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Biochemistry

एसएफ 9 शुद्ध सुपरप्रोसेसिव किन्सिन -3 फैमिली मोटर्स का एकल-अणु विश्लेषण

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63837
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Discipline of Biological Engineering, Indian Institute of Technology Gandhinagar, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Sambalpur University

Summary

यह अध्ययन एसएफ 9-बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके काइन्सिन -3 परिवार के सदस्य केआईएफ 1 ए (1-393 एलजेड) के शुद्धिकरण का विवरण देता है। इन शुद्ध मोटर्स के इन विट्रो एकल-अणु और मल्टी-मोटर ग्लाइडिंग विश्लेषण ने स्तनधारी सेल लाइसेट से मोटर्स के बराबर मजबूत गतिशीलता गुणों का प्रदर्शन किया। इस प्रकार, एसएफ 9-बैकुलोवायरस प्रणाली रुचि के मोटर प्रोटीन को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए उत्तरदायी है।

Abstract

एक जटिल सेलुलर वातावरण एकल-अणु गतिशीलता विश्लेषण के लिए चुनौतियां पैदा करता है। हालांकि, इमेजिंग तकनीकों में प्रगति ने एकल-अणु अध्ययन में सुधार किया है और फ्लोरोसेंट-टैग किए गए अणुओं के गतिशील व्यवहार का पता लगाने और समझने में अत्यधिक लोकप्रियता हासिल की है। यहां, हम कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके काइन्सिन -3 परिवार मोटर्स के इन विट्रो एकल-अणु अध्ययन के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। किन्सिन -3 एक बड़ा परिवार है जो इंट्रासेल्युलर कार्गो परिवहन से लेकर सेल डिवीजन से लेकर विकास तक सेलुलर और शारीरिक कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हमने पहले दिखाया है कि स्तनधारी कोशिकाओं में मोटर व्यक्त करके तैयार सेल लाइसेट का उपयोग करके एकल-अणु स्तर पर उच्च सूक्ष्मनलिकाएं संबंध के साथ संवैधानिक रूप से सक्रिय डिमेरिक किन्सिन -3 मोटर्स तेजी से और सुपरप्रोसेसिव गतिशीलता प्रदर्शित करते हैं। हमारी प्रयोगशाला सेलुलर, जैव रासायनिक और बायोफिज़िकल दृष्टिकोण का उपयोग करके किन्सिन -3 मोटर्स और उनके नियामक तंत्र का अध्ययन करती है, और इस तरह के अध्ययन बड़े पैमाने पर शुद्ध प्रोटीन की मांग करते हैं। स्तनधारी कोशिकाओं का उपयोग करके इन मोटर्स की अभिव्यक्ति और शुद्धि महंगी और समय लेने वाली होगी, जबकि प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणाली में अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप काफी समेकित और निष्क्रिय प्रोटीन होता है। बैक्टीरियल शुद्धिकरण प्रणालियों और स्तनधारी सेल लाइसेट द्वारा उत्पन्न सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने इन मोटर्स को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए एक मजबूत एसएफ 9-बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति प्रणाली स्थापित की है। काइन्सिन -3 मोटर्स को सी-टर्मिनल रूप से 3-टेंडम फ्लोरोसेंट प्रोटीन (3xmCitirine या 3xmCit) के साथ टैग किया जाता है जो उन्नत संकेत प्रदान करते हैं और फोटोब्लीचिंग में कमी करते हैं। एसएफ 9 शुद्ध प्रोटीन के इन विट्रो एकल-अणु और मल्टी-मोटर ग्लाइडिंग विश्लेषण से पता चलता है कि किन्सिन -3 मोटर स्तनधारी सेल लाइसेट का उपयोग करके हमारे पिछले अध्ययनों के समान तेज और सुपरप्रोसेसिव हैं। इन परखों का उपयोग करने वाले अन्य अनुप्रयोगों में मोटर्स की ऑलिगोमर स्थितियों, जैव रासायनिक अध्ययनों के समानांतर विशिष्ट बाध्यकारी भागीदारों और उनकी गतिज स्थिति का विस्तृत ज्ञान शामिल है।

Introduction

एक बेहद भीड़ वाले सेल वातावरण ने नियत प्रोटीन और अणुओं को छांटने में कई चुनौतियां पैदा की हैं। साइटोप्लाज्म के भीतर अणुओं के संगठन और स्थानिक वितरण का यह गहन कार्यभार आणविक मोटर्स और साइटोस्केलेटल पटरियों द्वारा सुगम है। आणविक मोटर्स एंजाइम हैं जो एटीपी जैसी ऊर्जा मुद्राओं को हाइड्रोलाइज करते हैं और गति और बल उत्पादनके दौरान उस ऊर्जा का उपयोग करते हैं। अमीनो एसिड अनुक्रम समानता के आधार पर, किन्सिन को 14 परिवारों में वर्गीकृत किया जाता है और इस समानता के बावजूद, प्रत्येक मोटर एक सेल के कामकाज में विशिष्ट योगदान देती है। किन्सिन -3 परिवार मोटर्स सबसे बड़े में से एक का गठन करते हैं, जिसमें पांच उप-परिवार (केआईएफ 1, केआईएफ 13, केआईएफ 14, केआईएफ 16, और केआईएफ 28)2 शामिल हैं, जो पुटिका परिवहन, सिग्नलिंग, माइटोसिस, परमाणु प्रवास और विकास 3,4,5 सहित विभिन्न सेलुलर और शारीरिक कार्यों से जुड़े हैं। काइन्सिन -3 परिवहन समारोह में हानि कई न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों, विकास संबंधी दोषों और कैंसर रोगों 6,7,8,9 में निहित है।

