные из PSC, являются благоприятными моделями для изучения развития и органогенеза, хотя и не могут достичь сопоставимого уровня созревания органоидов, полученных из ASC. Фетально-подобный статус созревания органоидов, полученных из PSC, и сложность создания этих органоидов существенно препятствуют их широкому применению для изучения биологии и патологии в зрелых тканях.
Дыхательные пути человека, от носа до терминальных бронхиол, выстланы эпителием дыхательных путей, также называемым псевдостратифицированным реснитчатым эпителием, который состоит из четырех основных типов клеток, то есть реснитчатых клеток, бокаловидных клеток, базальных клеток и клубных клеток. Мы установили органоид легких человека, полученный из ASC, из легочных тканей человека в сотрудничестве с лабораторией Clevers12,13. Эти леговидные органоиды последовательно расширяются в расширительной среде в течение более года; точная продолжительность варьируется между различными органоидными линиями, полученными от разных доноров. Однако, по сравнению с нативным эпителием дыхательных путей, эти долгосрочные расширяемые органоиды легких недостаточно зрелы, поскольку реснитчатые клетки, основная клеточная популяция в дыхательных путях человека, недостаточно представлены в этих легких органоидах. Таким образом, мы разработали протокол проксимальной дифференцировки и сгенерировали 3D и 2D органоиды дыхательных путей, которые морфологически и функционально фенокопируют эпителий дыхательных путей до почти физиологического уровня.
Здесь мы предоставляем видеопротокол для получения органоидов легких человека из первичных легочных тканей, расширения органоидов легких и индуцирования проксимальной дифференцировки для генерации 3D и 2D органоидов дыхательных путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с использованием тканей человека, описанные в настоящем документе, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Гонконга / Управлением больниц Гонконга Западного кластера (UW13-364 и UW21-695). Информированное согласие было получено от пациентов до сбора тканей.
1. Происхождение органоида легких человека
- Подготовка экспериментальных материалов
- Готовят базальную среду, добавляя усовершенствованную среду DMEM/F12 2 мМ глутамина, 10 мМ HEPES, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
- Приготовьте среду расширения органоидов легких человека, добавив базальную среду 10% кондиционированной средой R-спондина 1, 10% кондиционированной средой Ноггина, 1x добавкой B27, 1,25 мМ N-ацетилцистеина, 10 мМ никотинамида, 5 мкМ Y-27632, 500 нМ A-83-01, 1 мкМ SB202190, 5 нг/мл фактора роста фиброблста (FGF)-7, 20 нг/мл FGF-10 и 100 мкг/мл примоцина (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кондиционированная среда R-спондина 1 и Ноггина может быть заменена коммерческим рекомбинантным R-спондином 1 (500 нг/мл) и Ноггином (100 нг/мл). - Предваренная 24-луночная суспензионная культуральная пластина в инкубаторе клеточной культуры. Используйте стандартный инкубатор клеточных культур с 5% CO2 и увлажненной атмосферой при 37 °C. Матрица размораживания подвала в холодильнике с температурой 4 °C. Держите подвальную матрицу и культуральную среду на льду во время экспериментов.
- Выделение клеток из легочных тканей человека для 3D органоидной культуры
- Закупайте свежерезированные легочные ткани человека размером около 0,5 см у пациентов, которые подвергаются хирургической резекции из-за различных заболеваний. Транспортировать легочные ткани в 30 мл базальной среды при комнатной температуре и как можно быстрее обрабатывать внутри вытяжки биобезопасности.
- Измельчите легочные ткани небольшими кусочками (0,5-1 мм) стерильным скальпелем в чашке для культивирования клеток 10 см. Промыть кусочки ткани 10 мл холодной базальной среды в центрифужной трубке объемом 15 мл с последующим центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу в 8 мл базальной среды, дополненной коллагеназой в конечной концентрации 2 мг/мл. Переваривайте кусочки ткани, встряхивая трубку со скоростью 120 об/мин в течение 30-40 мин при 37 °C.
