Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحليل جزيء واحد لمحركات عائلة Kinesin-3 فائقة المعالجة المنقى Sf9

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63837
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Discipline of Biological Engineering, Indian Institute of Technology Gandhinagar, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Sambalpur University

Summary

توضح هذه الدراسة تنقية KIF1A (1-393LZ) ، وهو عضو في عائلة kinesin-3 ، باستخدام نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9. أظهر تحليل الانزلاق أحادي الجزيء ومتعدد المحركات في المختبر لهذه المحركات المنقاة خصائص حركية قوية مماثلة للمحركات من محللة خلايا الثدييات. وبالتالي ، فإن نظام Sf9-baculovirus قابل للتعبير عن البروتين الحركي ذي الأهمية وتنقيته.

Abstract

تشكل البيئة الخلوية المعقدة تحديات لتحليل حركية الجزيء الواحد. ومع ذلك ، فقد أدى التقدم في تقنيات التصوير إلى تحسين دراسات الجزيء الواحد واكتسب شعبية هائلة في اكتشاف وفهم السلوك الديناميكي للجزيئات الموسومة بالفلورسنت. هنا ، نصف طريقة مفصلة للدراسات أحادية الجزيء في المختبر لمحركات عائلة kinesin-3 باستخدام الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF). Kinesin-3 هي عائلة كبيرة تلعب أدوارا حاسمة في الوظائف الخلوية والفسيولوجية التي تتراوح من نقل البضائع داخل الخلايا إلى انقسام الخلايا إلى التنمية. لقد أظهرنا سابقا أن محركات ثنائي الحركة 3 النشطة بشكل أساسي تظهر حركية سريعة وفائقة المعالجة مع تقارب عالي للأنابيب الدقيقة على مستوى الجزيء الواحد باستخدام محللات الخلايا المحضرة عن طريق التعبير عن المحرك في خلايا الثدييات. يدرس مختبرنا محركات kinesin-3 وآلياتها التنظيمية باستخدام الأساليب الخلوية والكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية ، وتتطلب مثل هذه الدراسات بروتينات نقية على نطاق واسع. سيكون التعبير عن هذه المحركات وتنقيتها باستخدام خلايا الثدييات مكلفا ويستغرق وقتا طويلا ، في حين أن التعبير في نظام التعبير بدائي النواة أدى إلى بروتين مجمع وغير نشط بشكل كبير. للتغلب على القيود التي تفرضها أنظمة تنقية البكتيريا وتحلل خلايا الثدييات ، أنشأنا نظام تعبير قوي عن فيروس Sf9-baculovirus للتعبير عن هذه المحركات وتنقيتها. محركات kinesin-3 موسومة بشكل نهائي C ببروتينات فلورية ترادفية ثلاثية (3xmCitirine أو 3xmCit) توفر إشارات محسنة وتقلل من التبييض الضوئي. في المختبر ، يوضح تحليل الانزلاق أحادي الجزيء ومتعدد المحركات للبروتينات المنقاة Sf9 أن محركات kinesin-3 سريعة وفائقة المعالجة تشبه دراساتنا السابقة باستخدام تحلل خلايا الثدييات. تشمل التطبيقات الأخرى التي تستخدم هذه المقايسات المعرفة التفصيلية لظروف oligomer للمحركات ، وشركاء الربط المحددين الموازين للدراسات الكيميائية الحيوية ، وحالتهم الحركية.

Introduction

تشكل بيئة الخلية المزدحمة للغاية العديد من التحديات في فرز البروتينات والجزيئات المتجهة. يتم تسهيل عبء العمل المكثف للتنظيم والتوزيع الزماني المكاني للجزيئات داخل السيتوبلازم بواسطة المحركات الجزيئية والمسارات الهيكلية الخلوية. المحركات الجزيئية هي الإنزيمات التي تحلل عملات الطاقة مثل ATP وتستخدم تلك الطاقة أثناء الحركة وتوليد القوة1. بناء على تشابه تسلسل الأحماض الأمينية ، يتم تجميع الكينيسين في 14 عائلة وعلى الرغم من هذا التشابه ، يساهم كل محرك بشكل فريد في عمل الخلية. تشكل محركات عائلة Kinesin-3 واحدة من أكبر المحركات ، وتضم خمس عائلات فرعية (KIF1 و KIF13 و KIF14 و KIF16 و KIF28) 2 ، المرتبطة بوظائف خلوية وفسيولوجية متنوعة ، بما في ذلك نقل الحويصلة ، والإشارات ، والانقسام ، والهجرة النووية ، والتنمية 3،4،5. ضعف في وظيفة النقل kinesin-3 متورط في العديد من الاضطرابات التنكسية العصبية ، وعيوب النمو ، وأمراض السرطان6،7،8،9.

أظهرت الأعمال الحديثة أن محركات kinesin-3 هي مونومرات ولكنها تخضع للتثبيط الناجم عن البضائع وتؤدي إلى حركة سريعة وفائقة المعالجة مقارنة بالكينيسينالتقليدي 10،11،12،13. يحتاج توصيفها البيوكيميائي والفيزيائي الحيوي إلى كمية كبيرة من البروتينات النقية النشطة. ومع ذلك ، أدى إنتاجها في نظام التعبير بدائي النواة إلى محركات غير نشطة أو مجمعة ، على الأرجح بسبب تخليق البروتين غير المتوافق ، وآلات الطي والتعديل14،15،16،17،18. للتحايل على هذه القيود وزيادة العائد ، أنشأنا هنا نظام تعبير قوي عن فيروس Sf9-baculovirus للتعبير عن هذه المحركات وتنقيتها.

يستخدم نظام تعبير الفيروس البقعي خطوط خلايا الحشرات Sf9 كنظام مضيف لتعبير البروتين المؤتلف حقيقي النواة عالي الإنتاجية19,20. يمتلك Baculovirus محفزا قويا متعدد السطوح يساعد في التعبير الجيني غير المتجانس وإنتاج البروتينات المؤتلفة القابلة للذوبان17. نظرا لفعاليتها من حيث التكلفة وآمنة في التعامل معها وكمية عالية من تعبير البروتين النشط ، فقد أصبحت أداة قوية21. للتعبير عن البروتين محل الاهتمام ، تتمثل الخطوة الرئيسية في توليد باكميد مؤتلف. نظرا لأن مجموعات توليد bacmid المتاحة تجاريا باهظة الثمن وسنعمل مع المزيد من العينات ، فقد طورنا بروتوكولا داخليا لكل من الإدخالات الكبيرة والصغيرة لمحركات kinesin-3 في bacmids. تم استخدام محركات kinesin-3 المنقى Sf9 لتوصيف خصائص انزلاق الأنابيب الدقيقة أحادية الجزيء ومتعددة المحركات في المختبر باستخدام الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF). يتم تمييز المحركات بشكل نهائي C بجزيئات فلورية ترادفية ثلاثية (3xmCit) لتوفير إشارة محسنة وتقليل التبييض الضوئي. نظرا لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، والسمية الضوئية الأقل ، والتصوير الانتقائي لمنطقة صغيرة جدا بالقرب من الغطاء ، فقد تم استخدام تصوير TIRF على نطاق واسع لتصور ديناميكيات البروتين على مستوى الجزيء الواحد في الجسم الحي وفي المختبر.