हाल के काम से पता चला है कि किन्सिन -3 मोटर्स मोनोमर्स हैं, लेकिन कार्गो-प्रेरित डिमराइजेशन से गुजरते हैं और इसके परिणामस्वरूप पारंपरिक किन्सिन 10,11,12,13 की तुलना में तेज और सुपरप्रोसेसिव गतिशीलता होती है। उनके जैव रासायनिक और बायोफिज़िकल लक्षण वर्णन को बड़ी मात्रा में शुद्ध, सक्रिय प्रोटीन की आवश्यकता होती है। हालांकि, प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणाली में उनके उत्पादन के परिणामस्वरूप निष्क्रिय या समेकित मोटर्स हुए, संभवतः असंगत प्रोटीन संश्लेषण, फोल्डिंग और संशोधन मशीनरी 14,15,16,17,18 के कारण। ऐसी सीमाओं को दरकिनार करने और उपज बढ़ाने के लिए, यहां हमने इन मोटर्स को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए एक मजबूत एसएफ 9-बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति प्रणाली स्थापित की है।

बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति प्रणाली उच्च-थ्रूपुट यूकेरियोटिक पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति 19,20 के लिए एक मेजबान प्रणाली के रूप में एसएफ9 कीट सेल लाइनों का उपयोग करती है। बैकुलोवायरस में एक मजबूत पॉलीहेड्रिन प्रमोटर होता है जो हेटरोलॉगस जीन अभिव्यक्ति और घुलनशील पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन में सहायता करताहै। इसकी लागत-प्रभावशीलता, संभालने के लिए सुरक्षित और सक्रिय प्रोटीन अभिव्यक्ति की उच्च मात्रा के कारण, यह एक शक्तिशाली उपकरणबन गया है। रुचि के प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए, एक महत्वपूर्ण कदम एक पुनः संयोजक बैकमिड उत्पन्न करना है। चूंकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बैकमिड जनरेटिंग किट महंगे हैं और हम अधिक नमूनों के साथ काम करेंगे, इसलिए हमने बैक्मिड्स में काइन्सिन -3 मोटर्स के बड़े और छोटे दोनों सम्मिलन के लिए एक इन-हाउस प्रोटोकॉल विकसित किया। कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इन विट्रो एकल-अणु और मल्टी-मोटर माइक्रोट्यूबुल्स ग्लाइडिंग गुणों को चिह्नित करने के लिए एसएफ 9-शुद्ध किनेसिन -3 मोटर्स का उपयोग किया गया था। मोटर्स को 3-टेंडम फ्लोरोसेंट अणुओं (3xmCit) के साथ सी-टर्मिनल रूप से टैग किया जाता है ताकि उन्नत सिग्नल और कम फोटोब्लीचिंग प्रदान की जा सके। इसके बढ़े हुए सिग्नल-टू-शोर अनुपात, कम फोटोटॉक्सिसिटी और कवरस्लिप के करीब एक बहुत छोटे क्षेत्र की चयनात्मक इमेजिंग के कारण, टीआईआरएफ इमेजिंग का व्यापक रूप से विवो और इन विट्रो में एकल-अणु स्तर पर प्रोटीन गतिशीलता की कल्पना करने के लिए उपयोग किया गया है।

यह अध्ययन एसएफ 9-बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति प्रणाली और इन विट्रो सिंगल-मॉलिक्यूल इमेजिंग और टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मोटर्स के मल्टी-मोटर ग्लाइडिंग विश्लेषण को नियोजित करके किनेसिन -3 मोटर्स के शुद्धिकरण पर चर्चा करता है। कुल मिलाकर, इस अध्ययन से पता चलता है कि एसएफ 9 शुद्ध मोटर्स के गतिशीलता गुण स्तनधारी सेल लाइसेट से तैयार मोटर्स के समान हैं। इसलिए, हम मानते हैं कि एसएफ 9-बैकुलोवायरस प्रणाली को रुचि के किसी भी मोटर प्रोटीन को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

1. एसएफ 9 संस्कृति, अभिकर्मक और वायरस पीढ़ी

नोट: एसएफ -900 / एसएफएम माध्यम के 30 एमएल में एसएफ 9 कोशिकाओं को 100 एमएल बाँझ, डिस्पोजेबल शंक्वाकार फ्लास्क में 28 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक के बिना बनाए रखें। निलंबन संस्कृति को 90 आरपीएम पर कक्षीय शेकर में रखें। सीओ2 की आपूर्ति और आर्द्रता रखरखाव की आवश्यकता नहीं है। कोशिकाओं को आमतौर पर चौथे दिन 2.0 x 106 कोशिकाओं / एमएल घनत्व तक पहुंचने के लिए 0.5 x 106 कोशिकाओं / एमएल को इंजेक्ट करके हर चौथे दिन उपसंस्कृति की जाती है।

