Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

אנליזה של מולקולה בודדת של מנועי משפחת קינסין-3 מטוהרים מסוג Sf9

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63837
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Discipline of Biological Engineering, Indian Institute of Technology Gandhinagar, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Sambalpur University

Summary

מחקר זה מפרט טיהור של KIF1A(1-393LZ), חבר במשפחת קינזין-3, באמצעות מערכת ביטוי Sf9-baculovirus. ניתוח החלקה חד-מולקולתית ורב-מנועית במבחנה של מנועים מטוהרים אלה הפגין תכונות תנועתיות חזקות הדומות למנועים של ליזאט תאי יונקים. לפיכך, מערכת Sf9-baculovirus היא מקובלת להביע ולטהר חלבון מוטורי של עניין.

Abstract

סביבה תאית מורכבת מציבה אתגרים לניתוח תנועתיות של מולקולה בודדת. עם זאת, ההתקדמות בטכניקות ההדמיה שיפרה את המחקרים על מולקולות בודדות וצברה פופולריות עצומה באיתור והבנה של ההתנהגות הדינמית של מולקולות המתויגות על-ידי פלואורסצנט. במאמר זה נתאר שיטה מפורטת למחקרי מולקולה בודדת במבחנה של מנועים ממשפחת קינסין-3 באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF). Kinesin-3 היא משפחה גדולה הממלאת תפקידים קריטיים בתפקודים תאיים ופיזיולוגיים, החל מהובלת מטענים תוך-תאיים, דרך חלוקת תאים ועד להתפתחות. הראינו בעבר שמנועי קינזין-3 דימריים פעילים באופן מכונן מפגינים תנועתיות מהירה וסופר-מעבדית עם זיקה מיקרוטובולית גבוהה ברמת המולקולה הבודדת באמצעות ליזטים תאיים שהוכנו על ידי ביטוי מוטורי בתאי יונקים. המעבדה שלנו חוקרת מנועי קינסין-3 ומנגנוני הוויסות שלהם תוך שימוש בגישות תאיות, ביוכימיות וביופיזיקליות, ומחקרים כאלה דורשים חלבונים מטוהרים בקנה מידה גדול. ביטוי וטיהור של מנועים אלה באמצעות תאי יונקים יהיה יקר וגוזל זמן, בעוד שביטוי במערכת ביטוי פרוקריוטית הביא לחלבון מצטבר ולא פעיל באופן משמעותי. כדי להתגבר על המגבלות שמציבות מערכות טיהור חיידקים וליזה של תאי יונקים, הקמנו מערכת ביטוי חזקה של Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר את המנועים האלה. מנועי הקינזין-3 מתויגים באופן סופי ב-C עם חלבונים פלואורסצנטיים בעלי 3 טנדם (3xmCitirine או 3xmCit) המספקים אותות משופרים והפחתת הלבנה. ניתוח החלקה חד-מולקולתית ורב-מנועית במבחנה של חלבונים מטוהרים מדגם Sf9 מראה כי מנועי קינזין-3 הם מהירים וסופר-מעבדים בדומה למחקרים קודמים שלנו שהשתמשו בליסאטות של תאי יונקים. יישומים אחרים המשתמשים במבחנים אלה כוללים ידע מפורט על תנאי אוליגומרים של מנועים, שותפים מחייבים ספציפיים המקבילים למחקרים ביוכימיים, ומצבם הקיני.

Introduction

סביבת תאים צפופה מאוד מציבה אתגרים רבים במיון חלבונים ומולקולות מיועדים. עומס עבודה אינטנסיבי זה של ארגון והפצה מרחבית-טמפורלית של מולקולות בתוך הציטופלסמה מתאפשר על ידי מנועים מולקולריים ומסלולים ציטוסקטליים. מנועים מולקולריים הם האנזימים שמבצעים הידרוליזה של מטבעות האנרגיה כגון ATP ומנצלים אנרגיה זו במהלך תנועה ויצירת כוח1. בהתבסס על הדמיון ברצף חומצות האמינו, קינסינים מקובצים ל-14 משפחות ולמרות הדמיון הזה, כל מנוע תורם באופן ייחודי לתפקוד התא. מנועי משפחת קינסין-3 מהווים את אחד הגדולים ביותר, הכולל חמש תת-משפחות (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 ו- KIF28)2, הקשורות למגוון תפקודים תאיים ופיזיולוגיים, כולל הובלת שלפוחית, איתות, מיטוזה, הגירה גרעינית ופיתוח 3,4,5. פגיעה בתפקוד ההובלה של קינזין-3 כרוכה בהפרעות נוירודגנרטיביות רבות, פגמים התפתחותיים ומחלות סרטן 6,7,8,9.

עבודות אחרונות הראו כי מנועי קינזין-3 הם מונומרים אך עוברים דימריזציה הנגרמת על ידי מטען וגורמים לתנועתיות מהירה וסופר-תהליכית בהשוואה לקינסיןקונבנציונלי 10,11,12,13. האפיון הביוכימי והביופיזי שלהם זקוק לכמות גדולה של חלבונים מטוהרים ופעילים. עם זאת, הייצור שלהם במערכת הביטוי הפרוקריוטית הביא למנועים לא פעילים או מצטברים, ככל הנראה בשל סינתזת חלבונים, קיפול ושינוי מכונות 14,15,16,17,18 שאינן תואמות. כדי לעקוף מגבלות כאלה ולהגדיל את התשואה, כאן הקמנו מערכת ביטוי חזקה Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר את המנועים האלה.

מערכת הביטוי של baculovirus משתמשת בקווי תאי חרקים Sf9 כמערכת מארחת לביטוי חלבון רקומביננטי אאוקריוטי בעל תפוקה גבוהה19,20. ל-Baculovirus יש מקדם פוליהדרין חזק המסייע בביטוי גנים הטרולוגיים ובייצור חלבונים רקומביננטיים מסיסים17. בשל עלותו החסכונית, בטיחותו לטיפול וכמות גבוהה של ביטוי חלבון פעיל, הוא הפך לכלי רב עוצמה21. כדי לבטא חלבון בעל עניין, צעד מפתח הוא ליצור בסיס רקומביננטי. מכיוון שערכות ייצור הבקמיד הזמינות מסחרית הן יקרות ואנחנו נעבוד עם דגימות נוספות, פיתחנו פרוטוקול פנימי לתוספות גדולות וקטנות של מנועי קינזין-3 לתוך bacmids. מנועי קינזין-3 מטוהרים Sf9 שימשו לאפיון תכונות גלישה של מיקרוטובול מיקרו-מבחנה חד-מבנית ורב-מנועית באמצעות מיקרוסקופיית השתקפות פלואורסצנטית פנימית כוללת (TIRF). מנועים מתויגים באופן סופי C עם מולקולות פלואורסצנטיות 3-טנדם (3xmCit) כדי לספק אות משופר והפחתת הלבנת פוטו. בשל יחס אות לרעש מוגבר, פחות פוטוטוקסיות והדמיה סלקטיבית של אזור קטן מאוד קרוב לכיסוי, נעשה שימוש נרחב בהדמיית TIRF כדי לדמיין דינמיקה של חלבונים ברמת המולקולה הבודדת in vivo ו- in vitro.