تناقش هذه الدراسة تنقية محركات kinesin-3 من خلال استخدام نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9 والتصوير أحادي الجزيء في المختبر وتحليل الانزلاق متعدد المحركات باستخدام الفحص المجهري TIRF. إجمالا ، تظهر هذه الدراسة أن خصائص الحركة للمحركات المنقاة Sf9 متطابقة مع خصائص المحركات المحضرة من محللات خلايا الثدييات. ومن ثم ، نعتقد أنه يمكن تكييف نظام Sf9-baculovirus للتعبير عن أي بروتين حركي مهم وتنقيته.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة Sf9 ، والنقل ، وتوليد الفيروسات

ملاحظة: حافظ على خلايا Sf9 في 30 مل من وسط Sf-900 / SFM في دورق مخروطي معقم 100 مل يمكن التخلص منه بدون أي مضاد حيوي / مضاد حيوي عند 28 درجة مئوية. حافظ على ثقافة التعليق في شاكر مداري عند 90 دورة في الدقيقة. توريد CO2 وصيانة الرطوبة غير مطلوب. عادة ما يتم زراعة الخلايا كل يوم رابع عن طريق تلقيح 0.5 × 106 خلايا / مل للوصول إلى كثافة 2.0 × 106 خلايا / مل في اليوم الرابع.

  1. توليد مخزون فيروس P0
    1. لنقل الخلايا ، خلايا البذور في طبق 35 ملم مع التقاء 4.5 × 105 خلايا / مل والحفاظ عليها عند 28 درجة مئوية دون اهتزاز.
    2. بعد 24 ساعة ، بمجرد أن تعلق الخلايا وتبدو صحية ، تابع النقل كما هو موضح أدناه.
      1. الأنبوب أ: امزج 1 ميكروغرام من ترميز الحمض النووي bacmid لمحرك kinesin-3 الخاص ب KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG مع 100 ميكرولتر من وسائط Grace غير المكملة.
      2. الأنبوب B: امزج 6 ميكرولتر من كاشف النقل مع 100 ميكرولتر من وسائط جريس غير المكملة.
      3. انقل محتوى الأنبوب A بعناية إلى الأنبوب B واخلطه جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل (حوالي 20 مرة).
      4. احتضان الخليط لمدة ~ 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. بعد الانتهاء من الحضانة ، أضف 0.8 مل من وسائط جريس غير المكملة إلى الخليط أعلاه واخلطها ببطء عن طريق السحب.
    4. قم بشفط وسائط Sf-900 / SFM برفق من الخلايا (لإزالة أي آثار للمصل قد تؤثر على كفاءة النقل).
    5. أضف خليط النقل من الخطوة 1.1.3 قطرة قطرة على الجزء العلوي من الخلايا واحتضان اللوحة لمدة 6 ساعات عند 28 درجة مئوية.
    6. بعد الحضانة ، قم بإزالة خليط النقل بعناية ، وأضف 2 مل من وسائط Sf-900 / SFM واحتضانها لمدة 48 ساعة عند 28 درجة مئوية.
    7. تحقق من تعبير البروتين الحركي تحت مجهر مضان مقلوب. يتم تمييز البروتين الحركي ببروتين الفلورسنت ، mCitrine ، وهو نوع من بروتين الفلورسنت الأصفر.
      ملاحظة: تم تصور الخلايا المنقولة تحت مجهر مقلوب مزود بتباين التداخل التفاضلي (DIC) وإضاءة فوق التألق مع هدف 20x (تكبير 200 مرة) ومصباح زئبقي وكاميرا EM-CCD. تحقق من كفاءة توليد الفيروس والعدوى من خلال مراقبة تعبير المحركات الموسومة بالسيترين في الخلايا من خلال إثارة mCitrine ومكعب مرشح الانبعاثات. بالإضافة إلى ذلك ، تحقق من التغيرات المورفولوجية للخلايا المصابة ، مثل الخلايا / النوى المتضخمة (الشكل 1A-C).
    8. مرة أخرى ، تحقق من الخلايا بعد 72 ساعة من الإصابة. عادة ، تبدأ الخلايا في الانفصال عن السطح (الشكل 2).
    9. إذا انفصلت >5٪ من الخلايا عن السطح ، فقم بحصاد الوسائط المصابة بالخلايا المصابة في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 1.5 مل وتدور لمدة 5 دقائق عند 500 × جم.
    10. اجمع حصص التجميد الطافي والمفاجئة البالغة 1 مل في النيتروجين السائل وقم بتخزينها كمخزون P0 عند -80 درجة مئوية أو استخدمها لتوليد مخزون فيروس P1.
  2. توليد مخزون فيروس P1
    1. لزيادة تضخيم مخزون الفيروس البقعي P0 وتأكيد تعبير البروتين ، قم بزراعة خلايا Sf9 في ثقافة التعليق السائل.
    2. في دورق مخروطي معقم سعة 100 مل ، أضف 10 مل من وسائط Sf-900 / SFM بكثافة خلية تبلغ 2 × 106 خلايا / مل و 1 مل من مخزون فيروس P0. احتضان عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 90 دورة في الدقيقة.
    3. بعد 72 ساعة من الإصابة، تحقق من تعبير البروتين كما هو موضح سابقا (الخطوة 1.1.7). إذا كان تعبير البروتين جيدا (>90٪ من الخلايا تظهر إشارة مضان mCitrine ساطعة) ويظهر موتا كبيرا للخلايا (حوالي 10٪ -15٪) ، فقم بتدوير الخلايا في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. اجمع القسمة الطافية المتجمدة المفاجئة من 1 مل (مخزون P1) في النيتروجين السائل وخزنها في -80 درجة مئوية أو تابع العدوى على نطاق واسع وتنقية البروتين.
  3. عدوى واسعة النطاق
    1. للتعبير البروتيني على نطاق واسع ، تصيب 30 مل من مزرعة التعليق بكثافة 2 × 106 خلايا / مل مع 1 مل من مخزون فيروس P1 واحتضانها عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 90 دورة في الدقيقة.
    2. بعد ~ 72 ساعة بعد الإصابة ، تحقق من تعبير البروتين (بشكل عام ، يتم تحقيق أقصى تعبير للبروتين بين 65-75 ساعة بعد الإصابة).
    3. إذا أظهرت >90٪ من الخلايا إشارة فلورية ساطعة مع الحد الأدنى من موت الخلايا (<5٪) ، فقم بجمع الخلايا في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل وقم بالدوران لأسفل عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك حد أدنى من موت الخلايا (<5٪) ، لأن الخلايا الميتة تطلق المحتويات الخلوية في الوسائط ، مما يؤدي إلى فقدان البروتين المعبر عنه.
    4. تخلص من المادة الطافية ، واجمع حبيبات الخلية ، واستمر في تنقية البروتين.