  1. पी0 वायरस स्टॉक उत्पादन
    1. अभिकर्मक के लिए, बीज कोशिकाओं को 4.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल कंफ्लुएंसी के साथ35 मिमी डिश में रखा जाता है और बिना हिलाए 28 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है।
    2. 24 घंटे के बाद, एक बार जब कोशिकाएं जुड़ जाती हैं और स्वस्थ दिखती हैं, तो नीचे वर्णित अभिकर्मक के लिए आगे बढ़ें।
      1. ट्यूब ए: संवैधानिक रूप से सक्रिय केआईएफ 1 ए (1-393 एलजेड) -3xmCit-FLAG विशिष्ट किनेसिन -3 मोटर के लिए बैकमिड डीएनए एन्कोडिंग के 1 μg को 100 μL ग्रेस के मीडिया के साथ मिलाएं।
      2. ट्यूब बी: 6 μL अभिकर्मक को 100 μL अनसप्लीमेंट्ड ग्रेस के मीडिया के साथ मिलाएं।
      3. ट्यूब ए की सामग्री को ट्यूब बी में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें और ऊपर और नीचे (लगभग 20 बार) पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं।
      4. कमरे के तापमान पर ~ 45 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    3. इनक्यूबेशन को पूरा करने के बाद, उपरोक्त मिश्रण में 0.8 एमएल अनसप्लीमेंटेड ग्रेस का मीडिया जोड़ें और पाइपिंग द्वारा धीरे-धीरे मिलाएं।
    4. धीरे से कोशिकाओं से एसएफ -900 / एसएफएम मीडिया को एस्पिरेट करें (सीरम के किसी भी निशान को हटाने के लिए जो अभिकर्मक दक्षता को प्रभावित कर सकता है)।
    5. कोशिकाओं के शीर्ष पर चरण 1.1.3 ड्रॉपवाइज से अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें और प्लेट को 28 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. इनक्यूबेशन के बाद, अभिकर्मक मिश्रण को सावधानीपूर्वक हटा दें, 2 एमएल एसएफ -900 / एसएफएम मीडिया जोड़ें और 28 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए आगे इनक्यूबेट करें।
    7. एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत मोटर प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करें। मोटर प्रोटीन को एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एमसिट्रिन, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एक संस्करण के साथ टैग किया गया है।
      नोट: ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं को एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था जो 20x उद्देश्य (200 गुना आवर्धन), पारा लैंप और एक ईएम-सीसीडी कैमरा के साथ विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) और एपिफ्लोरेसेंस रोशनी से लैस था। एमसिट्रीन उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर क्यूब के माध्यम से कोशिकाओं में एमसिट्रिन-टैग किए गए मोटर्स की अभिव्यक्ति की निगरानी करके वायरस उत्पादन और संक्रमण की दक्षता की जांच करें। इसके अलावा, संक्रमित कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तनों की जांच करें, जैसे कि बढ़ी हुई कोशिकाएं / नाभिक (चित्रा 1 ए-सी)।
    8. फिर से, संक्रमण के 72 घंटे बाद कोशिकाओं की जांच करें। आमतौर पर, कोशिकाएं सतह से अलग होना शुरू कर देती हैं (चित्रा 2)।
    9. यदि >5% कोशिकाएं सतह से अलग हो जाती हैं, तो 1.5 एमएल बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में संक्रमित कोशिकाओं के साथ मीडिया को काटें और 500 x g पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें।
    10. सुपरनैटेंट इकट्ठा करें और तरल नाइट्रोजन में 1 एमएल के फ्रीज एलिकोट को स्नैप करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर पी 0 स्टॉक के रूप में स्टोर करें या पी 1 वायरस स्टॉक उत्पन्न करने के लिए इसका उपयोग करें।
  2. पी 1 वायरस स्टॉक उत्पादन
    1. पी 0 बैकुलोवायरस स्टॉक को और बढ़ाने और प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए, तरल निलंबन संस्कृति में एसएफ 9 कोशिकाओं को विकसित करें।
    2. बाँझ 100 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क में, 2 x 106 कोशिकाओं / एमएल के सेल घनत्व और पी 0 वायरस स्टॉक के 1 एमएल के साथ एसएफ -900 / एसएफएम मीडिया के 10 एमएल जोड़ें। 90 आरपीएम पर लगातार झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. संक्रमण के 72 घंटे के बाद, प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करें जैसा कि पहले वर्णित है (चरण 1.1.7)। यदि प्रोटीन अभिव्यक्ति अच्छी है (>90% कोशिकाएं एक उज्ज्वल एमसिट्रिन फ्लोरेसेंस सिग्नल दिखाती हैं) और महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु (लगभग 10% -15%) दिखाती हैं, तो कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 500 x g पर 15 एमएल बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में घुमाएं।
    4. सुपरनैटेंट एकत्र करें, तरल नाइट्रोजन में 1 एमएल (पी 1 स्टॉक) के एलिकोट को स्नैप फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या बड़े पैमाने पर संक्रमण और प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए आगे बढ़ें।
  3. बड़े पैमाने पर संक्रमण
    1. बड़े पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, 1 एमएल पी 1 वायरस स्टॉक के साथ 2 x 106 कोशिकाओं / एमएल घनत्व पर निलंबन संस्कृति के 30 एमएल को संक्रमित करें और 90 आरपीएम पर लगातार झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. ~ 72 घंटे के बाद संक्रमण के बाद, प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करें (सामान्य तौर पर, संक्रमण के बाद 65-75 घंटे के बीच अधिकतम प्रोटीन अभिव्यक्ति प्राप्त की जाती है)।
    3. यदि >90% कोशिकाएं न्यूनतम कोशिका मृत्यु (<5%) के साथ एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट सिग्नल दिखाती हैं, तो कोशिकाओं को बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x g पर घूमते हैं।
      नोट: न्यूनतम कोशिका मृत्यु (<5%) होनी चाहिए, क्योंकि मृत कोशिकाएं सेलुलर सामग्री को मीडिया में छोड़ती हैं, जिससे व्यक्त प्रोटीन का नुकसान होता है।
    4. सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, सेल गोली एकत्र करें, और प्रोटीन शुद्धिकरण के साथ आगे बढ़ें।

