Summary
El protocolo presenta un método para derivar organoides pulmonares humanos a partir de tejidos pulmonares primarios, expandir los organoides pulmonares e inducir la diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D que fenopicon fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas.
Abstract
La falta de un modelo robusto in vitro del epitelio respiratorio humano dificulta la comprensión de la biología y la patología del sistema respiratorio. Describimos un protocolo definido para derivar organoides pulmonares humanos a partir de células madre adultas en el tejido pulmonar e inducir la diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias. Los organoides pulmonares se expanden consecutivamente durante más de 1 año con alta estabilidad, mientras que los organoides diferenciados de las vías respiratorias se utilizan para simular morfológica y funcionalmente el epitelio de las vías respiratorias humanas a un nivel casi fisiológico. Así, establecemos un modelo organoide robusto del epitelio de la vía aérea humana. La expansión a largo plazo de los organoides pulmonares y los organoides diferenciados de las vías respiratorias genera una fuente estable y renovable, lo que permite a los científicos reconstruir y expandir las células epiteliales de las vías respiratorias humanas en platos de cultivo. El sistema organoide pulmonar humano proporciona un modelo in vitro único y fisiológicamente activo para diversas aplicaciones, incluido el estudio de la interacción virus-huésped, las pruebas de medicamentos y el modelado de enfermedades.
Introduction
Los organoides se han convertido en una herramienta robusta y universal para el modelado in vitro del desarrollo de órganos y el estudio de la biología y la enfermedad. Cuando se cultivan en un medio de cultivo definido por el factor de crecimiento, las células madre adultas (ASC) de una variedad de órganos pueden expandirse en 3 dimensiones (3D) y autoensamblarse en grupos celulares similares a órganos compuestos de múltiples tipos de células, denominados organoides. El laboratorio de Clevers informó de la derivación del primer organoide derivado de ASC, el organoide intestinal humano, en 2009 1,2. Posteriormente, se han establecido organoides derivados de ASC para una variedad de órganos y tejidos humanos, incluyendo próstata 3,4, hígado 5,6, estómago 7,8,9, páncreas10, glándula mamaria11 y pulmón 12,13 . Estos organoides derivados de ASC conservaron las propiedades celulares, estructurales y funcionales críticas del órgano nativo y mantuvieron la estabilidad genética y fenotípica en cultivos de expansión a largo plazo14,15.
Los organoides también pueden derivarse de células madre pluripotentes (PSC), incluidas las células madre embrionarias (ES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS)16. Mientras que los organoides derivados de PSC explotan los mecanismos de desarrollo de órganos para su establecimiento, los ASC pueden ser coaccionados para formar organoides mediante la reconstrucción de condiciones que imitan el nicho de células madre durante la autorrenovación fisiológica del tejido o la reparación de tejidos. Los organoides derivados de PSC son modelos favorables para explorar el desarrollo y la organogénesis, aunque no pueden alcanzar el nivel de maduración comparable de los organoides derivados de ASC. El estado de maduración similar al fetal de los organoides derivados de PSC y la complejidad para establecer estos organoides impiden sustancialmente sus amplias aplicaciones para estudiar la biología y la patología en tejidos maduros.
El tracto respiratorio humano, desde la nariz hasta el bronquiolo terminal, está revestido con el epitelio de las vías respiratorias, también llamado epitelio ciliado pseudoestratificado, que consta de cuatro tipos principales de células, es decir, células ciliadas, células caliciformes, células basales y células club. Establecimos el organoide pulmonar humano derivado de ASC a partir de tejidos pulmonares humanos en colaboración con el laboratorio12,13 de Clevers. Estos organoides pulmonares se expanden consecutivamente en el medio de expansión durante más de un año; la duración precisa varía entre las diferentes líneas organoides obtenidas de diferentes donantes. Sin embargo, en comparación con el epitelio nativo de las vías respiratorias, estos organoides pulmonares expandibles a largo plazo no son lo suficientemente maduros ya que las células ciliadas, la principal población celular en las vías respiratorias humanas, están subrepresentadas en estos organoides pulmonares. Así, desarrollamos un protocolo de diferenciación proximal y generamos organoides de las vías respiratorias 3D y 2D que fenocopian morfológica y funcionalmente el epitelio de las vías respiratorias a un nivel casi fisiológico.