- Пипетка вверх и вниз в течение 20 раз, чтобы срезать переваренные кусочки ткани с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Сложите сетчатый фильтр 100 мкм на центрифужную трубку объемом 50 мл и отфильтруйте суспензию.
- Извлеките кусочки ткани на ситечке с базальной средой и перенесите их в центрифужную трубку объемом 15 мл с последующим вторым раундом сдвига и фильтрации. Дополнительная сдвиг-фильтрация может быть выполнена 1x-2x для выделения большего количества клеток, особенно когда закупается небольшой кусочек ткани (например, <0,5 см).
- Добавьте FBS к проточному потоку с конечной концентрацией 2% для прекращения пищеварения с последующим центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Повторно суспендируют ячейку гранулы в 10 мл базальной среды с последующим центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °С. Выбросьте супернатант.
- (Необязательно) Если в грануле видно много эритроцитов (оценивается по цвету гранулы), повторно суспендируют клеточную гранулу в 2 мл буфера лизиса эритроцитов и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем добавляют в пробирку 10 мл базальной среды с последующим центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
- Повторно суспендировать гранулы в холодной подвальной матрице и держать на льду. Добавьте 80-160 мкл фундаментного матрикса для клеток, извлеченных из легочной ткани размером около 0,5 см; количество достаточно для посева 2-4 капель.
- Дозируйте по 40 мкл суспензии в каждую лунку предварительно нагретой 24-луночной суспензионной культуральной пластины. Инкубируют культуральную пластину при 37 °C в течение 10-15 мин. Дайте фундаментной матрице затвердеть, чтобы образовалась капля.
- Добавьте в каждую лунку 500 мкл среды расширения органоидов легких человека, дополненной 5 нМ бета-1 герегулина, и инкубируйте пластинку в инкубаторе клеточной культуры.
- Обновляйте среду каждые 3 дня. Удалите старую среду, сохраняя каплю неповрежденной, и добавьте свежую среду с осторожностью. Прохождение органоидов после инкубации в течение 10-14 дней. Используйте Херегулин бета-1 только в исходной культуре перед первым прохождением.
- Понаблюдайте за органоидами под микроскопом, чтобы убедиться, что органоиды не встроены с очень высокой плотностью клеток. Если капля распадается из-за чрезмерно высокой плотности клеток, восстановите и повторно встройте органоиды и клетки с большим объемом фундаментного матрикса, чтобы сделать больше капель с более низкой и желательной плотностью клеток.
2. Расширение легочных органоидов человека
- Подготовьте пипетку Пастера, сжигая наконечник пипетки Пастера на пламя, такое как горелка Бунзена, чтобы сузить отверстие от 1,5 мм до примерно 1,0 мм в диаметре. Охладите пипетки с последующим автоклавированием для стерилизации. Смочите пипетки базальной средой, чтобы избежать прикрепления и потери клеток во время механической резки.
- Прохождение органоидов легких с механической сдвигом
- Используйте наконечник 1 мл и пипетку вверх и вниз, чтобы разбить капли, полученные выше. Затем перенесите органоиды вместе со средой в центрифужную трубку объемом 15 мл и отрегулируйте объем до 10 мл с холодной базальной средой. Выбрасывайте супернатант после центрифугирования при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C
- Еще раз промыть органоиды 10 мл холодной базальной среды. Повторное суспендирование органоидов в 2 мл холодной базальной среды. Пипетка вверх и вниз, чтобы разрезать органоиды на мелкие кусочки пипеткой Пастера.
- Дополнить базальной средой общим объемом 10 мл с последующим центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторное суспендирование фрагментов органоидов с матрицей холодного фундамента, достаточной для обеспечения расширения от 1:3 до 1:5. Держитесь на льду.
- Поместите 40 мкл органоидной суспензии в каждую лунку предварительно нагретой 24-луночной пластины. Инкубируют культуральную пластину при 37 °C в течение 10-15 мин. Дайте матрице подвала затвердеть.