2. काइन्सिन -3 मोटर्स का एसएफ 9 शुद्धिकरण

  1. उपरोक्त सेल पेलेट में, 3 एमएल आइस-कोल्ड लाइसिस बफर (पूरक तालिका 1) को ताजा पूरक के रूप में 5 एमएम डीटीटी, 5 μg / mL एप्रोटिनिन, 5 μg / mL ल्यूपेप्टिन, और PMSF के 5 μg / mL के साथ पूरक करें और किसी भी हवा के बुलबुले उत्पन्न किए बिना 20-25 बार पाइप करके कोशिकाओं को लाइस करें। सभी बफर रचनाओं और अभिकर्मकों के लिए, कृपया पूरक तालिका 1 देखें।
  2. सेल लाइसेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 150,000 x g पर घुमाएं।
  3. सुपरनैटेंट को एक ताजा, बाँझ ट्यूब में इकट्ठा करें और 50% एंटी-फ्लैग एम 2 आत्मीयता राल के ~ 40 μL के साथ मिलाएं। मिश्रण को 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एंड-टू-एंड टम्बलिंग के साथ इनक्यूबेट करें।
  4. इनक्यूबेशन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 500 x g पर घूमकर फ्लैग राल को गोली मार दें। 26 ग्राम सुई के साथ गोली को परेशान किए बिना धीरे से सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें और छोड़ दें।
  5. फ्लैग राल गोली को बर्फ-ठंडे धोने बफर (पूरक तालिका 1) के साथ तीन बार धोएं, ताजा 2 एमएम डीटीटी, 5 μg / mL aprotinin, 5 μg / mL ल्यूपेप्टिन, और PMSF के 5 μg / mL के साथ पूरक। प्रत्येक धोने में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 500 x g पर घूमकर मोतियों को पेलेट करें।
  6. तीसरे धोने के बाद, गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना वॉश बफर को सावधानीपूर्वक सूखा दें। प्रोटीन एल्यूशन के लिए, राल गोली में 100 μg/mL FLAG पेप्टाइड युक्त ~ 70 μL वॉश बफर जोड़ें और अंत-से-अंत टम्बलिंग के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  7. अगले दिन, राल को 500 x g पर 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं। शुद्ध प्रोटीन युक्त सुपरनैटेंट को एक ताजा ट्यूब में इकट्ठा करें और 10% ग्लिसरॉल के साथ पूरक करें। स्नैप तरल नाइट्रोजन में 5 μL के एलिकोट को फ्रीज करें और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. प्रोटीन एकाग्रता और उपज निर्धारित करने के लिए एसडीएस-पेज जेल चलाएं। रुचि के शुद्ध प्रोटीन के साथ, एक मानक प्रोटीन नियंत्रण, 0.2 μg, 0.4 μg, 0.6 μg, 0.8 μg, और 1 μg से लेकर ज्ञात सांद्रता का बीएसए एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए लोड किया जाता है। जेल को कूमासी ब्रिलियंट ब्लू (चित्रा 3) के साथ दाग दें।
  9. इमेजजे सॉफ्टवेयर में अंतर्निहित जेल परिमाणीकरण उपकरण का उपयोग करके जेल का विश्लेषण करें। सबसे पहले, बीएसए की ज्ञात सांद्रता की बैंड तीव्रता को मापें और मानक वक्र उत्पन्न करें। फिर, शुद्ध प्रोटीन बैंड की तीव्रता को मापें और प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें। ऐसा करने के लिए छवि जे सॉफ्टवेयर खोलें, मेनू बार में विश्लेषण विकल्प पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू में जैल का चयन करें।

3. एसएफ 9-शुद्ध किनेसिन -3 मोटर्स का उपयोग करके इन विट्रो एकल-अणु गतिशीलता परख

नोट: एसएफ 9-शुद्ध किन्सिन -3 मोटर्स का उपयोग जैव रासायनिक और बायोफिज़िकल गुणों जैसे एटीपी टर्नओवर दर, सूक्ष्मनलिका आत्मीयता, वेग, रन लंबाई, चरण आकार और बल उत्पादन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यहां, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके केआईएफ 1 ए (1-393 एलजेड) के इन विट्रो एकल-अणु गतिशीलता विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्णित है। सभी बफर संरचना और अभिकर्मकों के लिए, कृपया पूरक तालिका 1 देखें।

  1. सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन
    1. एक पूर्व-ठंडा 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, निम्नलिखित क्रम में पिपेटिंग द्वारा एक पोलीमराइजेशन मिश्रण तैयार करें: बीआरबी 80 बफर का 12.0 μL, पीएच 6.9; 100 mM MgCl2 का 0.45 μL, 25 mM GTP का 1 μL।
    2. तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत 10 मिलीग्राम / एमएल ट्यूबुलिन का 10 μL एलिकोट निकालें, तुरंत पिघल जाएं, और उपरोक्त पोलीमराइजेशन मिश्रण में जोड़ें। बिना किसी हवा के बुलबुले के 2-3 बार पाइप करके धीरे-धीरे मिलाएं।
      नोट: बर्फ पर उपरोक्त चरणों को जल्दी और सख्ती से करें।
    3. उपरोक्त मिश्रण को 5 मिनट के लिए बर्फ पर बैठने दें।
      नोट: ट्यूबुलिन के विकृतीकरण को रोकने या छोटे सूक्ष्मनलिका के बीज के गठन से बचने के लिए यह एक महत्वपूर्ण कदम है।
    4. ट्यूब को पूर्व-गर्म 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक / पानी के स्नान में स्थानांतरित करें और सूक्ष्मनलिकाएं के पोलीमराइजेशन के लिए 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. जबकि सूक्ष्मनलिकाएं बहुलक होती हैं, पी 12 बफर के एक एलिकोट को पिघलाएं और इसे कमरे के तापमान पर लाएं।
    6. इनक्यूबेशन के 30 मिनट पूरा करने से पहले, एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पी 12 बफर के 100 μL को पाइप करके एमटी स्थिरीकरण बफर तैयार करना शुरू करें। इसमें, 1 mM taxol का 1 μL जोड़ें और मिश्रण को तुरंत भंवर करें।
      नोट: चरण 3.1.4 में इनक्यूबेशन को पूरा करने से लगभग 5 मिनट पहले एमटी स्थिरीकरण बफर तैयार करना शुरू करें। टैक्सोल β-ट्यूबुलिन से बंधकर पॉलीमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल्स को स्थिर करता है।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए सूक्ष्मनलिका स्थिरीकरण बफर को गर्म करें और नीचे पोलीमराइजेशन मिश्रण को परेशान किए बिना धीरे से इसे पॉलीमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल्स में जोड़ें।
      नोट: स्थिरीकरण बफर को गर्म करने से यह पोलीमराइजेशन मिश्रण के समान तापमान पर आ जाएगा।
    8. मिश्रण को टैप या पिपेट न करें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे इनक्यूबेट करें।
    9. धीरे से मिश्रण को टैप करें और इसे पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे एक बेवेल कट टिप (200 μL क्षमता) के साथ मिलाएं।
      नोट: इस बिंदु से आगे, सूक्ष्मनलिकाएं कतरने से बचने के लिए हमेशा सूक्ष्मनलिकाएं को कटी हुई नोक के साथ संभालें।
    10. उचित सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन की जांच करने के लिए प्रवाह कोशिका में 10-15 μL पॉलीमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल्स लें।
      नोट: डीआईसी माइक्रोस्कोपी सेटअप का उपयोग करके बिना लेबल वाले सूक्ष्मनलिकाएं की कल्पना कर सकते हैं।
    11. यदि सूक्ष्मनलिकाएं केंद्रित हैं, तो उन्हें पी 12 बफर में पतला करें जो 10 μM taxol के साथ पूरक है।
  2. गतिशीलता प्रवाह सेल कक्ष की तैयारी
    1. ग्लास स्लाइड, डबल-साइडेड टेप और ग्लास कवरस्लिप (22 मिमी x 30 मिमी) का उपयोग करके एक गतिशीलता कक्ष तैयार करें।
    2. एक ग्लास स्लाइड लें, बीच में विआयनीकृत आसुत जल की एक बूंद (~ 70 μL) रखें और इसे लिंट-मुक्त टिशू पेपर से पोंछ दें।
    3. डबल-साइडेड टेप (~ 35 x 3 मिमी) की दो स्ट्रिप्स को काटें और उन्हें समानांतर रूप से ग्लास स्लाइड पर चिपकाएं, जिससे एक संकीर्ण मार्ग बनाने के लिए दो स्ट्रिप्स के बीच ~ 4-5 मिमी का अंतर रह जाए।
    4. इसके बाद, एक कवरस्लिप लें और बीच में विआयनीकृत आसुत जल की एक बूंद (~ 20 μL) जोड़ें। पानी की बूंद पर लिंट-फ्री लेंस सफाई टिशू पेपर की एक पट्टी रखें जब तक कि यह पानी को अवशोषित न कर ले। फिर, इसे धीरे-धीरे कवरस्लिप के एक छोर की ओर स्लाइड करें।
      नोट: कवरस्लिप पूरी तरह से सूखा होना चाहिए। कवरस्लिप पर कोई पानी दिखाई नहीं देना चाहिए।
    5. स्लाइड पर चिपकी हुई डबल-साइडेड स्ट्रिप्स पर कवरस्लिप रखें और मजबूती से चिपकने के लिए कवरस्लिप को स्ट्रिप्स के साथ समान रूप से दबाएं।
      नोट: कृपया सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप का साफ किया गया पक्ष ग्लास स्लाइड का सामना करता है।
    6. सुनिश्चित करें कि एक साथ यह गतिशीलता परख (चित्रा 4 ए) करने के लिए 10-15 μL क्षमता का एक संकीर्ण कक्ष बनाता है।
  3. इन विट्रो एकल-अणु गतिशीलता परख
    नोट: मोटर्स के सूक्ष्मनलिका-आधारित एकल-अणु गतिशीलता गुणों का अध्ययन करने के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं को गतिशीलता कक्ष में कवरस्लिप सतह पर अधिशोषित करने की आवश्यकता होती है।
    1. पी 12 बफर में पॉलीमराइज्ड टैक्सोल-स्टेबलाइज्ड माइक्रोट्यूबुल्स को पतला करें, जिसे 1: 5 अनुपात पर 10 एसएम टैक्सोल के साथ पूरक किया जाता है और धीरे-धीरे एक घुमावदार टिप के साथ पाइप करके मिलाएं।
    2. प्रवाह कक्ष को तिरछी स्थिति (~ 15-20 ° ) में रखें। तरल को अवशोषित करने के लिए निचले छोर पर एक लिंट-मुक्त टिशू पेपर रखते हुए ऊपरी छोर से प्रवाह कक्ष के माध्यम से पतला सूक्ष्मनलिका समाधान का 30 μL प्रवाह करें। यह प्रवाह दिशा में सूक्ष्मनलिकाएं को संरेखित करने के लिए एक कतरनी बल बनाता है और सूक्ष्मनलिकाएं सीधे सोखने और समानांतर संरेखित करने में मदद करता है।
    3. कक्ष के दोनों सिरों पर तरल की एक छोटी बूंद छोड़ दें और गतिशीलता कक्ष को सूखने से रोकने के लिए एक बंद, नम कक्ष में प्रवाह कोशिका को उल्टी स्थिति (नीचे की ओर कवरस्लिप) में रखें।
    4. इसे ~ 30 मिनट के लिए बैठने दें ताकि सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता कक्ष के अंदर कवरस्लिप की सतह पर सोख सकें।
    5. इस बीच, 1 एमएम टैक्सोल के 5 μL के साथ 500 μL P12-BSA बफर को मिलाकर ब्लॉकिंग बफर तैयार करें।
    6. बफर को अवरुद्ध करने के 40-50 μL प्रवाहित करें और स्लाइड को एक नम कक्ष में 10 मिनट के लिए उल्टी स्थिति में इनक्यूबेट करें।
    7. निम्नलिखित घटकों को निम्नलिखित क्रम में 500 μL क्षमता बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पाइप करके गतिशीलता मिश्रण तैयार करें: टैक्सोल के साथ P12 बफर का 25 μL, 100 mM MgCl2 का 0.5 μL, 100 mM DTT का 0.5 μL, 20 mg/mL ग्लूकोज ऑक्सीडेज का 0.5 μL, 8 mg/mL कैटालेज का 0.5 μL, 2.25 M Glucose का 0.5 μL, और 100 mM ATP का 1.0 μL।
      नोट: फ्लोरेसेंस इमेजिंग का व्यापक रूप से जैविकअनुप्रयोगों 22,23,24,25,26 के लिए उपयोग किया गया है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन का फोटोउत्तेजना प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पन्न करती है, जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के फोटोब्लीचिंग और जैविक नमूनों को नुकसान पहुंचा सकती है। ग्लूकोज, ग्लूकोज ऑक्सीडेज और कैटालेज जैसे ऑक्सीजन स्कैवेंजर्स का उपयोग नियमित रूप से गतिशीलता परख में फोटोडैमेज को सीमित करने और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विरंजन समय को बढ़ाने के लिए किया जाता है।
    8. अंत में, उपरोक्त गतिशीलता मिश्रण में शुद्ध मोटर का 1 μL जोड़ें और गतिशीलता कक्ष में बहने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं।
    9. तरल पैराफिन मोम के साथ गतिशीलता कक्ष के दोनों सिरों को सील करें और 1.5x आवर्धन के साथ 1.49 NA के 100X TIRF उद्देश्य का उपयोग करके TIRF रोशनी के तहत तुरंत छवि बनाएं।
    10. कवरस्लिप सतह पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, सबसे पहले, अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) रोशनी के तहत गतिशीलता कक्ष में डबल-साइडेड टेप के आंतरिक किनारों में से एक पर ध्यान केंद्रित करें।
      नोट: उज्ज्वल और असमान सतह दिखाई देगी।
    11. फिर, फोकस को गतिशीलता कक्ष में ले जाएं। ठीक समायोजन का उपयोग करके, कवरस्लिप सतह पर ध्यान केंद्रित करें और कवरस्लिप सतह पर अधिशोषित सूक्ष्मनलिकाएं देखें।
    12. एक बार सूक्ष्मनलिकाएं केंद्रित होने के बाद, 488 एनएम उत्तेजना लेजर के साथ टीआईआरएफ रोशनी पर स्विच करें और सबसे अच्छा और समान टीआईआरएफ रोशनी प्राप्त करने के लिए उत्तेजना बीम कोण को बदलकर रोशनी की गहराई को समायोजित करें (चित्रा 4 बी)।
    13. 100 एमएस एक्सपोज़र के साथ सूक्ष्मनलिका सतह के साथ प्रक्रियात्मक रूप से चलने वाले व्यक्तिगत एमसिट्रिन-टैग किए गए मोटर्स पर ध्यान केंद्रित करें और ईएम-सीसीडी कैमरे का उपयोग करके गति रिकॉर्ड करें।
      नोट: यद्यपि गतिशीलता परख बिना लेबल वाले सूक्ष्मनलिकाएं पर की गई थीं, अधिकतम तीव्रता जेड-प्रोजेक्शन फ़ंक्शन का उपयोग सूक्ष्मनलिका ट्रैक की रूपरेखा को प्रकट करने के लिए किया जा सकता है। अधिमानतः, ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए लंबे सूक्ष्मनलिका पटरियों पर घटनाओं पर विचार किया गया था।
    14. मैन्युअल रूप से इमेजजे (nih.gov) सॉफ्टवेयर में कस्टम-लिखित प्लगइन का उपयोग करके लंबे सूक्ष्मनलिका ट्रैक फ्रेम-दर-फ्रेम पर चलने वाले फ्लोरोसेंटली टैग किए गए व्यक्तिगत मोटर्स की स्थिति को ट्रैक करें, जैसा कि पहले29 वर्णित है।
    15. प्रत्येक बिन में घटनाओं की संख्या को प्लॉट करके मोटर आबादी के लिए वेग और रन लंबाई के हिस्टोग्राम उत्पन्न करें। औसत वेग प्राप्त करने और लंबाई12 (चित्रा 4 सी-ई) प्राप्त करने के लिए इन हिस्टोग्राम को एकल गॉसियन पीक फ़ंक्शन में फिट करें।

4. इन विट्रो माइक्रोट्यूबुल्स ग्लाइडिंग परख

नोट: किन्सिन -3 मोटर्स के सामूहिक व्यवहार को समझने के लिए, इन विट्रो माइक्रोट्यूबुल्स ग्लाइडिंग परख 18,30,31 का प्रदर्शन किया गया था। जहां मोटर्स को उल्टे स्थिति में कवरस्लिप पर स्थिर किया जाता है और कक्ष में सूक्ष्मनलिकाएं जोड़ने पर, सूक्ष्मनलिकाएं मोटर्स पर उतरती हैं और मोटर्स पर चलने की कोशिश करते समय ग्लाइड करती हैं (चित्रा 5 ए, बी)।

  1. फ्लोरोसेंट सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन: पहले वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सूक्ष्मनलिकाएं पॉलीमराइज़ करें, सिवाय रोडामाइन लेबल ट्यूबुलिन (3 मिलीग्राम / एमएल) को बिना लेबल वाले ट्यूबुलिन (10 मिलीग्राम / एमएल) के साथ 1: 10 के अनुपात में मिलाने के अलावा।
  2. पोलीमराइजेशन के 30 मिनट के बाद, धीरे से पूर्व-गर्म सूक्ष्मनलिका स्थिरीकरण बफर के 30 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए आगे इनक्यूबेट करें।
  3. इसके बाद, केशिका-लोडिंग टिप (~ 25-30 बार) के साथ पाइप करके सूक्ष्मनलिकाएं कतरनी करें।
  4. पहले वर्णित गतिशीलता प्रवाह कक्ष तैयार करें, एसएफ 9-शुद्ध जीएफपी नैनोबॉडीज के 50 μL प्रवाह (100 एनएम का 2.5 μL P12 बफर के 50 μL में पतला) और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक नम कक्ष में नीचे की ओर कवरस्लिप के साथ इनक्यूबेट करें।
    नोट: मोटर्स को एमसिट्रिन के साथ सी-टर्मिनल रूप से टैग किया गया है। जीएफपी नैनोबॉडीज का उपयोग मोटर्स को उनके कम पृथक्करण स्थिरांक32 के कारण गतिहीन करने के लिए किया जाता है।
  5. गैर-विशिष्ट प्रोटीन सोखना को रोकने के लिए प्रवाह कक्ष में ब्लॉक बफर के 50 μL प्रवाहित करके कवरस्लिप सतह को अवरुद्ध करें और 5 मिनट के लिए आगे इनक्यूबेट करें।
  6. ब्लॉक बफर के 50 μL, 100mM ATP के 1 μL और 100 nM Sf9-शुद्ध किनेसिन -3 मोटर्स के 5 μL को पाइप करके मोटर मिश्रण तैयार करें। कक्ष में बहने से पहले धीरे से मिलाएं और नम कक्ष में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. पी 12 कैसिइन के 50 μL के साथ कक्ष को दो बार धोएं।
  8. एक बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, निम्नलिखित क्रम में ग्लाइडिंग परख मिश्रण तैयार करें, 10 μM taxol के साथ P12-कैसिइन का 45 μL, 100 mM ATP का 1 μL, 8 mg/mL कैटालेज़ का 0.5 μL, 20 mg/mL ग्लूकोज ऑक्सीडेज का 0.5 μL, 2.25 M ग्लूकोज का 0.5 μL और कतरनी फ्लोरोसेंट माइक्रोट्यूबुल्स का 1 μL। गतिशीलता कक्ष में बहने से पहले धीरे से सामग्री को मिलाएं और तरल पैराफिन मोम के साथ कक्ष के सिरों को सील करें।
  9. 100 एमएस एक्सपोजर पर टीआईआरएफ रोशनी के तहत माइक्रोट्यूबुल्स ग्लाइडिंग की छवि बनाएं और संलग्न ईएम-सीसीडी कैमरे के साथ छवियों को कैप्चर करें।
    नोट: औसत सूक्ष्मनलिका ग्लाइडिंग वेग इमेजजे29 में कस्टम-लिखित प्लगइन का उपयोग करके लगभग 100 व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं फ्रेम-बाय-फ्रेम को मैन्युअल रूप से ट्रैक करके निर्धारित किया गया था। हिस्टोग्राम उत्पन्न करके और गॉसियन फ़ंक्शन (चित्रा 5 सी, डी) में फिट करके औसत सूक्ष्मनलिका ग्लाइडिंग वेग निर्धारित करें।

