Summary
Cette étude détaille la purification de KIF1A (1-393LZ), un membre de la famille des kinésines-3, à l’aide du système d’expression du baculovirus Sf9. L’analyse in vitro de glissement monomoléculaire et multimoteur de ces moteurs purifiés a montré des propriétés de motilité robustes comparables à celles des moteurs du lysat de cellules de mammifères. Ainsi, le système Sf9-baculovirus est susceptible d’exprimer et de purifier la protéine motrice d’intérêt.
Abstract
Un environnement cellulaire complexe pose des défis pour l’analyse de la motilité d’une seule molécule. Cependant, les progrès des techniques d’imagerie ont amélioré les études sur une seule molécule et ont acquis une immense popularité dans la détection et la compréhension du comportement dynamique des molécules marquées par fluorescence. Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour les études in vitro à molécule unique des moteurs de la famille kinesine-3 à l’aide de la microscopie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRF). La kinésine-3 est une grande famille qui joue un rôle essentiel dans les fonctions cellulaires et physiologiques allant du transport intracellulaire de la cargaison à la division cellulaire en passant par le développement. Nous avons montré précédemment que les moteurs de kinésine-3 dimérique constitutivement actifs présentent une motilité rapide et superprocessive avec une affinité microtubule élevée au niveau de la molécule unique en utilisant des lysats cellulaires préparés par moteur exprimant dans des cellules de mammifères. Notre laboratoire étudie les moteurs kinésine-3 et leurs mécanismes de régulation à l’aide d’approches cellulaires, biochimiques et biophysiques, et de telles études nécessitent des protéines purifiées à grande échelle. L’expression et la purification de ces moteurs à l’aide de cellules de mammifères seraient coûteuses et prendraient beaucoup de temps, tandis que l’expression dans un système d’expression procaryote entraînerait une protéine significativement agrégée et inactive. Pour surmonter les limites posées par les systèmes de purification bactérienne et le lysat de cellules de mammifères, nous avons mis en place un système robuste d’expression du baculovirus Sf9 pour exprimer et purifier ces moteurs. Les moteurs kinesin-3 sont marqués en C terminale avec des protéines fluorescentes 3-tandem (3xmCitirine ou 3xmCit) qui fournissent des signaux améliorés et une diminution du photoblanchiment. L’analyse in vitro de la molécule unique et du glissement multimoteur des protéines purifiées Sf9 démontre que les moteurs kinésine-3 sont rapides et superprocessifs, comme nos études précédentes utilisant des lysats de cellules de mammifères. D’autres applications utilisant ces tests comprennent une connaissance détaillée des conditions oligomères des moteurs, des partenaires de liaison spécifiques parallèles aux études biochimiques et leur état cinétique.
Introduction
Un environnement cellulaire immensément encombré pose de nombreux défis dans le tri des protéines et des molécules destinées. Cette charge de travail intense d’organisation et de distribution spatio-temporelle des molécules dans le cytoplasme est facilitée par les moteurs moléculaires et les pistes cytosquelettiques. Les moteurs moléculaires sont les enzymes qui hydrolysent les monnaies énergétiques telles que l’ATP et utilisent cette énergie pendant la génération de mouvement et de force1. Sur la base de la similitude de la séquence d’acides aminés, les kinésines sont regroupées en 14 familles et malgré cette similitude, chaque moteur contribue de manière unique au fonctionnement d’une cellule. Les moteurs de la famille Kinesin-3 constituent l’un des plus importants, comprenant cinq sous-familles (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 et KIF28)2, associées à diverses fonctions cellulaires et physiologiques, y compris le transport des vésicules, la signalisation, la mitose, la migration nucléaire et le développement 3,4,5. L’altération de la fonction de transport de la kinésine-3 implique de nombreux troubles neurodégénératifs, anomalies du développement et maladies cancéreuses 6,7,8,9.
Des travaux récents ont démontré que les moteurs kinésine-3 sont des monomères mais subissent une dimérisation induite par la cargaison et entraînent une motilité rapide et superprocessive par rapport à la kinésineconventionnelle 10,11,12,13. Leur caractérisation biochimique et biophysique nécessite une grande quantité de protéines actives purifiées. Cependant, leur production dans le système d’expression procaryote a entraîné des moteurs inactifs ou agrégés, probablement en raison de machines de synthèse de protéines, de repliement et de modificationincompatibles 14,15,16,17,18. Pour contourner ces limitations et augmenter le rendement, nous avons ici mis en place un système robuste d’expression du baculovirus Sf9 pour exprimer et purifier ces moteurs.
Le système d’expression du baculovirus utilise des lignées cellulaires d’insectes Sf9 comme système hôte pour l’expression de protéines recombinantes eucaryotes à haut débit19,20. Le baculovirus possède un puissant promoteur de polyèdrine qui aide à l’expression hétérologue des gènes et à la production de protéines recombinantes solubles17. En raison de son rapport coût-efficacité, de sa sécurité à manipuler et de sa grande quantité d’expression de protéines actives, il est devenu un outil puissant21. Pour exprimer une protéine d’intérêt, une étape clé consiste à générer un bacmide recombinant. Étant donné que les kits de génération de bacmide disponibles dans le commerce sont chers et que nous travaillerons avec plus d’échantillons, nous avons développé un protocole interne pour les inserts grands et petits de moteurs kinésine-3 dans les bacmides. Des moteurs kinésine-3 purifiés au Sf9 ont été utilisés pour caractériser in vitro les propriétés de glissement des microtubules monomoléculaires et multimoteurs à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF). Les moteurs sont marqués en C avec des molécules fluorescentes en tandem 3 (3xmCit) pour fournir un signal amélioré et une diminution du photoblanchiment. En raison de son rapport signal/bruit accru, de sa phototoxicité moindre et de l’imagerie sélective d’une très petite zone proche de la lamelle de couverture, l’imagerie TIRF a été largement utilisée pour visualiser la dynamique des protéines au niveau d’une seule molécule in vivo et in vitro.