2. تنقية Sf9 لمحركات kinesin-3

  1. إلى حبيبات الخلية أعلاه ، أضف 3 مل من محلول تحلل الجليد البارد (الجدول التكميلي 1) مستكمل حديثا ب 5 mM DTT ، و 5 ميكروغرام / مل من الأبروتينين ، و 5 ميكروغرام / مل من الليوبتين ، و 5 ميكروغرام / مل من PMSF وقم بتحليل الخلايا عن طريق السحب 20-25 مرة دون توليد أي فقاعات هواء. لجميع التركيبات والكواشف العازلة ، يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 1.
  2. قم بتدوير محللة الخلية عند 150000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. اجمع المادة الطافية في أنبوب طازج ومعقم واخلطها مع ~ 40 ميكرولتر من راتنج التقارب M2 المضاد ل FLAG بنسبة 50٪. احتضن الخليط لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية مع التقليب من طرف إلى طرف.
  4. بعد الحضانة, بيليه راتنج FLAG عن طريق الغزل عند 500 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استنشاق الطافت برفق دون إزعاج الحبيبات بإبرة 26 جم والتخلص منها.
  5. اغسل حبيبات راتنج FLAG ثلاث مرات باستخدام محلول غسيل مثلج بارد (الجدول التكميلي 1) مكمل حديثا ب 2 mM DTT ، و 5 ميكروغرام / مل من الأبروتينين ، و 5 ميكروغرام / مل من الليوبتين ، و 5 ميكروغرام / مل من PMSF. حبيبات الخرز عن طريق الغزل في 500 × غرام لمدة 1 دقيقة عند 4 °C في كل غسلة.
  6. بعد الغسيل الثالث ، قم بتصريف المخزن المؤقت للغسيل بعناية قدر الإمكان دون إزعاج الحبيبات. لشطف البروتين ، أضف ~ 70 ميكرولتر من محلول الغسيل الذي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من ببتيد FLAG إلى حبيبات الراتنج واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هبوط من طرف إلى طرف.
  7. في اليوم التالي ، قم بتدوير الراتنج عند 500 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على البروتين المنقى في أنبوب طازج واستكمل بنسبة 10٪ من الجلسرين. التقط حصص تجميد 5 ميكرولتر في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  8. قم بتشغيل جل SDS-PAGE لتحديد تركيز البروتين وإنتاجيته. جنبا إلى جنب مع البروتين المنقى من الفائدة ، يتم تحميل عنصر تحكم البروتين القياسي ، BSA بتركيزات معروفة تتراوح من 0.2 ميكروغرام ، 0.4 ميكروغرام ، 0.6 ميكروغرام ، 0.8 ميكروغرام ، و 1 ميكروغرام لتوليد منحنى قياسي. وصمة عار الجل مع Coomassie بريليانت الأزرق (الشكل 3).
  9. قم بتحليل الجل باستخدام أداة قياس كمية الجل المدمجة في برنامج ImageJ. أولا ، قم بقياس شدة النطاق للتركيزات المعروفة ل BSA وإنشاء المنحنى القياسي. بعد ذلك ، قم بقياس شدة شريط البروتين المنقى وتحديد تركيز البروتين. للقيام بذلك ، افتح برنامج Image J ، وانقر فوق خيار التحليل في شريط القائمة وحدد Gels في القائمة المنسدلة.

3. مقايسة حركية الجزيء الواحد في المختبر باستخدام محركات kinesin-3 المنقى Sf9

ملاحظة: يمكن استخدام محركات kinesin-3 المنقى Sf9 لدراسة الخصائص البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية مثل معدل دوران ATP ، وتقارب الأنابيب الدقيقة ، والسرعة ، وطول التشغيل ، وحجم الخطوة ، وتوليد القوة. هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لتحليل حركية الجزيء الواحد في المختبر ل KIF1A (1-393LZ) باستخدام الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF). لجميع مكونات المخازن المؤقتة والكواشف ، يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 1.