- Добавьте 500 мкл легочной органоидной расширительной среды в каждую лунку и инкубируйте в инкубаторе клеточной культуры. Обновляйте среду каждые 3 дня. Прохождение органоидов каждые 2 недели с соотношением 1:3 к 1:5.
- Прохождение органоидов легких с трипсинизацией
ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсинизация предпочтительна, когда трудно разрезать органоид легких на мелкие кусочки с помощью пипетки Пастера, или размер органоидов сильно варьируется, или последующие эксперименты требуют органоидов более однородного размера.- Извлечение органоидов легких, как показано на этапе 2.2.1. Повторно суспендируют органоид в 1 мл фермента диссоциации и инкубируют на водяной бане 37 °C в течение 3-5 мин.
- Добавьте в пробирку 1 мл базальной среды. Срезайте органоиды механически, пипетируя органоиды вверх и вниз на мелкие кусочки с помощью пипетки Пастера. Проверьте размер органоидных фигур под микроскопом при 4-кратном увеличении. Затем добавьте 40 мкл FBS, чтобы прекратить пищеварение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Определить размер органоидных фрагментов под микроскопом в соответствии с экспериментальной компоновкой. Если для эксперимента требуется больше органоидов или органоидов более однородного размера, разрежьте органоиды на более мелкие кусочки или даже отдельные клетки. Затем требуется больше времени, вероятно, 3 недели, прежде чем органоиды будут готовы к экспериментам. - Долить базальной средой до конечного объема 10 мл с последующим центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 °С. Повторно суспендируют органоидные куски в холодную подвальную матрицу с объемом, достаточным для прохождения с соотношением 1:5-1:10. Держитесь на льду.
- Поместите 40 мкл органоидной суспензии в каждую лунку предварительно нагретой 24-луночной пластины. Инкубируют культуральную пластину при 37 °C в течение 10-15 мин. Дайте матрице подвала затвердеть.
- Дополнить 500 мкл легочной органоидной расширительной среды на лунку и инкубировать в инкубаторе клеточной культуры. Обновляйте носитель расширения каждые 3 дня. Прохождение органоидов через 2-3 недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Около 100 органоидов установлены в капельке 40 мкл фундаментной матрицы. Леговидные органоиды обычно растут лучше при относительно высокой плотности клеток. Повторно встраивайте органоиды с более низкой плотностью клеток, если капли распадаются или растущие органоиды соединяются вместе из-за чрезмерно высокой плотности клеток.
3. Проксимальная дифференцировка для генерации зрелых органоидов дыхательных путей
- Получение проксимальной дифференцировочной среды (PD среды) путем дополнения базальной среды раздела воздушной жидкости 1x добавкой интерфейса воздушной жидкости, 1 добавкой для поддержания интерфейса воздушной жидкости, 4 мкг/мл гепарина, 1 мкМ гидрокортизона, 10 мкМ Y-27632 и 10 мкМ DAPT (см. Таблицу материалов).
- Органоиды 3D дыхательных путей
- Инкубируют органоиды легких в расширительной среде в течение 7-10 дней после прохождения методом механической резки. Замените расширительную среду средой PD. Инкубируют органоиды в среде PD в течение 14 дней в инкубаторе клеточной культуры.
- Выбросьте ПД-среду в каждой скважине. Добавьте буфер лизата клеток для извлечения дифференцированного органоида дыхательных путей для экстракции РНК и обнаружения экспрессии клеточных генов с помощью анализа RT-qPCR.
- Альтернативно, инкубируют органоиды при 37 °C в течение 60 мин после добавления 10 мМ ЭДТА для диссоциации органоидов в отдельные клетки с последующим анализом проточной цитометрии для изучения клеточных популяций. Органоиды готовы к различным экспериментальным манипуляциям.
- Органоид 2D дыхательных путей
- Подготовьте достаточное количество 3D-органоидов легких для 2D-дифференцировки культуры. В общей сложности 1,3 х 105 и 4,5 х 105 ячеек требуются для 24-луночной проницаемой опорной вставки и 12-луночной проницаемой опорной вставки, соответственно.