Cette étude traite de la purification des moteurs de kinésine-3 en utilisant le système d’expression du baculovirus Sf9 et l’imagerie in vitro d’une seule molécule et l’analyse de glissement multimoteur des moteurs à l’aide de la microscopie TIRF. Dans l’ensemble, cette étude montre que les propriétés de motilité des moteurs purifiés Sf9 sont identiques à celles des moteurs préparés à partir de lysats de cellules de mammifères. Par conséquent, nous pensons que le système Sf9-baculovirus peut être adapté pour exprimer et purifier toute protéine motrice d’intérêt.
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Protocol
1. Culture Sf9, transfection et génération de virus
REMARQUE : Maintenir les cellules Sf9 dans 30 mL de milieu Sf-900/SFM dans 100 mL de fiole conique jetable stérile sans antibiotique/antimycotique à 28 °C. Conserver la culture de suspension dans un agitateur orbital à 90 tr/min. L’alimentation en CO2 et le maintien de l’humidité ne sont pas nécessaires. Les cellules sont habituellement sous-cultivées tous les quatre jours en inoculant 0,5 x 10 6 cellules/mL pour atteindre une densité de 2,0 x 106 cellules/mL le quatrième jour.
- Génération de stock de virus P0
- Pour la transfection, introduire les cellules de graines dans une boîte de 35 mm avec une confluence de 4,5 x 105 cellules/ml et maintenir à 28 °C sans agiter.
- Après 24 heures, une fois que les cellules sont attachées et semblent saines, procédez à la transfection comme décrit ci-dessous.
- Tube A : Mélanger 1 μg d’ADN bacmidique codant pour le moteur kinésine-3 spécifique KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG constitutifment actif avec 100 μL de milieux de Grace non supplémentés.
- Tube B : Mélanger 6 μL de réactif de transfection avec 100 μL de milieu de Grace non supplémenté.
- Transférer soigneusement le contenu du tube A dans le tube B et bien mélanger en tuytant de haut en bas (environ 20 fois).
- Incuber le mélange pendant ~45 min à température ambiante.
- Une fois l’incubation terminée, ajouter 0,8 mL de milieu de Grace non supplémenté au mélange ci-dessus et mélanger lentement par pipetage.
- Aspirer doucement le milieu Sf-900/SFM des cellules (pour éliminer toute trace de sérum susceptible d’affecter l’efficacité de la transfection).
- Ajouter goutte à goutte le mélange de transfection de l’étape 1.1.3 sur le dessus des cellules et incuber la plaque pendant 6 h à 28 °C.
- Après l’incubation, retirer délicatement le mélange de transfection, ajouter 2 mL de milieu Sf-900/SFM et incuber pendant 48 h à 28 °C.
- Vérifiez l’expression de la protéine motrice au microscope à fluorescence inversée. La protéine motrice est marquée avec une protéine fluorescente, la mCitrine, une variante de la protéine fluorescente jaune.
REMARQUE: Les cellules transfectées ont été visualisées sous un microscope inversé équipé d’un contraste interférentiel différentiel (DIC) et d’un éclairage par épifluorescence avec un objectif 20x (grossissement 200 fois), une lampe au mercure et une caméra EM-CCD. Vérifier l’efficacité de la génération de virus et de l’infection en surveillant l’expression des moteurs marqués à la mCitrine dans les cellules grâce à l’excitation mCitrine et au cube de filtre d’émission. De plus, vérifier les changements morphologiques des cellules infectées, telles que les cellules / noyaux élargis (Figure 1A-C). - Encore une fois, vérifiez les cellules 72 h après l’infection. Habituellement, les cellules commencent à se détacher de la surface (Figure 2).
- Si >5 % des cellules se détachent de la surface, récoltez le milieu contenant des cellules infectées dans des tubes à microcentrifugeuses stériles de 1,5 mL et faites tourner pendant 5 min à 500 x g.
- Prélever les aliquotes surnageantes et congeler rapidement 1 mL dans de l’azote liquide et les conserver sous forme de P0 à -80 °C ou les utiliser pour générer du stock de virus P1.
- Génération de stock de virus P1
- Pour amplifier davantage le stock de baculovirus P0 et confirmer l’expression des protéines, cultivez des cellules Sf9 en culture de suspension liquide.
- Dans une fiole conique stérile de 100 mL, ajouter 10 mL de milieu Sf-900/SFM avec une densité cellulaire de 2 x 106 cellules/mL et 1 mL de souche de virus P0. Incuber à 28 °C en agitant constamment à 90 tr/min.
- Après 72 h d’infection, vérifier l’expression protéique décrite précédemment (étape 1.1.7). Si l’expression de la protéine est bonne (>90% des cellules montrent un signal de fluorescence mCitrine brillant) et montre une mort cellulaire significative (environ 10%-15%), faites tourner les cellules dans un tube conique stérile de 15 ml à 500 x g pendant 5 min.
- Prélever le surnageant, congeler les aliquotes de 1 mL (stock P1) dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C ou procéder à une infection à grande échelle et à la purification des protéines.
- Infection à grande échelle
- Pour l’expression protéique à grande échelle, infecter 30 mL de la culture en suspension à une densité de 2 x 106 cellules/mL avec 1 mL de souche du virus P1 et incuber à 28 °C en agitant constamment à 90 tr/min.
- Après ~72 h post-infection, vérifiez l’expression protéique (en général, l’expression protéique maximale est atteinte entre 65 et 75h après l’infection).
- Si >90 % des cellules présentent un signal fluorescent brillant avec une mort cellulaire minimale (<5 %), recueillir les cellules dans un tube conique stérile de 50 ml et tourner vers le bas à 500 x g à 4 °C pendant 15 minutes.
REMARQUE: Il devrait y avoir une mort cellulaire minimale (<5%), car les cellules mortes libèrent le contenu cellulaire dans le milieu, ce qui entraîne une perte de protéines exprimées. - Jetez le surnageant, recueillez la pastille cellulaire et procédez à la purification des protéines.
2. Purification Sf9 des moteurs kinésine-3
- À la pastille cellulaire ci-dessus, ajouter 3 mL de tampon de lyse glacée (tableau supplémentaire 1) fraîchement complété avec 5 mM de DTT, 5 μg/mL d’aprotinine, 5 μg/mL de leupeptine et 5 μg/mL de PMSF et lyser les cellules en pipetant 20 à 25 fois sans générer de bulles d’air. Pour toutes les compositions tampons et les réactifs, veuillez vous référer au tableau supplémentaire 1.
- Faites tourner le lysat cellulaire à 150 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
- Recueillir le surnageant dans un tube frais et stérile et mélanger avec ~40 μL de résine d’affinité M2 anti-FLAG à 50%. Incuber le mélange pendant 3 h à 4 °C avec un culbutage de bout en bout.
- Après incubation, pelleter la résine FLAG en la faisant tourner à 500 x g pendant 1 min à 4 °C. Aspirer doucement le surnageant sans déranger la pastille avec une aiguille de 26 G et jeter.
- Lavez la pastille de résine FLAG trois fois avec un tampon de lavage à froid glacé (tableau supplémentaire 1) fraîchement complété avec 2 mM de DTT, 5 μg/mL d’aprotinine, 5 μg/mL de leupeptine et 5 μg/mL de PMSF. Enduire les billes en les faisant tourner à 500 x g pendant 1 min à 4 °C à chaque lavage.
- Après le troisième lavage, égoutter soigneusement le tampon de lavage autant que possible sans déranger la pastille. Pour l’élution des protéines, ajouter ~70 μL de tampon de lavage contenant 100 μg/mL de peptide FLAG à la pastille de résine et incuber pendant une nuit à 4 °C avec un culbutage de bout en bout.
- Le lendemain, faire tourner la résine à 500 x g pendant 1 min à 4 °C. Recueillir le surnageant contenant des protéines purifiées dans un tube frais et compléter avec 10% de glycérol. Congeler des aliquotes de 5 μL dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
- Exécutez le gel SDS-PAGE pour déterminer la concentration et le rendement en protéines. En plus de la protéine purifiée d’intérêt, un témoin protéique standard, BSA de concentrations connues allant de 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg et 1 μg sont chargés pour générer une courbe standard. Teindre le gel avec Coomassie Brilliant blue (Figure 3).
- Analysez le gel à l’aide d’un outil de quantification de gel intégré dans le logiciel ImageJ. Tout d’abord, mesurer l’intensité de la bande des concentrations connues de BSA et générer la courbe standard. Ensuite, mesurez l’intensité de la bande de protéines purifiées et déterminez la concentration en protéines. Pour ce faire, ouvrez le logiciel Image J, cliquez sur l’option Analyser dans la barre de menu et sélectionnez Gels dans le menu déroulant.
3. Essai de motilité in vitro d’une seule molécule à l’aide de moteurs kinésine-3 purifiés au Sf9
REMARQUE: Les moteurs kinésine-3 purifiés Sf9 peuvent être utilisés pour étudier les propriétés biochimiques et biophysiques telles que le taux de renouvellement de l’ATP, l’affinité des microtubules, la vitesse, la longueur de l’exécution, la taille du pas et la génération de force. Ici, un protocole détaillé pour l’analyse in vitro de la motilité à molécule unique de KIF1A (1-393LZ) à l’aide de la microscopie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) est décrit. Pour toute la composition des tampons et les réactifs, veuillez vous référer au tableau supplémentaire 1.
- Polymérisation des microtubules
- Dans un tube microcentrifuge prérefroidi de 0,5 mL, préparer un mélange de polymérisation par pipetage dans l’ordre suivant : 12,0 μL de tampon BRB80, pH 6,9; 0,45 μL de 100 mM MgCl2, 1 μL de 25 mM GTP.
- Prélever une partie aliquote de 10 μL de tubuline à 10 mg/mL stockée dans de l’azote liquide, décongeler immédiatement et l’ajouter au mélange de polymérisation ci-dessus. Mélanger doucement en pipetant 2-3 fois sans créer de bulles d’air.
REMARQUE: Effectuez les étapes ci-dessus rapidement et strictement sur la glace. - Laissez le mélange ci-dessus reposer sur la glace pendant 5 minutes.
NOTE: Il s’agit d’une étape critique pour empêcher la dénaturation de la tubuline ou pour éviter la formation de graines de microtubules courtes. - Transférer le tube dans un bloc de chaleur / bain-marie préchauffé à 37 °C et incuber pendant 30 minutes pour la polymérisation des microtubules.
- Pendant que les microtubules polymérisent, décongelez une partie aliquote du tampon P12 et amenez-la à température ambiante.
- Avant d’avoir terminé 30 minutes d’incubation, commencez à préparer le tampon de stabilisation MT en pipetant 100 μL de tampon P12 dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. À cela, ajoutez 1 μL de taxol 1 mM et faites immédiatement tourbillonner le mélange.
REMARQUE : Commencez à préparer le tampon de stabilisation MT environ 5 minutes avant de terminer l’incubation à l’étape 3.1.4. Le taxol stabilise les microtubules polymérisés en se liant à la β-tubuline. - Réchauffer le tampon de stabilisation des microtubules pendant 2-3 min à 37 °C et l’ajouter doucement aux microtubules polymérisés sans perturber le mélange de polymérisation au fond.
REMARQUE: Le réchauffement du tampon de stabilisation l’amènera à la même température que le mélange de polymérisation. - Ne pas tapoter ou pipeter le mélange et incuber à 37 °C pendant 5 min.