  1. بلمرة الأنابيب الدقيقة
    1. في أنبوب طرد مركزي دقيق 0.5 مل مبرد مسبقا ، قم بإعداد مزيج بلمرة عن طريق السحب بالترتيب التالي: 12.0 ميكرولتر من المخزن المؤقت BRB80 ، درجة الحموضة 6.9 ؛ 0.45 ميكرولتر من 100 mM MgCl2 ، 1 ميكرولتر من 25 mM GTP.
    2. أخرج حصة 10 ميكرولتر من 10 مجم / مل توبولين مخزن في النيتروجين السائل ، وقم بإذابة الثلج على الفور ، وأضفه إلى خليط البلمرة أعلاه. تخلط بلطف عن طريق سحب 2-3 مرات دون خلق أي فقاعات الهواء.
      ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه بسرعة وبدقة على الجليد.
    3. دع الخليط أعلاه يجلس على الثلج لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: هذه خطوة حاسمة لمنع تغيير طبيعة التوبولين أو لتجنب تكوين بذور الأنابيب الدقيقة القصيرة.
    4. انقل الأنبوب إلى كتلة حرارية / حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مسبقا واحتضانه لمدة 30 دقيقة لبلمرة الأنابيب الدقيقة.
    5. أثناء بلمرة الأنابيب الدقيقة ، قم بإذابة حصة من المخزن المؤقت P12 وإحضارها إلى درجة حرارة الغرفة.
    6. قبل الانتهاء من 30 دقيقة من الحضانة ، ابدأ في إعداد المخزن المؤقت لتثبيت MT عن طريق سحب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت P12 في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. لهذا ، أضف 1 ميكرولتر من 1 mM taxol ودوامة الخليط على الفور.
      ملاحظة: ابدأ في إعداد المخزن المؤقت لتثبيت MT قبل حوالي 5 دقائق من إكمال الحضانة في الخطوة 3.1.4. يعمل تاكسول على استقرار الأنابيب الدقيقة المبلمرة عن طريق الارتباط ب β-tubulin.
    7. قم بتسخين المخزن المؤقت لتثبيت الأنابيب الدقيقة لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية وأضفه برفق إلى الأنابيب الدقيقة المبلمرة دون إزعاج خليط البلمرة في الأسفل.
      ملاحظة: سيؤدي تسخين مخزن التثبيت المؤقت إلى جعله في نفس درجة حرارة خليط البلمرة.
    8. لا تنقر على الخليط أو تضعه في ماصة وتحتضنه أكثر عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    9. اضغط برفق على الخليط واخلطه بطرف مقطوع مشطوف (سعة 200 ميكرولتر) ببطء باستخدام الماصة.
      ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، تعامل دائما مع الأنابيب الدقيقة بطرف مقطوع مشطوف لتجنب قص الأنابيب الدقيقة.
    10. خذ 10-15 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة المبلمرة في خلية التدفق للتحقق من بلمرة الأنابيب الدقيقة المناسبة.
      ملاحظة: يمكن للمرء أن يتصور الأنابيب الدقيقة غير المسماة باستخدام إعداد الفحص المجهري DIC.
    11. إذا كانت الأنابيب الدقيقة مركزة ، فقم بتخفيفها في المخزن المؤقت P12 المكمل ب 10 ميكرومتر تاكسول.
  2. إعداد غرفة خلية تدفق الحركة
    1. قم بإعداد غرفة الحركة باستخدام شريحة زجاجية وشريط على الوجهين وغطاء زجاجي (22 مم × 30 مم).
    2. خذ شريحة زجاجية ، ضع قطرة (~ 70 ميكرولتر) من الماء المقطر منزوع الأيونات في المنتصف وامسحها بورق مناديل خال من النسالة.
    3. قم بقص شريطين من الشريط على الوجهين (~ 35 × 3 مم) وألصقهما بإحكام على الشريحة الزجاجية بالتوازي ، مع ترك فجوة ~ 4-5 مم بين شريطين لإنشاء ممر ضيق.
    4. بعد ذلك ، خذ غطاء وأضف قطرة (~ 20 ميكرولتر) من الماء المقطر منزوع الأيونات في المنتصف. ضع شريطا من المناديل الورقية لتنظيف العدسات الخالية من النسالة على قطرة الماء حتى تمتص الماء. ثم حركه ببطء نحو أحد طرفي غطاء الغطاء.
      ملاحظة: يجب أن يكون الغطاء جافا تماما. يجب ألا يكون الماء مرئيا على غطاء الغطاء.
    5. ضع الغطاء على الشرائط ذات الوجهين العالقة على الشريحة واضغط على الغطاء بالتساوي على طول الشرائط لتلتصق بإحكام.
      ملاحظة: يرجى التأكد من أن الجانب النظيف من غطاء الغطاء يواجه الشريحة الزجاجية.
    6. تأكد من أن هذا معا يخلق غرفة ضيقة بسعة 10-15 ميكرولتر لأداء فحص الحركة (الشكل 4 أ).
  3. مقايسة حركية الجزيء الواحد في المختبر
    ملاحظة: لدراسة خصائص حركية الجزيئات المفردة القائمة على الأنابيب الدقيقة للمحركات ، يجب امتصاص الأنابيب الدقيقة على سطح الغطاء في غرفة الحركة.
    1. قم بتخفيف الأنابيب الدقيقة المبلمرة المستقرة في المخزن المؤقت P12 المكمل بتاكسول 10 ميكرومتر بنسب 1: 5 واخلطها عن طريق السحب ببطء بطرف مشطوف.
    2. حافظ على غرفة التدفق في وضع مائل (~ 15-20 درجة). تدفق 30 ميكرولتر من محلول الأنابيب الدقيقة المخفف عبر غرفة التدفق من الطرف العلوي مع الحفاظ على مناديل ورقية خالية من النسالة في الطرف السفلي لامتصاص السائل. هذا يخلق قوة قص لمحاذاة الأنابيب الدقيقة في اتجاه التدفق ويساعد على امتصاص الأنابيب الدقيقة بشكل مستقيم ومحاذاة متوازية.
    3. اترك قطرة صغيرة من السائل على طرفي الحجرة واحتفظ بخلية التدفق في وضع مقلوب (غطاء مواجه للأسفل) في غرفة مغلقة ورطبة لمنع جفاف غرفة الحركة.
    4. اتركه لمدة ~ 30 دقيقة حتى تمتز الأنابيب الدقيقة على سطح الغطاء داخل غرفة الحركة.
    5. في غضون ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت للحظر عن طريق خلط 500 ميكرولتر P12-BSA مع 5 ميكرولتر من 1 مللي متر تاكسول.
    6. تدفق 40-50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب واحتضان الشريحة في وضع مقلوب لمدة 10 دقائق في غرفة رطبة.
    7. تحضير خليط الحركة عن طريق سحب المكونات التالية في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 500 ميكرولتر بالترتيب التالي: 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت P12 مع تاكسول ، 0.5 ميكرولتر من 100 مللي متر MgCl2 ، 0.5 ميكرولتر من 100 مللي متر DTT ، 0.5 ميكرولتر من 20 مجم / مل أوكسيديز الجلوكوز ، 0.5 ميكرولتر من 8 مجم / مل كاتلاز ، 0.5 ميكرولتر من 2.25 M جلوكوز ، و 1.0 ميكرولتر من 100 mM ATP.
      ملاحظة: تم استخدام التصوير الفلوري على نطاق واسع للتطبيقات البيولوجية22،23،24،25،26. يولد الإثارة الضوئية للبروتينات الفلورية أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والتي يمكن أن تسبب التبييض الضوئي للبروتينات الفلورية وتلف العينات البيولوجية27,28. تستخدم كاسحات الأكسجين مثل الجلوكوز وأوكسيديز الجلوكوز والكاتلاز بشكل روتيني في فحوصات الحركة للحد من التلف الضوئي وإطالة وقت تبييض البروتينات الفلورية.
    8. أخيرا ، أضف 1 ميكرولتر من المحرك المنقى إلى مزيج الحركة أعلاه واخلطه جيدا قبل التدفق إلى غرفة الحركة.
    9. أغلق طرفي غرفة الحركة بشمع البارافين السائل وصورها على الفور تحت إضاءة TIRF باستخدام هدف TIRF 100X 1.49 NA مع تكبير 1.5x.
    10. من أجل تركيز سطح انزلاق الغطاء ، أولا ، ركز على أحد الحواف الداخلية للشريط على الوجهين في غرفة الحركة تحت إضاءة تباين التداخل التفاضلي (DIC).
      ملاحظة: سيكون السطح اللامع وغير المستوي مرئيا.
    11. ثم انقل التركيز إلى غرفة الحركة. باستخدام الضبط الدقيق ، ركز سطح الغطاء وابحث عن الأنابيب الدقيقة الممتصة على سطح غطاء الغطاء.
    12. بمجرد تركيز الأنابيب الدقيقة ، قم بالتبديل إلى إضاءة TIRF باستخدام ليزر إثارة 488 نانومتر واضبط عمق الإضاءة عن طريق تغيير زاوية شعاع الإثارة للحصول على أفضل إضاءة TIRF موحدة (الشكل 4 ب).
    13. ركز المحركات الفردية الموسومة بعلامة mCitrine التي تتحرك بشكل عملي على طول سطح الأنابيب الدقيقة مع التعرض لمدة 100 مللي ثانية وسجل الحركة باستخدام كاميرا EM-CCD.
      ملاحظة: على الرغم من إجراء فحوصات الحركة على الأنابيب الدقيقة غير الموسومة ، يمكن استخدام وظيفة الإسقاط z ذات الكثافة القصوى للكشف عن الخطوط العريضة لمسار الأنابيب الدقيقة. بشكل تفضيلي ، تم النظر في الأحداث على مسارات الأنابيب الدقيقة الطويلة لتحليل التتبع.
    14. تتبع يدويا موضع المحركات الفردية الموسومة بالفلورسنت والتي تسير على مسارات الأنابيب الدقيقة الطويلة إطارا تلو الآخر باستخدام مكون إضافي مكتوب خصيصا في برنامج ImageJ (nih.gov) كما هو موضح سابقا29.
    15. قم بإنشاء الرسوم البيانية للسرعة وطول التشغيل لسكان المحرك عن طريق رسم عدد الأحداث في كل صندوق. قم بتركيب هذه الرسوم البيانية مع دالة ذروة غاوسية واحدة للحصول على متوسط السرعة وطول التشغيل12 (الشكل 4C-E).

4. في المختبر اختبار انزلاق الأنابيب الدقيقة

ملاحظة: لفهم السلوك الجماعي لمحركات kinesin-3 ، تم إجراء اختبار انزلاق الأنابيب الدقيقة في المختبر 18،30،31. عندما يتم تثبيت المحركات على غطاء الغطاء في وضع مقلوب وعند إضافة الأنابيب الدقيقة إلى الغرفة ، تهبط الأنابيب الدقيقة على المحركات وتنزلق على طول بينما تحاول المحركات المشي عليها (الشكل 5 أ ، ب).