Aquí proporcionamos un protocolo de video para derivar organoides pulmonares humanos de los tejidos pulmonares primarios, expandir los organoides pulmonares e inducir la diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D.
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Protocol
Toda la experimentación con tejidos humanos descritos en este documento fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Hong Kong / Autoridad Hospitalaria Hong Kong West Cluster (UW13-364 y UW21-695). Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de la recolección de tejidos.
1. Derivación del organoide pulmonar humano
- Preparación de materiales experimentales
- Prepare el medio basal complementando el medio DMEM/F12 avanzado con 2 mM de glutamina, 10 mM HEPES, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
- Preparar el medio de expansión organoide pulmonar humana complementando el medio basal con 10% de R-spondina 1 medio condicionado, 10% de medio condicionado de Noggin, 1x suplemento de B27, 1,25 mM de N-acetilcisteína, 10 mM de nicotinamida, 5 μM de Y-27632, 500 nM de A-83-01, 1 μM de SB202190, 5 ng/mL de factor de crecimiento fibroblst (FGF)-7, 20 ng/mL de FGF-10 y 100 μg/mL de primocina (ver Tabla de Materiales).
NOTA: El medio acondicionado R-spondin 1 y Noggin puede ser reemplazado por R-spondinante comercial 1 (500 ng/mL) y Noggin (100 ng/mL). - Precalentar una placa de cultivo en suspensión de 24 pocillos en una incubadora de cultivo celular. Utilice una incubadora de cultivo celular estándar con 5% de CO2 y atmósfera humidificada a 37 °C. Descongele la matriz del sótano en una nevera de 4 °C. Mantenga la matriz del sótano y el medio de cultivo en hielo durante la experimentación.
- Aislamiento celular de tejidos pulmonares humanos para cultivo de organoides en 3D
- Procure tejidos pulmonares humanos recién resecados de un tamaño de alrededor de 0,5 cm de pacientes que se someten a resección quirúrgica debido a diversas enfermedades. Transportar los tejidos pulmonares en 30 ml de medio basal a temperatura ambiente y procesarlos lo más rápido posible dentro de una campana de bioseguridad.
- Picar los tejidos pulmonares en trozos pequeños (0,5-1 mm) con un bisturí estéril en una placa de cultivo celular de 10 cm. Lavar las piezas de tejido con 10 ml de medio basal frío en un tubo centrífugo de 15 ml, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Desechar el sobrenadante y resuspend el pellet en 8 mL de medio basal suplementado con colagenasa a una concentración final de 2 mg/mL. Digiera las piezas de tejido agitando el tubo a 120 rpm durante 30-40 min a 37 °C.
- Pipetee hacia arriba y hacia abajo durante 20x para cortar las piezas de tejido digeridas utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Apilar un colador de 100 μm en un tubo centrífugo de 50 ml y filtrar la suspensión.
- Recupere las piezas de tejido en el colador con el medio basal y transfiéralas a un tubo centrífugo de 15 ml, seguido de una segunda ronda de cizallamiento y filtrado. Se puede realizar un filtrado de cizallamiento adicional 1x-2x para aislar más células, especialmente cuando se adquiere un pequeño trozo de tejido (por ejemplo, <0,5 cm).
- Agregue FBS al flujo con una concentración final del 2% para terminar la digestión, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspend el pellet celular en 10 mL de medio basal, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- (Opcional) Si se ven muchos eritrocitos en el pellet (estimado por el color del pellet), vuelva a suspender el pellet celular en 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube a temperatura ambiente durante 5 min. Luego, agregue 10 ml de medio basal al tubo, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet en la matriz del sótano frío y manténgalo en hielo. Añadir 80-160 μL de matriz basal para células recuperadas de un tejido pulmonar de tamaño alrededor de 0,5 cm; la cantidad es suficiente para sembrar 2-4 gotas.
- Dispensar 40 μL de suspensión a cada pocillo de una placa de cultivo de suspensión de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 10-15 min. Deje que la matriz del sótano se solidifique para formar una gota.
- Añadir 500 μL de medio de expansión de organoides pulmonares humanos suplementado con 5 nM de Heregulin beta-1 a cada pocillo e incubar la placa en una incubadora de cultivo celular.
- Refresque el medio cada 3 días. Retire el medio viejo mientras mantiene la gota intacta y agregue el medio fresco con precaución. Pase los organoides después de la incubación durante 10-14 días. Use Heregulin beta-1 solo en el cultivo inicial antes del primer pasaje.
- Observe los organoides bajo un microscopio para asegurarse de que los organoides no estén incrustados con una densidad celular muy alta. Si una gota se desintegra debido a una densidad celular demasiado alta, recupere y vuelva a incrustar los organoides y las células con un mayor volumen de matriz basal para hacer más gotas con una densidad celular más baja y deseable.
2. Expansión de organoides pulmonares humanos
- Prepare una pipeta Pasteur quemando la punta de una pipeta Pasteur en una llama, como un quemador Bunsen, para reducir la abertura de 1,5 mm a alrededor de 1,0 mm de diámetro. Enfríe las pipetas, seguido de un autoclave para esterilizar. Humedezca las pipetas con el medio basal para evitar la fijación y pérdida de células durante el cizallamiento mecánico.
- Paso de organoides pulmonares con cizallamiento mecánico
- Use una punta de 1 ml y pipetee hacia arriba y hacia abajo para romper las gotas obtenidas arriba. Luego, transfiera los organoides junto con el medio a un tubo centrífugo de 15 ml y ajuste el volumen a 10 ml con medio basal frío. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C
- Lavar los organoides con 10 ml de medio basal frío una vez más. Resuspendir los organoides en 2 mL de medio basal frío. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para cortar los organoides en trozos pequeños con una pipeta Pasteur.
- Suplementar con medio basal a un volumen total de 10 mL, seguido de centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspend los fragmentos organoides con matriz de basamento frío suficiente para permitir una expansión de 1:3 a 1:5. Manténgase en hielo.
- Coloque 40 μL de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 10-15 min. Deje que la matriz del sótano se solidifique.
- Añadir 500 μL de medio de expansión organoide pulmonar a cada pocillo e incubar en una incubadora de cultivo celular. Refresque el medio cada 3 días. Pase los organoides cada 2 semanas con una proporción de 1:3 a 1:5.
- Paso de organoides pulmonares con tripsinización
NOTA: Se prefiere la tripsinización cuando es difícil cortar el organoide pulmonar en pedazos pequeños usando una pipeta Pasteur, o el tamaño de los organoides es muy variable, o las experimentaciones posteriores requieren organoides de tamaño más uniforme.- Extraiga los organoides pulmonares como se muestra en el paso 2.2.1. Resuspend el organoide en 1 mL de enzima disociación e incubar en un baño de agua a 37 °C durante 3-5 min.
- Agregue 1 ml de medio basal al tubo. Corta los organoides mecánicamente mediante pipeteos de los organoides hacia arriba y hacia abajo en pedazos pequeños usando una pipeta Pasteur. Compruebe el tamaño de las piezas organoides bajo un microscopio con un aumento de 4x. Luego, agregue 40 μL de FBS para terminar la digestión.
NOTA: Determine el tamaño de los fragmentos organoides bajo el microscopio de acuerdo con la disposición experimental. Si un experimento necesita más organoides u organoides de tamaño más uniforme, corte los organoides en pedazos más pequeños o incluso en células individuales. Luego, toma más tiempo, probablemente 3 semanas, antes de que los organoides estén listos para la experimentación. - Recargue con medio basal hasta un volumen final de 10 ml, seguido de centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspend las piezas organoides en matriz de basamento frío con un volumen suficiente para pasar con una proporción de 1:5-1:10. Manténgase en hielo.
- Coloque 40 μL de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 10-15 min. Deje que la matriz del sótano se solidifique.
- Suplementar con 500 μL de medio de expansión organoide pulmonar por pozo e incubar en una incubadora de cultivo celular. Actualice el medio de expansión cada 3 días. Pase los organoides después de 2-3 semanas.
NOTA: Alrededor de 100 organoides están montados dentro de una gota de 40 μL de matriz basal. Los organoides pulmonares normalmente crecen mejor con una densidad celular relativamente alta. Vuelva a incrustar los organoides con una densidad celular más baja si las gotas se desintegran o los organoides en crecimiento se unen debido a la densidad celular demasiado alta.
3. Diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias
- Preparar el medio de diferenciación proximal (medio PD) complementando el medio basal de interfaz líquida de aire con 1 suplemento de interfaz de líquido de aire, 1 suplemento de mantenimiento de interfaz líquida de aire, 4 μg/ml de heparina, 1 μM de hidrocortisona, 10 μM de Y-27632 y 10 μM de DAPT (ver Tabla de Materiales).
- Organoides 3D de las vías respiratorias
- Incubar organoides pulmonares en el medio de expansión durante 7-10 días después de la transmisión a través de cizallamiento mecánico. Reemplace el medio de expansión por el medio PD. Incubar los organoides en el medio PD durante 14 días en una incubadora de cultivo celular.
- Deseche el medio de DP en cada pozo. Agregue un tampón de lisado celular para cosechar el organoide diferenciado de las vías respiratorias para la extracción de ARN y la detección de la expresión génica celular mediante el ensayo RT-qPCR.
- Alternativamente, incube los organoides a 37 ° C durante 60 minutos después de la adición de 10 mM EDTA para disociar los organoides en células individuales, seguido de un análisis de citometría de flujo para examinar las poblaciones celulares. Los organoides están listos para diversas manipulaciones experimentales.
- Organoide 2D de las vías respiratorias
- Preparar suficientes organoides pulmonares 3D para el cultivo de diferenciación 2D. Se requiere un total de 1,3 x 105 y 4,5 x 105 celdas para un inserto de soporte permeable de 24 pocillos y un inserto de soporte permeable de 12 pocillos, respectivamente.
- Después de que los organoides pulmonares 3D crezcan en el medio de expansión durante 2 semanas, digiera los organoides en células individuales y firme en los insertos de 24 y 12 pocillos para generar organoides de las vías respiratorias 2D.
- Preincubar los insertos con el medio basal durante la noche en una incubadora de cultivo celular. Agregue 250 μL y 500 μL de medio basal en la cámara superior e inferior de una placa de 24 pocillos, respectivamente. Para una placa de 12 pocillos, agregue 500 μL y 1,000 μL de medio basal en la cámara superior e inferior, respectivamente.
- Cosechar organoides pulmonares 3D como se describe en el paso 2.2.1. Resuspendir los organoides con 1 ml de enzima disociación e incubar en un baño de agua a 37 °C durante 3-5 min.
- Agregue 1 ml de medio basal al tubo. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para cortar los organoides en células individuales con una pipeta Pasteur y verifique las células bajo un microscopio. Luego, agregue 40 μL de FBS para terminar la digestión.
- Filtre las células a través de un colador de 40 μm en un tubo centrífugo de 50 ml. Transfiera la suspensión de la celda filtrada a un tubo de 15 ml. Recargue con medio basal a un volumen total de 10 ml, seguido de centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
- Resuspend el pellet, recogido de 24 gotas (40 μL), en 1-2,5 mL de medio de expansión organoide pulmonar dependiendo de la densidad celular en las gotas. Cuente el número de células con un contador celular bajo un microscopio. Ajuste la concentración de la celda a 1,3 x 106/ml (para insertos de 24 pocillos) o 9 x 105/ml (para insertos de 12 pocillos).
- Retire el medio basal de las cámaras superior e inferior. Agregue 500 μL y 1.000 μL de medio de expansión en la cámara inferior del inserto de 24 pocillos y el inserto de 12 pocillos, respectivamente. Semilla de 100 μL y 500 μL de suspensión celular preparada en la etapa 3.3.7 en la cámara apical del inserto de 24 pocillos y el inserto de 12 pocillos, respectivamente.
- Incubar en una incubadora de cultivo celular durante 2 días. Reemplace el medio de expansión con el medio PD en la cámara apical e inferior de las placas. Incubar los organoides en la incubadora de cultivo celular durante 14 días y refrescar el medio de EP cada 3 días.
NOTA: Los cilios móviles son discernibles en los organoides 3D y 2D bajo un microscopio desde el día 7 después de la incubación en el medio PD. Después de 14 días de cultivo de diferenciación en el medio de EP, los organoides de las vías respiratorias están maduros para diversas manipulaciones experimentales. - Mida la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) cada dos días utilizando un sistema de medición de resistencia eléctrica de acuerdo con un protocolo estándar descrito en17.
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Representative Results
Este protocolo permite la derivación de organoides pulmonares humanos con una alta tasa de éxito. El tejido pulmonar humano fresco se pica en trozos pequeños y luego se descompone con colagenasa. Las células individuales resultantes se incrustan en la matriz del basamento y se incuban en el medio de expansión organoide pulmonar complementado con un cóctel de factores de nicho para el crecimiento de células madre epiteliales (paso 1.1.2). La Figura 1 muestra la microfotografía de células pulmonares recién aisladas incrustadas en la matriz de membrana basal de factor de crecimiento reducido Tipo 2 (BME; Figura 1A, izquierda). Los organoides quísticos aparecen y se agrandan con el tiempo (Figura 1A, derecha). Mientras tanto, las células no relacionadas sufren la muerte celular gradualmente. Los fibroblastos están presentes en el cultivo durante el primer o segundo pasaje. Posteriormente, el cultivo contiene exclusivamente organoides epiteliales, que son organoides pulmonares derivados de células madre epiteliales presentes en los tejidos pulmonares primarios. Estos organoides pulmonares se pasan cada 2-3 semanas por cizallamiento mecánico en una proporción de 1:3 a 1:5 o por tripsinización en una proporción de 1:5 a 1:10 (pasos 2.2-2.3). Las microfotografías representativas de los organoides pulmonares después del cuarto pasaje se muestran en la Figura 1B. Después del cizallamiento mecánico, los fragmentos organoides incrustados en BME forman dominios quísticos en un par de horas (Figura 1B, izquierda). Una microfotografía del mismo campo en el día 5 (Figura 1B, derecha) muestra organoides que crecen con el tiempo. Estos organoides pulmonares humanos en expansión albergan los cuatro tipos principales de células epiteliales de las vías respiratorias, incluidas las células ciliadas ACCTUB + o FOXJ1 +, las células basales P63 +, las células club CC10 + y las células caliciformes MUC5AC +18 (Figura 1C), en un estado prematuro. En particular, estos organoides pulmonares humanos pueden pasar consecutiva y establemente durante más de 1 año. Cuando se mantienen dentro de la matriz del basamento, los organoides pulmonares tienen más probabilidades de mostrar una polaridad apical-in, menos del 2%-3% de los organoides pulmonares muestran una polaridad apical-out13. Como resultado, los ápices celulares no son fácilmente accesibles a menos que los organoides 3D se abran.
Sin embargo, en comparación con el epitelio nativo de las vías respiratorias humanas, estos organoides pulmonares expandibles a largo plazo no son lo suficientemente maduros ya que la población celular dominante en el epitelio nativo de las vías respiratorias humanas, la célula ciliada, está subrepresentada en el organoide pulmonar. A continuación, definimos un medio de diferenciación proximal (DP) para mejorar el estado de maduración de los organoides pulmonares humanos. Los organoides incubados en el medio de expansión y el medio PD desarrollaron una morfología distinta a lo largo del tiempo (Figura 2A). Los cilios móviles fueron más abundantes en los organoides en el medio de EP que en los del medio de expansión. Después de 2 semanas de cultivo de diferenciación en el medio de EP, los cilios móviles son discernibles en cada organoide (Figura 2B y Video Complementario 1). Curiosamente, los cilios que golpean impulsan los restos celulares y la mucina excretada dentro de la luz organoide para girar unidireccionalmente, lo que recapitula adecuadamente la escalera mecánica mucociliar para eliminar las partículas inhaladas (Video suplementario 1), un importante mecanismo de autolimpieza de las vías respiratorias humanas. Demostramos que las células ciliadas aumentaron dramáticamente a alrededor del 50% en los organoides diferenciados en comparación con los organoides pulmonares originales. Para evaluar los porcentajes de cuatro tipos de células epiteliales, los organoides de las vías respiratorias 2D se analizaron mediante citometría de flujo. Brevemente, los organoides se disociaron con 10 mM de EDTA durante 60 min a 37 °C, se fijaron con PFA al 4% y se permeabilizaron con surfactante al 0,1%. Posteriormente, las células se incubaron con anticuerpos primarios (ver Tabla de Materiales) durante 1 h a 4 °C seguido de tinción con anticuerpos secundarios. Se utilizó un sistema FACS para analizar las muestras. El análisis de citometría de flujo demostró que los organoides diferenciados acomodan cuatro tipos de células epiteliales de las vías respiratorias (Figura 2C). Por lo tanto, desarrollamos un protocolo de diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias que puedan simular fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas a un nivel casi fisiológico.
Para permitir que la superficie apical organoide sea fácilmente accesible y modele mejor la exposición del epitelio de las vías respiratorias humanas a patógenos respiratorios, generamos monocapas 2D de organoides de las vías respiratorias. Después de 2 semanas de cultivo de diferenciación, los organoides 2D de las vías respiratorias desarrollaron una barrera epitelial intacta (Figura 3A, B). También realizamos un ensayo de bloqueo de dextrano para evaluar la integridad de la barrera epitelial formada en organoides de las vías respiratorias 2D. El día 10 después del cultivo en insertos transwell, se añadió fluoresceína isotiocianato-dextrano (MW 10.000) en el medio de la cámara superior y se incubó a 37 °C durante 4 h. Los medios en las cámaras superior e inferior se cosecharon para un ensayo de fluorescencia. El índice de bloqueo de dextrano se refiere a la intensidad de fluorescencia del medio en la cámara superior frente a la de la cámara inferior (Figura 3B). Estos organoides 2D de las vías respiratorias también contienen abundantes células ciliadas (Figura 3C). Las células ciliadas fueron marcadas por el anticuerpo anti-β-Tubulina IV (ACCTUB) y el anticuerpo secundario anti-ratón de cabra 488. Las imágenes confocales se adquirieron utilizando un microscopio confocal. Las imágenes multicanal se adquirieron utilizando los láseres de 405 nm para DAPI, 488 nm para ACCTUB y 633/640 nm para faloidina. Los parámetros de imagen se ajustaron de acuerdo con el manual de usuario del microscopio confocal. Brevemente, el tamaño del agujero de alfiler se estableció en 1 UA, la ganancia maestra se estableció en 650 V a 750 V con una ganancia digital de 1.0, y la potencia del láser se ajustó para cada canal dentro del rango de 0.2% a 5%. El procesamiento de imágenes se realizó utilizando el software de análisis proporcionado.
El tracto respiratorio humano está revestido con dos tipos distintos de epitelios, es decir, epitelio de las vías respiratorias y epitelio alveolar. El primero recubre las vías respiratorias desde la cavidad nasal hasta el bronquiolo terminal y consta de cuatro tipos principales de células epiteliales, es decir, células ciliadas, células caliciformes, células club y células basales. Además, el epitelio de las vías respiratorias que recubre las vías respiratorias proximales y distales muestra una composición celular variable a lo largo del eje proximal-distal. El epitelio de las vías respiratorias proximales está pseudoestratificado, consistiendo en abundantes células ciliadas y células caliciformes secretoras de moco; mientras que el epitelio de la vía aérea distal es una sola capa de células cuboidales ciliadas y club con menos células basales y caliciformes19. Los tejidos pulmonares humanos utilizados para derivar organoides pulmonares se han obtenido de pacientes que se sometieron a resecciones quirúrgicas debido a diversas enfermedades. Utilizamos tejidos pulmonares normales adyacentes a los tejidos enfermos para el cultivo de organoides. Estos tejidos pulmonares suelen contener bronquiolos de tamaño variable rodeados de sacos alveolares. Durante el cultivo inicial, las células madre epiteliales de las vías respiratorias o las células progenitoras de las vías respiratorias en los tejidos pulmonares sobreviven y proliferan debido a los factores de nicho en el medio de expansión. El medio de expansión permite la derivación inicial y la expansión a largo plazo de los organoides pulmonares dirigiendo los organoides hacia un estado inmaduro, mientras que el protocolo de diferenciación de las vías respiratorias genera organoides de las vías respiratorias que fenocopian el epitelio nativo de las vías respiratorias morfológica y funcionalmente. El sistema modelo, que incluye la derivación, expansión y diferenciación de organoides pulmonares, se describe en la Figura 4. La composición celular en el epitelio de las vías respiratorias proximal y distal también se ilustra en la Figura 4.
Figura 1: Derivación, expansión y caracterización de organoides pulmonares humanos. (A) Una microfotografía representativa muestra células individuales incrustadas en la matriz del sótano después del aislamiento de los tejidos pulmonares en el día 0 (izquierda). En el día 5, los organoides quísticos están creciendo (derecha). La barra de escala es de 0,5 mm. (B) Una microfotografía representativa de organoides pulmonares el día del cuarto pasaje y el día 5 después del pasaje. La barra de escala es de 0,5 mm. P1 y P4 representan el primer y cuarto pasaje. Las imágenes fueron tomadas a un aumento de 10x. (C) Imágenes confocales de cuatro tipos de células epiteliales de las vías respiratorias en organoides pulmonares humanos. Cuatro linajes de células epiteliales de las vías respiratorias están presentes en los organoides pulmonares, incluidas las células ciliadas ACCUB+ y FOXJ1+, las células basales P63+, las células club CC10+ y las células caliciformes MUC5AC+. Los núcleos y los filamentos de actina celular se contrateñen con DAPI (azul) y faloidina-647 (púrpura), respectivamente. La barra de escala es de 10 μm. Esta cifra se ha adoptado a partir de13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diferenciación proximal de organoides pulmonares humanos. (A) Los organoides pulmonares humanos se cultivaron en el medio DE DP o en el medio de expansión (Exp) en paralelo durante 16 días. Se muestran microfotografías de campo brillante de organoides en los días indicados. La barra de escala es de 0,4 mm. (B) Se muestran cilios en los organoides diferenciados de las vías respiratorias (flecha negra). La barra de escala es de 20 μm. (C) Los porcentajes de tipos de células individuales en organoides incubados en medio PD (arriba) y medio de expansión (abajo) detectados por el análisis FACS. Se muestran los histogramas representativos de una línea organoide. El experimento se realizó en tres líneas organoides diferentes. Esta cifra se ha adoptado a partir de13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Generación de organoides diferenciados 2D de las vías respiratorias. (A) La resistencia electrónica transepitelial (TEER) se midió al día indicado después de la incubación en el medio de DP. Los datos muestran la desviación media ± estándar (DE) de las monocapas 2D en 10 insertos. (B) El día 10 después del cultivo en placas de soporte permeables, se agregó isotiocianato-dextrano de fluoresceína y se cosecharon los medios en las cámaras superior e inferior para un ensayo de fluorescencia después de 4 h. El índice de bloqueo de dextrano se refiere a la intensidad de fluorescencia del medio en la cámara superior frente a la de la cámara inferior. El diámetro de los insertos de soporte permeable utilizados en nuestro experimento es de 0,4 μm. Sin sembrar ninguna célula, el dextrano puede penetrar libremente en los insertos 2D normales. Por lo tanto, el índice de bloqueo de dextrano de un 2D normal (la barra etiquetada con Blank) debe ser 1. Los datos representan la media ± SD de 10 insertos sembrados con organoides 2D de las vías respiratorias (organoide 2D) y los de dos insertos en blanco (en blanco). (C) Imágenes confocales de abundantes células ciliadas ACCTUB+ (verdes) en organoides 2D de las vías respiratorias. Los filamentos de actina celular se contrateñen con faloidina-647 (púrpura). La barra de escala es de 20 μm. Esta cifra se ha adoptado a partir de13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ilustración esquemática de la derivación, expansión y diferenciación de organoides pulmonares humanos. Las células individuales aisladas de los tejidos pulmonares humanos se incrustan directamente en la matriz del sótano y se incuban en el medio de expansión organoide pulmonar. Los organoides pulmonares humanos derivados pueden expandirse a largo plazo con alta estabilidad y recuperarse fácilmente de las poblaciones criopreservadas. Tras la diferenciación, los organoides de las vías respiratorias generados pueden simular fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas. Se han desarrollado organoides de las vías respiratorias 2D y 3D para diversas manipulaciones experimentales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video complementario 1. Los cilios que golpean sincrónicamente hacen que los desechos celulares se arremolinan unidireccionalmente en los organoides diferenciados de las vías respiratorias13. Este video ha sido adoptado a partir de13. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Las vías respiratorias humanas están revestidas con el epitelio de las vías respiratorias, también conocido como epitelio ciliado pseudoestratificado. Los principales tipos de células del epitelio de las vías respiratorias superiores son las células ciliadas que permiten el movimiento coordinado de sus cilios apicales para expulsar el moco y las partículas inhaladas de las vías respiratorias, las células caliciformes que producen y secretan moco y las células basales que recubren la membrana basal y están implicadas en la regeneración. En las vías respiratorias pequeñas, como los bronquiolos, el epitelio cuboidal de las vías respiratorias contiene células club secretoras y menos células ciliadas que en las regiones de las vías respiratorias superiores. Describimos un protocolo robusto para derivar organoides pulmonares humanos a partir de las células madre epiteliales en los tejidos pulmonares humanos. Estos organoides pulmonares humanos se mantienen en el medio de expansión y se pasan consecutivamente durante más de 1 año con alta estabilidad. Los factores clave de crecimiento en el medio de expansión incluyen R-spondina, un agonista de Wnt20; y Noggin, que es un inhibidor de la señalizaciónBMP 21, así como FGF7 y FGF10. Estudios previos han revelado un papel crucial de la señalización de Wnt, FGF y BMP en la homeostasis del epitelio respiratorio 22,23,24. El medio de expansión permite la derivación inicial y la expansión a largo plazo de los organoides pulmonares al dirigir los organoides hacia un estado inmaduro. Además, desarrollamos un método de diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D, que acomodan cuatro tipos principales de células de las vías respiratorias y simulan el epitelio de las vías respiratorias humanas a un nivel casi fisiológico. Durante todo el procedimiento, incluida la derivación inicial, la expansión a largo plazo y la diferenciación proximal, no se requiere ni la tediosa purificación celular ni las células alimentadoras y estromales. Así, establecemos un modelo organoide del epitelio de la vía aérea humana. Las dos fases de la cultura, la cultura de expansión y la cultura de diferenciación, son mutuamente excluyentes. Los organoides pulmonares proporcionan una fuente estable para la expansión a largo plazo, mientras que los organoides diferenciados de las vías respiratorias fenocopian fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas. Estos organoides son susceptibles de diversas manipulaciones experimentales, incluyendo imágenes, secuenciación de ARN, análisis de citometría de flujo, edición genética, etc.13,14,25,26,27.
Para garantizar una alta eficiencia para derivar organoides pulmonares, el medio de expansión debe reconstituirse de manera precisa y meticulosa, lo cual es esencial para la alta tasa de establecimiento habilitada por el protocolo. Una limitación importante de este modelo organoide es la composición epitelial pura, la falta de células estromales y las células inmunes presentes en la mucosa respiratoria humana, lo que puede hacer que los organoides de las vías respiratorias se desvíen del epitelio nativo de las vías respiratorias hasta cierto punto. Por lo tanto, nos esforzamos por generar la próxima generación de organoides respiratorios mediante la incorporación de células inmunes y otros componentes biológicamente relevantes en nuestro modelo organoide actual.
Los organoides de las vías respiratorias que establecimos simulan fielmente la composición multicelular y la funcionalidad del epitelio respiratorio humano nativo a un nivel casi fisiológico, lo que es imposible en cualquier línea celular homogénea. Nuestros modelos organoides permiten a los científicos reconstruir y expandir de manera estable el epitelio nativo de las vías respiratorias humanas en placas de cultivo. Estos organoides de las vías respiratorias son una herramienta universal para estudiar la biología y la patología de las vías respiratorias humanas. Las células epiteliales primarias de las vías respiratorias utilizadas en los laboratorios de investigación no son expandibles debido a la limitada capacidad replicativa y apenas sirven como una herramienta de investigación reproducible y de fácil acceso.
Los organoides, incluidos los organoides respiratorios humanos, han revelado su singularidad y fuerza para el estudio de patógenos humanos, incluido el SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34. Como una herramienta universal y fisiológicamente activa, los organoides pulmonares humanos se pueden utilizar ampliamente para explorar la biología y la patología del tracto respiratorio humano.
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Disclosures
J. Z., C.L. y M.C.C. figuran como inventores de la patente de organoides de las vías respiratorias (publicación No: US-2021-0207081-A1). Los otros autores no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos al Centro de Ciencias Panorómicas y a la Unidad de Microscopio Electrónico, Facultad de Medicina Li Ka Shing, Universidad de Hong Kong, por su asistencia en imágenes confocales y citometría de flujo. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos del Fondo de Salud e Investigación Médica (HMRF, 17161272 y 19180392) de la Oficina de Alimentos y Salud; Fondo General de Investigación (GRF, 17105420) del Consejo de Becas de Investigación; y Health@InnoHK, Comisión de Innovación y Tecnología, el Gobierno de la Región Administrativa Especial de Hong Kong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
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