מחקר זה דן בטיהור מנועי קינסין-3 על ידי שימוש במערכת ביטוי Sf9-baculovirus והדמיית מולקולה בודדת במבחנה וניתוח גלישה רב-מוטורית של מנועים באמצעות מיקרוסקופיית TIRF. בסך הכל, מחקר זה מראה כי תכונות התנועתיות של מנועים מטוהרים Sf9 זהות לאלה של מנועים שהוכנו מליסאטות של תאי יונקים. לפיכך, אנו מאמינים כי ניתן להתאים את מערכת Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר כל חלבון מוטורי בעל עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית, טרנספקציה ויצירת וירוסים Sf9

הערה: שמור על תאי Sf9 ב-30 מ"ל של מדיום Sf-900/SFM בבקבוקון חרוטי סטרילי וחד-פעמי של 100 מ"ל ללא כל אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. שמור על תרבות המתלים בשייקר מסלולי ב-90 סל"ד. אין צורך באספקת CO2 ותחזוקת לחות. תאים הם בדרך כלל תת תרבית כל יום רביעי על ידי חיסון 0.5 x 10 6 תאים / מ"ל כדי להגיע 2.0 x 106 תאים / מ"ל צפיפות ביום הרביעי.

  1. יצירת מלאי וירוסים P0
    1. לצורך טרנספקציה, תאי זרעים לתוך צלחת 35 מ"מ עם 4.5 x 105 תאים / מ"ל מפגש ולשמור על 28 מעלות צלזיוס ללא רעידות.
    2. לאחר 24 שעות, ברגע שהתאים מחוברים ונראים בריאים, המשיכו להעברה כמתואר להלן.
      1. צינור A: ערבבו 1 מיקרוגרם של קידוד DNA בקמיד עבור מנוע KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG ספציפי kinesin-3 עם 100 μL של המדיה של גרייס שלא הוכרעה.
      2. צינור B: ערבבו 6 μL של מגיב טרנספקציה עם 100 μL של מדיה של גרייס שלא הוכרעה.
      3. העבירו בזהירות את התוכן של Tube A לתוך Tube B וערבבו היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה (כ-20 פעמים).
      4. לדגור את התערובת במשך ~ 45 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לאחר השלמת הדגירה, יש להוסיף 0.8 מ"ל של מדיה של גרייס ללא תוספת לתערובת הנ"ל ולערבב באיטיות על ידי פיפטה.
    4. שאפו בעדינות את מדיית Sf-900/SFM מתאים (כדי להסיר עקבות של סרום שעלולים להשפיע על יעילות ההעברה).
    5. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה משלב 1.1.3 טיפה על החלק העליון של התאים ומדגרים את הצלחת במשך 6 שעות ב-28 מעלות צלזיוס.
    6. לאחר הדגירה, הסר בזהירות את תערובת הטרנספקציה, הוסף 2 מ"ל של מדיה Sf-900/SFM ודגרה נוספת במשך 48 שעות ב 28 מעלות צלזיוס.
    7. בדוק את ביטוי החלבון המוטורי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. החלבון המוטורי מתויג עם חלבון פלואורסצנטי, mCitrine, גרסה של חלבון פלואורסצנטי צהוב.
      הערה: תאים שעברו טרנספקציה הודגמו תחת מיקרוסקופ הפוך המצויד בניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ותאורת אפיפלואורסצנציה עם מטרה של פי 20 (הגדלה של פי 200), מנורת כספית ומצלמת EM-CCD. בדוק את היעילות של יצירת וירוסים וזיהום על ידי ניטור הביטוי של מנועים מתויגים mCitrine בתאים באמצעות עירור mCitrine וקוביית מסנן פליטה. בנוסף, בדקו אם קיימים שינויים מורפולוגיים של תאים נגועים, כגון תאים/גרעינים מוגדלים (איור 1A-C).
    8. שוב, בדוק את התאים 72 שעות לאחר ההדבקה. בדרך כלל, תאים מתחילים להתנתק מפני השטח (איור 2).
    9. אם >5% מהתאים מנותקים מפני השטח, קצרו את המדיה עם תאים נגועים בצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים של 1.5 מ"ל והסתובבו במשך 5 דקות ב-500 x גרם.
    10. אסוף את ה-supernatant והקפיא את ה-aliquots של 1 מ"ל בחנקן נוזלי ואחסן כמלאי P0 בטמפרטורה של -80°C או השתמש בו כדי ליצור מלאי וירוסים P1.
  2. יצירת מלאי וירוס P1
    1. כדי להגביר עוד יותר את מלאי ה-P0 baculovirus ולאשר את ביטוי החלבון, לגדל תאי Sf9 בתרבית תרחיף נוזלי.
    2. בבקבוק חרוטי סטרילי של 100 מ"ל, הוסף 10 מ"ל של מדיה Sf-900/SFM עם צפיפות תאים של 2 x 106 תאים למ"ל ו-1 מ"ל של מלאי וירוסים P0. דגירה ב-28°C עם רעידות קבועות ב-90 סל"ד.
    3. לאחר 72 שעות של זיהום, בדוק את ביטוי החלבון כפי שתואר קודם לכן (שלב 1.1.7). אם ביטוי החלבון טוב (>90% מהתאים מראים אות פלואורסצנטי בהיר של mCitrine) ומראה מוות תאי משמעותי (בערך 10%-15%), סובבו את התאים בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל בגודל 500 x g למשך 5 דקות.
    4. אסוף את ה-supernatant, הקפאה מהירה של 1 מ"ל (מלאי P1) בחנקן נוזלי ואחסן בטמפרטורה של -80°C או המשך לזיהום בקנה מידה גדול ולטיהור חלבונים.
  3. זיהום בקנה מידה גדול
    1. לביטוי חלבונים בקנה מידה גדול, יש להדביק 30 מ"ל של תרבית התרחיף בצפיפות של 2 x 106 תאים /מ"ל עם 1 מ"ל של מלאי נגיפי P1 ולדגור ב-28 מעלות צלזיוס עם רעידות קבועות ב-90 סל"ד.
    2. לאחר ~ 72 שעות לאחר ההדבקה, בדוק את ביטוי החלבון (באופן כללי, ביטוי חלבון מקסימלי מושג בין 65-75h לאחר ההדבקה).
    3. אם >90% מהתאים מראים אות פלואורסצנטי בהיר עם מוות תאי מינימלי (<5%), אספו את התאים בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל והסתובבו כלפי מטה בטמפרטורה של 500 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: צריך להיות מוות תאי מינימלי (<5%), מכיוון שתאים מתים משחררים את תוכן התאים למדיה, מה שמוביל לאובדן של חלבון מבוטא.
    4. השליכו את הסופרנטנט, אספו את גלולת התא והמשיכו בטיהור החלבון.

2. טיהור Sf9 של מנועי קינזין-3

  1. לכדור התא הנ"ל, הוסיפו 3 מ"ל של חיץ תזה קר כקרח (טבלה משלימה 1) בתוספת טרייה של 5 mM DTT, 5 מיקרוגרם/מ"ל של אפרוטינין, 5 מיקרוגרם/מ"ל של לאופטין, ו-5 מיקרוגרם/מ"ל של PMSF והניחו את התאים על ידי פיפטינג 20-25 פעמים מבלי ליצור בועות אוויר. עבור כל הרכבי החיץ והריאגנטים, עיין בטבלה משלימה 1.
  2. סובב את התא ליזאט ב 150,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. אסוף את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה וסטרילית וערבב עם ~ 40 μL של שרף זיקה נגד FLAG M2. דגירה של התערובת במשך 3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס עם רעידות מקצה לקצה.
  4. לאחר הדגירה, גלולה שרף FLAG על ידי סיבוב ב 500 x g במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס. שאפו בעדינות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור עם מחט של 26 גרם והשליכו אותו.
  5. יש לשטוף את גלולת השרף FLAG שלוש פעמים עם חיץ שטיפה קר כקרח (טבלה משלימה 1) בתוספת טרייה של 2 mM DTT, 5 מיקרוגרם/מ"ל של אפרוטינין, 5 מיקרוגרם/מ"ל של לאופטין ו-5 מיקרוגרם/מ"ל של PMSF. גלולה את החרוזים על ידי סיבוב ב 500 x גרם במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס בכל כביסה.
  6. לאחר הכביסה השלישית, מסננים בזהירות את חיץ הכביסה ככל האפשר מבלי להפריע לכדור. עבור elution חלבון, להוסיף ~ 70 μL של מאגר לשטוף המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל פפטיד FLAG גלולה שרף ו דגירה לילה ב 4 °C עם tumbling מקצה לקצה.
  7. ביום שלאחר מכן, לסובב את השרף ב 500 x גרם במשך 1 דקה ב 4 מעלות צלזיוס. יש לאסוף את הסופרנטנט המכיל חלבון מטוהר לתוך שפופרת טרייה ולהשלים עם 10% גליצרול. יש להקפיא אליקוטים של 5 μL בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
  8. הפעל את ג'ל SDS-PAGE כדי לקבוע את ריכוז החלבון ותפוקתו. יחד עם חלבון מטוהר של עניין, בקרת חלבון סטנדרטית, BSA של ריכוזים ידועים הנעים בין 0.2 מיקרוגרם, 0.4 מיקרוגרם, 0.6 מיקרוגרם, 0.8 מיקרוגרם ו 1 מיקרוגרם נטענים כדי ליצור עקומה סטנדרטית. הכתימו את הג'ל בכחול מבריק של Coomassie (איור 3).
  9. נתחו את הג'ל באמצעות כלי כימות ג'ל מובנה בתוכנת ImageJ. ראשית, מדדו את עוצמת הפסים של ריכוזים ידועים של BSA וצרו את העקומה הסטנדרטית. לאחר מכן, מדדו את עוצמת רצועת החלבון המטוהרת וקבעו את ריכוז החלבון. לשם כך פתח את תוכנת Image J, לחץ על נתח אפשרות בשורת התפריטים ובחר ג'לים בתפריט הנפתח.

3. בדיקת תנועתיות מולקולה בודדת במבחנה באמצעות מנועי קינזין-3 מטוהרים Sf9

הערה: ניתן להשתמש במנועי קינסין-3 המטוהרים Sf9 כדי לחקור תכונות ביוכימיות וביופיזיות כגון קצב תחלופת ATP, זיקת מיקרוטובולים, מהירות, אורך ריצה, גודל צעד ויצירת כוח. כאן מתואר פרוטוקול מפורט לניתוח תנועתיות מולקולה בודדת במבחנה של KIF1A(1-393LZ) באמצעות מיקרוסקופיית השתקפות פנימית כוללת פלואורסצנטית (TIRF). עבור כל הרכב המאגרים והריאגנטים, עיין בטבלה משלימה 1.

  1. פילמור מיקרוטובול
    1. בצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש של 0.5 מ"ל, הכינו תערובת פילמור על ידי פיפטינג בסדר הבא: 12.0 מיקרוליטר של חיץ BRB80, pH 6.9; 0.45 מיקרון ליטר של 100 mM MgCl2, 1 μL של 25 mM GTP.
    2. מוציאים 10 μL aliquot של 10 מ"ג/מ"ל טובולין המאוחסן בחנקן נוזלי, מפשירים מיד ומוסיפים לתערובת הפילמור הנ"ל. מערבבים בעדינות על ידי צנרת 2-3 פעמים מבלי ליצור בועות אוויר.
      הערה: בצע את השלבים לעיל במהירות ובקפדנות על קרח.
    3. תנו לתערובת הנ"ל לשבת על קרח למשך 5 דקות.
      הערה: זהו צעד קריטי כדי למנוע דנטורציה של טובולין או כדי למנוע היווצרות של זרעי microtubule קצרים.
    4. מעבירים את הצינור לבלוק חום/אמבט מים מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים במשך 30 דקות לפילמור מיקרוטובולים.
    5. בזמן שהמיקרוטובולים מתפלמרים, הפשירו מאגר של P12 והביאו אותו לטמפרטורת החדר.
    6. לפני השלמת 30 דקות של דגירה, התחל להכין חיץ ייצוב MT על ידי הזרמת 100 μL של חיץ P12 לתוך צינור microcentrifuge טרי. לשם כך, מוסיפים 1 μL של 1 mM טקסול ומיד מערבלת את התערובת.
      הערה: התחל להכין את מאגר ייצוב MT כ-5 דקות לפני השלמת הדגירה בשלב 3.1.4. טקסול מייצב את המיקרוטובולים הפולימריים על ידי קשירה ל-β-טובולין.
    7. מחממים את חיץ הייצוב של המיקרוטובול למשך 2-3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומוסיפים אותו בעדינות למיקרוטובולים הפולימריים מבלי להפריע לתערובת הפילמור בתחתית.
      הערה: חימום חיץ הייצוב יביא אותו לאותה טמפרטורה כמו תערובת הפילמור.
    8. אין להקיש או לפיפטה על התערובת ולדגור עוד יותר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    9. מקישים בעדינות על התערובת ומערבבים אותה עם קצה חתוך משופע (קיבולת של 200 μL) באיטיות באמצעות הפיפטה.
      הערה: מנקודה זו והלאה, טפל תמיד במיקרוטובולים עם קצה חתך משופע כדי למנוע גזירה של מיקרוטובול.
    10. קח 10-15 μL של מיקרוטובולים פולימריים בתא זרימה כדי לבדוק פילמור תקין של מיקרוטובולים.
      הערה: ניתן לדמיין את המיקרוטובולים ללא תווית באמצעות הגדרת מיקרוסקופיית DIC.
    11. אם מרוכזים מיקרוטובולים, דיללו אותם במאגר P12 בתוספת טקסול של 10 מיקרומטר.
  2. הכנת תא תא זרימה תנועתיות
    1. הכינו תא תנועתיות באמצעות מגלשת זכוכית, סרט הדבקה דו-צדדי וכיסוי זכוכית (22 מ"מ x 30 מ"מ).
    2. קח מגלשת זכוכית, הנח טיפה (~ 70 μL) של מים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה באמצע ונגב אותם עם נייר טישו ללא מוך.
    3. חותכים שתי רצועות של סרט דו-צדדי (~ 35 x 3 מ"מ) ומדביקים אותן בחוזקה לשקופית הזכוכית במקביל, משאירים רווח של ~ 4-5 מ"מ בין שתי רצועות כדי ליצור מעבר צר.
    4. לאחר מכן, קח כיסוי והוסף טיפה (~ 20 μL) של מים מזוקקים deionized באמצע. הניחו רצועה של נייר טישו לניקוי עדשות ללא מוך על טיפת המים עד שהיא סופגת את המים. לאחר מכן, החליקו אותו באיטיות לעבר קצה אחד של הכיסוי.
      הערה: הכיסוי צריך להיות יבש לחלוטין. אין לראות מים על הכיסוי.
    5. הניחו את הכיסוי על הרצועות הדו-צדדיות שנתקעו על המגלשה ולחצו על הכיסוי באופן שווה לאורך הרצועות כדי להידבק בחוזקה.
      הערה: ודא שהצד הנקי של הכיסוי פונה למגלשת הזכוכית.
    6. ודא שיחד זה יוצר תא צר של קיבולת של 10-15 μL לביצוע בדיקת תנועתיות (איור 4A).
  3. מבחן תנועתיות של מולקולה בודדת במבחנה
    הערה: כדי לחקור את תכונות התנועתיות מבוססות המיקרוטובול של מולקולות בודדות של מנועים, יש לספוח מיקרוטובולים על משטח הכיסוי בתא התנועתיות.
    1. דילל את המיקרוטובולים המיוצבים בטקסול פולימרי במאגר P12 בתוספת טקסול של 10 μM ביחס של 1:5 וערבב על ידי פיפטינג איטי עם קצה משופע.
    2. שמור על תא הזרימה במצב נטוי (~15-20°). הזרם 30 μL של תמיסת מיקרוטובול מדולל דרך תא הזרימה מהקצה העליון תוך שמירה על נייר טישו ללא מוך בקצה התחתון לספיגת הנוזל. פעולה זו יוצרת כוח גזירה ליישור המיקרוטובול בכיוון הזרימה ומסייעת לספוח את המיקרוטובולים ישר וליישר במקביל.
    3. השאירו טיפה קטנה של נוזל בשני קצות התא ושמרו על תא הזרימה במצב הפוך (כיסוי הפונה לתחתית) בתא סגור ולח כדי למנוע ייבוש של תא התנועתיות.
    4. תן לו לשבת במשך ~ 30 דקות, כך microtubules ספיחה על פני השטח של כיסוי להחליק בתוך תא תנועתיות.
    5. בינתיים, הכן את מאגר החסימה על ידי ערבוב 500 μL P12-BSA מאגר עם 5 μL של 1 mM טקסול.
    6. זרימה 40-50 μL של מאגר חוסם ודגירה של המגלשה במצב הפוך במשך 10 דקות בתא לח.
    7. הכן את תערובת התנועתיות על ידי צינורית הרכיבים הבאים לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בקיבולת 500 μL בסדר הבא: 25 μL של חיץ P12 עם טקסול, 0.5 μL של 100 mM MgCl2, 0.5 μL של 100 mM DTT, 0.5 μL של 20 מ"ג / מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 0.5 μL של 8 מ"ג / מ"ל קטלאז, 0.5 μL של 2.25 M גלוקוז, ו 1.0 μL של 100 mM ATP.
      הערה: הדמיה פלואורסצנטית נמצאת בשימוש נרחב עבור יישומים ביולוגיים 22,23,24,25,26. פוטו-אקסצייטציה של חלבונים פלואורסצנטיים יוצרת מיני חמצן תגובתי (ROS), מה שעלול לגרום לפוטו-הלבנה של החלבונים הפלואורסצנטיים ולפגיעה בדגימות הביולוגיות27,28. אוכלי נבלות חמצן כגון גלוקוז, גלוקוז אוקסידאז וקטלאז משמשים באופן שגרתי במבחני תנועתיות כדי להגביל את הפוטו-דאם ולהאריך את זמן ההלבנה של חלבונים פלואורסצנטיים.
    8. לבסוף, הוסיפו 1 μL של המנוע המטוהר לתערובת התנועתיות הנ"ל וערבבו היטב לפני שתזרמו לתא התנועתיות.
    9. אטמו את שני הקצוות של תא התנועתיות עם שעוות פרפין נוזלית ומיד צלמו תחת תאורת TIRF באמצעות יעד TIRF 100X של 1.49 NA עם הגדלה של פי 1.5.
    10. על מנת למקד את משטח הכיסוי, ראשית, התמקדו באחד הקצוות הפנימיים של סרט הדבקה דו-צדדי בתא התנועתיות תחת תאורת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC).
      הערה: המשטח הבהיר והלא אחיד יהיה גלוי.
    11. לאחר מכן, העבר את המיקוד לתא התנועתיות. באמצעות כוונון עדין, מקד את משטח הכיסוי וחפש את המיקרוטובולים הנספגים על משטח הכיסוי.
    12. לאחר שהמיקרוטובולים ממוקדים, עברו לתאורת TIRF עם לייזר עירור של 488 ננומטר והתאימו את עומק ההארה על ידי שינוי זווית קרן העירור כדי לקבל את תאורת ה-TIRF הטובה והאחידה ביותר (איור 4B).
    13. מקד את המנועים הבודדים המתויגים על-ידי mCitrine הנעים באופן תהליכי לאורך משטח המיקרוטובול בחשיפה של 100 אלפיות השנייה והקלט את התנועה באמצעות מצלמת EM-CCD.
      הערה: למרות שמבחני התנועתיות בוצעו על מיקרוטובולים ללא תווית, ניתן להשתמש בפונקציית ההטלה z בעוצמה המרבית כדי לחשוף את קווי המתאר של מסלול המיקרוטובול. באופן מועדף, אירועים על מסלולי מיקרוטובול ארוכים נחשבו לניתוח מעקב.
    14. עקוב באופן ידני אחר מיקומם של מנועים בודדים המתויגים באופן פלואורסצנטי ההולכים על מסלולי מיקרוטובול ארוכים מסגרת אחר מסגרת באמצעות תוסף שנכתב בהתאמה אישית בתוכנת ImageJ (nih.gov) כפי שתואר קודםלכן 29.
    15. צור את ההיסטוגרמות של מהירות ואורך ריצה עבור אוכלוסיית המנוע על ידי התוויית מספר האירועים בכל סל. התאימו את ההיסטוגרמות האלה לפונקציית שיא גאוס יחידה כדי לקבל מהירות ממוצעת ואורך ריצה12 (איור 4C-E).

4. בדיקת גלישה במיקרוטובול במבחנה

הערה: כדי להבין את ההתנהגות הקולקטיבית של מנועי קינזין-3, בדיקת גלישה במיקרוטובול במבחנה בוצעה 18,30,31. כאשר מנועים משותקים על הכיסוי במצב הפוך, וכאשר מוסיפים מיקרוטובולים לתא, מיקרוטובולים נוחתים על מנועים וגולשים הלאה בזמן שהמנועים מנסים ללכת עליהם (איור 5A,B).

  1. פולימריזציה של מיקרוטובולים פלואורסצנטיים: פילמר את המיקרוטובולים בהתאם לפרוטוקול שתואר קודם לכן, למעט ערבוב רובולין המסומן ברודמין (3 מ"ג/מ"ל) עם טובולין ללא תווית (10 מ"ג/מ"ל) ביחס של 1:10.
  2. לאחר 30 דקות של פילמור, הוסיפו בעדינות 30 μL של חיץ ייצוב מיקרוטובול שחומם מראש ודגרו עוד יותר במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר מכן, גזירת המיקרוטובולים על ידי פיפטינג עם קצה העמסת הנימים (~25-30 פעמים).
  4. הכינו את תא זרימת התנועתיות כפי שתואר קודם לכן, זרמו 50 μL של ננו-גופי GFP מטוהרים Sf9 (2.5 μL של 100 ננומטר מדולל ב-50 μL של חיץ P12) ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כאשר הכיסוי פונה כלפי מטה בתא לח.
    הערה: המנועים מתויגים באופן סופי C עם mCitrine. ננו-גופים GFP משמשים לשיתוק המנועים בשל קבוע הדיסוציאציה הנמוךשלהם 32.
  5. חסום את משטח הכיסוי על ידי הזרמת 50 μL של מאגר בלוקים לתוך תא הזרימה כדי למנוע ספיחת חלבונים לא ספציפיים ודגרה נוספת במשך 5 דקות.
  6. הכן את תערובת המנוע על ידי צינורות 50 μL של חיץ בלוק, 1 μL של 100mM ATP, ו 5 μL של 100 nM Sf9 מטוהרים קינזין -3 מנועים. מערבבים בעדינות לפני הזרימה לתוך התא ודוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
  7. שטפו את התא פעמיים עם 50 מיקרו-ליטר של קזאין P12.
  8. בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי, הכינו את תערובת בדיקת הגלישה בסדר הבא, 45 μL של P12-casein עם 10 μM טקסול, 1 μL של 100 mM ATP, 0.5 μL של 8 מ"ג / מ"ל קטלאז, 0.5 μL של 20 מ"ג / מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 0.5 μL של 2.25 M גלוקוז ו 1 μL של מיקרוטובולים פלואורסצנטיים גזוזים. מערבבים בעדינות את התוכן לפני הזרימה לתוך תא התנועתיות ואוטמים את קצות התא עם שעוות פרפין נוזלית.
  9. מיקרוטובול תמונה גולש תחת תאורת TIRF בחשיפה של 100 אלפיות השנייה וצלם את התמונות באמצעות מצלמת EM-CCD מחוברת.
    הערה: מהירות הגלישה הממוצעת של מיקרוטובול נקבעה על-ידי מעקב ידני אחר כ-100 מיקרוטובולים בודדים מסגרת אחר מסגרת באמצעות תוסף שנכתב בהתאמה אישית ב-ImageJ29. קבעו את מהירות הגלישה הממוצעת של מיקרוטובולים על ידי יצירת היסטוגרמה והתאמה לפונקציית גאוס (איור 5C,D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לבטא ולטהר חלבונים מוטוריים רקומביננטיים פעילים ופונקציונליים בקנה מידה גדול באמצעות הביטוי Sf9-baculovirus, המערכת זקוקה ליצירת חלקיקים נגיפיים הנושאים ביציבות רצף קידוד כדי להדביק תאי Sf9. כדי להשיג זאת, תאי Sf9 הומרו עם קידוד רקומביננטי של הבקמיד KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG. לאחר 72 שעות, אוכלוסייה משמעותית של תאים הראתה ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (mCitrine) עם תאים וגרעינים מוגדלים (איור 1 ואיור 2), מה שמרמז על ייצור מוצלח של חלקיקים נגיפיים (P0). חלקיקים נגיפיים אלה הורחבו עוד יותר על ידי הדבקת אוכלוסיית Sf9 טרייה בנפח גבוה יותר כדי ליצור מלאי נגיפי P1 לאחסון והדבקה בקנה מידה גדול. לטיהור מנוע קינזין-3, תרבית של 30 מ"ל של תאי Sf9 הודבקו ב-1 מ"ל של חלקיקים נגיפיים מסוג P1. לאחר 72 שעות של זיהום, תאים המבטאים בבהירות חלבון פלואורסצנטי ירוק נקטפו, הושלכו וטוהרו באמצעות טיהור זיקה של תג C-terminal FLAG עם שרף מצופה נוגדנים נגד FLAG. באופן מעניין, התוספת של פפטיד FLAG לחרוזים שהוצמדו למנועי קינזין-3 חילצה את רוב החלבון בשבר אחד והחלבון המטוהר היה בטוהר גבוה, שהוצג כפס של ~120 kDa בנתיב 7 של איור 3.

הפילמור המוצלח של מיקרוטובולים ארוכים ובריאים כדי לחקור את תכונות התנועתיות של מנועי קינסין-3 מטוהרים S9 ברמת מולקולה אחת דורש טובולין טהור. במחקר הנוכחי, המיקרוטובולים עברו פולימריזציה באמצעות טובולין מחזורי פי 2 מטוהרים ממוח העז בריכוז קריטי בין ~2.5-3.0 מ"ג/מ"ל למשך 30 דקות בהיעדר טקסול, שכן טקסול מקטין את הריכוז הקריטי של נוקלאציה של מיקרוטובולים ומייצר מספר רב של מיקרוטובולים קצרים33,34,35 . טקסול נוסף לאחר פילמור כדי לייצב את המיקרוטובולים ולמנוע דה-פולימריזציה. מיקרוטובולים שעברו פולימריזציה בשיטה זו יצרו מבנים ארוכים ואחידים (וידאו 1) באורך ממוצע של 60-70 מיקרומטר.

ניתוח תנועתיות של מולקולה בודדת במבחנה של מנוע קינסין-3 מטוהר Sf9, KIF1A (1-393LZ) תחת תאורת TIRF (איור 4B) הציג תנועה חד-כיוונית, מהירה וסופר-מעובדת לאורך המיקרוטובול (וידאו 2), כפי שמוצג בקימוגרף כקווים לבנים אלכסוניים ארוכים (איור 4C). ניתוח מעקב של אירועי תנועתיות-על ארוכים אלה הראה מהירות ואורך ריצה ממוצעים של 2.44 ± 0.02 מיקרומטר-1 ו-10.79 ± 0.28 מיקרומטר (איור 4D-E), בהתאמה. תוצאות אלה תואמות את הנתונים שלנושפורסמו בעבר 12,13 באמצעות מנועים שהוכנו מליזאט תאי יונקים על ידי ביטוי יתר. יתר על כן, בדיקת המיקרוטובול הרב-מנועית באמצעות מנועים מטוהרים מסוג Sf9 המחוברים על הכיסוי מתחת לתאורת TIRF הציגה תנועה ארוכה, אחידה וחד-כיוונית (איור 5C ווידאו 3). ניתוח מעקב של אירועי ההחלקה המיקרוטובוליים הארוכים האלה הראה מהירות ממוצעת של 1.37 ± 0.01 מיקרומטר-1 (איור 5D).

יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שמערכת Sf9-baculovirus מספקת מערכת מצוינת לביטוי וטיהור של חלבונים מוטוריים פעילים שבדרך כלל קשים לשימוש במערכת הפרוקריוטית. תג FLAG מציע יתרון של טיהור חד-שלבי של חלבון בצורתו הטהורה. יתר על כן, פילמור מיקרוטובולים באמצעות טובולין טרי וטהור וייצובם לאחר הפילמור מניבים מיקרוטובולים ארוכים ואחידים. בנוסף, ניתוח תנועתיות של מולקולה בודדת במבחנה מצביע על כך שמנועים מטוהרים Sf9 היו חזקים והפגינו תכונות תנועתיות דומות למנועים המתבטאים במערכות יונקים.

Figure 1
איור 1: 48 שעות לאחר טרנספקציה של תאי Sf9 עם מנוע קינזין-3 המתויג פלואורסצנטי: תאי Sf9 היו מצופים על צלחת של 35 מ"מ בצפיפות של 4.5 x 105 תאים למ"ל. לאחר 24 שעות, התאים עברו טרנספקציה עם דנ"א רקומביננטי המקודד למנוע קינזין-3 ספציפי, KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG באמצעות ריאגנט טרנספקציה. לאחר 48 שעות של טרנספקציה, התמונות צולמו תחת הפרעה דיפרנציאלית וניגודיות (DIC) ותאורת אפיפלואורסצנציה. (A) תאים לא מחוברים, קטנים, עגולים ומחוברים היטב. (B) תאים שעברו טרנספקציה המבטאים את KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG חלבון מתויג המציג קוטר תא מוגדל ומחובר באופן רופף לפני השטח. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. (C) גרף עמודות המציין קוטר תא ממוצע של תאים לא משוננים ותאים שעברו טרנספקציה. קווי שגיאה מייצגים ממוצע ± SD. N = 50 תאים. מבחן t של התלמיד משמש למציאת ערך המשמעות (****p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: 72 שעות לאחר העברה של תאי Sf9 עם מנוע קינזין-3 המתויג פלואורסצנטי: תמונות המציגות יותר מ-90% מתאי Sf9 המבטאים מנוע קינזין-3 המתויג פלואורסצנטי, KIF1A(1-393LZ). התאים קשורים באופן רופף לפני השטח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מנוע קינזין-3 מטוהר Sf9: ג'ל SDS-PAGE מוכתם בקומסי המייצג מנוע קינזין-3 מטוהר Sf9, KIF1A(1-393LZ) C-מתויג באופן סופי עם 3xmCit-FLAG. משמאל לימין, סולם חלבונים (M), בקרת חלבון סטנדרטית BSA, 0.2 מיקרוגרם (נתיב 2), 0.4 מיקרוגרם (נתיב 3), 0.6 מיקרוגרם (נתיב 4), 0.8 מיקרוגרם (נתיב 5) ו-1.0 מיקרוגרם (נתיב 6), מנוע קינזין-3 מטוהר (S) (נתיב 7). BSA שימש כתקן להערכת ריכוז חלבונים מטוהרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: בדיקת תנועתיות של מולקולה בודדת במבחנה באמצעות מנועי קינזין-3 מטוהרים Sf9:(A) תא תנועתיות של תא זרימה סכמטי שהוכן באמצעות מגלשת זכוכית, סרט דו-צדדי וכיסוי זכוכית. (B) דיאגרמה מצוירת הממחישה הדמיה תוך-גופית של מולקולות בודדות של מנועים מתויגים פלואורסצנטיים הנעים לאורך משטח המיקרוטובול הנספג על גבי הכיסוי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF). רק המולקולות הקרובות מאוד לכיסוי מתרגשות בגלל השדה האוונסנטי (~150-200 ננומטר) שנוצר על ידי השתקפות מלאה של אור האירוע כאשר הוא מואר בזווית שמעבר לזווית הקריטית. (C) קימוגרף מתאר קינזין-3 מהלך מוטורי תהליכי (קווים לבנים אלכסוניים) לאורך פני השטח של המיקרוטובול. זמן על ציר y (חץ אנכי) ומרחק על ציר x (חץ אופקי). (ד-ה) ההיסטוגרמות של מהירות (D) ואורך ריצה (E) נקבעו על ידי מעקב אחר מנועים בודדים שהלכו על משטח המיקרוטובול מסגרת אחר מסגרת והיסטוגרמות שורטטו עבור כל אוכלוסיית מנועים והתאימו לגאוס יחיד. השיא מייצג את המהירות הממוצעת ואת אורך הריצה והערכים מוצגים בגרף כממוצע ± SEM. N = מספר האירועים שנספרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: בדיקת גלישה במיקרוטובולים במבחנה באמצעות מנועי קינזין-3 מטוהרים Sf9: (A) סכמת תא זרימה שהוכנה באמצעות מגלשת זכוכית, סרט דו-צדדי וכיסוי זכוכית. (B) דיאגרמה מצוירת הממחישה מיקרוטובולים בעלי תווית רודמין גולשים על פני השטח של מנועי קינסין-3 פעילים באופן מכונן. מכיוון שמנועי קינזין-3 מתויגים באופן סופי ב-C-Terminally עם mCitrine, נעשה שימוש בננו-גופים GFP כדי לחבר אותם למשטח הזכוכית. לאחר מכן, מיקרוטובולים עם תווית רודמין הוכנסו לתא הזרימה ותמונות של תנועת גלישה של מיקרוטובולים צולמו תחת תאורת TIRF. (C) הקימוגרף מייצג החלקה חלקה של מיקרוטובול (פס לבן אלכסוני) על ידי מנועי קינזין-3. זמן על ציר y (חץ אנכי) ומרחק על ציר x (חץ אופקי). ד. ההיסטוגרמה של המהירות תוכננה עבור אוכלוסייה של מיקרוטובולים והתאימה לפסגה אחת של גאוס. מהירות גלישה ממוצעת מסומנת בפינה השמאלית העליונה כממוצע ± SEM. N = מספר המולקולות שנספרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרטון 1: מיקרוטובולים פולימריים. הדמיית TIRF של מיקרוטובולים פולימריים לפני דילול לבדיקת תנועתיות. הסרט נרכש בחשיפה של 100 מילישניות והסרטון מוקרן במהירות של 60 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו 2: בדיקה תוך-גופית של מולקולה בודדת של מנוע קינזין-3 הפעיל המרכיב. מנועי KIF1A(1-393LZ) המתויגים פלואורסצנטיים מטוהרים מתאי Sf9 ונעים בהדרגה לאורך משטח המיקרוטובול (ללא תווית) הנספג על הכיסוי בתא בדיקה תנועתיות. ההדמיה בוצעה בתאורת TIRF ונרכשו תמונות בחשיפה של 100 אלפיות השנייה. הווידאו מופעל בקצב של 30 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו 3: בדיקת גלישה מיקרוטובולית של מנוע קינזין-3 הפעיל המרכיב. מיקרוטובולים עם תווית רודמין גולשים בצורה חלקה על פני השטח של מכסה הזכוכית המצופה במנוע KIF1A מטוהר Sf9 (1-393LZ). ההדמיה בוצעה בתאורת TIRF ונרכשו תמונות בחשיפה של 100 אלפיות השנייה. הווידאו מופעל במהירות של 60 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

טבלה משלימה 1: הרכב המאגרים והריאגנטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת הביטוי Sf9-baculovirus היא אחת השיטות הרב-תכליתיות והמוצלחות ביותר לייצור חלבונים בתפוקה גבוהה 19,36,37. יכולת השינוי לאחר ההעברה של תאי Sf9 דומה מאוד למערכת היונקים15. חסרון ניכר בשימוש במערכת זו הוא שהיא איטית ורגישה לזיהום. אחד הצעדים הקריטיים ביותר הוא זיהום יעיל וביטוי מוצלח בתאי Sf9, הדורש טיפול ותחזוקה נאותים של תאי Sf9 ללא כל זיהום. המערכת דורשת מקום ייעודי ללא אבק ומכשירים כגון אינקובטור ושייקר מבוקרי טמפרטורה. תרגול לא סדיר של תרביות תאים ושימוש בתרבית מגודלת יתר יגרום לזיהום לקוי, לגדילה איטית ולמוות משמעותי של תאים.

לטיהור תג FLAG של חלבון המתבטא בתאי Sf9 יש מספר יתרונות. ראשית, תאי Sf9 יכולים להיות מלוכדים ביעילות כדי לקבל את רוב החלבון בצורתו הפעילה והמסיסה. שנית, לשרף FLAG יש פחות ספיחת חלבונים לא ספציפיים מאשר שרף HIS ו-GST38. כתוצאה מכך, כמות משמעותית של החלבון משתחררת בשלב אחד בצורתו הטהורה. מנועי הקינזין-3 המטוהרים Sf9 הראו שיעורי תחלופה חזקים של ATP מגורה מיקרוטובול במבחני ATPase ביוכימיים14. באופן דומה, במבחני תנועתיות של מולקולה בודדת במבחנה, מנועים אלה הראו תנועתיות מהירה וסופר-מעבדית על פני השטח של המיקרוטובול. באופן מעניין, תכונות תנועתיות אלה הראו דמיון יוצא דופן עם תכונות התנועתיות שנמדדו באמצעות מנועים שהוכנו מליזאטים של תאי יונקים11,12,13. בנוסף, קצב הדריכה הנמדד של מנועי קינסין-3 במבחן תנועתיות המולקולה הבודדת במבחנה תואם באופן הדוק את קצב ההידרוליזה של ATP שנמדד בבדיקת ATPase ביוכימית, מה שמרמז על כך שמנועים מבצעים הידרוליזה של מולקולת ATP אחת לכל שלב14. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שמנועי kinesin3 שטוהרו ממערכת הביטוי Sf9-baculovirus הניבו אוכלוסייה גדולה משמעותית של חלבונים פעילים ומסיסים. לכן, אנו מאמינים כי ניתן להשתמש במערכת Sf9-baculovirus כדי לטהר חלבונים מוטוריים בעלי עניין עם השינויים הדרושים.

בדיקת תנועתיות של מולקולה בודדת במבחנה של מנועי קינזין-3 המפגינים תנועתיות על-מעבדית זקוקה לפילמור של מיקרוטובולים פולימריים ארוכים. שלב קריטי בפולימריזציה במבחנה של מיקרוטובולים ארוכים הוא להכין תערובת פילמור עם ריכוז טובולין קריטי, זמן הדגירה ו- pH מתאים של חיץ. הטובולין המשמש לפולימריזציה של מיקרוטובולים צריך להיות מוכשר מאוד, טהור ומאוחסן בחנקן נוזלי באליקוטים קטנים כדי למנוע הקפאה והפשרה. אין להקפיא את טובולין, לאחר ההפשרה, לצורך פילמור עתידי, משום שטובולין מאבד את יכולתו באופן משמעותי בכל מחזור הפשרה בהקפאה. טובולין לא כשיר לא יתרום לפולימריזציה של המיקרוטובול, אך יעכב את תהליך הפילמור ויגרום למיקרוטובולים קצרים עם פגמים לא ידועים. ריכוז הטובולין האופטימלי בתערובת הפילמור צריך להיות בין 2.5-3 מ"ג/מ"ל ויש לשמור את התערובת על קרח למשך 5 דקות לפני הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לצורך פילמור. משך פילמור microtubules צריך להיות בין 20-30 דקות ולא יעלה על 30 דקות, כמו פילמור ממושך לעתים קרובות גורם להיווצרות של microtubules קצר ומקוטע.

לאחר מכן, ייצוב של מיקרוטובולים פולימריים הוא שלב קריטי שני. טקסול מסיס בצורה גרועה במים ומזרז בתמיסה מימית39. לכן, הכינו את חיץ הייצוב טרי עם טקסול 10 μM, הוסיפו בעדינות מעל תערובת המיקרוטובולים הפולימריים, ודגרו הלאה מבלי להפריע. השתמש תמיד ב-taxol aliquot קפוא מהמקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס כדי להכין את חיץ הייצוב, שכן אליקוט מופשר גורם למשקעים/צבירה של מיקרוטובולים פולימריים. טפל תמיד במיקרוטובולים הפולימריים באמצעות קצוות משופעים כדי למנוע שבירה. מיקרוטובולים שעברו פולימריזציה בשיטה זו מניבים מיקרוטובולים ארוכים באורך 60-70 מיקרומטר המתאימים לניתוח תנועתיות סופר-מעבדית. השלב הקריטי הבא הוא ספיחה יציבה של מיקרוטובולים למשטח הכיסוי בתא התנועתיות. כדי להשיג זאת, יש לאחסן את הכיסויים במקום יבש מכיוון שחשיפת הכיסויים לסביבה הלחה מקטינה באופן משמעותי את יעילות ספיחת המיקרוטובולים ואת יציבותם.

הכנת תערובת בדיקת תנועתיות עם מרכיבים מתאימים בריכוזים מסוימים וריכוז חלבון מוטורי אופטימלי חשובה להשגת אירועי תנועתיות חזקים לאורך פני המיקרוטובול. המרכיב החיוני ביותר ביצירת תנועתיות חלקה ותהליכית הוא שימוש בתמיסת ATP יציבה בתערובת הבדיקה. (לפיכך, יש לנקוט משנה זהירות בעת הכנת מניית ה-ATP). המסת מלח הנתרן של ATP במאגר 10 mM PIPES pH 6.9, מניבה תמיסה ברורה עם pH נמוך מאוד. ATP הוא מאוד לא יציב ב-pH נמוך ועובר הידרוליזה מהירה ל-ADP ולפוספט, ובכך שמירה על התמיסה קרה והתאמה מיידית של ה-pH ל-7.0 באמצעות KOH מרוכז מונעת הידרוליזה.) הזרימו את תערובת התנועתיות לתוך תא הזרימה ואטמו את שני הקצוות עם פרפין נוזלי כדי למנוע זרימת נוזל וייבוש של התא תוך הדמיה תחת תאורת TIRF.

מכיוון שמנועי קינזין-3 הם מהירים וסופר-מעבדים לאורך מסלולי המיקרוטובול, ההדמיה, רכישת הנתונים והניתוח שלהם מציבים מספר אתגרים. הדמיה של מולקולה בודדת ואיסוף נתונים צריכים להתבצע בעוצמת לייזר נמוכה כדי למנוע הלבנה של חלבונים פלואורסצנטיים לפני שהמנוע משלים את הריצה התהליכית שלו. הנתונים הנרכשים יהיו בעוצמה נמוכה עם יחס אות לרעש גרוע. כתוצאה מכך, מעקב אחר אירועי תנועתיות בודדים אלה באמצעות תוכנת מעקב אוטומטית קיימת כדי לאפיין את אירועי התנועתיות שלהם יהיה קשה. לכן, ניתוח נתונים צריך להתבצע באופן ידני על ידי מעקב מדויק אחר נקודות מנוע מתויגות פלואורסצנטיות הנעות לאורך מסלולי המיקרוטובול מסגרת אחר מסגרת עם מינימום שגיאות. לניתוח נתונים, באופן מועדף, בחר את אירועי התנועתיות במסלולי המיקרוטובול הארוכים כדי למנוע ממנועים להגיע לקצה המיקרוטובול לפני השלמת ריצתם. לקבלת תוצאות עקביות וניתנות לשחזור, שקול רק את אירועי התנועתיות למעקב, לפחות, אחר 10 המסגרות האחרונות (500 אלפיות השנייה) עם התחלה וסיום ברורים של הריצה התהליכית.

בסך הכל, השיטה מציעה מספר יתרונות על פני השיטה הקיימת, כגון טיהור פשוט וחד-שלבי של חלבונים מוטוריים פעילים, הכנת מיקרוטובולים ארוכים ופרוטוקול מפורט שלב אחר שלב עם הוראות להשגת תנועתיות טובה. באופן עקרוני, ניתן ליישם את השיטה כדי לבטא ולטהר כל סוג וסוג של חלבונים, כולל אך לא מוגבל למיוזין, קינזין ודיינין. ואכן, מערכת הביטוי baculovirus הוקמה בהצלחה כדי לטהר כמה חיסונים ויראליים, וקטורים של ריפוי גנטי וחלבונים תרופתיים אחרים20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים להצהיר.

Acknowledgments

V.S. ו- P.S. מודים לפרופ' קריסטן ג'יי ורהי (אוניברסיטת מישיגן, אן ארבור, מישיגן, ארה"ב) ולפרופ' רופ מאליק (המכון ההודי לטכנולוגיה בומביי (IITB), מומבאי, הודו) על תמיכתם ללא תנאי לאורך כל המחקר. נ.ב. מודה לד"ר סיבפריה קירובקאראן על תמיכתה לאורך כל הפרויקט. V.S. מאשרת מימון באמצעות DBT (מענק מס': BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 ו-BT/RLF/Re-entry/45/2015) ו-DST-SERB (מענק מס': ECR/2016/000913). P.K.N מאשרת את ICMR למימון (מענק מס' 5/13/2019/NCD-III). נ.ב. מאשרת מימון משעון הקיץ (מענק מס': SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S מכיר במלגה מ- IIT Gandhinagar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinity Biolegend 651502 For protein purification
Aprotinin Sigma A6279 For protein purification
Cellfectin Invitrogen 10362100 For Sf9 transfection
DTT Sigma D5545 For motility assays and protein purification
FLAG peptide Sigma F3290 For protein purification
Glycerol Sigma G5516 To freeze the protein
HEPES Sigma H3375 For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630 Sigma I8896 For Sf9 lysis buffer
KCl Sigma P9541 For buffers preparation
Leupeptin Sigma L2884 For protein purification
MgCl2 Sigma M2670 For buffers preparation
NaCl Sigma S7653 For preparing lysis buffer
PMSF Sigma P7626 For protein purification
Sf9 cells Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottles Thermo Scientific 4115-0125 For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X) Thermo Scientific 10902-096 -500ml For culturing Sf9 cells
Sucrose Sigma S1888 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s media Thermo Scientific 11595030 -500ml For Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATP Sigma A2647 For motility and gliding assay
BSA Sigma A2153 For blocking motility chamber
Catalase Sigma C9322 For motility and gliding assay
DMSO Sigma D5879 For dissolving Rhodamine
EGTA Sigma 3777 For preparing buffers
Glucose Sigma G7021 For motility and gliding assay
Glucose oxidase Sigma G2133 For motility and gliding assay
GTP Sigma G8877 For microtubule polymerization
KOH Sigma P1767 Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPES Sigma P6757 For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needle Dispovan For shearing microtubules
Casein Sigma C3400 For microtubule glidning assay
GFP nanobodies Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) For attaching motors to the coverslip
Rhodamine Thermo Scientific 46406 For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tips Eppendorf For Sf9 culture and purification
15ml concal tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
35mm cell culture dish Cole Palmer 15179-39 For Sf9 culture
Balance Sartorious 0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubator REMI For Sf9 suspenculture at 28oC
Camera EMCCD Andor iXon Ultra 897 For TIRF imaging and acquesition
Double sided tape Scotch For making motility chamber
Glass coverslip Fisherfinest 12-548-5A size; 22X30
Glass slide Blue Star For making motility chamber
Heating block Neuation Dissolving paraffin wax
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti- U To check protein expression
Lasers 488nm (100mW) For TIRF imaging
Liquid nitrogen For sample freezing and storage
Microcapillary loading tip Eppendorf EP022491920 For shearing microtubules
Microscope Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up For TIRF imaging
Mini spin Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd For quick spin
Objective 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion For TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XE Beckman Coulter For protein purification
Parafilm Eppendorf
pH-meter Corning Coring 430 To adjust pH
Pipette-boy VWR For Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21 Thermo Scientific For protein purification
Sorvall ST8R centrifuge Thermo Scientific Protein purification
ThermoMixer Eppendorf For microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotor Beckman coulter SW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixer Neuation Sample mixing
Wax Sigma V001228 To seal motility chamber

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A. Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. Kumar, D., Gong, C. , Springer International Publishing. 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Tags

ביוכימיה גיליון 185
אנליזה של מולקולה בודדת של מנועי משפחת קינסין-3 מטוהרים מסוג Sf9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soppina, P., Shewale, D. J., Naik,… More

Soppina, P., Shewale, D. J., Naik, P. K., Soppina, V. Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors. J. Vis. Exp. (185), e63837, doi:10.3791/63837 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter