Summary
Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A'nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.
Abstract
Karmaşık bir hücresel ortam, tek moleküllü hareketlilik analizi için zorluklar doğurur. Bununla birlikte, görüntüleme tekniklerindeki ilerleme, tek moleküllü çalışmaları geliştirmiş ve floresan etiketli moleküllerin dinamik davranışlarını tespit etmede ve anlamada büyük popülerlik kazanmıştır. Burada, Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak kinesin-3 ailesi motorların in vitro tek moleküllü çalışmaları için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Kinesin-3, hücre içi kargo taşımacılığından hücre bölünmesine ve gelişime kadar değişen hücresel ve fizyolojik fonksiyonlarda kritik roller oynayan büyük bir ailedir. Yapısal olarak aktif dimerik kinezin-3 motorlarının, memeli hücrelerinde motor eksprese edilerek hazırlanan hücre lizatlarını kullanarak tek molekül düzeyinde yüksek mikrotübül afinitesi ile hızlı ve süperprosesik hareketlilik sergilediğini daha önce göstermiştik. Laboratuvarımız hücresel, biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlar kullanarak kinesin-3 motorlarını ve düzenleyici mekanizmalarını inceler ve bu tür çalışmalar büyük ölçekte saflaştırılmış proteinler gerektirir. Bu motorların memeli hücreleri kullanılarak ekspresyonu ve saflaştırılması pahalı ve zaman alıcı olurken, prokaryotik bir ekspresyon sistemindeki ekspresyon önemli ölçüde toplanmış ve inaktif protein ile sonuçlanmıştır. Bakteriyel saflaştırma sistemleri ve memeli hücre lizatının getirdiği sınırlamaların üstesinden gelmek için, bu motorları eksprese etmek ve saflaştırmak için sağlam bir Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kurduk. Kinesin-3 motorları, gelişmiş sinyaller sağlayan ve fotobeyazlatmayı azaltan 3-tandem floresan proteinleri (3xmCitirine veya 3xmCit) ile C-terminal olarak etiketlenmiştir. Sf9 saflaştırılmış proteinlerin in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, kinezin-3 motorlarının memeli hücre lizatlarını kullanan önceki çalışmalarımıza benzer şekilde hızlı ve süperprosesik olduğunu göstermektedir. Bu testleri kullanan diğer uygulamalar, motorların oligomer koşulları, biyokimyasal çalışmalara paralel özel bağlanma ortakları ve kinetik durumları hakkında ayrıntılı bilgi içerir.
Introduction
Son derece kalabalık bir hücre ortamı, kaderindeki proteinleri ve molekülleri sıralamada birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Sitoplazma içindeki moleküllerin organizasyonu ve mekansal zamansal dağılımının bu yoğun iş yükü, moleküler motorlar ve sitoiskelet izleri tarafından kolaylaştırılmıştır. Moleküler motorlar, ATP gibi enerji para birimlerini hidrolize eden ve bu enerjiyi hareket ve kuvvet üretimisırasında kullanan enzimlerdir. Amino asit dizisi benzerliğine dayanarak, kinezinler 14 aileye ayrılır ve bu benzerliğe rağmen, her motor bir hücrenin işleyişine benzersiz bir şekilde katkıda bulunur. Kinesin-3 ailesi motorlar, vezikül taşıma, sinyalleşme, mitoz, nükleer göç ve gelişim 3,4,5 dahil olmak üzere çeşitli hücresel ve fizyolojik işlevlerle ilişkili beş alt aileden (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 ve KIF28)2 oluşan en büyüklerden birini oluşturur. Kinezin-3 taşıma fonksiyonundaki bozulma birçok nörodejeneratif bozukluk, gelişimsel defekt ve kanser hastalığına etki eder 6,7,8,9.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kinezin-3 motorlarının monomer olduğunu, ancak kargo kaynaklı dimerizasyona uğradığını ve geleneksel kinesin10,11,12,13'e kıyasla hızlı ve süperprosesik hareketliliğe neden olduğunu göstermiştir. Biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonları büyük miktarda saflaştırılmış, aktif proteine ihtiyaç duyar. Bununla birlikte, prokaryotik ekspresyon sistemindeki üretimleri, muhtemelen uyumsuz protein sentezi, katlama ve modifikasyon makineleri 14,15,16,17,18 nedeniyle inaktif veya agrega motorlarıyla sonuçlandı. Bu tür sınırlamaları aşmak ve verimi artırmak için, burada bu motorları ifade etmek ve saflaştırmak için sağlam bir Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kurduk.
Bakülovirüs ekspresyon sistemi, yüksek verimli ökaryotik rekombinant protein ekspresyonu 19,20 için konakçı sistem olarakSf9 böcek hücre hatlarını kullanır. Bakülovirüs, heterolog gen ekspresyonuna ve çözünür rekombinant proteinlerin üretimine yardımcı olan güçlü bir polihedrin promotörüne sahiptir17. Uygun maliyeti, kullanımı güvenli ve yüksek miktarda aktif protein ekspresyonu nedeniyle, güçlü bir araç haline gelmiştir21. İlgilenilen bir proteini ifade etmek için önemli bir adım, rekombinant bir bacmid üretmektir. Ticari olarak temin edilebilen bacmid üretim kitleri pahalı olduğundan ve daha fazla numune ile çalışacağımızdan kinezin-3 motorlarının hem büyük hem de küçük ekleri için bacmidlere şirket içi bir protokol geliştirdik. Sf9-saflaştırılmış kinesin-3 motorları, toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak in vitro tek moleküllü ve çok motorlu mikrotübül kayma özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Motorlar, gelişmiş sinyal sağlamak ve fotobeyazlatmayı azaltmak için 3 tandem floresan molekülleri (3xmCit) ile C-terminal olarak etiketlenmiştir. Artan sinyal-gürültü oranı, daha az fototoksisite ve kapak kaymasına yakın çok küçük bir alanın seçici görüntülenmesi nedeniyle, TIRF görüntüleme, protein dinamiklerini in vivo ve in vitro olarak tek moleküllü seviyede görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bu çalışmada, Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak kinesin-3 motorlarının saflaştırılması ve TIRF mikroskobu kullanılarak motorların in vitro tek moleküllü görüntüleme ve çok motorlu kayma analizi tartışılmaktadır. Toplamda, bu çalışma, Sf9 saflaştırılmış motorların hareketlilik özelliklerinin, memeli hücre lizatlarından hazırlanan motorlarınkiyle aynı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sisteminin, ilgilenilen herhangi bir motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uyarlanabileceğine inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sf9 kültürü, transfeksiyonu ve virüs üretimi
NOT: Sf9 hücrelerini, 28 °C'de herhangi bir antibiyotik/antimikotik olmadan 100 mL steril, tek kullanımlık konik şişede 30 mL Sf-900/SFM ortamında muhafaza edin. Süspansiyon kültürünü yörüngesel bir çalkalayıcıda 90 rpm'de tutun. CO2 ve nem bakımı gerekli değildir. Hücreler genellikle dördüncü günde 2.0 x 10 6 hücre / mL yoğunluğa ulaşmak için 0.5 x 106 hücre / mL aşılanarak her dördüncü günde bir alt kültüre alınır.
- P0 virüs stok üretimi
- Transfeksiyon için, tohum hücrelerini 4.5 x 10 5 hücre / mL akıcılığa sahip35 mm'lik bir kaba koyun ve titremeden 28 ° C'de tutun.
- 24 saat sonra, hücreler bağlandıktan ve sağlıklı göründükten sonra, aşağıda açıklandığı gibi transfeksiyona devam edin.
- Tüp A: Yapısal olarak aktif KIF1A (1-393LZ)-3xmCit-FLAG spesifik kinesin-3 motor için 1 μg bacmid DNA kodlamasını 100 μL takviyesiz Grace ortamı ile karıştırın.
- Tüp B: 6 μL transfeksiyon reaktifini 100 μL takviyesiz Grace ortamı ile karıştırın.
- Tüp A'nın içeriğini dikkatlice Tüp B'ye aktarın ve yukarı ve aşağı pipetleyerek, yukarı ve aşağı (yaklaşık 20 kez) iyice karıştırın.
- Karışımı oda sıcaklığında ~ 45 dakika boyunca inkübe edin.
- Kuluçkayı tamamladıktan sonra, yukarıdaki karışıma 0,8 mL takviyesiz Grace ortamı ekleyin ve pipetleme ile yavaşça karıştırın.
- Sf-900/SFM ortamını hücrelerden nazikçe aspire edin (transfeksiyon verimliliğini etkileyebilecek serum izlerini çıkarmak için).
- Transfeksiyon karışımını 1.1.3 adımından damla damla hücrelerin üstüne ekleyin ve plakayı 28 ° C'de 6 saat boyunca inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra, transfeksiyon karışımını dikkatlice çıkarın, 2 mL Sf-900 / SFM ortamı ekleyin ve 28 ° C'de 48 saat daha inkübe edin.
- Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında motor protein ekspresyonunu kontrol edin. Motor protein, sarı floresan proteininin bir varyantı olan floresan proteini mCitrin ile etiketlenmiştir.
NOT: Transfekte hücreler, diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve epifloresan aydınlatma ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop altında, 20x objektif (200 kat büyütme), cıva lambası ve bir EM-CCD kamera ile görselleştirilmiştir. mCitrine uyarımı ve emisyon filtresi küpü aracılığıyla hücrelerdeki mCitrin etiketli motorların ekspresyonunu izleyerek virüs üretiminin ve enfeksiyonun verimliliğini kontrol edin. Ek olarak, genişlemiş hücreler / çekirdekler gibi enfekte olmuş hücrelerin morfolojik değişikliklerini kontrol edin (Şekil 1A-C). - Yine, enfeksiyondan 72 saat sonra hücreleri kontrol edin. Genellikle hücreler yüzeyden ayrılmaya başlar (Şekil 2).
- Hücrelerin% >5'i yüzeyden ayrılırsa, medyayı 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüplerinde enfekte olmuş hücrelerle hasat edin ve 500 x g'de 5 dakika boyunca döndürün.
- Süpernatantı toplayın ve 1 mL'lik dondurucu alikotları sıvı azotta toplayın ve -80 ° C'de P0 stoğu olarak saklayın veya P1 virüs stoğu oluşturmak için kullanın.
- P1 virüsü stok üretimi
- P0 bakülovirüs stoğunu daha da arttırmak ve protein ekspresyonunu doğrulamak için, sıvı süspansiyon kültüründe Sf9 hücrelerini büyütün.
- Steril 100 mL konik şişede, hücre yoğunluğu 2 x 106 hücre/mL ve 1 mL P0 virüs stoğuna sahip 10 mL Sf-900/SFM ortamı ekleyin. 90 rpm'de sürekli sallama ile 28 ° C'de inkübe edin.
- 72 saatlik enfeksiyondan sonra, daha önce tarif edildiği gibi protein ekspresyonunu kontrol edin (adım 1.1.7). Protein ekspresyonu iyiyse (hücrelerin% >90'ı parlak bir mCitrine floresan sinyali gösterir) ve önemli miktarda hücre ölümü (yaklaşık% 10 -% 15) gösteriyorsa, hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'de 15 mL steril konik bir tüpte döndürün.
- Sıvı azotta 1 mL'lik (P1 stok) süpernat, çıtçıtlı dondurucu alikotları toplayın ve -80 ° C'de saklayın veya büyük ölçekli enfeksiyon ve protein saflaştırması için devam edin.
- Büyük ölçekli enfeksiyon
- Büyük ölçekli protein ekspresyonu için, süspansiyon kültürünün 30 mL'sini 2 x 106 hücre / mL yoğunlukta 1 mL P1 virüs stoğu ile enfekte edin ve 90 rpm'de sürekli sallanarak 28 ° C'de inkübe edin.
- Enfeksiyon sonrası ~ 72 saat sonra, protein ekspresyonunu kontrol edin (genel olarak, maksimum protein ekspresyonu enfeksiyon sonrası 65-75 saat arasında elde edilir).
- Hücrelerin% >90'ı minimum hücre ölümü (% <5) ile parlak bir floresan sinyali gösteriyorsa, hücreleri steril bir 50 mL konik tüp içinde toplayın ve 15 dakika boyunca 4 ° C'de 500 x g'de aşağı doğru döndürün.
NOT: Minimum hücre ölümü (% <5) olmalıdır, çünkü ölü hücreler hücresel içeriği ortama bırakır ve bu da eksprese edilen protein kaybına yol açar. - Süper natantı atın, hücre peletini toplayın ve protein saflaştırmaya devam edin.
2. Kinesin-3 motorlarının Sf9 saflaştırılması
- Yukarıdaki hücre peletine, 5 mM DTT, 5 μg / mL aprotinin, 5 μg / mL leupeptin ve 5 μg / mL PMSF ile taze olarak takviye edilmiş 3 mL buz gibi soğuk lizis tamponu (Ek Tablo 1) ekleyin ve hücreleri herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadan 20-25 kez pipetleyerek lize edin. Tüm tampon bileşimleri ve reaktifleri için lütfen Ek Tablo 1'e bakınız.
- Hücre lizatını 150.000 x g'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca döndürün.
- Süpernatantı taze, steril bir tüpe toplayın ve ~ 40 μL% 50 anti-FLAG M2 afinite reçinesi ile karıştırın. Karışımı 4 °C'de 3 saat boyunca uçtan uca yuvarlanarak inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra, 4 ° C'de 1 dakika boyunca 500 x g'de döndürerek FLAG reçinesini pelet edin. Peleti 26 G'lik bir iğne ile rahatsız etmeden süpernatantı nazikçe aspire edin ve atın.
- FLAG reçine peletini üç kez, 2 mM DTT, 5 μg / mL aprotinin, 5 μg / mL leupeptin ve 5 μg / mL PMSF ile taze olarak desteklenmiş buz gibi soğuk yıkama tamponu (Ek Tablo 1) ile yıkayın. Her yıkamada 4 °C'de 1 dakika boyunca 500 x g'da eğirerek boncukları topaklayın.
- Üçüncü yıkamadan sonra, peleti rahatsız etmeden yıkama tamponunu mümkün olduğunca dikkatlice boşaltın. Protein elüsyonu için, reçine peletine 100 μg / mL FLAG peptid içeren ~ 70 μL yıkama tamponu ekleyin ve uçtan uca yuvarlanma ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, reçineyi 4 ° C'de 1 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Saflaştırılmış protein içeren süpernatantı taze bir tüpe toplayın ve% 10 gliserol ile destekleyin. 5 μL'lik alikotları sıvı azotta dondurun ve daha fazla kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.
- Protein konsantrasyonunu ve verimini belirlemek için SDS-PAGE jelini çalıştırın. İlgilenilen saflaştırılmış protein ile birlikte, standart bir protein kontrolü, standart bir eğri oluşturmak için 0.2 μg, 0.4 μg, 0.6 μg, 0.8 μg ve 1 μg arasında değişen bilinen konsantrasyonların BSA'sı yüklenir. Jeli Coomassie Brilliant mavi ile lekeleyin (Şekil 3).
- ImageJ yazılımında yerleşik bir jel niceleme aracı kullanarak jeli analiz edin. İlk olarak, bilinen BSA konsantrasyonlarının bant yoğunluğunu ölçün ve standart eğriyi oluşturun. Ardından, saflaştırılmış protein bandının yoğunluğunu ölçün ve protein konsantrasyonunu belirleyin. Bunu yapmak için Image J yazılımını açın, menü çubuğundaki Analiz Et seçeneğine tıklayın ve açılır menüden Jeller'i seçin.
3. Sf9-saflaştırılmış kinezin-3 motorları kullanılarak in vitro tek moleküllü motilitesi testi
NOT: Sf9-saflaştırılmış kinezin-3 motorları, ATP devir hızı, mikrotübül afinitesi, hız, çalışma uzunluğu, adım boyutu ve kuvvet üretimi gibi biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri incelemek için kullanılabilir. Burada, Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak KIF1A'nın (1-393LZ) in vitro tek moleküllü hareketlilik analizi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Tüm tampon bileşimi ve reaktifleri için lütfen Ek Tablo 1'e bakınız.
- Mikrotübül polimerizasyonu
- Önceden soğutulmuş 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünde, aşağıdaki sırayla pipetleme yaparak bir polimerizasyon karışımı hazırlayın: 12,0 μL BRB80 tamponu, pH 6,9; 100 mM MgCl 2'nin 0,45 μL'si,25 mM GTP'nin 1 μL'si.
- Sıvı azotta depolanan 10 mg / mL tübülinden oluşan 10 μL'lik bir alikotu çıkarın, hemen çözün ve yukarıdaki polimerizasyon karışımına ekleyin. Hava kabarcığı oluşturmadan 2-3 kez pipetleyerek, hafifçe karıştırın.
NOT: Yukarıdaki adımları buz üzerinde hızlı ve kesin bir şekilde uygulayın. - Yukarıdaki karışımı 5 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.
NOT: Bu, tübülinin denatüre olmasını önlemek veya kısa mikrotübül tohumlarının oluşumunu önlemek için kritik bir adımdır. - Tüpü önceden ısıtılmış 37 °C ısı bloğu / su banyosuna aktarın ve mikrotübüllerin polimerizasyonu için 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Mikrotübüller polimerize olurken, P12 tamponunun bir alikotunu çözün ve oda sıcaklığına getirin.
- 30 dakikalık inkübasyonu tamamlamadan önce, 100 μL P12 tamponunu taze bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyerek, MT stabilizasyon tamponunu hazırlamaya başlayın. Buna, 1 μL 1 mM taksol ekleyin ve hemen karışımı vorteksleyin.
NOT: Adım 3.1.4'te inkübasyonu tamamlamadan yaklaşık 5 dakika önce MT stabilizasyon tamponunu hazırlamaya başlayın. Taxol, polimerize mikrotübülleri β-tübüline bağlayarak stabilize eder. - Mikrotübül stabilizasyon tamponunu 37 ° C'de 2-3 dakika ısıtın ve alttaki polimerizasyon karışımını bozmadan polimerize mikrotübüllere yavaşça ekleyin.
NOT: Stabilizasyon tamponunun ısıtılması, polimerizasyon karışımı ile aynı sıcaklığa getirecektir. - Karışıma dokunmayın veya pipet uygulamayın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de daha fazla inkübe edin.
- Karışıma hafifçe dokunun ve pipeti kullanarak eğimli bir kesme ucu (200 μL kapasiteli) ile yavaşça karıştırın.
NOT: Bu noktadan itibaren, mikrotübül kesmeyi önlemek için mikrotübülleri her zaman eğimli bir kesme ucuyla tutun. - Uygun mikrotübül polimerizasyonunu kontrol etmek için bir akış hücresinde 10-15 μL polimerize mikrotübül alın.
NOT: Bir DIC mikroskopi kurulumu kullanarak etiketlenmemiş mikrotübüller görselleştirilebilir. - Mikrotübüller konsantre edilmişse, bunları 10 μM taksol ile desteklenmiş P12 tamponunda seyreltin.
- Motiliteli akış hücresi odasının hazırlanması
- Bir cam slayt, çift taraflı bant ve cam kapak kayması (22 mm x 30 mm) kullanarak bir hareketlilik odası hazırlayın.
- Bir cam slayt alın, ortasına bir damla (~ 70 μL) deiyonize damıtılmış su yerleştirin ve tüy bırakmayan bir kağıt mendille silin.
- İki çift taraflı bant şeridini (~ 35 x 3 mm) kesin ve bunları cam slayta paralel olarak sıkıca yapıştırın, dar bir geçit oluşturmak için iki şerit arasında ~ 4-5 mm'lik bir boşluk bırakın.
- Daha sonra, bir kapak kayması alın ve ortasına bir damla (~ 20 μL) deiyonize damıtılmış su ekleyin. Tüy bırakmayan lens temizleme mendili kağıdından oluşan bir şeridi, suyu emene kadar su damlasının üzerine yerleştirin. Ardından, yavaşça kapak kaymasının bir ucuna doğru kaydırın.
NOT: Kapak kapağı tamamen kuru olmalıdır. Kapak kapağında su görünmemelidir. - Kapak kaymasını slayta sıkışmış çift taraflı şeritlerin üzerine yerleştirin ve sıkıca yapışması için kapak kaymasını şeritler boyunca eşit şekilde bastırın.
NOT: Lütfen kapak kapağının temizlenmiş tarafının cam kızağa baktığından emin olun. - Bunun birlikte, hareketlilik testi yapmak için 10-15 μL kapasiteli dar bir oda oluşturduğundan emin olun (Şekil 4A).
- In vitro tek moleküllü motilitesi testi
NOT: Motorların mikrotübül bazlı tek moleküllü hareketlilik özelliklerini incelemek için, mikrotübüllerin hareketlilik odasındaki örtü kayması yüzeyine adsorbe edilmesi gerekir.- Polimerize taksol stabilize mikrotübülleri, 1:5 oranlarında 10 μM taksol ile desteklenmiş P12 tamponunda seyreltin ve eğimli bir uçla yavaşça pipetleyerek karıştırın.
- Akış odasını eğimli konumda tutun (~ 15-20 °). Sıvıyı emmek için alt uçta tüy bırakmayan bir doku kağıdı tutarken, 30 μL seyreltilmiş mikrotübül çözeltisini üst uçtan akış odasından geçirin. Bu, mikrotübülü akış yönünde hizalamak için bir kesme kuvveti oluşturur ve mikrotübülleri düz adsorbe etmeye ve paralel olarak hizalamanıza yardımcı olur.
- Odanın her iki ucunda küçük bir sıvı damlası bırakın ve hareket odasının kurumasını önlemek için akış hücresini kapalı, nemli bir odada ters çevrilmiş bir konumda (kapak kayması tabana bakan) tutun.
- ~ 30 dakika bekletin, böylece mikrotübüller hareket odasının içindeki kapak kaymasının yüzeyine adsorbe olur.
- Bu arada, 500 μL P12-BSA tamponunu 5 μL 1 mM taksol ile karıştırarak blokaj tamponunu hazırlayın.
- 40-50 μL blokaj tamponu akışı sağlayın ve sürgüyü nemli bir odada 10 dakika boyunca ters çevrilmiş konumda inkübe edin.
- Aşağıdaki bileşenleri aşağıdaki sırayla 500 μL kapasiteli steril bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyerek, hareketlilik karışımını hazırlayın: Taksollü 25 μL P12 tamponu, 0,5 μL 100 mM MgCl2, 0,5 μL 100 mM DTT, 0,5 μL 20 mg/mL Glikoz oksidaz, 0,5 μL 8 mg/mL Katalaz, 0.5 μL 2.25 M Glikoz ve 1.0 μL 100 mM ATP.
NOT: Floresan görüntüleme biyolojik uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır22,23,24,25,26. Floresan proteinlerin fotoeksitasyonu, floresan proteinlerin fotobeyazlamasına ve biyolojik örneklere zarar verebilecek reaktif oksijen türleri (ROS) üretir27,28. Glikoz, glikoz oksidaz ve katalaz gibi oksijen temizleyiciler, fotohasarı sınırlamak ve floresan proteinlerin ağartma süresini uzatmak için motilitesi testlerinde rutin olarak kullanılmaktadır. - Son olarak, saflaştırılmış motorun 1 μL'sini yukarıdaki hareketlilik karışımına ekleyin ve hareketlilik odasına akmadan önce iyice karıştırın.
- Hareketlilik odasının her iki ucunu da sıvı parafin mumu ile kapatın ve 1.5x büyütme ile 1.49 NA'lık 100X TIRF hedefini kullanarak TIRF aydınlatması altında hemen görüntü alın.
- Kapak kayması yüzeyini odaklamak için, ilk olarak, diferansiyel girişim kontrastı (DIC) aydınlatması altındaki hareketlilik odasındaki çift taraflı bandın iç kenarlarından birine odaklanın.
NOT: Parlak ve düz olmayan yüzey görünür olacaktır. - Ardından, odağı hareketlilik odasına taşıyın. İnce ayar kullanarak, coverslip yüzeyine odaklanın ve coverslip yüzeyinde adsorbe edilen mikrotübülleri arayın.
- Mikrotübüller odaklandıktan sonra, 488 nm uyarma lazeri ile TIRF aydınlatmasına geçin ve en iyi ve düzgün TIRF aydınlatmasını elde etmek için uyarma ışını açısını değiştirerek aydınlatma derinliğini ayarlayın (Şekil 4B).
- 100 ms pozlama ile mikrotübül yüzeyi boyunca işlemsel olarak hareket eden mCitrine etiketli motorları odaklayın ve bir EM-CCD kamera kullanarak hareketi kaydedin.
NOT: Hareketlilik testleri etiketlenmemiş mikrotübüller üzerinde gerçekleştirilmiş olsa da, mikrotübül izinin ana hatlarını ortaya çıkarmak için maksimum yoğunluk z-projeksiyon fonksiyonu kullanılabilir. Tercihen, uzun mikrotübül izlerindeki olaylar izleme analizi için dikkate alındı. - Daha önce açıklandığı gibi ImageJ (nih.gov) yazılımında özel olarak yazılmış bir eklenti kullanarak uzun mikrotübül izleri üzerinde yürüyen floresan etiketli bireysel motorların konumunu kare kare izleyin29.
- Her bölmedeki olayların sayısını çizerek motor popülasyonu için hız ve çalışma uzunluğunun histogramlarını oluşturun. Ortalama hız ve çalışma uzunluğu12 elde etmek için bu histogramları tek bir Gauss tepe fonksiyonuna takın (Şekil 4C-E).
4. In vitro mikrotübül kayma testi
NOT: Kinesin-3 motorlarının kolektif davranışını anlamak için, in vitro mikrotübül kayma testi 18,30,31 yapılmıştır. Motorların ters çevrilmiş bir konumda kapak kayması üzerine hareketsiz hale getirildiği ve hazneye mikrotübüller eklendikten sonra, mikrotübüller motorların üzerine iner ve motorlar üzerlerinde yürümeye çalışırken kayar (Şekil 5A, B).
- Floresan mikrotübül polimerizasyonu: Rodamin etiketli tübülin (3 mg / mL) ile etiketlenmemiş tübülin (10 mg / mL) oranının 1:10 oranında karıştırılması dışında, daha önce açıklanan protokolü izleyerek mikrotübülleri polimerize edin.
- 30 dakikalık polimerizasyondan sonra, 30 μL önceden ısıtılmış mikrotübül stabilizasyon tamponunu yavaşça ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika daha inkübe edin.
- Daha sonra, kılcal yükleme ucuyla pipetleme yaparak mikrotübülleri kesin (~ 25-30 kez).
- Motiliteli akış odasını daha önce tarif edildiği gibi hazırlayın, 50 μL Sf9-saflaştırılmış GFP nanocisimciklerini (50 μL P12 tamponunda seyreltilmiş 100 nM'nin 2.5 μL'si) akıtın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin, kapak kayması nemli bir odada aşağı bakacak şekilde inkübe edin.
NOT: Motorlar C-terminali mCitrin ile etiketlenmiştir. GFP nanogövdeleri, düşük ayrışma sabiti32 nedeniyle motorları hareketsiz hale getirmek için kullanılır. - Spesifik olmayan protein adsorpsiyonunu önlemek için akış odasına 50 μL blok tamponu akıtarak kapak kayma yüzeyini bloke edin ve 5 dakika boyunca daha fazla inkübe edin.
- Motor karışımını 50 μL blok tampon, 1 μL 100mM ATP ve 5 μL 100 nM Sf9 saflaştırılmış kinesin-3 motorlarını pipetleyerek hazırlayın. Odaya akmadan önce hafifçe karıştırın ve nemli bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Odayı 50 μL P12 kazein ile iki kez yıkayın.
- Steril bir mikrosantrifüj tüpünde, kayma testi karışımını aşağıdaki sırayla hazırlayın, 10 μM taksol ile 45 μL P12-kazein, 1 μL 100 mM ATP, 0.5 μL 8 mg / mL katalaz, 0.5 μL 20 mg / mL glikoz oksidaz, 0.5 μL 2.25 M glikoz ve 1 μL kesilmiş floresan mikrotübüller. Hareketlilik odasına akmadan önce içeriği yavaşça karıştırın ve odanın uçlarını sıvı parafin mumu ile kapatın.
- 100 ms pozlamada TIRF aydınlatması altında kayan görüntü mikrotübülleri ve ekli EM-CCD kamera ile görüntüleri yakalayın.
NOT: Ortalama mikrotübül kayma hızı, ImageJ29'daki özel olarak yazılmış bir eklenti kullanılarak yaklaşık 100 ayrı mikrotübülün kare kare manuel olarak izlenmesiyle belirlenmiştir. Bir histogram üreterek ve bir Gauss fonksiyonuna uyarak ortalama mikrotübül kayma hızını belirleyin (Şekil 5C, D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aktif ve fonksiyonel rekombinant motor proteinleri Sf9-bakülovirüs ekspresyonunu kullanarak büyük ölçekte eksprese etmek ve saflaştırmak için, sistemin Sf9 hücrelerini enfekte etmek için bir kodlama dizisi taşıyan viral parçacıkların üretilmesine ihtiyacı vardır. Bunu başarmak için, Sf9 hücreleri KIF1A (1-393LZ)-3xmCit-FLAG kodlayan rekombinant bacmid ile transfekte edildi. 72 saat sonra, önemli bir hücre popülasyonu, genişlemiş hücreler ve çekirdeklerle yeşil floresan proteininin (mCitrine) ekspresyonunu gösterdi (Şekil 1 ve Şekil 2), bu da viral parçacıkların (P0) başarılı bir şekilde üretildiğini düşündürdü. Bu viral parçacıklar, depolama ve büyük ölçekli enfeksiyon için P1 viral stokları oluşturmak için taze Sf9 popülasyonunu daha yüksek bir hacimde enfekte ederek daha da genişletildi. Kinezin-3 motorunun saflaştırılması için, 30 mL'lik bir Sf9 hücresi kültürü, 1 mL P1 viral partikülleri ile enfekte edildi. 72 saatlik enfeksiyondan sonra, yeşil floresan proteinini parlak bir şekilde eksprese eden hücreler, anti-FLAG antikor kaplı reçine ile C-terminal FLAG etiket afinite saflaştırması kullanılarak toplandı, lize edildi ve saflaştırıldı. İlginç bir şekilde, kinezin-3 motorlarıyla tutturulmuş boncuklara FLAG peptidinin eklenmesi, proteinin çoğunu tek bir fraksiyonda saldı ve saflaştırılmış protein, Şekil 3'ün 7. Şeridinde ~ 120 kDa'lık bir bant olarak gösterilen yüksek saflıktaydı.
S9-saflaştırılmış kinesin-3 motorlarının motilitesini tek moleküllü bir seviyede incelemek için uzun ve sağlıklı mikrotübüllerin başarılı polimerizasyonu saf tübülin gerektirir. Bu çalışmada, mikrotübüller, taksol yokluğunda 30 dakika boyunca ~ 2.5-3.0 mg / mL arasında kritik bir konsantrasyonda keçi beyninden saflaştırılmış 2X döngülü tübül kullanılarak polimerize edildi, çünkü taksol, mikrotübül çekirdeğinin kritik konsantrasyonunu azaltır ve çok sayıda kısa mikrotübül üretir33,34,35 . Mikrotübülleri stabilize etmek ve depolimerizasyonu önlemek için polimerizasyon sonrası taksol eklendi. Bu yöntem kullanılarak polimerize edilen mikrotübüller, ortalama uzunluğu 60-70 μm olan uzun ve düzgün yapılarla (Video 1) sonuçlandı.
Sf9-saflaştırılmış kinezin-3 motorunun in vitro tek moleküllü hareketlilik analizi, TIRF aydınlatması altındaki KIF1A (1-393LZ) (Şekil 4B), kymografta uzun diyagonal beyaz çizgiler olarak gösterildiği gibi mikrotübül boyunca tek yönlü, hızlı ve süperprojik hareket sergilemiştir (Video 2). Bu uzun süperprosesif hareketlilik olaylarının izleme analizi, sırasıyla 2.44 ± 0.02 μms-1 ve 10.79 ± 0.28 μm (Şekil 4D-E) ortalama hız ve çalışma uzunluğu göstermiştir. Bu sonuçlar, memeli hücre lizatından aşırı ekspresyon yoluyla hazırlanan motorlar kullanılarak daha önce yayınlanan12,13 verilerimizle uyumludur. Ayrıca, TIRF aydınlatması altında kapak kaymasına tutturulmuş Sf9 saflaştırılmış motorları kullanan çok motorlu mikrotübül kayma testi, uzun, düzgün ve tek yönlü hareket sergilemiştir (Şekil 5C ve Video 3). Bu uzun mikrotübül kayma olaylarının izleme analizi, ortalama 1.37 ± 0.01 μms-1 hızlarını göstermiştir (Şekil 5D).
Birlikte, bu sonuçlar, Sf9-bakülovirüs sisteminin, prokaryotik sistemi kullanarak genellikle zor olan aktif motor proteinlerinin ekspresyonu ve saflaştırılması için mükemmel bir sistem sağladığını göstermektedir. FLAG etiketi, proteinin saf haliyle tek adımlı saflaştırılmasının bir avantajını sunar. Ayrıca, taze ve saf tübülin kullanılarak mikrotübül polimerizasyonu ve polimerizasyondan sonra stabilizasyonu uzun ve düzgün mikrotübüller verir. Ek olarak, in vitro tek moleküllü hareketlilik analizi, Sf9-saflaştırılmış motorların sağlam olduğunu ve memeli sistemlerinde ifade edilen motorlara benzer hareketlilik özellikleri sergilediğini göstermektedir.
Şekil 1: Floresan etiketli kinesin-3 motorlu Sf9 hücrelerinin transfeksiyonundan 48 saat sonra: Sf9 hücreleri, 4.5 x 10 5 hücre / mL yoğunlukta35 mm'lik bir çanak üzerine kaplandı. 24 saat sonra, hücreler transfeksiyon reaktifi kullanılarak spesifik kinesin-3 motorunu kodlayan rekombinant bacmid DNA, KIF1A (1-393LZ)-3xmCit-FLAG ile transfekte edildi. 48 saatlik transfeksiyondan sonra, görüntüler diferansiyel girişim ve kontrast (DIC) ve Epifloresan aydınlatma altında yakalandı. (A) Transfekte edilmemiş, küçük, yuvarlak ve sıkıca tutturulmuş hücreler. (B) KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG eksprese eden transfekte hücreler, genişlemiş hücre çapını gösteren ve yüzeye gevşek bir şekilde tutturulmuş proteini gösterir. Ölçek çubuğu, 100 μm. (C) Transfekte edilmemiş ve transfekte edilmiş hücrelerin ortalama hücre çapını gösteren çubuk grafik. Hata çubukları ortalama ± SD'yi temsil eder. Anlamlılık değerini bulmak için öğrencinin t-testi kullanılır (****p < 0.0001). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Floresan etiketli kinesin-3 motorlu Sf9 hücrelerinin 72 saat sonraki transfeksiyonu: Floresan etiketli kinesin-3 motorunu ifade eden Sf9 hücrelerinin %90'ından fazlasını gösteren görüntüler, KIF1A(1-393LZ). Hücreler yüzeye gevşek bir şekilde bağlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Sf9-saflaştırılmış kinesin-3 motoru: Sf9-saflaştırılmış kinesin-3 motorunu temsil eden Coomassie boyalı SDS-PAGE jel, KIF1A(1-393LZ) C-terminally 3xmCit-FLAG ile etiketlenmiş. Soldan sağa, Protein merdiveni (M), BSA standart protein kontrolü, 0,2 μg (şerit 2), 0,4 μg (şerit 3), 0,6 μg (şerit 4), 0,8 μg (şerit 5) ve 1,0 μg (şerit 6), saflaştırılmış kinesin-3 motor (S) (şerit 7). BSA, saflaştırılmış protein konsantrasyonunu tahmin etmek için standart olarak kullanılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sf9 saflaştırılmış kinezin-3 motorları kullanılarak in vitro tek moleküllü hareketlilik testi: (A) Bir cam slayt, çift taraflı bant ve cam kapak kayması kullanılarak hazırlanan şematik akış hücresi hareketlilik odası. (B) Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak kapak kayması üzerine adsorbe edilen mikrotübül yüzeyi boyunca hareket eden floresan etiketli motorların in vitro tek moleküllü görüntülemesini gösteren karikatür diyagramı. Sadece kapak kaymasına çok yakın moleküller, kritik açının ötesinde bir açıyla aydınlatıldığında gelen ışığın tam yansımasıyla oluşan kaçış alanı (~ 150-200 nm) nedeniyle heyecanlanır. (C) Kymograph, mikrotübül yüzeyi boyunca kinesin-3 motor yürüyüşünü (çapraz beyaz çizgiler) tasvir eder. Y eksenindeki zaman (dikey ok) ve x eksenindeki mesafe (yatay ok). (D-E) Hız (D) ve çalışma uzunluğunun (E) histogramları, mikrotübül yüzeyinde kare kare yürüyen ayrı ayrı motorların izlenmesiyle belirlendi ve histogramlar her bir motor popülasyonu için çizildi ve tek bir Gaussian'a sığdırıldı. Tepe noktası ortalama hızı ve çalışma uzunluğunu temsil eder ve değerler grafikte ortalama SEM ± olarak gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sf9 saflaştırılmış kinezin-3 motorları kullanılarak in vitro mikrotübül kayma testi: (A) Bir cam slayt, çift taraflı bant ve cam kapak kayması kullanılarak hazırlanan akış hücresi odasının şeması. (B) Yapısal olarak aktif kinesin-3 motorlarının yüzeyinde kayan rodamin etiketli mikrotübülleri gösteren karikatür diyagramı. Kinesin-3 motorları C-terminali mCitrine ile etiketlendiğinden, GFP-nanocisimleri cam yüzeye tutturmak için kullanıldı. Daha sonra, kesilmiş rodamin etiketli mikrotübüller akış odasına sokuldu ve mikrotübül kayma hareketinin görüntüleri TIRF aydınlatması altında yakalandı. (C) Kimograf, kinesin-3 motorları tarafından düzgün mikrotübül kaymasını (çapraz beyaz şerit) temsil eder. Y eksenindeki zaman (dikey ok) ve x eksenindeki mesafe (yatay ok). D. Hızın histogramı, bir mikrotübül popülasyonu için çizildi ve tek bir Gauss zirvesine sığdı. Ortalama kayma hızı, sol üst köşede ortalama ± SEM olarak gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Polimerize mikrotübüller. Motilitesi testi için seyreltmeden önce polimerize mikrotübüllerin TIRF görüntülemesi. Film 100 ms pozlamada elde edildi ve video 60 kare / s'de oynatıldı. Ölçek çubuğu, 10 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 2: Yapısal olarak aktif kinesin-3 motorunun in vitro tek moleküllü testi. Floresan etiketli KIF1A (1-393LZ) motorları, bir hareketlilik tahlil odasında kapak kayması üzerinde adsorbe edilen mikrotübül yüzeyi (etiketsiz) boyunca aşamalı olarak hareket eden Sf9 hücrelerinden saflaştırılmıştır. Görüntüleme TIRF aydınlatmada yapıldı ve 100 ms pozlamada görüntüler elde edildi. Video 30 kare/sn'de oynatılır. Ölçek çubuğu, 10 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 3: Yapısal olarak aktif kinesin-3 motorunun mikrotübül kayma testi. Rhodamine etiketli mikrotübüller, Sf9 saflaştırılmış KIF1A (1-393LZ) motoruyla kaplanmış cam kapak kaymasının yüzeyinde sorunsuz bir şekilde kayar. Görüntüleme TIRF aydınlatmada yapıldı ve 100 ms pozlamada görüntüler elde edildi. Video 60 kare/sn'de oynatılır. Ölçek çubuğu, 10 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Tamponlar ve reaktifler bileşimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi, yüksek verimli protein üretimi için en çok yönlü ve başarılı yöntemlerden biridir 19,36,37. Sf9 hücrelerinin posttranslasyonel modifikasyon yeteneği, memeli sistemi15 ile oldukça karşılaştırılabilir. Bu sistemi kullanmanın önemli bir dezavantajı, yavaş ve kontaminasyona karşı hassas olmasıdır. En kritik adımlardan biri, Sf9 hücrelerinde etkili enfeksiyon ve başarılı ekspresyondur, bu da Sf9 hücrelerinin herhangi bir kontaminasyon olmadan uygun şekilde kullanılmasını ve bakımını gerektirir. Sistem, özel tozsuz alan ve sıcaklık kontrollü inkübatör ve çalkalayıcı gibi aletler gerektirir. Düzensiz hücre kültürü uygulaması ve aşırı büyümüş kültürün kullanımı zayıf enfeksiyon, yavaş büyüme ve önemli hücre ölümüne neden olacaktır.
Sf9 hücrelerinde eksprese edilen proteinin FLAG etiketi saflaştırılmasının çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, Sf9 hücreleri, proteinin çoğunu aktif ve çözünür formunda elde etmek için verimli bir şekilde lize edilebilir. İkincisi, FLAG reçinesi, HIS ve GST reçinesi38'den daha az spesifik olmayan protein adsorpsiyonuna sahiptir. Sonuç olarak, proteinin önemli bir miktarı saf haliyle tek adımlı bir elüsyonda salınır. Sf9-saflaştırılmış kinesin-3 motorları, biyokimyasal ATPaz tahlilleri14'te sağlam mikrotübül ile uyarılmış ATP devir hızları göstermiştir. Benzer şekilde, in vitro tek moleküllü hareketlilik testleri, bu motorlar mikrotübülün yüzeyinde hızlı ve süperprosesif hareketlilik göstermiştir. İlginçtir ki, bu hareketlilik özellikleri, memeli hücre lizatları11,12,13'ten hazırlanan motorlar kullanılarak ölçülen hareketlilik özellikleri ile dikkate değer benzerlik göstermiştir. Ek olarak, in vitro tek moleküllü hareketlilik testinde kinesin-3 motorlarının ölçülen adım hızı, biyokimyasal ATPaz testinde ölçülen ATP hidroliz oranıyla yakından eşleşir ve motorlarınadım 14 başına bir ATP molekülünü hidrolize ettiğini düşündürür. Birlikte, bu sonuçlar, Sf9-bakülovirüs ekspresyon sisteminden saflaştırılan kinesin3 motorlarının, önemli ölçüde büyük bir aktif ve çözünür protein popülasyonu sağladığını göstermektedir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sisteminin, ilgilenilen motor proteinleri gerekli modifikasyonlarla saflaştırmak için kullanılabileceğine inanıyoruz.
Süperprosesif hareketlilik sergileyen kinesin-3 motorlarının in vitro tek moleküllü hareketlilik testi, uzun polimerize mikrotübüllerin polimerizasyonuna ihtiyaç duyar. Uzun mikrotübüllerin in vitro polimerizasyonunda kritik bir adım, kritik tübülin konsantrasyonu, inkübasyon süresi ve uygun tampon pH'ı olan bir polimerizasyon karışımı hazırlamaktır. Mikrotübül polimerizasyonu için kullanılan tübülin son derece yetkin, saf olmalı ve donma ve çözülmeyi önlemek için küçük alikotlarda sıvı azotta depolanmalıdır. Tubulin, çözüldükten sonra, gelecekteki polimerizasyon için tekrar dondurulmamalıdır, çünkü tübülin her donma-çözülme döngüsünde yetkinliğini önemli ölçüde kaybeder. Yetersiz tübülin, mikrotübül polimerizasyonuna katkıda bulunmayacak, ancak polimerizasyon işlemini engelleyecek ve bilinmeyen kusurlara sahip kısa mikrotübüllerle sonuçlanacaktır. Polimerizasyon karışımındaki optimal tübülin konsantrasyonu 2.5-3 mg / mL arasında olmalı ve karışım, polimerizasyon için 37 ° C'de inkübe edilmeden önce 5 dakika boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. Mikrotübüllerin polimerizasyon süresi 20-30 dakika arasında olmalı ve 30 dakikayı geçmemelidir, çünkü uzun süreli polimerizasyon genellikle kısa ve parçalanmış mikrotübüllerin oluşumuna neden olur.
Daha sonra, polimerize mikrotübüllerin stabilizasyonu ikinci kritik bir adımdır. Taksol, suda zayıf bir şekilde çözünür ve sulu bir çözelti içinde çökelir39. Bu nedenle, stabilizasyon tamponunu 10 μM taksol ile taze olarak hazırlayın, polimerize mikrotübüller karışımının üzerine hafifçe ekleyin ve rahatsız etmeden daha fazla inkübe edin. Stabilizasyon tamponunu hazırlamak için daima -20 °C dondurucudan dondurulmuş taksol aliquot kullanın, çünkü çözülmüş aliquot polimerize mikrotübüllerin çökeltilmesine / toplanmasına neden olur. Kırılmayı önlemek için polimerize mikrotübülleri daima eğimli uçlar kullanarak kullanın. Bu yöntem kullanılarak polimerize edilen mikrotübüller, süperprosesik hareketlilik analizi için uygun 60-70 μm uzunluğunda uzun mikrotübüller verir. Bir sonraki kritik adım, mikrotübüllerin hareketlilik odasındaki örtü kayma yüzeyine kararlı adsorpsiyonudur. Bunu başarmak için, örtü kaymaları kuru bir yerde saklanmalıdır, çünkü örtü kapaklarının nemli ortama maruz kalması, mikrotübül adsorpsiyon verimliliğini ve stabilitelerini önemli ölçüde azaltır.
Belirli konsantrasyonlarda uygun bileşenler ve optimum motor protein konsantrasyonu ile bir motilitesi testi karışımı hazırlamak, mikrotübül yüzeyi boyunca sağlam hareketlilik olayları elde etmek için önemlidir. Pürüzsüz ve işlemsel hareketlilik oluşturmadaki en önemli bileşen, tahlil karışımında kararlı bir ATP çözeltisi kullanmaktır. (Bu nedenle ATP stoğu hazırlanırken dikkatli olunmalıdır. ATP'nin sodyum tuzunu 10 mM PIPES tampon pH 6.9'da çözündürerek, çok düşük pH'lı berrak bir çözelti elde edilir. ATP, düşük pH'ta son derece kararsızdır ve ADP ve fosfata hızla hidrolize olur, böylece çözeltiyi soğuk tutar ve konsantre KOH kullanarak pH'ı hemen 7.0'a ayarlamak hidrolizi önler.) Hareketlilik karışımını akış hücresine akıtın ve TIRF aydınlatması altında görüntüleme yaparken sıvı akışını ve odanın kurumasını önlemek için her iki kenarı da sıvı parafin ile kapatın.
Kinesin-3 motorları mikrotübül rayları boyunca hızlı ve süperprosesik olduğundan, görüntüleme, veri toplama ve analiz çeşitli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Tek moleküllü görüntüleme ve veri toplama, motor işlemsel çalışmasını tamamlamadan önce floresan proteinlerinin fotobeyazlatmasını önlemek için düşük lazer yoğunluğu altında yapılmalıdır. Elde edilen veriler, zayıf sinyal-gürültü oranı ile düşük yoğunlukta olacaktır. Sonuç olarak, bu bireysel hareketlilik olaylarının, hareketlilik olaylarını karakterize etmek için mevcut otomatik izleme yazılımını kullanarak izlenmesi zor olacaktır. Bu nedenle, mikrotübül boyunca hareket eden floresan etiketli motor noktalarının minimum hatayla kare kare izlenmesiyle veri analizinin manuel olarak yapılması gerekir. Veri analizi için, tercihen, motorların çalışmalarını tamamlamadan önce mikrotübül ucuna ulaşmasını önlemek için uzun mikrotübül raylarındaki hareketlilik olaylarını seçin. Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar için, yalnızca en azından son 10 kareyi (500 ms) izlemek için bu hareketlilik olaylarını göz önünde bulundurun ve işlemsel çalışmanın net bir başlangıcı ve bitişi ile sonuçlandırın.
Genel olarak, yöntem, aktif motor proteinlerinin basit ve tek adımlı saflaştırılması, uzun mikrotübüllerin hazırlanması ve iyi hareketlilik elde etmek için talimatlarla ayrıntılı adım adım protokol gibi mevcut yönteme göre çeşitli avantajlar sunar. Prensip olarak, yöntem miyosin, kinesin ve dynein dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere herhangi bir protein sınıfını ve türünü ifade etmek ve saflaştırmak için uygulanabilir. Gerçekten de, birkaç viral aşıyı, gen terapisi vektörlerini ve diğer farmasötik proteinleri saflaştırmak için bakülovirüs ekspresyon sistemi başarıyla kurulmuştur20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan etmek için rekabet eden finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
VS ve PS, Prof. Kristen J. Verhey'e (Michigan Üniversitesi, Ann Arbor, MI, ABD) ve Prof. Roop Mallik'e (Hindistan Teknoloji Enstitüsü Bombay (IITB), Mumbai, Hindistan) çalışma boyunca koşulsuz destekleri için teşekkür eder. Not: Proje boyunca verdiği destek için Dr. Sivapriya Kirubakaran'a teşekkür eder. V.S., DBT (Hibe No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 ve BT/RLF/Re-entry/45/2015) ve DST-SERB (Hibe No.: ECR/2016/000913) aracılığıyla finansman sağlamaktadır. P.K.N, ICMR'yi finansman için kabul etmektedir (Hibe No. 5/13/13/2019/NCD-III). Not: DST'den fon kabul etmektedir (Hibe No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S, IIT Gandhinagar'ın bursunu kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For protein purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For protein purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assays and protein purification |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For protein purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | To freeze the protein |
| HEPES | Sigma | H3375 | For Sf9 lysis buffer |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | For Sf9 lysis buffer |
| KCl | Sigma | P9541 | For buffers preparation |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For protein purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For buffers preparation |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For protein purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and protein purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For preparing motility and gliding assay buffers |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
References
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
- Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
- Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
- Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
- Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
- Rath, O., Kozielski, F.
- Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
- Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
- Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
- Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
- Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
- Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
- Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
- Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
- Kurland, C., Gallant, J.
- Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
- Kumar, N., Pandey, D., Halder, A. Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. Kumar, D., Gong, C. , Springer International Publishing. 163-191 (2018).
- Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
- Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
- Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
- Ettinger, A., Wittmann, T.
- Waters, J. C.
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Wojtovich, A. P., Foster, T. H.
- Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
- Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
- Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
- Muyldermans, S.
- Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
- Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
- Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
- Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).