- Tapotez doucement le mélange et mélangez-le avec une pointe de coupe biseautée (capacité de 200 μL) lentement à l’aide de la pipette.
REMARQUE: À partir de ce moment, manipulez toujours les microtubules avec une pointe de coupe biseautée pour éviter le cisaillement des microtubules. - Prendre 10-15 μL de microtubules polymérisés dans une cellule d’écoulement pour vérifier la polymérisation correcte des microtubules.
REMARQUE: On peut visualiser les microtubules non marqués à l’aide d’une configuration de microscopie DIC. - Si les microtubules sont concentrés, diluez-les dans un tampon P12 additionné de taxol 10 μM.
- Préparation de la chambre cellulaire d’écoulement de motilité
- Préparez une chambre motilité à l’aide d’une lame de verre, d’un ruban adhésif double face et d’une glissière de verre (22 mm x 30 mm).
- Prenez une lame de verre, placez une goutte (~70 μL) d’eau distillée désionisée au milieu et essuyez-la avec un papier de soie non pelucheux.
- Coupez deux bandes de ruban adhésif double face (~35 x 3 mm) et collez-les fermement à la lame de verre parallèlement, en laissant un espace de ~4-5 mm entre deux bandes pour créer un passage étroit.
- Ensuite, prenez un couvercle et ajoutez une goutte (~ 20 μL) d’eau distillée désionisée au milieu. Placez une bande de papier de soie de nettoyage de lentilles non pelucheux sur la goutte d’eau jusqu’à ce qu’elle absorbe l’eau. Ensuite, faites-le glisser lentement vers une extrémité du couvercle.
REMARQUE: Le couvercle doit être complètement sec. Aucune eau ne doit être visible sur la lamelle de couverture. - Placez le bordereau sur les bandes recto-verso collées sur la glissière et appuyez uniformément sur le bordereau de couverture le long des bandes pour coller fermement.
REMARQUE: Assurez-vous que le côté nettoyé de la lamelle de couverture fait face à la lame de verre. - Assurez-vous qu’ensemble, cela crée une chambre étroite d’une capacité de 10 à 15 μL pour effectuer un essai de motilité (figure 4A).
- Essai de motilité monomoléculaire in vitro
REMARQUE: Pour étudier les propriétés de motilité à molécule unique à base de microtubules des moteurs, les microtubules doivent être adsorbés sur la surface de la lamelle de couverture dans la chambre de motilité.- Diluer les microtubules polymérisés stabilisés au taxol dans un tampon P12 complété par du taxol 10 μM dans des rapports de 1:5 et mélanger en pipetant lentement avec une pointe biseautée.
- Maintenez la chambre d’écoulement en position oblique (~15-20°). Écoulez 30 μL de solution de microtubules dilués à travers la chambre d’écoulement à partir de l’extrémité supérieure tout en conservant un papier de soie non pelucheux à l’extrémité inférieure pour absorber le liquide. Cela crée une force de cisaillement pour aligner le microtubule dans la direction de l’écoulement et aide à adsorber les microtubules droits et à s’aligner parallèlement.
- Laissez une petite goutte de liquide aux deux extrémités de la chambre et maintenez la cellule d’écoulement en position inversée (glissement de couverture face au fond) dans une chambre fermée et humide pour éviter le dessèchement de la chambre de motilité.
- Laisser reposer pendant ~30 min pour que les microtubules s’adsorbent à la surface de la lamelle de couverture à l’intérieur de la chambre de motilité.
- En attendant, préparez le tampon de blocage en mélangeant 500 μL de tampon P12-BSA avec 5 μL de taxol 1 mM.
- Écoulez 40-50 μL de tampon de blocage et incuber la lame en position inversée pendant 10 min dans une chambre humide.
- Préparer le mélange de motilité en pipetant les composants suivants dans un tube de microcentrifugation stérile d’une capacité de 500 μL dans l’ordre suivant : 25 μL de tampon P12 avec taxol, 0,5 μL de 100 mM MgCl2, 0,5 μL de DTT 100 mM, 0,5 μL de 20 mg/mL de glucose oxydase, 0,5 μL de 8 mg/mL de Catalase, 0,5 μL de 2,25 M de glucose et 1,0 μL de 100 mM d’ATP.
NOTE: L’imagerie par fluorescence a été largement utilisée pour des applications biologiques 22,23,24,25,26. La photoexcitation des protéines fluorescentes génère des espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui peuvent provoquer un photoblanchiment des protéines fluorescentes et endommager les échantillons biologiques27,28. Les piégeurs d’oxygène tels que le glucose, la glucose oxydase et la catalase sont couramment utilisés dans les tests de motilité pour limiter les photodommages et prolonger le temps de blanchiment des protéines fluorescentes. - Enfin, ajoutez 1 μL du moteur purifié au mélange de motilité ci-dessus et mélangez bien avant de l’écouler dans la chambre de motilité.
- Scellez les deux extrémités de la chambre de motilité avec de la cire de paraffine liquide et imagez immédiatement sous éclairage TIRF en utilisant un objectif TIRF 100X de 1,49 NA avec un grossissement de 1,5x.
- Pour faire la mise au point de la surface de la lamelle de couverture, concentrez-vous d’abord sur l’un des bords intérieurs du ruban adhésif double face dans la chambre de motilité sous éclairage DIC (differential interference contrast).
REMARQUE: La surface brillante et inégale sera visible. - Ensuite, déplacez le foyer dans la chambre de motilité. À l’aide d’un réglage fin, concentrez la surface de la lamelle de couverture et recherchez les microtubules adsorbés sur la surface de la lamelle de couverture.
- Une fois les microtubules focalisés, passez à l’éclairage TIRF avec un laser d’excitation de 488 nm et ajustez la profondeur d’éclairage en modifiant l’angle du faisceau d’excitation pour obtenir le meilleur éclairage TIRF uniforme (figure 4B).
- Concentrez les moteurs individuels marqués mCitrine se déplaçant processivement le long de la surface du microtubule avec une exposition de 100 ms et enregistrez le mouvement à l’aide d’une caméra EM-CCD.
REMARQUE: Bien que les essais de motilité aient été effectués sur des microtubules non marqués, la fonction de projection z d’intensité maximale peut être utilisée pour révéler le contour de la piste des microtubules. De préférence, les événements sur de longues traces de microtubules ont été pris en compte pour l’analyse de suivi. - Suivez manuellement la position des moteurs individuels marqués par fluorescence marchant sur de longues pistes de microtubules image par image à l’aide d’un plug-in personnalisé écrit dans le logiciel ImageJ (nih.gov) comme décrit précédemment29.
- Générez les histogrammes de vitesse et de longueur d’exécution pour la population motrice en traçant le nombre d’événements dans chaque bac. Ajustez ces histogrammes à une seule fonction de pic gaussien pour obtenir la vitesse moyenne et la longueur d’exécution12 (Figure 4C-E).
4. Essai de vol plané in vitro sur microtubules
REMARQUE: Pour comprendre le comportement collectif des moteurs kinésine-3, un essai de vol plané in vitro sur microtubules a été effectué 18,30,31. Lorsque les moteurs sont immobilisés sur la lamelle de couverture en position inversée et lors de l’ajout de microtubules dans la chambre, les microtubules atterrissent sur les moteurs et glissent pendant que les moteurs tentent de marcher dessus (Figure 5A,B).
- Polymérisation des microtubules fluorescents : Polymériser les microtubules en suivant le protocole décrit précédemment, sauf pour mélanger la tubuline marquée à la rhodamine (3 mg/mL) avec la tubuline non marquée (10 mg/mL) dans un rapport de 1:10.
- Après 30 min de polymérisation, ajouter doucement 30 μL de tampon de stabilisation des microtubules préchauffé et incuber davantage pendant 5 min à 37 °C.
- Ensuite, cisaillez les microtubules en pipetant avec l’extrémité de charge capillaire (~25-30 fois).
- Préparer la chambre d’écoulement de motilité comme décrit précédemment, écouler 50 μL de nanocorps GFP purifiés Sf9 (2,5 μL de 100 nM dilués dans 50 μL de tampon P12) et incuber pendant 30 min à température ambiante avec la lamelle de couverture orientée vers le bas dans une chambre humide.
REMARQUE: Les moteurs sont marqués C-terminally avec mCitrine. Les nanocorps GFP sont utilisés pour immobiliser les moteurs en raison de leur faible constante de dissociation32. - Bloquer la surface de la glissière de recouvrement en faisant couler 50 μL de tampon bloc dans la chambre d’écoulement pour empêcher l’adsorption de protéines non spécifiques et incuber davantage pendant 5 minutes.
- Préparer le mélange de moteurs en pipetant 50 μL de tampon de bloc, 1 μL d’ATP 100 mM et 5 μL de moteurs kinésine-3 purifiés Sf9 de 100 nM. Mélanger doucement avant de couler dans la chambre et incuber pendant 30 min à température ambiante dans une chambre humide.
- Lavez la chambre deux fois avec 50 μL de caséine P12.
- Dans un tube microcentrifuge stérile, préparer le mélange de dosage glissant dans l’ordre suivant, 45 μL de caséine P12 avec 10 μM de taxol, 1 μL d’ATP 100 mM, 0,5 μL de catalase 8 mg/mL, 0,5 μL de glucose oxydase 20 mg/mL, 0,5 μL de glucose 2,25 M glucose et 1 μL de microtubules fluorescents cisaillés. Mélanger délicatement le contenu avant de l’écouler dans la chambre de motilité et sceller les extrémités de la chambre avec de la cire de paraffine liquide.
- Microtubule d’image glissant sous l’éclairage TIRF à une exposition de 100 ms et capturez les images avec la caméra EM-CCD attachée.
REMARQUE: La vitesse moyenne de glissement des microtubules a été déterminée en suivant manuellement environ 100 microtubules individuels image par image à l’aide d’un plug-in personnalisé dans ImageJ29. Déterminer la vitesse moyenne de glissement des microtubules en générant un histogramme et en l’ajustant à une fonction gaussienne (Figure 5C,D).
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Representative Results
Pour exprimer et purifier les protéines motrices recombinantes actives et fonctionnelles à grande échelle en utilisant l’expression du baculovirus Sf9, le système a besoin de générer des particules virales portant de manière stable une séquence codante pour infecter les cellules Sf9. Pour ce faire, les cellules Sf9 ont été transfectées avec du bacmide recombinant codant KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG. Après 72 h, une population importante de cellules a montré l’expression de la protéine fluorescente verte (mCitrine) avec des cellules et des noyaux élargis (Figure 1 et Figure 2), suggérant une génération réussie de particules virales (P0). Ces particules virales ont été encore élargies en infectant la population fraîche de Sf9 à un volume plus élevé pour générer des stocks viraux P1 pour le stockage et l’infection à grande échelle. Pour la purification du moteur kinésine-3, une culture de 30 mL de cellules Sf9 a été infectée par 1 mL de particules virales P1. Après 72 heures d’infection, les cellules exprimant brillamment la protéine fluorescente verte ont été récoltées, lysées et purifiées à l’aide de la purification par affinité de marquage C-terminal FLAG avec une résine enrobée d’anticorps anti-FLAG. Fait intéressant, l’ajout du peptide FLAG aux billes attachées avec des moteurs kinésine-3 éluait la majeure partie de la protéine en une seule fraction et la protéine purifiée était de haute pureté, représentée par une bande de ~ 120 kDa dans la voie 7 de la figure 3.
La polymérisation réussie de microtubules longs et sains pour étudier les propriétés de motilité des moteurs kinésine-3 purifiés S9 au niveau d’une seule molécule nécessite de la tubuline pure. Dans la présente étude, les microtubules ont été polymérisés à l’aide de tubuline cyclée 2X purifiée à partir du cerveau de chèvre à une concentration critique comprise entre ~2,5 et 3,0 mg/mL pendant 30 minutes en l’absence de taxol, car le taxol diminue la concentration critique de nucléation des microtubules et génère un grand nombre de microtubules courts33,34,35 . Taxol a été ajouté post-polymérisation pour stabiliser les microtubules et empêcher la dépolymérisation. Les microtubules polymérisés à l’aide de cette méthode ont donné des structures longues et uniformes (vidéo 1) d’une longueur moyenne de 60 à 70 μm.
L’analyse in vitro de la motilité à molécule unique du moteur kinésine-3 purifié par Sf9, KIF1A (1-393LZ) sous éclairage TIRF (figure 4B) a montré un mouvement unidirectionnel, rapide et superprocessus le long du microtubule (vidéo 2), comme le montre le kymographe sous forme de longues lignes blanches diagonales (figure 4C). L’analyse de suivi de ces longs événements de motilité superprocessive a montré une vitesse moyenne et une longueur d’exécution de 2,44 ± 0,02 μms-1 et 10,79 ± 0,28 μm (Figure 4D-E), respectivement. Ces résultats sont en accord avec nos données précédemment publiées12,13 utilisant des moteurs préparés à partir de lysat de cellules de mammifères par surexpression. De plus, le test de glissement microtubule multimoteur utilisant des moteurs purifiés Sf9 fixés sur la lamelle de couverture sous éclairage TIRF a montré un mouvement long, uniforme et unidirectionnel (Figure 5C et Vidéo 3). L’analyse de suivi de ces longs événements de vol plané de microtubules a montré une vitesse moyenne de 1,37 ± 0,01 μms-1 (figure 5D).
Ensemble, ces résultats suggèrent que le système Sf9-baculovirus fournit un excellent système pour l’expression et la purification des protéines motrices actives qui sont généralement difficiles à utiliser le système procaryote. L’étiquette FLAG offre un avantage de la purification en une seule étape des protéines sous leur forme pure. De plus, la polymérisation des microtubules à l’aide de tubuline fraîche et pure et leur stabilisation après la polymérisation donnent des microtubules longs et uniformes. De plus, l’analyse in vitro de la motilité d’une seule molécule suggère que les moteurs purifiés au Sf9 étaient robustes et présentaient des propriétés de motilité similaires à celles des moteurs exprimés dans les systèmes de mammifères.
Figure 1 : 48 h après la transfection de cellules Sf9 avec moteur kinésine-3 marqué par fluorescence : Les cellules Sf9 ont été plaquées sur une boîte de 35 mm à une densité de 4,5 x 105 cellules/mL. Après 24 h, les cellules ont été transfectées avec de l’ADN bacmidique recombinant codant pour un moteur kinésine-3 spécifique, KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG en utilisant un réactif de transfection. Après 48 h de transfection, les images ont été capturées sous interférence différentielle et contraste (DIC) et éclairage d’épifluorescence. (A) Cellules non transfectées, petites, rondes et solidement attachées. (B) Cellules transfectées exprimant la protéine marquée KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG montrant un diamètre cellulaire élargi et faiblement attachées à la surface. Barre d’échelle, 100 μm. (C) Graphique à barres indiquant le diamètre moyen des cellules non transfectées et transfectées. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± écart-type. N = 50 cellules. Le test t de Student est utilisé pour trouver la valeur de signification (****p < 0,0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : 72 h après la transfection de cellules Sf9 avec moteur kinésine-3 marqué par fluorescence : Images montrant plus de 90 % des cellules Sf9 exprimant un moteur kinésine-3 marqué par fluorescence, KIF1A(1-393LZ). Les cellules sont faiblement liées à la surface. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Moteur kinésine-3 purifié Sf9 : gel SDS-PAGE coloré à Coomassie représentant le moteur kinésine-3 purifié Sf9, KIF1A(1-393LZ) C-terminally marqué avec 3xmCit-FLAG. De gauche à droite, échelle de protéines (M), contrôle standard des protéines BSA, 0,2 μg (voie 2), 0,4 μg (voie 3), 0,6 μg (voie 4), 0,8 μg (voie 5) et 1,0 μg (voie 6), moteur kinésine-3 purifié (S) (voie 7). La BSA a été utilisée comme norme pour estimer la concentration en protéines purifiées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Essai in vitro de motilité d’une seule molécule à l’aide de moteurs à kinésine-3 purifiés Sf9 :(A) Chambre de motilité des cellules à écoulement schématique préparée à l’aide d’une lame de verre, d’un ruban adhésif double face et d’une lamelle de couvercle en verre. (B) Diagramme de bande dessinée illustrant l’imagerie in vitro d’une seule molécule de moteurs marqués par fluorescence se déplaçant le long de la surface du microtubule adsorbés sur la lamelle de couverture à l’aide de la microscopie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRF). Seules les molécules très proches de la lamelle de couverture sont excitées en raison du champ évanescent (~150-200 nm) formé par la réflexion complète de la lumière incidente lorsqu’elles sont éclairées à un angle au-delà de l’angle critique. (C) Le kymographe représente la kinésine-3 marchant processivement (lignes blanches diagonales) le long de la surface du microtubule. Temps sur l’axe y (flèche verticale) et distance sur l’axe des x (flèche horizontale). (D-E) Les histogrammes de vitesse (D) et de longueur (E) ont été déterminés en suivant les moteurs individuels marchant sur la surface des microtubules image par image et des histogrammes ont été tracés pour chaque population de moteurs et adaptés à un seul gaussien. Le pic représente la vitesse moyenne et la longueur d’exécution et les valeurs sont indiquées sur le graphique sous forme de moyenne ± SEM. N = Nombre d’événements comptés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Essai de glissement in vitro des microtubules à l’aide de moteurs à kinésine-3 purifiée Sf9 : (A) Schéma de la chambre cellulaire d’écoulement préparée à l’aide d’une lame de verre, d’un ruban adhésif double face et d’une glissière de verre. (B) Diagramme de bande dessinée illustrant des microtubules marqués à la rhodamine glissant à la surface de moteurs de kinésine-3 constitutivement actifs. Comme les moteurs kinésine-3 sont marqués en phase C avec de la mCitrine, des nanocorps GFP ont été utilisés pour les fixer à la surface du verre. Par la suite, des microtubules marqués à la rhodamine cisaillée ont été introduits dans la chambre d’écoulement et des images du mouvement de glissement des microtubules ont été capturées sous éclairage TIRF. (C) Le kymographe représente le glissement des microtubules lisses (bande blanche diagonale) par les moteurs kinesin-3. Temps sur l’axe y (flèche verticale) et distance sur l’axe des x (flèche horizontale). D. L’histogramme de la vitesse a été tracé pour une population de microtubules et adapté à un seul pic gaussien. La vitesse moyenne de glissement est indiquée dans le coin supérieur gauche sous forme de moyenne ± SEM. N = Nombre de molécules comptées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Microtubules polymérisés. Imagerie TIRF des microtubules polymérisés avant dilution pour le test de motilité. Le film a été acquis à une exposition de 100 ms et la vidéo est lue à 60 images/s. Barre d’échelle, 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2 : Essai in vitro d’une seule molécule du moteur de kinésine-3 constituant actif. Moteurs KIF1A (1-393LZ) marqués par fluorescence purifiés à partir de cellules Sf9 se déplaçant progressivement le long de la surface du microtubule (non marqué) adsorbés sur la lamelle de couverture dans une chambre d’essai de motilité. L’imagerie a été réalisée dans un éclairage TIRF et les images ont été acquises à une exposition de 100 ms. La vidéo est lue à 30 images/s. Barre d’échelle, 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 3 : Essai de glissement des microtubules du moteur kinésine-3 constituant actif. Microtubules marqués à la rhodamine glissant doucement sur la surface du couvercle en verre recouvert d’un moteur KIF1A (1-393LZ) purifié Sf9. L’imagerie a été réalisée dans un éclairage TIRF et les images ont été acquises à une exposition de 100 ms. La vidéo est lue à 60 images/s. Barre d’échelle, 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Tableau supplémentaire 1 : Composition des tampons et des réactifs. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le système d’expression du baculovirus Sf9 est l’une des méthodes les plus polyvalentes et les plus efficaces pour la production de protéines à haut débit 19,36,37. La capacité de modification post-traductionnelle des cellules Sf9 est très comparable à celle du système mammifère15. Un inconvénient considérable de l’utilisation de ce système est qu’il est lent et sensible à la contamination. L’une des étapes les plus critiques est l’infection efficace et l’expression réussie dans les cellules Sf9, ce qui nécessite une manipulation et un entretien appropriés des cellules Sf9 sans aucune contamination. Le système nécessite un espace dédié sans poussière et des instruments tels qu’un incubateur et un agitateur à température contrôlée. La pratique irrégulière de la culture cellulaire et l’utilisation d’une culture envahie par la végétation entraîneront une infection médiocre, une croissance lente et une mort cellulaire importante.
La purification par marquage FLAG des protéines exprimées dans les cellules Sf9 présente plusieurs avantages. Tout d’abord, les cellules Sf9 peuvent être lysées efficacement pour obtenir la majeure partie de la protéine sous sa forme active et soluble. Deuxièmement, la résine FLAG a moins d’adsorption protéique non spécifique que la résine HIS et GST38. En conséquence, une quantité importante de la protéine est libérée dans une élution en une seule étape dans sa forme pure. Les moteurs kinésine-3 purifiés Sf9 ont montré des taux de renouvellement de l’ATP stimulés par microtubule robustes dans les tests biochimiques ATPase14. De même, dans les essais de motilité in vitro d’une seule molécule, ces moteurs ont montré une motilité rapide et superprocessive à la surface du microtubule. Fait intéressant, ces propriétés de motilité ont montré une similitude remarquable avec les propriétés de motilité mesurées à l’aide de moteurs préparés à partir de lysats de cellules de mammifères11,12,13. De plus, le taux de pas mesuré des moteurs kinésine-3 dans le test de motilité in vitro d’une seule molécule correspond étroitement au taux d’hydrolyse de l’ATP mesuré dans le test biochimique de l’ATPase, ce qui suggère que les moteurs hydrolysent une molécule d’ATP par étape14. Ensemble, ces résultats suggèrent que les moteurs kinésine3 purifiés à partir du système d’expression du baculovirus Sf9 ont produit une population significativement importante de protéines actives et solubles. Par conséquent, nous pensons que le système Sf9-baculovirus peut être utilisé pour purifier les protéines motrices d’intérêt avec les modifications nécessaires.
Le test in vitro de motilité à molécule unique de moteurs kinésine-3 qui présentent une motilité superprocessive nécessite la polymérisation de microtubules polymérisés longs. Une étape critique de la polymérisation in vitro de microtubules longs consiste à préparer un mélange de polymérisation avec une concentration critique de tubuline, un temps d’incubation et un pH tampon approprié. La tubuline utilisée pour la polymérisation des microtubules doit être très compétente, pure et stockée dans de l’azote liquide dans de petites aliquotes pour éviter la congélation et la décongélation. La tubuline, une fois décongelée, ne devrait pas être congelée pour une polymérisation future, car la tubuline perd considérablement sa compétence à chaque cycle de congélation-dégel. Une tubuline incompétente ne contribuera pas à la polymérisation des microtubules, mais entravera le processus de polymérisation et entraînera des microtubules courts avec des défauts inconnus. La concentration optimale de tubuline dans le mélange de polymérisation doit se situer entre 2,5 et 3 mg/mL et le mélange doit être conservé sur la glace pendant 5 minutes avant d’être incubé à 37 °C pour la polymérisation. La durée de polymérisation des microtubules doit être comprise entre 20 et 30 minutes et ne doit pas dépasser 30 minutes, car une polymérisation prolongée entraîne souvent la formation de microtubules courts et fragmentés.
Ensuite, la stabilisation des microtubules polymérisés est une deuxième étape critique. Le taxol est peu soluble dans l’eau et précipite dans une solution aqueuse39. Par conséquent, préparez fraîchement le tampon de stabilisation avec 10 μM de taxol, ajoutez doucement sur le mélange de microtubules polymérisés et incuber davantage sans déranger. Toujours utiliser de la partie aliquote de taxol congelée provenant du congélateur à -20 °C pour préparer le tampon de stabilisation, car l’aliquote décongelée entraîne la précipitation/agrégation des microtubules polymérisés. Manipulez toujours les microtubules polymérisés à l’aide d’embouts biseautés pour éviter les bris. Les microtubules polymérisés à l’aide de cette méthode produisent des microtubules longs de 60 à 70 μm de long adaptés à l’analyse de motilité superprocessive. La prochaine étape critique est l’adsorption stable des microtubules sur la surface de la lamelle de couverture dans la chambre de motilité. Pour ce faire, les lamelles de recouvrement doivent être stockées dans un endroit sec car l’exposition des lamelles de couverture à l’environnement humide diminue considérablement l’efficacité d’adsorption des microtubules et leur stabilité.
La préparation d’un mélange de dosage de motilité avec des ingrédients appropriés à des concentrations particulières et une concentration optimale de protéines motrices est importante pour obtenir des événements de motilité robustes le long de la surface des microtubules. L’élément le plus crucial pour générer une motilité lisse et processive est l’utilisation d’une solution d’ATP stable dans le mélange de dosage. (Il faut donc faire preuve de prudence lors de la préparation du stock d’ATP. La dissolution du sel de sodium de l’ATP dans un tampon PIPES de 10 mM pH 6,9, donne une solution claire avec un pH très bas. L’ATP est extrêmement instable à faible pH et s’hydrolyse rapidement en ADP et en phosphate, gardant ainsi la solution froide et ajustant immédiatement le pH à 7,0 en utilisant du KOH concentré empêche l’hydrolyse.) Écoulez le mélange de motilité dans la cellule d’écoulement et scellez les deux bords avec de la paraffine liquide pour empêcher l’écoulement du liquide et le séchage de la chambre pendant l’imagerie sous éclairage TIRF.
Comme les moteurs kinesin-3 sont rapides et superprocessus le long des traces de microtubules, leur imagerie, leur acquisition de données et leur analyse posent plusieurs défis. L’imagerie à molécule unique et l’acquisition de données doivent être effectuées sous une faible intensité laser pour empêcher le photoblanchiment des protéines fluorescentes avant que le moteur ne termine son cycle de traitement. Les données acquises seraient de faible intensité avec un faible rapport signal/bruit. Par conséquent, il serait difficile de suivre ces événements de motilité individuels à l’aide du logiciel de suivi automatisé existant pour caractériser leurs événements de motilité. Par conséquent, l’analyse des données doit être effectuée manuellement en suivant avec précision les points moteurs marqués par fluorescence se déplaçant le long des traces de microtubules image par image avec un minimum d’erreurs. Pour l’analyse des données, choisissez de préférence les événements de motilité sur les longues traces de microtubules pour éviter que les moteurs n’atteignent l’extrémité du microtubule avant de terminer leur course. Pour des résultats cohérents et reproductibles, ne considérez que les événements de motilité pour le suivi, au moins, des 10 dernières images (500 ms) avec un début et une fin clairs de l’exécution processive.
Dans l’ensemble, la méthode offre plusieurs avantages par rapport à la méthode existante, tels que la purification simple et en une étape des protéines motrices actives, la préparation de longs microtubules et un protocole détaillé étape par étape avec des instructions pour obtenir une bonne motilité. En principe, la méthode peut être appliquée pour exprimer et purifier n’importe quelle classe et type de protéines, y compris, mais sans s’y limiter, la myosine, la kinésine et la dynéine. En effet, le système d’expression du baculovirus a été mis en place avec succès pour purifier plusieurs vaccins viraux, vecteurs de thérapie génique et autres protéinespharmaceutiques20.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents à déclarer.
Acknowledgments
V.S. et P.S. remercient le Prof. Kristen J. Verhey (Université du Michigan, Ann Arbor, MI, USA) et le Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, Inde) pour leur soutien inconditionnel tout au long de l’étude. P.S. remercie le Dr Sivapriya Kirubakaran pour son soutien tout au long du projet. V.S. reconnaît le financement par le biais de DBT (subvention n° : BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 et BT/RLF/Re-entry/45/2015) et DST-SERB (subvention n° : ECR/2016/000913). P.K.N remercie l’ICMR pour son financement (subvention n° 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. reconnaît le financement de DST (Numéro de subvention: SR / WOS-A / LS-73/2017). D.J.S reconnaît la bourse de l’IIT Gandhinagar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For protein purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For protein purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assays and protein purification |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For protein purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | To freeze the protein |
| HEPES | Sigma | H3375 | For Sf9 lysis buffer |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | For Sf9 lysis buffer |
| KCl | Sigma | P9541 | For buffers preparation |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For protein purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For buffers preparation |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For protein purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and protein purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For preparing motility and gliding assay buffers |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
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