  1. بلمرة الأنابيب الدقيقة الفلورية: بلمرة الأنابيب الدقيقة باتباع البروتوكول الموصوف سابقا باستثناء خلط التوبولين المسمى رودامين (3 مجم / مل) مع توبولين غير مسمى (10 مجم / مل) بنسبة 1:10.
  2. بعد 30 دقيقة من البلمرة ، أضف برفق 30 ميكرولتر من مخزن تثبيت الأنابيب الدقيقة قبل التسخين واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. بعد ذلك ، قم بقص الأنابيب الدقيقة عن طريق السحب بطرف التحميل الشعري (~ 25-30 مرة).
  4. قم بإعداد غرفة تدفق الحركة كما هو موضح سابقا ، تدفق 50 ميكرولتر من الأجسام النانوية GF9 المنقى (2.5 ميكرولتر من 100 نانومتر مخففة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت P12) واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع توجيه الغطاء لأسفل في غرفة رطبة.
    ملاحظة: المحركات موسومة بشكل نهائي C ب mCitrine. تستخدم الأجسام النانوية GFP لشل حركة المحركات بسبب انخفاض ثابت تفككها32.
  5. قم بسد سطح انزلاق الغطاء عن طريق تدفق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للكتلة إلى غرفة التدفق لمنع امتصاص البروتين غير المحدد واحتضانه لمدة 5 دقائق.
  6. قم بإعداد مزيج المحرك عن طريق سحب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للكتلة ، و 1 ميكرولتر من 100mM ATP ، و 5 ميكرولتر من محركات kinesin-3 المنقى 100 نانومتر Sf9. تخلط بلطف قبل أن تتدفق إلى الحجرة واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.
  7. اغسل الحجرة مرتين باستخدام 50 ميكرولتر من الكازين P12.
  8. في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم ، قم بإعداد خليط الفحص المنزلق بالترتيب التالي ، 45 ميكرولتر من P12-casein مع 10 ميكرومتر تاكسول ، 1 ميكرولتر من 100 mM ATP ، 0.5 ميكرولتر من 8 مجم / مل كاتلاز ، 0.5 ميكرولتر من 20 مجم / مل من أوكسيديز الجلوكوز ، 0.5 ميكرولتر من 2.25 M جلوكوز و 1 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة الفلورية المنفصمة. امزج المحتوى برفق قبل التدفق إلى غرفة الحركة وأغلق نهايات الغرفة بشمع البارافين السائل.
  9. صورة الأنابيب الدقيقة تنزلق تحت إضاءة TIRF عند التعرض 100 مللي ثانية والتقاط الصور باستخدام كاميرا EM-CCD المرفقة.
    ملاحظة: تم تحديد متوسط سرعة انزلاق الأنابيب الدقيقة من خلال تتبع ما يقرب من 100 أنبوب دقيق فردي يدويا إطارا تلو الآخر باستخدام مكون إضافي مكتوب خصيصا في ImageJ29. حدد متوسط سرعة انزلاق الأنابيب الدقيقة عن طريق إنشاء مدرج تكراري وملاءمته لدالة Gaussian (الشكل 5C ، D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للتعبير عن البروتينات الحركية المؤتلفة النشطة والوظيفية وتنقيتها على نطاق واسع باستخدام تعبير Sf9-baculovirus ، يحتاج النظام إلى توليد جزيئات فيروسية تحمل بثبات تسلسل ترميز لإصابة خلايا Sf9. لتحقيق ذلك ، تم نقل خلايا Sf9 بترميز bacmid المؤتلف KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG. بعد 72 ساعة ، أظهرت مجموعة كبيرة من الخلايا تعبيرا عن بروتين الفلورسنت الأخضر (mCitrine) مع الخلايا والنوى المتضخمة (الشكل 1 والشكل 2) ، مما يشير إلى توليد ناجح للجزيئات الفيروسية (P0). تم توسيع هذه الجسيمات الفيروسية بشكل أكبر عن طريق إصابة مجموعات Sf9 الجديدة بحجم أكبر لتوليد مخزونات فيروسية P1 للتخزين والعدوى على نطاق واسع. لتنقية محرك kinesin-3 ، أصيبت مزرعة 30 مل من خلايا Sf9 ب 1 مل من الجسيمات الفيروسية P1. بعد 72 ساعة من الإصابة ، تم حصاد الخلايا التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر بشكل مشرق ، وتحليلها ، وتنقيتها باستخدام تنقية تقارب علامة C-terminal FLAG مع راتنج مغلف بالأجسام المضادة ل FLAG. ومن المثير للاهتمام ، أن إضافة ببتيد FLAG إلى الخرز المرفق بمحركات kinesin-3 استخلصت معظم البروتين في جزء واحد وكان البروتين المنقى عالي النقاء ، كما هو موضح كنطاق ~ 120 كيلو دالتون في الحارة 7 من الشكل 3.

تتطلب البلمرة الناجحة للأنابيب الدقيقة الطويلة والصحية لدراسة خصائص الحركة لمحركات kinesin-3 المنقى S9 على مستوى جزيء واحد توبولين نقي. في الدراسة الحالية ، تم بلمرة الأنابيب الدقيقة باستخدام توبولين دائري 2X منقى من دماغ الماعز بتركيز حرج بين ~ 2.5-3.0 مجم / مل لمدة 30 دقيقة في غياب التاكسول ، حيث يقلل التاكسول من التركيز الحرج لنواة الأنابيب الدقيقة ويولد عددا كبيرا من الأنابيب الدقيقة القصيرة33،34،35 . تمت إضافة Taxol بعد البلمرة لتثبيت الأنابيب الدقيقة ومنع إزالة البلمرة. أدت الأنابيب الدقيقة المبلمرة باستخدام هذه الطريقة إلى هياكل طويلة وموحدة (فيديو 1) بمتوسط طول 60-70 ميكرومتر.

في تحليل حركية الجزيء الواحد في المختبر لمحرك كينيسين -3 المنقى Sf9 ، أظهر KIF1A (1-393LZ) تحت إضاءة TIRF (الشكل 4B) حركة أحادية الاتجاه وسريعة وفائقة المعالجة على طول الأنابيب الدقيقة (فيديو 2) ، كما هو موضح في kymograph كخطوط بيضاء قطرية طويلة (الشكل 4C). أظهر تحليل التتبع لأحداث الحركة الفائقة الطويلة هذه سرعة متوسطة وطول تشغيل يبلغ 2.44 ± 0.02 ميكرومتر -1 و 10.79 ± 0.28 ميكرومتر (الشكل 4D-E) ، على التوالي. تتفق هذه النتائج مع بياناتنا المنشورة سابقا12,13 باستخدام محركات محضرة من محللة خلايا الثدييات عن طريق الإفراط في التعبير. علاوة على ذلك ، أظهر اختبار انزلاق الأنابيب الدقيقة متعدد المحركات باستخدام محركات منقاة Sf9 مثبتة على غطاء الغطاء تحت إضاءة TIRF حركة طويلة وموحدة وأحادية الاتجاه (الشكل 5C والفيديو 3). أظهر تحليل تتبع أحداث انزلاق الأنابيب الدقيقة الطويلة هذه سرعة متوسطة تبلغ 1.37 ± 0.01 ميكرومتر مكعب -1 (الشكل 5 د).

معا ، تشير هذه النتائج إلى أن نظام Sf9-baculovirus يوفر نظاما ممتازا للتعبير عن البروتينات الحركية النشطة وتنقيتها والتي يصعب استخدامها بشكل عام باستخدام نظام بدائية النواة. توفر علامة FLAG ميزة تنقية البروتين بخطوة واحدة في شكله النقي. علاوة على ذلك ، فإن بلمرة الأنابيب الدقيقة باستخدام توبولين طازج ونقي واستقرارها بعد البلمرة ينتج عنه أنابيب دقيقة طويلة وموحدة. بالإضافة إلى ذلك ، يشير تحليل حركية الجزيء الواحد في المختبر إلى أن المحركات المنقاة Sf9 كانت قوية وأظهرت خصائص حركية مشابهة للمحركات المعبر عنها في أنظمة الثدييات.

Figure 1
الشكل 1: 48 ساعة بعد نقل خلايا Sf9 بمحرك kinesin-3 الموسوم بالفلورسنت : تم طلاء خلايا Sf9 على طبق 35 مم بكثافة 4.5 × 105 خلايا / مل. بعد 24 ساعة ، تم نقل الخلايا باستخدام الحمض النووي الباكميد المؤتلف الذي يشفر محرك kinesin-3 المحدد ، KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG باستخدام كاشف النقل. بعد 48 ساعة من النقل ، تم التقاط الصور تحت التداخل التفاضلي والتباين (DIC) وإضاءة Epifluorescence. أ: خلايا غير منقولة، صغيرة، مستديرة، ومتصلة بإحكام. (ب) الخلايا المنقولة التي تعبر عن KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG البروتين الموسوم يظهر قطر الخلية الموسع والتعلق بشكل فضفاض بالسطح. شريط المقياس ، 100 ميكرومتر. (C) رسم بياني شريطي يشير إلى متوسط قطر الخلية للخلايا غير المنقولة والمنقولة تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ± SD. N = 50 خلية. يستخدم اختبار t للطالب لإيجاد قيمة الأهمية (****p < 0.0001). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: 72 ساعة بعد نقل خلايا Sf9 بمحرك kinesin-3 الموسوم بالفلورسنت: صور تظهر أكثر من 90٪ من خلايا Sf9 تعبر عن محرك kinesin-3 الموسوم بالفلورسنت ، KIF1A (1-393LZ). ترتبط الخلايا بشكل فضفاض بالسطح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: محرك كينيسين -3 المنقى Sf9: هلام SDS-PAGE الملون ب Coomassie الذي يمثل محرك kinesin-3 المنقى Sf9 ، KIF1A (1-393LZ) C- الموسومة نهائيا ب 3xmCit-FLAG. من اليسار إلى اليمين ، سلم البروتين (M) ، التحكم القياسي في البروتين BSA ، 0.2 ميكروغرام (الحارة 2) ، 0.4 ميكروغرام (الحارة 3) ، 0.6 ميكروغرام (الحارة 4) ، 0.8 ميكروغرام (الحارة 5) ، و 1.0 ميكروغرام (الحارة 6) ، محرك kinesin-3 المنقى (S) (الحارة 7). تم استخدام BSA كمعيار لتقدير تركيز البروتين المنقى. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: مقايسة حركية الجزيء الواحد في المختبر باستخدام محركات كينيسين -3 المنقى Sf9: (أ) غرفة حركة خلية التدفق التخطيطي المحضرة باستخدام شريحة زجاجية وشريط على الوجهين وغطاء زجاجي. (ب) رسم كاريكاتوري يوضح في المختبر تصويرا أحادي الجزيء للمحركات الموسومة بالفلورسنت التي تتحرك على طول سطح الأنابيب الدقيقة الممتصة على الغطاء باستخدام الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF). فقط الجزيئات القريبة جدا من الغطاء تتحمس بسبب المجال الزائل (~ 150-200 نانومتر) الذي يتكون من الانعكاس الكامل للضوء الساقط عند إضاءته بزاوية تتجاوز الزاوية الحرجة. (ج) يصور كيموغراف محرك كينيسين-3 يمشي بشكل عملي (خطوط بيضاء قطرية) على طول سطح الأنابيب الدقيقة. الوقت على المحور ص (السهم العمودي) والمسافة على المحور السيني (السهم الأفقي). (دال - ه) تم تحديد الرسوم البيانية للسرعة (D) وطول التشغيل (E) من خلال تتبع المحركات الفردية التي تمشي على سطح الأنابيب الدقيقة إطارا تلو الآخر وتم رسم الرسوم البيانية لكل مجموعة من المحركات وتناسب Gaussian واحد. تمثل الذروة متوسط السرعة وطول التشغيل وتظهر القيم على الرسم البياني كمتوسط ± SEM. N = عدد الأحداث التي تم حسابها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: مقايسة انزلاق الأنابيب الدقيقة في المختبر باستخدام محركات kinesin-3 المنقى Sf9: (أ) رسم تخطيطي لغرفة خلية التدفق المعد باستخدام شريحة زجاجية وشريط على الوجهين وغطاء زجاجي. (ب) رسم كاريكاتوري يوضح الأنابيب الدقيقة الموسومة بالرودامين والتي تنزلق على سطح محركات kinesin-3 النشطة بشكل أساسي. نظرا لأن محركات kinesin-3 موسومة بشكل نهائي ب mCitrene ، فقد تم استخدام أجسام GFP-nano لربطها بالسطح الزجاجي. بعد ذلك ، تم إدخال الأنابيب الدقيقة الموسومة بالرودامين في غرفة التدفق وتم التقاط صور لحركة انزلاق الأنابيب الدقيقة تحت إضاءة TIRF. (ج) يمثل الكيموغراف انزلاقا أملسا للأنابيب الدقيقة (شريط أبيض قطري) بواسطة محركات kinesin-3. الوقت على المحور ص (السهم العمودي) والمسافة على المحور السيني (السهم الأفقي). د. تم رسم الرسم البياني للسرعة لمجموعة من الأنابيب الدقيقة وتناسب قمة غاوسية واحدة. يشار إلى متوسط سرعة الانزلاق في الزاوية العلوية اليسرى كمتوسط ± SEM. N = عدد الجزيئات المحسوبة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

فيديو 1: الأنابيب الدقيقة المبلمرة. تصوير TIRF للأنابيب الدقيقة المبلمرة قبل التخفيف لفحص الحركة. تم الحصول على الفيلم عند التعرض 100 مللي ثانية ويتم تشغيل الفيديو بمعدل 60 إطارا / ثانية. شريط المقياس ، 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 2: فحص جزيء واحد في المختبر لمحرك kinesin-3 النشط بشكل أساسي. محركات KIF1A (1-393LZ) الموسومة بالفلورسنت المنقى من خلايا Sf9 تتحرك تدريجيا على طول سطح الأنابيب الدقيقة (غير الملصقة) الممتصة على الغطاء في غرفة فحص الحركة. تم إجراء التصوير في إضاءة TIRF وتم الحصول على الصور عند التعرض 100 مللي ثانية. يتم تشغيل الفيديو بمعدل 30 إطارا / ثانية. شريط المقياس ، 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 3: فحص انزلاق الأنابيب الدقيقة لمحرك kinesin-3 النشط بشكل أساسي. تنزلق الأنابيب الدقيقة التي تحمل علامة الرودامين بسلاسة على سطح الغطاء الزجاجي المطلي بمحرك SF1A المنقى KIF1A (1-393LZ). تم إجراء التصوير في إضاءة TIRF وتم الحصول على الصور عند التعرض 100 مللي ثانية. يتم تشغيل الفيديو بمعدل 60 إطارا / ثانية. شريط المقياس ، 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الجدول التكميلي 1: تكوين المخازن المؤقتة والكواشف. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9 أحد أكثر الطرق تنوعا ونجاحا لإنتاج البروتين عالي الإنتاجية19،36،37. قدرة التعديل بعد الترجمة لخلايا Sf9 قابلة للمقارنة إلى حد كبير مع نظام الثدييات15. عيب كبير في استخدام هذا النظام هو أنه بطيء وحساس للتلوث. واحدة من أهم الخطوات هي العدوى الفعالة والتعبير الناجح في خلايا Sf9 ، الأمر الذي يتطلب التعامل السليم وصيانة خلايا Sf9 دون أي تلوث. يتطلب النظام مساحة مخصصة خالية من الغبار وأدوات مثل حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها وشاكر. ستؤدي ممارسة زراعة الخلايا غير المنتظمة واستخدام الثقافة المتضخمة إلى ضعف العدوى وبطء النمو وموت الخلايا بشكل كبير.

تنقية علامة FLAG للبروتين المعبر عنه في خلايا Sf9 لها العديد من المزايا. أولا ، يمكن تحليل خلايا Sf9 بكفاءة للحصول على معظم البروتين في شكله النشط والقابل للذوبان. ثانيا ، يحتوي راتنج FLAG على امتزاز بروتين غير محدد أقل من راتنج HIS و GST38. نتيجة لذلك ، يتم إطلاق كمية كبيرة من البروتين في شطف من خطوة واحدة في شكله النقي. أظهرت محركات kinesin-3 المنقى Sf9 معدلات دوران ATP قوية محفزة بالأنابيب الدقيقة في مقايسات ATPaseالبيوكيميائية 14. وبالمثل ، في فحوصات حركية الجزيء الواحد في المختبر ، أظهرت هذه المحركات حركة سريعة وفائقة المعالجة على سطح الأنابيب الدقيقة. ومن المثير للاهتمام ، أن خصائص الحركة هذه أظهرت تشابها ملحوظا مع خصائص الحركة المقاسة باستخدام المحركات المحضرة من محللات خلايا الثدييات11،12،13. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معدل التدرج المقاس لمحركات kinesin-3 في مقايسة حركية الجزيء الواحد في المختبر يتطابق بشكل وثيق مع معدل التحلل المائي ATP المقاس في مقايسة ATPase البيوكيميائية ، مما يشير إلى أن المحركات تحلل جزيء ATP واحد لكل خطوة14. تشير هذه النتائج معا إلى أن محركات kinesin3 المنقاة من نظام التعبير Sf9-baculovirus أسفرت عن عدد كبير بشكل ملحوظ من البروتينات النشطة والقابلة للذوبان. لذلك ، نعتقد أنه يمكن استخدام نظام Sf9-baculovirus لتنقية البروتينات الحركية ذات الأهمية مع التعديلات اللازمة.

يحتاج اختبار الحركة أحادية الجزيء في المختبر لمحركات kinesin-3 التي تظهر حركية فائقة المعالجة إلى بلمرة الأنابيب الدقيقة المبلمرة الطويلة. تتمثل الخطوة الحاسمة في البلمرة المختبرية للأنابيب الدقيقة الطويلة في تحضير خليط بلمرة بتركيز توبولين حرج ، ووقت حضانة ، ودرجة حموضة عازلة مناسبة. يجب أن يكون التوبولين المستخدم في بلمرة الأنابيب الدقيقة عالي الكفاءة ونقيا ومخزنا في النيتروجين السائل في حصص صغيرة لتجنب التجمد والذوبان. لا ينبغي تجميد التوبولين ، بمجرد إذابته ، مرة أخرى للبلمرة المستقبلية لأن التوبولين يفقد كفاءته بشكل كبير في كل دورة تجميد وذوبان. لن يساهم التوبولين غير الكفء في بلمرة الأنابيب الدقيقة ولكنه سيعيق عملية البلمرة وينتج عنه أنابيب دقيقة قصيرة ذات عيوب غير معروفة. يجب أن يكون تركيز التوبولين الأمثل في خليط البلمرة بين 2.5-3 مجم / مل ويجب حفظ الخليط على الثلج لمدة 5 دقائق قبل تحضينه عند 37 درجة مئوية للبلمرة. يجب أن تكون مدة بلمرة الأنابيب الدقيقة بين 20-30 دقيقة ويجب ألا تتجاوز 30 دقيقة ، حيث تؤدي البلمرة المطولة غالبا إلى تكوين أنابيب دقيقة قصيرة ومجزأة.

بعد ذلك ، يعد تثبيت الأنابيب الدقيقة المبلمرة خطوة حاسمة ثانية. تاكسول ضعيف الذوبان في الماء ويترسب في محلول مائي39. لذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتثبيت طازجا باستخدام 10 ميكرومتر تاكسول ، وأضفه برفق فوق خليط الأنابيب الدقيقة المبلمرة ، واحتضانه أكثر دون إزعاج. استخدم دائما حصص التاكسول المجمد من الفريزر -20 درجة مئوية لتحضير المخزن المؤقت للتثبيت ، حيث يؤدي القسمة المذابة إلى ترسيب / تجميع الأنابيب الدقيقة المبلمرة. تعامل دائما مع الأنابيب الدقيقة المبلمرة باستخدام أطراف مشطوفة لتجنب الكسر. الأنابيب الدقيقة المبلمرة باستخدام هذه الطريقة تنتج أنابيب دقيقة طويلة بطول 60-70 ميكرومتر مناسبة لتحليل الحركة الفائقة. الخطوة الحاسمة التالية هي الامتزاز المستقر للأنابيب الدقيقة إلى سطح الغطاء في غرفة الحركة. لتحقيق ذلك ، يجب تخزين أغطية الأغطية في مكان جاف لأن تعرض الأغطية للبيئة الرطبة يقلل بشكل كبير من كفاءة امتصاص الأنابيب الدقيقة وثباتها.

يعد تحضير خليط مقايسة الحركة مع المكونات المناسبة بتركيزات معينة وتركيز البروتين الحركي الأمثل أمرا مهما لتحقيق أحداث حركية قوية على طول سطح الأنابيب الدقيقة. المكون الأكثر أهمية في توليد حركية سلسة وعملية هو استخدام محلول ATP مستقر في خليط الفحص. (وبالتالي ، يجب توخي الحذر أثناء إعداد مخزون ATP. إذابة ملح الصوديوم من ATP في 10 mM أنابيب عازلة درجة الحموضة 6.9 ، ينتج محلول واضح مع درجة حموضة منخفضة جدا. ATP غير مستقر للغاية عند انخفاض درجة الحموضة ويتحلل بسرعة إلى ADP والفوسفات ، وبالتالي الحفاظ على المحلول باردا وضبط الرقم الهيدروجيني على الفور إلى 7.0 باستخدام KOH المركز يمنع التحلل المائي.) قم بتدفق خليط الحركة في خلية التدفق وأغلق كلا الحواف بالبارافين السائل لمنع تدفق السائل وتجفيف الغرفة أثناء التصوير تحت إضاءة TIRF.

نظرا لأن محركات kinesin-3 سريعة وفائقة المعالجة على طول مسارات الأنابيب الدقيقة ، فإن تصويرها والحصول على البيانات وتحليلها يشكل العديد من التحديات. يجب إجراء التصوير أحادي الجزيء والحصول على البيانات تحت كثافة ليزر منخفضة لمنع التبييض الضوئي للبروتينات الفلورية قبل أن يكمل المحرك تشغيله العملي. ستكون البيانات التي تم الحصول عليها منخفضة الكثافة مع نسبة إشارة إلى ضوضاء ضعيفة. وبالتالي ، سيكون من الصعب تتبع أحداث الحركة الفردية هذه باستخدام برامج التتبع الآلي الحالية لتوصيف أحداث حركتها. لذلك ، يجب إجراء تحليل البيانات يدويا عن طريق التتبع الدقيق لبقع المحرك الموسومة بالفلورسنت التي تتحرك على طول مسارات الأنابيب الدقيقة إطارا تلو الآخر مع الحد الأدنى من الأخطاء. لتحليل البيانات ، يفضل اختيار أحداث الحركة على مسارات الأنابيب الدقيقة الطويلة لتجنب وصول المحركات إلى نهاية الأنابيب الدقيقة قبل إكمال تشغيلها. للحصول على نتائج متسقة وقابلة للتكرار ، ضع في اعتبارك فقط أحداث الحركة هذه لتتبع ، على الأقل ، آخر 10 إطارات (500 مللي ثانية) مع بداية ونهاية واضحة للتشغيل العملي.

بشكل عام ، توفر الطريقة العديد من المزايا مقارنة بالطريقة الحالية ، مثل التنقية البسيطة وخطوة واحدة للبروتينات الحركية النشطة ، وإعداد الأنابيب الدقيقة الطويلة ، والبروتوكول التفصيلي خطوة بخطوة مع تعليمات لتحقيق حركة جيدة. من حيث المبدأ ، يمكن تطبيق الطريقة للتعبير عن وتنقية أي فئة ونوع من البروتينات ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الميوسين والكينيسين والداينين. في الواقع ، تم إنشاء نظام التعبير عن الفيروس البقعي بنجاح لتنقية العديد من اللقاحات الفيروسية ونواقل العلاج الجيني والبروتينات الصيدلانية الأخرى20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة للإعلان عنها.

Acknowledgments

يشكر V.S. و PS البروفيسور كريستين ج. فيرهي (جامعة ميشيغان ، آن أربور ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية) والبروفيسور روب ماليك (المعهد الهندي للتكنولوجيا في بومباي (IITB) ، مومباي ، الهند) على دعمهم غير المشروط طوال فترة الدراسة. ملاحظة تشكر الدكتورة سيفابريا كيروباكاران على دعمها طوال المشروع. تقر V.S. بالتمويل من خلال DBT (رقم المنحة: BT / PR15214 / BRB / 10/1449/2015 و BT / RLF / Re-entry / 45/2015) و DST-SERB (رقم المنحة: ECR / 2016 / 000913). تقر P.K.N بتمويل ICMR (المنحة رقم 5/13/13/2019 / NCD-III). PS تقر بالتمويل من DST (رقم المنحة: SR / WOS-A / LS-73/2017). يعترف D.J.S بالزمالة من IIT Gandhinagar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinity Biolegend 651502 For protein purification
Aprotinin Sigma A6279 For protein purification
Cellfectin Invitrogen 10362100 For Sf9 transfection
DTT Sigma D5545 For motility assays and protein purification
FLAG peptide Sigma F3290 For protein purification
Glycerol Sigma G5516 To freeze the protein
HEPES Sigma H3375 For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630 Sigma I8896 For Sf9 lysis buffer
KCl Sigma P9541 For buffers preparation
Leupeptin Sigma L2884 For protein purification
MgCl2 Sigma M2670 For buffers preparation
NaCl Sigma S7653 For preparing lysis buffer
PMSF Sigma P7626 For protein purification
Sf9 cells Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottles Thermo Scientific 4115-0125 For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X) Thermo Scientific 10902-096 -500ml For culturing Sf9 cells
Sucrose Sigma S1888 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s media Thermo Scientific 11595030 -500ml For Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATP Sigma A2647 For motility and gliding assay
BSA Sigma A2153 For blocking motility chamber
Catalase Sigma C9322 For motility and gliding assay
DMSO Sigma D5879 For dissolving Rhodamine
EGTA Sigma 3777 For preparing buffers
Glucose Sigma G7021 For motility and gliding assay
Glucose oxidase Sigma G2133 For motility and gliding assay
GTP Sigma G8877 For microtubule polymerization
KOH Sigma P1767 Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPES Sigma P6757 For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needle Dispovan For shearing microtubules
Casein Sigma C3400 For microtubule glidning assay
GFP nanobodies Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) For attaching motors to the coverslip
Rhodamine Thermo Scientific 46406 For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tips Eppendorf For Sf9 culture and purification
15ml concal tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
35mm cell culture dish Cole Palmer 15179-39 For Sf9 culture
Balance Sartorious 0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubator REMI For Sf9 suspenculture at 28oC
Camera EMCCD Andor iXon Ultra 897 For TIRF imaging and acquesition
Double sided tape Scotch For making motility chamber
Glass coverslip Fisherfinest 12-548-5A size; 22X30
Glass slide Blue Star For making motility chamber
Heating block Neuation Dissolving paraffin wax
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti- U To check protein expression
Lasers 488nm (100mW) For TIRF imaging
Liquid nitrogen For sample freezing and storage
Microcapillary loading tip Eppendorf EP022491920 For shearing microtubules
Microscope Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up For TIRF imaging
Mini spin Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd For quick spin
Objective 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion For TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XE Beckman Coulter For protein purification
Parafilm Eppendorf
pH-meter Corning Coring 430 To adjust pH
Pipette-boy VWR For Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21 Thermo Scientific For protein purification
Sorvall ST8R centrifuge Thermo Scientific Protein purification
ThermoMixer Eppendorf For microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotor Beckman coulter SW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixer Neuation Sample mixing
Wax Sigma V001228 To seal motility chamber

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A. Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. Kumar, D., Gong, C. , Springer International Publishing. 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 185 ،
تحليل جزيء واحد لمحركات عائلة Kinesin-3 فائقة المعالجة المنقى Sf9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soppina, P., Shewale, D. J., Naik,… More

Soppina, P., Shewale, D. J., Naik, P. K., Soppina, V. Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors. J. Vis. Exp. (185), e63837, doi:10.3791/63837 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter