Summary
Protokollen presenterer en metode for å utlede humane lungeorganoider fra primære lungevev, utvide lungeorganoidene og indusere proksimal differensiering for å generere 3D- og 2D-luftveisorganoider som trofast fenokopierer det menneskelige luftveisepitelet.
Abstract
Mangelen på en robust in vitro-modell av det menneskelige respiratoriske epitelet hindrer forståelsen av biologien og patologien i luftveiene. Vi beskriver en definert protokoll for å utlede humane lungeorganoider fra voksne stamceller i lungevevet og indusere proksimal differensiering for å generere modne luftveisorganoider. Lungeorganoidene utvides deretter fortløpende i over 1 år med høy stabilitet, mens de differensierte luftveisorganoidene brukes til å morfologisk og funksjonelt simulere humant luftveisepiteli til et nesten fysiologisk nivå. Dermed etablerer vi en robust organoid modell av det menneskelige luftveisepitelet. Den langsiktige utvidelsen av lungeorganoider og differensierte luftveisorganoider genererer en stabil og fornybar kilde, slik at forskere kan rekonstruere og utvide de menneskelige luftveisepitelcellene i kulturretter. Det humane lungeorganoidsystemet gir en unik og fysiologisk aktiv in vitro-modell for ulike bruksområder, inkludert studier av virusvertsinteraksjon, legemiddeltesting og sykdomsmodellering.
Introduction
Organoider har blitt et robust og universelt verktøy for in vitro modellering av organutvikling og studier av biologi og sykdom. Når de dyrkes i et vekstfaktordefinert kulturmedium, kan voksne stamceller (ASC) fra en rekke organer utvides i 3-dimensjon (3D) og selvmontert i organlignende cellulære klynger sammensatt av flere celletyper, kalt organoider. Clevers' laboratorium rapporterte avledningen av den første ASC-avledede organoiden, humant tarmorganoid, i 2009 1,2. Etterpå er ASC-avledede organoider etablert for en rekke menneskelige organer og vev, inkludert prostata 3,4, lever 5,6, mage 7,8,9, bukspyttkjertel10, brystkjertel11 og lunge 12,13 . Disse ASC-avledede organoidene beholdt de kritiske cellulære, strukturelle og funksjonelle egenskapene til det opprinnelige organet og opprettholdt genetisk og fenotypisk stabilitet i langsiktig ekspansjonskultur14,15.
Organoider kan også avledes fra pluripotente stamceller (PSC), inkludert embryonale stammeceller (ES) og indusert pluripotentstamme (iPS) celle16. Mens PSC-avledede organoider utnytter mekanismene for organutvikling for etableringen, kan ASC-er tvinges til å danne organoider ved å gjenoppbygge forhold som etterligner stamcellenisjen under fysiologisk vev selvfornyelse eller vevsreparasjon. PSC-avledede organoider er gunstige modeller for å utforske utvikling og organogenese, om enn ikke i stand til å nå det sammenlignbare modningsnivået til ASC-avledede organoider. Fosterlignende modningsstatus for PSC-avledede organoider, og kompleksitet for å etablere disse organoidene forhindrer betydelig deres brede anvendelser for å studere biologi og patologi i modne vev.
Den menneskelige luftveiene, fra nese til terminal bronkiol, er foret med luftveisepitelet, også kalt pseudostratifisert ciliated epitel, som består av fire store celletyper, det vil si ciliated celle, begercelle, basalcelle og klubbcelle. Vi etablerte den ASC-avledede humane lungeorganoiden fra humant lungevev i samarbeid med Clevers' lab12,13. Disse lungeorganoidene utvides fortløpende i ekspansjonsmediet i over et år; den nøyaktige varigheten varierer mellom ulike organoidlinjer hentet fra forskjellige givere. Men sammenlignet med det opprinnelige luftveisepitelet, er disse langsiktige utvidbare lungeorganoidene ikke modne nok siden ciliated celler, den store cellepopulasjonen i den menneskelige luftveien, er underrepresentert i disse lungeorganoidene. Dermed utviklet vi en proksimal differensieringsprotokoll og genererte 3D- og 2D-luftveisorganoider som morfologisk og funksjonelt fenokopierer luftveisepitelet til et nesten fysiologisk nivå.
Her gir vi en videoprotokoll for å utlede humane lungeorganoider fra det primære lungevevet, utvide lungeorganoidene og indusere proksimal differensiering for å generere 3D- og 2D-luftveisorganoider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All eksperimentering ved hjelp av humant vev beskrevet her ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Hong Kong / Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 og UW21-695). Informert samtykke ble innhentet fra pasienter før vevsinnsamling.
1. Avledning av human lungeorganoid
- Utarbeidelse av eksperimentelle materialer
- Forbered basal medium ved å supplere avansert DMEM / F12 medium med 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin.
- Forbered humant lungeorganoid ekspansjonsmedium ved å supplere basalmedium med 10% R-spondin 1 betinget medium, 10% Noggin betinget medium, 1x B27 supplement, 1,25 mM N-acetylcysteine, 10 mM nikotinamid, 5 μM Y-27632, 500 nM A-83-01, 1 μM SB202190, 5 ng/ml første vekstfaktor (FGF)-7, 20 ng/ml FGF-10 og 100 μg/ml primocin (se materialtabellen).
MERK: Det kondisjonerte mediet R-spondin 1 og Noggin kan erstattes med kommersiell rekombinant R-spondin 1 (500 ng/ml) og Noggin (100 ng/ml). - Prewarm en 24-brønns suspensjon kulturplate i en cellekultur inkubator. Bruk en standard cellekulturinkubator med 5% CO2 og fuktet atmosfære ved 37 °C. Tine kjellermatrisen i et 4 °C kjøleskap. Hold kjellermatrisen og kulturmediet på is under eksperimentering.
- Celleisolasjon fra humant lungevev for 3D organoid kultur
- Procure nyoppussede menneskelige lungevev størrelse rundt 0,5 cm fra pasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon på grunn av ulike sykdommer. Transporter lungevevet i 30 ml basalmedium ved romtemperatur og behandle så raskt som mulig inne i en biosikkerhetshette.
- Hakk lungevev i små biter (0,5-1 mm) med en steril skalpell i en 10 cm cellekulturrett. Vask vevsstykker med 10 ml kaldt basalmedium i et 15 ml sentrifugerør, etterfulgt av sentrifugering ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatanten og resuspender pelletsen i 8 ml basalmedium supplert med kollagenal ved en endelig konsentrasjon på 2 mg/ml. Fordøye vevsstykkene ved å riste røret ved 120 o/min i 30-40 min ved 37 °C.
- Pipet opp og ned for 20x å skjære de fordøyde vevsstykkene ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Stable en 100 μm sil på et 50 ml sentrifugerør og filtrer suspensjonen.
- Gjenopprett vevstykker på silen med basalmediet og overfør dem til et 15 ml sentrifugerør, etterfulgt av en andre runde med skjæring og filtrering. Ytterligere skjærefiltrering kan utføres 1x-2x for å isolere flere celler, spesielt når et lite stykke vev (f.eks. <0,5 cm) anskaffes.
- Legg FBS til gjennomstrømningen med en endelig konsentrasjon på 2% for å avslutte fordøyelsen, etterfulgt av sentrifugering ved 400 x g i 5 min ved 4 °C.
- Resuspend cellepellet i 10 ml basalmedium, etterfulgt av sentrifugering ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
- (Valgfritt) Hvis mange erytrocytter ses i pellets (estimert av pelletsfargen), resuspenderer cellepelleten i 2 ml rød blodcellelysbuffer og inkuberer ved romtemperatur i 5 min. Tilsett deretter 10 ml basalmedium til røret, etterfulgt av sentrifugering ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Resuspend pellet i kald kjellermatrise og hold på is. Tilsett 80-160 μL kjellermatrise for celler gjenopprettet fra et lungevev av størrelse rundt 0,5 cm; mengden er tilstrekkelig til å frø 2-4 dråper.
- Dispenser 40 μL suspensjon til hver brønn av en forhåndsvarmet 24-brønns fjæringskulturplate. Inkuber kulturplaten ved 37 °C i 10–15 minutter. La kjellermatrisen størkne for å danne en dråpe.
- Tilsett 500 μL humane lungeorganoider ekspansjonsmedium supplert med 5 nM Heregulin beta-1 til hver brønn og inkuber platen i en cellekulturinkubator.
- Oppdater mediet hver tredje dag. Fjern det gamle mediet mens du holder dråpen intakt og tilsett friskt medium med forsiktighet. Passasje organoidene etter inkubasjon i 10-14 dager. Bruk Heregulin beta-1 bare i den første kulturen før første passasje.
- Vær oppmerksom på organoidene under et mikroskop for å sikre at organoidene ikke er innebygd med en svært høy celletetthet. Hvis en dråpe oppløses på grunn av en altfor høy celletetthet, gjenopprette og legge inn organoidene og cellene med et høyere volum kjellermatrise for å lage flere dråper med lavere og ønskelig celletetthet.
2. Utvidelse av humane lungeorganoider
- Forbered en Pasteur pipette ved å brenne spissen av en Pasteur pipette på en flamme, for eksempel en Bunsen brenner, for å begrense åpningen fra 1,5 mm til rundt 1,0 mm i diameter. Avkjøl pipettene, etterfulgt av autoklavering for å sterilisere. Fukt pipettene med basalmediet for å unngå cellefeste og tap under mekanisk skjæring.
- Lungeorganoider passasje med mekanisk skjæring
- Bruk en 1 ml spiss og pipet opp og ned for å bryte dråpene som er oppnådd ovenfor. Overfør deretter organoidene sammen med mediet til et 15 ml sentrifugerør og juster volumet til 10 ml med kaldt basalmedium. Kast supernatanten etter sentrifugering ved 300 x g i 5 min ved 4 °C
- Vask organoidene med 10 ml kaldt basalmedium igjen. Resuspend organoidene i 2 ml kaldt basalmedium. Pipet opp og ned for å skjære organoidene i små biter med en Pasteur pipette.
- Supplement med basal medium til et totalt volum på 10 ml, etterfulgt av sentrifugering ved 300 x g i 5 min ved 4 °C. Resuspend organoid fragmenter med kald kjeller matrise tilstrekkelig til å muliggjøre en 1:3 til 1:5 utvidelse. Hold deg på isen.
- Plasser 40 μL organoid suspensjon i hver brønn av en forvarmet 24-brønns plate. Inkuber kulturplaten ved 37 °C i 10–15 minutter. La kjellermatrisen størkne.
- Tilsett 500 μL lungeorganoid ekspansjonsmedium til hver brønn og inkuber i en cellekulturinkubator. Oppdater mediet hver tredje dag. Passasje organoidene hver annen uke med et forhold på 1:3 til 1:5.
- Lungeorganoider passasje med trypsinisering
MERK: Trypsinisering foretrekkes når det er vanskelig å skjære lungen organoid i små biter ved hjelp av en Pasteur pipet, eller størrelsen på organoidene er svært variabel, eller de påfølgende eksperimenteringene krever organoider av mer jevn størrelse.- Høst lungeorganoidene som vist i trinn 2.2.1. Resuspend organoiden i 1 ml dissosiasjonsenzym og inkubere i et 37 °C vannbad i 3-5 min.
- Tilsett 1 ml basalmedium til røret. Skjær organoidene mekanisk ved å pipetter organoidene opp og ned i små biter ved hjelp av en Pasteur pipet. Kontroller størrelsen på organoidstykker under et mikroskop ved 4x forstørrelse. Deretter legger du til 40 μL FBS for å avslutte fordøyelsen.
MERK: Bestem størrelsen på organoidfragmenter under mikroskopet i henhold til det eksperimentelle arrangementet. Hvis et eksperiment trenger flere organoider eller organoider av mer jevn størrelse, skjær organoider i mindre stykker eller til og med enkeltceller. Deretter tar det lengre tid, sannsynligvis 3 uker, før organoidene er klare for eksperimentering. - Fyll på med basalmedium til et endelig volum på 10 ml, etterfulgt av sentrifugering ved 300 x g i 5 min ved 4 °C. Resuspend de organoide delene i kald kjellermatrise med et volum som er tilstrekkelig til å passere med et forhold på 1:5-1:10. Hold deg på isen.
- Plasser 40 μL organoid suspensjon i hver brønn av en forvarmet 24-brønns plate. Inkuber kulturplaten ved 37 °C i 10–15 minutter. La kjellermatrisen størkne.
- Supplement med 500 μL lunge organoid ekspansjonsmedium per brønn og inkubere i en cellekulturinkubator. Oppdater ekspansjonsmediet hver tredje dag. Passasje organoidene etter 2-3 uker.
MERK: Rundt 100 organoider er montert i en 40 μL dråpe kjellermatrise. Lungeorganoidene vokser normalt bedre med en relativt høy celletetthet. Bygg inn organoidene på nytt med lavere celletetthet hvis dråper går i oppløsning eller de voksende organoidene festes sammen på grunn av den altfor høye celletettheten.
3. Proksimal differensiering for å generere modne luftveisorganoider
- Forbered proksimalt differensieringsmedium (PD-medium) ved å supplere luftvæskegrensesnittbasalmediet med 1x luftvæskegrensesnitttilskudd, 1x vedlikeholdstilskudd for luftvæskegrensesnitt, 4 μg/ml heparin, 1 μM hydrokortison, 10 μM Y-27632 og 10 μM DAPT (se Materiallisten).
- 3D luftveis organoider
- Inkuber lungeorganoider i ekspansjonsmediet i 7-10 dager etter passering via mekanisk skjæring. Bytt ut ekspansjonsmediet med PD-mediet. Inkuber organoidene i PD-mediet i 14 dager i en cellekulturinkubator.
- Kast PD-mediet i hver brønn. Tilsett cellelysbuffer for å høste den differensierte luftveisorganoiden for RNA-ekstraksjon og påvisning av cellulært genuttrykk ved RT-qPCR-analyse.
- Alternativt kan du inkubere organoidene ved 37 °C i 60 minutter etter tilsetning av 10 mM EDTA for å fjerne tilknytningen av organoidene i enkeltceller, etterfulgt av strømningscytometrianalyse for å undersøke cellepopulasjoner. Organoidene er klare for ulike eksperimentelle manipulasjoner.
- 2D luftveis organoid
- Forbered tilstrekkelige 3D-lungeorganoider for 2D-differensieringskultur. Totalt kreves det 1,3 x 105 og 4,5 x 105 celler for en 24-brønns gjennomtrengelig støtteinnsats og en 12-brønns gjennomtrengelig støtteinnsats.
- Etter at 3D lungeorganoider vokser i ekspansjonsmediet i 2 uker, fordøyer organoidene i enkeltceller og frø i 24-brønnen og 12-brønnsinnleggene for å generere 2D luftveisorganoider.
- Inkuber innsatsene med basalmediet over natten i en cellekulturinkubator. Tilsett henholdsvis 250 μL og 500 μL basalmedium i øverste og nederste kammer på en 24-brønns plate. For en 12-brønns plate, tilsett henholdsvis 500 μL og 1000 μL basalmedium i topp- og bunnkammeret.
- Høst 3D-lungeorganoider som beskrevet i trinn 2.2.1. Resuspend organoidene med 1 ml dissosiasjonsenzym og inkubere i et 37 °C vannbad i 3-5 min.
- Tilsett 1 ml basalmedium til røret. Pipet opp og ned for å skjære organoidene inn i enkeltceller med en Pasteur pipet og sjekk cellene under et mikroskop. Deretter legger du til 40 μL FBS for å avslutte fordøyelsen.
- Filtrer cellene gjennom en 40 μm sil i et 50 ml sentrifugerør. Overfør den filtrerte cellefjæringen til et 15 ml rør. Fyll på med basal medium til et totalt volum på 10 ml, etterfulgt av sentrifugering ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
- Resuspend pellet, samlet fra 24 dråper (40 μL), i 1-2,5 ml lungeorganoid ekspansjonsmedium avhengig av celletettheten i dråpene. Tell antall celler med en celleteller under et mikroskop. Juster cellekonsentrasjonen til 1,3 x 106/ml (for 24-brønns innsatser) eller 9 x 105/ml (for 12-brønns innsatser).
- Fjern basalmediet fra topp- og bunnkamrene. Tilsett henholdsvis 500 μL og 1000 μL ekspansjonsmedium i bunnkammeret på 24-brønnsinnsatsen og 12-brønnsinnsatsen. Frø 100 μL og 500 μL cellefjæring fremstilt i trinn 3.3.7 på det apikale kammeret til henholdsvis 24-brønnsinnsatsen og 12-brønnsinnsatsen.
- Inkuber i en cellekulturinkubator i 2 dager. Bytt ut ekspansjonsmediet med PD-mediet i både apikalt og nederste kammer på platene. Inkuber organoidene i cellekulturinkubatoren i 14 dager og oppdater PD-mediet hver tredje dag.
MERK: Mobile cilia er merkbare i 3D- og 2D-organoidene under et mikroskop fra dag 7 etter inkubasjon i PD-mediet. Etter 14 dager med differensieringskultur i PD-mediet, er luftveisorganoidene modne for ulike eksperimentelle manipulasjoner. - Mål transepitelial elektrisk motstand (TEER) annenhver dag ved hjelp av et målesystem for elektrisk motstand som er knyttet til en standardprotokoll beskrevet i17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen muliggjør avledning av humane lungeorganoider med høy suksessrate. Friskt humant lungevev blir hakket i små biter, og deretter dekomponert med kollagenaliser. De resulterende enkeltcellene er innebygd i kjellermatrisen og inkuberes i lungeorganoid ekspansjonsmediet supplert med en cocktail av nisjefaktorer for utvekst av epitelceller (trinn 1.1.2). Figur 1 viser mikrofotografen til nyisolerte lungeceller innebygd i redusert vekstfaktor kjellermembranmatrise Type 2 (BME; Figur 1A, venstre). Cystiske organoider vises og forstørres over tid (figur 1A, høyre). I mellomtiden gjennomgår de ikke-relaterte cellene celledød gradvis. Fibroblaster er til stede i kulturen under første eller andre passasjer. Etterpå inneholder kulturen epitelorganoider utelukkende, som er lungeorganoider avledet fra epitelceller tilstede i det primære lungevevet. Disse lungeorganoidene passerer hver 2-3 uker ved mekanisk skjæring i forholdet 1:3 til 1:5 eller ved prøvespinn i forholdet 1:5 til 1:10 (trinn 2.2-2.3). De representative mikrofotografiene av lungeorganoider etter fjerde passasje er vist i figur 1B. Etter mekanisk skjæring danner organoidfragmentene innebygd i BME cystiske domener innen et par timer (figur 1B, venstre). En mikrofotograf av samme felt på dag 5 (figur 1B, høyre) viser organoider som vokser over tid. Disse ekspanderende humane lungeorganoidene har alle de fire store luftveis epitelcelletypene, inkludert ACCTUB + eller FOXJ1 + ciliated celle, P63 + basalcelle, CC10 + klubbcelle og MUC5AC + begercelle18 (figur 1C), i for tidlig tilstand. Spesielt kan disse menneskelige lungeorganoidene etter hverandre og stabilt passeres i over 1 år. Når de opprettholdes i kjellermatrisen, er lungeorganoider mest sannsynlig å vise en apikal polaritet, mindre enn 2% -3% av lungeorganoider viser en apikal polaritet13. Som et resultat er celleapekser ikke lett tilgjengelige med mindre 3D-organoidene er kuttet åpne.
Men sammenlignet med det innfødte humane luftveisepitelet, er disse langsiktige utvidbare lungeorganoidene ikke tilstrekkelig modne siden den dominerende cellepopulasjonen i det innfødte humane luftveisepitelet, ciliated cell, er underrepresentert i lungeorganoidet. Vi definerte deretter et proksimalt differensieringsmiddel (PD) for å forbedre modningsstatusen til humane lungeorganoider. Organoidene inkubert i ekspansjonsmediet og PD-mediet utviklet distinkt morfologi over tid (figur 2A). Motile cilia var mer rikelig i organoidene i PD-mediet enn de i ekspansjonsmediet. Etter 2 uker med differensieringskultur i PD-mediet, er motile cilia merkbare i hver enkelt organoid (figur 2B og supplerende video 1). Interessant nok driver den bankende cilia celleavfallet og utskilt mucin inne i den organoide lumen for å virvle enveis, som tilstrekkelig rekapitulerer mukopiliartrappen for å fjerne de inhalerte partiklene (Supplementary Video 1), en viktig selvryddingsmekanisme i de menneskelige luftveiene. Vi viser at de cilierte cellene økte dramatisk til rundt 50% i de differensierte organoidene sammenlignet med de opprinnelige lungeorganoidene. For å vurdere prosentandelen av fire typer epitelceller ble 2D-luftveisorganoidene analysert av strømningscytometri. Kort sagt ble organoidene dissosiert med 10 mM EDTA i 60 minutter ved 37 °C, festet med 4 % PFA og permeabilisert med 0,1 % overflateaktivt middel. Deretter ble cellene inkubert med primære antistoffer (se Materialtabell) i 1 time ved 4 °C etterfulgt av farging med sekundære antistoffer. Et FACS-system ble brukt til å analysere prøvene. Strømningscytometrianalysen viste at differensierte organoider rommer fire epitelcelletyper for luftveier (figur 2C). Derfor utviklet vi en proksimal differensieringsprotokoll for å generere luftveisorganoider som trofast kan simulere det menneskelige luftveisepitelet til et nesten fysiologisk nivå.
For at den organoide apikale overflaten skal være lett tilgjengelig og bedre modellere den menneskelige luftveisepitelets eksponering for respiratoriske patogener, genererte vi 2D-monolayers av luftveisorganoider. Etter 2 uker med differensieringskultur utviklet 2D luftveisorganoider en intakt epitelbarriere (figur 3A, B). Vi utførte også en dextran blokkeringsanalyse for å vurdere integriteten til epitelbarrieren dannet i 2D luftveisorganoider. På dag 10 etter kultur i transwell innsatser, fluorescein isothiocyanate-dextran (MW 10,000) ble tilsatt i mediet av toppkammeret og inkubert ved 37 °C i 4 timer. Mediene i topp- og bunnkamrene ble høstet for en fluorescensanalyse. Dextran blokkeringsindeks refererer til fluorescensintensiteten til mediet i toppkammeret kontra det i bunnkammeret (figur 3B). Disse 2D-luftveisorganoidene inneholder også rikelige cilierte celler (figur 3C). Ciliated celler ble merket med anti-β-Tubulin IV antistoff (ACCTUB) og geit anti-mus 488 sekundær antistoff. Konfokale bilder ble anskaffet ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Flerkanalsbilder ble anskaffet ved hjelp av laserne 405 nm for DAPI, 488 nm for ACCTUB og 633/640 nm for Phalloidin. Avbildningsparametere ble justert i henhold til brukerhåndboken for det konfiske mikroskopet. Kort sagt ble pinhole-størrelsen satt til 1 AU, master gain ble satt til 650 V til 750 V med digital gevinst på 1,0, og lasereffekten ble justert for hver kanal innenfor området 0,2% til 5%. Bildebehandling ble utført ved hjelp av analyseprogramvaren som fulgte med.
Den menneskelige luftveiene er foret med to forskjellige typer epitel, det vil si luftveis epitel og alveolar epitel. Førstnevnte linjer luftveiene fra nesehulen til terminalbronkiolen og består av fire store typer epitelceller, det vil si ciliated celle, begercelle, klubbcelle og basalcelle. I tillegg viser luftveisepitelet som fôrer de proksimale og distale luftveiene en variabel cellulær sammensetning langs den proksimale distale aksen. Det proksimale luftveisepitelet er pseudostratifisert, bestående av rikelige ciliated celler og slim-utskillende begerceller; mens det distale luftveisepitelet er et enkelt lag med cuboidal ciliated og klubbceller med mindre basale og begerceller19. Humant lungevev som brukes til å utlede lungeorganoider har blitt anskaffet fra pasienter som gjennomgikk kirurgiske reseksjoner på grunn av ulike sykdommer. Vi bruker normalt lungevev ved siden av det syke vevet for organoid kultur. Disse lungevevene inneholder vanligvis bronkioler av variabel størrelse omgitt av alveolar sacs. Under den første kulturen overlever og sprer luftveis epitelceller eller luftveisforfedrederceller i lungevevet og sprer seg på grunn av nisjefaktorene i ekspansjonsmediet. Ekspansjonsmediet muliggjør innledende avledning og langsiktig utvidelse av lungeorganoider ved å lede organoidene mot en umoden tilstand, mens luftveisdifferensieringsprotokollen genererer luftveisorganoider som fenokopierer det opprinnelige luftveisepitelet morfologisk og funksjonelt. Modellsystemet, inkludert avledning, ekspansjon og differensiering av lungeorganoider, er skissert i figur 4. Cellulær sammensetning i det proksimale og distale luftveisepitelet er også illustrert i figur 4.
Figur 1: Avledning, ekspansjon og karakterisering av humane lungeorganoider. (A) En representativ mikrofotografi viser enkeltceller innebygd i kjellermatrisen etter isolasjon fra lungevev på dag 0 (venstre). På dag 5 vokser cystiske organoider (høyre). Skala bar er 0,5 mm. (B) En representativ mikrofotograf av lungeorganoider på dagen for fjerde passasje og dag 5 etter passasje. Skalastangen er 0,5 mm. P1 og P4 representerer første og fjerde passering. Bildene ble tatt med 10x forstørrelse. (C) Konfiskere bilder av fire epitelcelletyper i luftveier i humane lungeorganoider. Fire avgrensninger av luftveisepitelceller finnes i lungeorganoidene, inkludert ACCUB+ og FOXJ1+ cilierte celler, P63+ basale celler, CC10+ klubbceller og MUC5AC + begerceller. Nuklei og cellulære aktinfilamenter motvirkes med henholdsvis DAPI (blå) og Phalloidin-647 (lilla). Skalalinjen er 10 μm. Dette tallet er vedtatt fra13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Proksimal differensiering av humane lungeorganoider. (A) Humane lungeorganoider ble dyrket i PD-mediet eller ekspansjonsmediet (Exp) parallelt i 16 dager. Bright-field mikrofotografer av organoider på de angitte dagene vises. Skalastangen er 0,4 mm. (B) Cilia i de differensierte luftveisorganoidene vises (svart pil). Skalalinjen er 20 μm. (C) Prosentandelen av individuelle celletyper i organoider inkuberes i PD-medium (topp) og ekspansjonsmedium (bunn) som oppdaget av FACS-analyse. De representative histogrammer av en organoid linje er vist. Eksperimentet ble utført i tre forskjellige organoide linjer. Dette tallet er vedtatt fra13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Generering av 2D-differensierte luftveisorganoider. (A) Trans-epitelial elektronisk motstand (TEER) ble målt på den angitte dagen etter inkubasjon i PD-mediet. Data viser gjennomsnittlig ± standardavvik (SD) for 2D-monolag i 10 innlegg. (B) På dag 10 etter kultur i gjennomtrengelige støtteplater ble fluorescein isothiocyanate-dextran lagt til og media i topp- og bunnkamrene ble høstet for en fluorescensanalyse etter 4 timer. Dextran blokkeringsindeks refererer til fluorescensintensiteten til mediet i toppkammeret kontra det i bunnkammeret. Diameteren på gjennomtrengelige støtteinnsatser som brukes i vårt eksperiment er 0,4 μm. Uten å så noen celler, kan dextran fritt trenge inn i de normale 2D-innsatsene. Dermed bør dextran blokkeringsindeksen til en vanlig 2D (linjen merket med Blank) være 1. Data representerer gjennomsnittlig ± SD på 10 innsatser frøet med 2D luftveisorganoider (2D organoid) og de i to tomme innsatser (blank). (C) Confocal bilder av rikelig ACCTUB + ciliated celler (grønn) i 2D luftveis organoider. Cellulære aktinfilamenter motvirkes med Phalloidin-647 (lilla). Skalalinjen er 20 μm. Dette tallet er vedtatt fra13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skjematisk illustrasjon av avledning, ekspansjon og differensiering av humane lungeorganoider. Enkeltceller isolert fra humant lungevev er direkte innebygd i kjellermatrisen og inkubert i lungeorganoid ekspansjonsmediet. De avledede humane lungeorganoidene kan utvides langsiktig med høy stabilitet og lett gjenopprettes fra kryopreserverte bestander. Ved differensiering kan de genererte luftveisorganoidene trofast simulere humant luftveisepiteli. 2D- og 3D-luftveisorganoider er utviklet for ulike eksperimentelle manipulasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende video 1. Den synkront slående cilia driver celleavfallet til å virvle enveis i de differensierte luftveisorganoidene13. Denne videoen er tatt i bruk fra13. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De menneskelige luftveiene er foret med luftveisepitelet, også kjent som pseudostratifisert ciliated epitel. De viktigste celletypene av det øvre luftveisepitelet er ciliated celler som gjør det mulig for koordinert bevegelse av deres apikale cilia å utvise slim og inhalerte partikler fra luftveiene, begerceller som produserer og utskiller slim og basale celler som ligger i kjellermembranen og er involvert i regenerering. I den lille luftveien som bronkioler inneholder det cuboidale luftveisepitelet sekretoriske klubbceller og færre cilierte celler enn i de øvre luftveisområdene. Vi beskriver en robust protokoll for å utlede humane lungeorganoider fra epitel stamceller i humant lungevev. Disse humane lungeorganoidene opprettholdes i ekspansjonsmediet og etterfølgende passerer i over 1 år med høy stabilitet. Viktige vekstfaktorer i ekspansjonsmediet inkluderer R-spondin, en Wnt agonist20; og Noggin, som er en hemmer av BMP-signalering21, samt FGF7 og FGF10. Tidligere studier har avdekket en avgjørende rolle for Wnt, FGF og BMP signalering i homeostase av respiratorisk epitel 22,23,24. Ekspansjonsmediet muliggjør innledende avledning og langsiktig utvidelse av lungeorganoider ved å lede organoidene mot en umoden tilstand. Vi videreutvikler en proksimal differensieringsmetode for å generere 3D- og 2D-luftveisorganoider, som rommer fire store luftveiscelletyper og simulerer det menneskelige luftveisepitelet til et nesten fysiologisk nivå. Under hele prosedyren, inkludert innledende avledning, langsiktig ekspansjon og proksimal differensiering, er det ikke nødvendig med kjedelig cellerensing eller mater og stromale celler. Dermed etablerer vi en organoid modell av det menneskelige luftveisepitelet. De to fasene av kultur, ekspansjonskultur og differensieringskultur er gjensidig utelukkende. Lungeorganoidene gir en stabil kilde for langsiktig ekspansjon, mens differensierte luftveisorganoider trofast fenokopierer det menneskelige luftveisepitelet. Disse organoidene er mottagelige for ulike eksperimentelle manipulasjoner, inkludert avbildning, RNA-sekvensering, strømningscytometrianalyse, genetisk redigering, etc.13,14,25,26,27.
For å sikre høy effektivitet for å utlede lungeorganoider, må ekspansjonsmediet rekonstitueres nøyaktig og omhyggelig, noe som er viktig for den høye etableringsraten som er aktivert av protokollen. En stor begrensning av denne organoidmodellen er den rene epitelsammensetningen, mangel på stromale celler og immunceller tilstede i den menneskelige respiratoriske slimhinnen, noe som kan føre til at luftveiene organoider avviker fra det opprinnelige luftveisepitelet til en viss grad. Dermed streber vi etter å generere neste generasjon respiratoriske organoider ved å inkorporere immunceller og andre biologisk relevante komponenter i vår nåværende organoidmodell.
Luftveisorganoidene vi etablerte simulerer trofast multicellulær sammensetning og funksjonalitet av det innfødte menneskelige respiratoriske epitelet til et nesten fysiologisk nivå, noe som er umulig i noen homogene cellelinjer. Våre organoidmodeller gjør det mulig for forskere å rekonstruere og stabilt utvide det innfødte humane luftveisepitelet i kulturplater. Disse luftveisorganoidene er et universelt verktøy for å studere biologien og patologien til de menneskelige luftveiene. Primære epitelceller i luftveier som brukes i forskningslaboratorier, kan ikke utvides på grunn av den begrensede replikeringskapasiteten og fungerer knapt som et reproduserbart og lett tilgjengelig forskningsverktøy.
Organoider, inkludert humane respiratoriske organoider, har avslørt sin unikhet og styrke for å studere menneskelige patogener, inkludert SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34. Som et universelt og fysiologisk aktivt verktøy kan humane lungeorganoider brukes mye til å utforske biologien og patologien i den menneskelige luftveiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J. Z., C.L., og M.C.C. er oppført som oppfinnere på patentet av luftveisorganoider (publikasjon Nr: US-2021-0207081-A1). De andre forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, for hjelp til konfektavbildning og strømningscytometri. Dette arbeidet ble delvis støttet av midler fra Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 og 19180392) fra Food and Health Bureau; Forskningsrådets generelle forskningsfond (GRF, 17105420). og Health@InnoHK, innovasjons- og teknologikommisjonen, regjeringen i Hong Kongs spesielle administrative region.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M.
- Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F (2021).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H.
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