- После того, как 3D-органоиды легких растут в расширительной среде в течение 2 недель, переваривайте органоиды в отдельные клетки и семяйте в 24-луночные и 12-луночные вставки для генерации 2D-органоидов дыхательных путей.
- Предварительно инкубируют вставки с базальной средой на ночь в инкубаторе клеточной культуры. Добавьте 250 мкл и 500 мкл базальной среды в верхнюю и нижнюю камеру 24-луночной пластины соответственно. Для 12-луночной пластины добавьте 500 мкл и 1000 мкл базальной среды в верхнюю и нижнюю камеры соответственно.
- Извлечение 3D-органоидов легких, как описано в шаге 2.2.1. Повторно суспендируют органоиды 1 мл фермента диссоциации и инкубируют на водяной бане 37 °C в течение 3-5 мин.
- Добавьте в пробирку 1 мл базальной среды. Пипетка вверх и вниз, чтобы разрезать органоиды на отдельные клетки с помощью пипетки Пастера и проверить клетки под микроскопом. Затем добавьте 40 мкл FBS, чтобы прекратить пищеварение.
- Отфильтруйте ячейки через сетчатый фильтр 40 мкм в центрифужную трубку объемом 50 мл. Переложите отфильтрованную клеточную суспензию в трубку объемом 15 мл. Долить базальной средой общим объемом 10 мл с последующим центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 °С.
- Повторно суспендируют гранулу, собранную из 24 капель (40 мкл), в 1-2,5 мл легочной органоидной расширительной среды в зависимости от плотности клеток в каплях. Подсчитайте количество клеток с помощью счетчика клеток под микроскопом. Отрегулируйте концентрацию в ячейке до 1,3 x 106/мл (для 24-луночных вкладышей) или 9 x 105/мл (для 12-луночных вкладышей).
- Удалите базальную среду из верхней и нижней камер. Добавьте 500 мкл и 1000 мкл расширительной среды в нижнюю камеру 24-луночной вставки и 12-луночной вставки соответственно. Семена 100 мкл и 500 мкл клеточной суспензии, приготовленной на стадии 3.3.7, попадают в апикальную камеру 24-луночной вставки и 12-луночной вставки соответственно.
- Инкубируют в инкубаторе клеточной культуры в течение 2 дней. Замените расширительную среду средой PD как в апикальной, так и в нижней камере пластин. Инкубируйте органоиды в инкубаторе клеточных культур в течение 14 дней и обновляйте среду PD каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подвижные реснички различимы в 3D и 2D органоидах под микроскопом с 7-го дня после инкубации в среде PD. После 14 дней дифференцировки культуры в среде БП органоиды дыхательных путей созревают для различных экспериментальных манипуляций. - Измеряйте трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) через день с помощью системы измерения электрического сопротивления в соответствии со стандартным протоколом, описанным в17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол позволяет получать органоиды легких человека с высоким уровнем успеха. Свежая легочная ткань человека измельчается на мелкие кусочки, а затем разлагается коллагеназой. Полученные одиночные клетки внедряются в фундаментную матрицу и инкубируются в среде расширения органоидов легких, дополненной коктейлем нишевых факторов для роста эпителиальных стволовых клеток (этап 1.1.2). На рисунке 1 показан микрофотограф свежеизолированных клеток легких, встроенных в матрицу базальной мембраны с пониженным фактором роста типа 2 (BME; Рисунок 1А, слева). Кистозные органоиды появляются и увеличиваются с течением времени (рисунок 1А, справа). Между тем, неродственные клетки постепенно подвергаются гибели клеток. Фибробласты присутствуют в культуре во время первого или второго прохода. После этого культура содержит исключительно эпителиальные органоиды, которые представляют собой органоиды легких, полученные из эпителиальных стволовых клеток, присутствующих в первичных легочных тканях. Эти органоиды легких проходят каждые 2-3 недели путем механической резки в соотношении от 1:3 до 1:5 или путем трипсинизации в соотношении от 1:5 до 1:10 (этапы 2,2-2.3). Репрезентативные микрофотографы органоидов легких после четвертого прохода показаны на рисунке 1В. После механической резки органоидные фрагменты, внедренные в BME, образуют кистозные домены в течение нескольких часов (рисунок 1B, слева). Микрофотография того же поля на 5-й день (рисунок 1В, справа) показывает, что органоиды растут с течением времени. Эти расширяющиеся органоиды легких человека содержат все четыре основных типа эпителиальных клеток дыхательных путей, включая ACCTUB + или FOXJ1 + реснитчатые клетки, P63 + базальную клетку, CC10 + клубную клетку и MUC5AC + бокаловидную клетку18 (рисунок 1C), в преждевременном состоянии. Примечательно, что эти органоиды легких человека могут последовательно и стабильно проходить в течение более 1 года. При поддержании в базовом матриксе органоиды легких, скорее всего, показывают апикальную полярность, менее 2%-3% органоидов легких показывают апикальную полярность13. В результате вершины клеток недоступны, если 3D-органоиды не разрезаны.
Однако, по сравнению с нативным эпителием дыхательных путей человека, эти долговременные расширяемые органоиды легких недостаточно зрелы, поскольку доминирующая клеточная популяция в нативном эпителии дыхательных путей человека, реснитчатой клетке, недостаточно представлена в органоиде легких. Затем мы определили среду проксимальной дифференцировки (БП) для улучшения статуса созревания органоидов легких человека. Органоиды, инкубированные в среде расширения и среде PD, со временем развивали различную морфологию (рисунок 2A). Подвижные реснички были более распространены в органоидах в среде PD, чем в среде расширения. После 2 недель дифференцировки культуры в среде БП подвижные реснички различимы в каждом отдельном органоиде (рисунок 2B и дополнительное видео 1). Интересно, что бьющиеся реснички загоняют клеточный мусор и выведенный муцин внутри органоидного просвета, чтобы вращаться в однонаправленном направлении, что адекватно повторяет мукоцилиарный эскалатор для удаления вдыхаемых частиц (Дополнительное видео 1), важный механизм самоочищения дыхательных путей человека. Мы демонстрируем, что реснитчатые клетки резко увеличились примерно до 50% в дифференцированных органоидах по сравнению с исходными органоидами легких. Чтобы оценить процентное содержание четырех типов эпителиальных клеток, органоиды 2D дыхательных путей были проанализированы методом проточной цитометрии. Вкратце, органоиды диссоциировали 10 мМ ЭДТА в течение 60 мин при 37 °C, фиксировали 4% PFA и пермеабилизировали 0,1% поверхностно-активным веществом. Впоследствии клетки инкубировали с первичными антителами (см. Таблицу материалов) в течение 1 ч при 4 °C с последующим окрашиванием вторичными антителами. Для анализа образцов использовалась система FACS. Анализ проточной цитометрии продемонстрировал, что дифференцированные органоиды вмещают четыре типа эпителиальных клеток дыхательных путей (рисунок 2C). Поэтому мы разработали протокол проксимальной дифференцировки для генерации органоидов дыхательных путей, которые могут точно имитировать эпителий дыхательных путей человека до почти физиологического уровня.
Чтобы органоидная апикальная поверхность была легкодоступной и лучше моделировала воздействие респираторных патогенов на эпителий дыхательных путей человека, мы создали 2D-монослои органоидов дыхательных путей. После 2 недель дифференцировки органоидов 2D дыхательных путей развился неповрежденный эпителиальный барьер (рисунок 3A, B). Мы также провели анализ блокировки декстрана для оценки целостности эпителиального барьера, сформированного в органоидах 2D дыхательных путей. На 10 день после культивирования в трансвеллерных вставках флуоресцеин изотиоцианат-декстран (MW 10 000) добавляли в среду верхней камеры и инкубировали при 37 °C в течение 4 ч. Среды в верхней и нижней камерах были собраны для флуоресцентного анализа. Индекс блокировки декстрана относится к интенсивности флуоресценции среды в верхней камере по сравнению с интенсивностью флуоресценции в нижней камере (рисунок 3B). Эти органоиды 2D-дыхательных путей также содержат обильные реснитчатые клетки (рисунок 3C). Реснитчатые клетки были помечены анти-β-тубулиновым IV антителом (ACCTUB) и козьим анти-мышиным 488 вторичным антителом. Конфокальные изображения были получены с помощью конфокального микроскопа. Многоканальные изображения были получены с помощью лазеров 405 нм для DAPI, 488 нм для ACCTUB и 633/640 нм для фаллоидина. Параметры визуализации корректировались в соответствии с руководством пользователя конфокального микроскопа. Вкратце, размер точечного отверстия был установлен на 1 а.е., мастер-коэффициент усиления был установлен на 650 В до 750 В с цифровым коэффициентом усиления 1,0, а мощность лазера была скорректирована для каждого канала в диапазоне от 0,2% до 5%. Обработка изображений выполнялась с использованием предоставленного аналитического программного обеспечения.
Дыхательные пути человека выстланы двумя различными типами эпителиев, то есть эпителием дыхательных путей и альвеолярным эпителием. Первый выстилает дыхательные пути от носовой полости до терминальной бронхиолы и состоит из четырех основных типов эпителиальных клеток, то есть реснитчатых клеток, бокаловидных клеток, клубных клеток и базальных клеток. Кроме того, эпителий дыхательных путей, выстилающий проксимальные и дистальные дыхательные пути, показывает переменный клеточный состав вдоль проксимально-дистальной оси. Эпителий проксимальных дыхательных путей является псевдостратифицированным, состоящим из обильных реснитчатых клеток и секрецирующих слизь бокаловидных клеток; в то время как дистальный эпителий дыхательных путей представляет собой один слой кубоидных реснитчатых и клубных клеток с меньшим количеством базальных и бокаловидных клеток19. Легочные ткани человека, используемые для получения органоидов легких, были приобретены у пациентов, перенесших хирургические резекции из-за различных заболеваний. Мы используем нормальные легочные ткани, прилегающие к больным тканям, для органоидной культуры. Эти легочные ткани обычно содержат бронхиолы переменного размера, окруженные альвеолярными мешочками. Во время начальной культуры эпителиальные стволовые клетки дыхательных путей или клетки-предшественники дыхательных путей в тканях легких выживают и размножаются благодаря нишевым факторам в среде расширения. Расширительная среда обеспечивает первоначальное выведение и долгосрочное расширение органоидов легких, направляя органоиды в незрелое состояние, в то время как протокол дифференцировки дыхательных путей генерирует органоиды дыхательных путей, фенокопирующие нативный эпителий дыхательных путей морфологически и функционально. Модельная система, включая выведение, расширение и дифференцировку органоидов легких, описана на рисунке 4. Клеточный состав в проксимальном и дистальном эпителии дыхательных путей также проиллюстрирован на рисунке 4.
Рисунок 1: Выведение, расширение и характеристика органоидов легких человека. (A) Репрезентативная микрофотография показывает одиночные клетки, встроенные в основную матрицу после выделения из легочных тканей на 0-й день (слева). На 5 день растут кистозные органоиды (справа). Шкала бара составляет 0,5 мм. (B) Репрезентативная микрофотография органоидов легких в день четвертого прохода и 5 день после прохождения. Шкала шкалы 0,5 мм. P1 и P4 представляют собой первый и четвертый отрывки. Снимки были сделаны с 10-кратным увеличением. (C) Конфокальные изображения четырех типов эпителиальных клеток дыхательных путей в органоидах легких человека. Четыре линии эпителиальных клеток дыхательных путей присутствуют в органоидах легких, включая реснитчатые клетки ACCUB + и FOXJ1 +, базальные клетки P63 +, клубные клетки CC10 + и бокаловидные клетки MUC5AC +. Ядра и клеточные нити актина уравновешиваются DAPI (синий) и фаллоидин-647 (фиолетовый) соответственно. Шкала бара составляет 10 мкм. Эта цифра была взята из13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Проксимальная дифференцировка органоидов легких человека. (А) Органоиды легких человека культивировали в среде PD или среде расширения (Exp) параллельно в течение 16 дней. Показаны ярко-полевые микрофотографы органоидов в указанные дни. Шкала полосы составляет 0,4 мм. (B) Показаны реснички в дифференцированных органоидах дыхательных путей (черная стрелка). Шкала бара составляет 20 мкм. (C) Процентное содержание отдельных типов клеток в органоидах, инкубированных в среде PD (вверху) и расширительной среде (внизу), обнаруженное анализом FACS. Показаны репрезентативные гистограммы одной органоидной линии. Эксперимент проводился в трех различных органоидных линиях. Эта цифра была взята из13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Генерация 2D дифференцированных органоидов дыхательных путей. (A) Трансэпителиальная электронная резистентность (TEER) измеряли в указанный день после инкубации в среде PD. Данные показывают среднее ± стандартного отклонения (SD) 2D монослоев в 10 вставках. (B) На 10-й день после культивирования в проницаемых опорных пластинах добавляли флуоресцеин изотиоцианат-декстран и собирали среду в верхней и нижней камерах для флуоресцентного анализа через 4 ч. Индекс блокировки декстрана относится к интенсивности флуоресценции среды в верхней камере по сравнению с интенсивностью в нижней камере. Диаметр проницаемых опорных вставок, используемых в нашем эксперименте, составляет 0,4 мкм. Без посева каких-либо клеток декстран может свободно проникать в обычные 2D-вставки. Таким образом, индекс блокировки декстрана нормального 2D (полоса, помеченная Blank) должен быть равен 1. Данные представляют собой среднее ± SD из 10 вкладышей, засеянных органоидами 2D дыхательных путей (2D органоид), и в двух пустых вставках (пустых). (C) Конфокальные изображения обильных реснитчатых клеток ACCTUB+ (зеленый) в органоидах 2D дыхательных путей. Клеточные актиновые нити контрокрашены фаллоидином-647 (фиолетовый). Шкала шкалы составляет 20 мкм. Эта цифра была взята из13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Схематическая иллюстрация деривации, расширения и дифференциации органоидов легких человека. Одиночные клетки, выделенные из легочных тканей человека, непосредственно внедряются в фундаментный матрикс и инкубируются в среде расширения органоида легких. Полученные органоиды легких человека могут быть в долгосрочной перспективе расширены с высокой стабильностью и легко извлечены из криоконсервированных запасов. После дифференцировки генерируемые органоиды дыхательных путей могут точно имитировать эпителий дыхательных путей человека. Органоиды 2D и 3D дыхательных путей были разработаны для различных экспериментальных манипуляций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительное видео 1. Синхронно бьющиеся реснички заставляют клеточный мусор вращаться однонаправленно в дифференцированных органоидах дыхательных путей13. Это видео было взято из13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Дыхательные пути человека выстланы эпителием дыхательных путей, также известным как псевдостратифицированный реснитчатый эпителий. Основными типами клеток эпителия верхних дыхательных путей являются реснитчатые клетки, которые обеспечивают скоординированное движение их апикальных ресничек для изгнания слизи и вдыхаемых частиц из дыхательных путей, бокаловидные клетки, которые производят и секретируют слизь, и базальные клетки, которые выстилают базальную мембрану и участвуют в регенерации. В небольших дыхательных путях, таких как бронхиолы, эпителий кубоидальных дыхательных путей содержит секреторные клубные клетки и меньше реснитчатых клеток, чем в верхних областях дыхательных путей. Мы описываем надежный протокол для получения органоидов легких человека из эпителиальных стволовых клеток в легочных тканях человека. Эти органоиды легких человека поддерживаются в среде расширения и последовательно проходят в течение более 1 года с высокой стабильностью. Ключевые факторы роста в среде расширения включают R-спондин, агонист Wnt20; и Ноггин, который является ингибитором передачи сигналов BMP21, а также FGF7 и FGF10. Предыдущие исследования выявили решающую роль передачи сигналов Wnt, FGF и BMP в гомеостазе респираторного эпителия 22,23,24. Расширительная среда обеспечивает начальное выведение и долгосрочное расширение легочных органоидов, направляя органоиды в незрелое состояние. Мы также разрабатываем метод проксимальной дифференцировки для генерации органоидов 3D и 2D дыхательных путей, которые вмещают четыре основных типа клеток дыхательных путей и имитируют эпителий дыхательных путей человека до почти физиологического уровня. В течение всей процедуры, включая начальное выведение, длительное расширение и проксимальную дифференцировку, не требуется ни утомительной очистки клеток, ни фидерных и стромальных клеток. Таким образом, мы устанавливаем органоидную модель эпителия дыхательных путей человека. Две фазы культуры, культура экспансии и культура дифференциации, являются взаимоисключающими. Органоиды легких обеспечивают стабильный источник для долгосрочного расширения, в то время как дифференцированные органоиды дыхательных путей добросовестно фенокопируют эпителий дыхательных путей человека. Эти органоиды поддаются различным экспериментальным манипуляциям, включая визуализацию, секвенирование РНК, анализ проточной цитометрии, генетическое редактирование и т. Д. 13,14,25,26,27.
Чтобы обеспечить высокую эффективность получения легочных органоидов, расширительная среда должна быть восстановлена точно и тщательно, что имеет важное значение для высокой скорости создания, обеспечиваемой протоколом. Основным ограничением этой органоидной модели является чистый эпителиальный состав, отсутствие стромальных клеток и иммунных клеток, присутствующих в слизистой оболочке дыхательных путей человека, что может привести к тому, что органоиды дыхательных путей в некоторой степени отклоняются от нативного эпителия дыхательных путей. Таким образом, мы стремимся создать следующее поколение респираторных органоидов, включив иммунные клетки и другие биологически значимые компоненты в нашу текущую органоидную модель.
Органоиды дыхательных путей, которые мы установили, точно имитируют многоклеточный состав и функциональность родного респираторного эпителия человека до почти физиологического уровня, что невозможно ни в каких однородных клеточных линиях. Наши органоидные модели позволяют ученым реконструировать и стабильно расширять эпителий родных дыхательных путей человека в культуральных пластинах. Эти органоиды дыхательных путей являются универсальным инструментом для изучения биологии и патологии дыхательных путей человека. Эпителиальные клетки первичных дыхательных путей, используемые в исследовательских лабораториях, не могут расширяться из-за ограниченной репликативной способности и вряд ли служат воспроизводимым и легкодоступным исследовательским инструментом.
Органоиды, в том числе органоиды дыхания человека, выявили свою уникальность и силу для изучения патогенов человека, включая SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34. В качестве универсального и физиологически активного инструмента органоиды легких человека могут широко использоваться для изучения биологии и патологии дыхательных путей человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J. Z., C.L. и M.C.C. перечислены как изобретатели в патенте на органоиды дыхательных путей (публикация No: US-2021-0207081-A1). Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Центр Панорамных Наук и Подразделение Электронного Микроскопа, Медицинский факультет Ли Ка Шинг Университета Гонконга, за помощь в конфокальной визуализации и проточной цитометрии. Эта работа была частично поддержана финансированием из Фонда медицинских исследований в области здравоохранения (HMRF, 17161272 и 19180392) Бюро продовольствия и здравоохранения; Общий исследовательский фонд (GRF, 17105420) Совета по исследовательским грантам; и Health@InnoHK, Комиссия по инновациям и технологиям, правительство Специального административного района Гонконг.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M.
- Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F (2021).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H.
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