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Representative Results

एसएफ 9-बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति का उपयोग करके बड़े पैमाने पर सक्रिय और कार्यात्मक पुनः संयोजक मोटर प्रोटीन को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए, सिस्टम को एसएफ 9 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए एक कोडिंग अनुक्रम को स्थिर रूप से ले जाने वाले वायरल कणों की पीढ़ी की आवश्यकता होती है। इसे प्राप्त करने के लिए, एसएफ 9 कोशिकाओं को पुनः संयोजक बैकमिड एन्कोडिंग KIF1A (1-393LZ)-3xmCit-FLAG के साथ स्थानांतरित किया गया था। 72 घंटे के बाद, कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण आबादी ने बढ़े हुए कोशिकाओं और नाभिक (चित्रा 1 और चित्रा 2) के साथ हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एमसिट्रिन) की अभिव्यक्ति दिखाई, जो वायरल कणों (पी 0) की सफल पीढ़ी का सुझाव देती है। भंडारण और बड़े पैमाने पर संक्रमण के लिए पी 1 वायरल स्टॉक उत्पन्न करने के लिए उच्च मात्रा में ताजा एसएफ 9 आबादी को संक्रमित करके इन वायरल कणों का और विस्तार किया गया। काइन्सिन -3 मोटर के शुद्धिकरण के लिए, एसएफ 9 कोशिकाओं की 30 एमएल संस्कृति को पी 1 वायरल कणों के 1 एमएल से संक्रमित किया गया था। संक्रमण के 72 घंटे के बाद, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को उज्ज्वल रूप से व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी-लेपित राल के साथ सी-टर्मिनल फ्लैग टैग आत्मीयता शुद्धिकरण का उपयोग करके काटा, लाइस और शुद्ध किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि काइन्सिन -3 मोटर्स से जुड़े मोतियों में फ्लैग पेप्टाइड के अलावा अधिकांश प्रोटीन एक ही अंश में थे और शुद्ध प्रोटीन उच्च शुद्धता का था, जिसे चित्रा 3 के लेन 7 में ~ 120 केडीए के बैंड के रूप में दिखाया गया था।

एकल-अणु स्तर पर एस 9-शुद्ध किनेसिन -3 मोटर्स की गतिशीलता गुणों का अध्ययन करने के लिए लंबे और स्वस्थ सूक्ष्मनलिकाएं के सफल पोलीमराइजेशन के लिए शुद्ध ट्यूबुलिन की आवश्यकता होती है। वर्तमान अध्ययन में, टैक्सोल की अनुपस्थिति में 30 मिनट के लिए ~ 2.5-3.0 मिलीग्राम / एमएल के बीच एक महत्वपूर्ण एकाग्रता पर बकरी के मस्तिष्क से शुद्ध 2एक्स चक्रित ट्यूबुलिन का उपयोग करके सूक्ष्मनलिकाएं पॉलीमराइज्ड की गईं, क्योंकि टैक्सोल सूक्ष्मनलिका न्यूक्लियेशन की महत्वपूर्ण एकाग्रता को कम करता है और बड़ी संख्या में लघु सूक्ष्मनलिकाएं उत्पन्न करता है 33,34,35 . सूक्ष्मनलिकाएं स्थिर करने और डिपोलीमराइजेशन को रोकने के लिए टैक्सोल को पोस्ट-पोलीमराइजेशन जोड़ा गया था। इस विधि का उपयोग करके पॉलीमराइज्ड सूक्ष्मनलिकाएं लंबी और समान संरचनाओं (वीडियो 1) में 60-70 μm की औसत लंबाई के साथ हुईं।

टीआईआरएफ रोशनी (चित्रा 4 बी) के तहत एसएफ 9-शुद्ध किन्सिन -3 मोटर, केआईएफ 1 ए (1-393 एलजेड) के इन विट्रो एकल-अणु गतिशीलता विश्लेषण ने सूक्ष्मनलिका (वीडियो 2) के साथ यूनिडायरेक्शनल, तेज और सुपरप्रोसेसिव गति का प्रदर्शन किया, जैसा कि किमोग्राफ में लंबी विकर्ण सफेद रेखाओं (चित्रा 4 सी) के रूप में दिखाया गया है। इन लंबी सुपरप्रोसेसिव गतिशीलता घटनाओं के ट्रैकिंग विश्लेषण ने क्रमशः 2.44 ± 0.02 μms-1 और 10.79 ± 0.28 μm (चित्रा 4D-E) की औसत वेग और रन लंबाई दिखाई। ये परिणाम स्तनधारी सेल लाइसेट से तैयार मोटर्स का उपयोग करके हमारे पहले प्रकाशित डेटा 12,13 के साथ समझौते में हैं। इसके अलावा, टीआईआरएफ रोशनी के तहत कवरस्लिप पर जुड़े एसएफ 9-शुद्ध मोटर्स का उपयोग करके मल्टी-मोटर माइक्रोट्यूबुल्स-ग्लाइडिंग परख ने लंबी, समान और यूनिडायरेक्शनल गति का प्रदर्शन किया (चित्रा 5 सी और वीडियो 3)। इन लंबी सूक्ष्मनलिका ग्लाइडिंग घटनाओं के ट्रैकिंग विश्लेषण ने 1.37 ± 0.01 μms-1 (चित्रा 5 डी) का औसत वेग दिखाया।

साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि एसएफ 9-बैकुलोवायरस प्रणाली सक्रिय मोटर प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करती है जो आम तौर पर प्रोकैरियोटिक प्रणाली का उपयोग करना मुश्किल होता है। फ्लैग टैग अपने शुद्ध रूप में प्रोटीन के एकल-चरण शुद्धिकरण का लाभ प्रदान करता है। इसके अलावा, ताजा और शुद्ध ट्यूबुलिन का उपयोग करके सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन और पोलीमराइजेशन के बाद उनका स्थिरीकरण लंबे और समान सूक्ष्मनलिकाएं पैदा करता है। इसके अतिरिक्त, इन विट्रो एकल-अणु गतिशीलता विश्लेषण से पता चलता है कि एसएफ 9-शुद्ध मोटर्स मजबूत थे और स्तनधारी प्रणालियों में व्यक्त मोटर्स के समान गतिशीलता गुणों का प्रदर्शन करते थे।

Figure 1
चित्रा 1: फ्लोरोसेंटली-टैगकिए गए किन्सिन -3 मोटर के साथ एसएफ 9 कोशिकाओं का 48 एच पोस्ट-अभिकर्मक: एसएफ 9 कोशिकाओं को 4.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर35 मिमी डिश पर चढ़ाया गया था। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करके पुनः संयोजक बैकमिड डीएनए एन्कोडिंग विशिष्ट किनेसिन -3 मोटर, केआईएफ 1 ए (1-393 एलजेड) -3 एक्सएमसिट-फ्लैग के साथ स्थानांतरित किया गया था। अभिकर्मक के 48 घंटे के बाद, छवियों को अंतर हस्तक्षेप और कंट्रास्ट (डीआईसी) और एपिफ्लोरेसेंस रोशनी के तहत कैप्चर किया गया था। (ए) असंक्रमित कोशिकाएं, छोटी, गोल और दृढ़ता से जुड़ी हुई। (बी) केआईएफ 1 ए (1-393 एलजेड) -3 एक्सएमसीआईटी-फ्लैग टैग किए गए प्रोटीन को व्यक्त करने वाली ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाएं बढ़ी हुई कोशिका व्यास दिखाती हैं और सतह से शिथिल रूप से जुड़ी होती हैं। स्केल बार, 100 μm. (C) बार ग्राफ जो असंक्रमित और स्थानांतरित कोशिकाओं के औसत सेल व्यास को दर्शाता है। त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± SD का प्रतिनिधित्व करती हैं। N = 50 कक्ष। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग महत्व मान (***पी < 0.0001) खोजने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरोसेंटली-टैगकिए गए किन्सिन -3 मोटर के साथ एसएफ 9 कोशिकाओं का 72 एच पोस्ट-अभिकर्मक: फ्लोरोसेंटली-टैगकिए गए किन्सिन -3 मोटर, केआईएफ 1 ए (1-393 एलजेड) को व्यक्त करने वाले एसएफ 9 कोशिकाओं के 90% से अधिक दिखाने वाली छवियां। कोशिकाएं शिथिल रूप से सतह से बंधी होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: एसएफ 9-शुद्ध किन्सिन -3 मोटर: कूमासी-सना हुआ एसडीएस-पेज जेल जो एसएफ 9-शुद्ध किन्सिन -3 मोटर का प्रतिनिधित्व करता है, केआईएफ 1 ए (1-393 एलजेड) सी-टर्मिनल रूप से 3एक्सएमसिट-फ्लैग के साथ टैग किया गया है। बाएं से दाएं, प्रोटीन सीढ़ी (एम), बीएसए मानक प्रोटीन नियंत्रण, 0.2 μg (लेन 2), 0.4 μg (लेन 3), 0.6 μg (लेन 4), 0.8 μg (लेन 5), और 1.0 μg (लेन 6), शुद्ध काइन्सिन -3 मोटर (एस) (लेन 7)। बीएसए का उपयोग शुद्ध प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए एक मानक के रूप में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एसएफ 9 शुद्ध काइन्सिन -3 मोटर्स का उपयोग करके इन विट्रो एकल-अणु गतिशीलता परख: (ए) योजनाबद्ध प्रवाह सेल गतिशीलता कक्ष ग्लास स्लाइड, डबल-साइडेड टेप और ग्लास कवरस्लिप का उपयोग करके तैयार किया गया। (बी) टोटल इंटरनल रिफ्लेक्शन फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कवरस्लिप पर अधिशोषित सूक्ष्मनलिका सतह के साथ चलने वाले फ्लोरोसेंटली टैग किए गए मोटर्स की इन विट्रो सिंगल-मॉलिक्यूल इमेजिंग को दर्शाने वाला कार्टून आरेख। महत्वपूर्ण कोण से परे एक कोण पर रोशन होने पर घटना प्रकाश के पूर्ण प्रतिबिंब द्वारा गठित एवेनेसेंट क्षेत्र (~ 150-200 एनएम) के कारण कवरस्लिप के बहुत करीब के अणु ही उत्तेजित हो जाते हैं। (सी) काइमोग्राफ सूक्ष्मनलिका सतह के साथ काइन्सिन -3 मोटर चलने को प्रक्रियात्मक रूप से (विकर्ण सफेद रेखाएं) दर्शाता है। वाई-अक्ष पर समय (ऊर्ध्वाधर तीर) और एक्स-अक्ष (क्षैतिज तीर) पर दूरी। (डी-ई) वेग (डी) और रन लेंथ (ई) के हिस्टोग्राम को सूक्ष्मनलिका सतह फ्रेम-बाय-फ्रेम पर चलने वाले अलग-अलग मोटर्स को ट्रैक करके निर्धारित किया गया था और हिस्टोग्राम को मोटर्स की प्रत्येक आबादी के लिए प्लॉट किया गया था और एक गॉसियन के लिए फिट किया गया था। शिखर औसत वेग और रन लंबाई का प्रतिनिधित्व करता है और मान ग्राफ पर एसईएम के माध्य के रूप ± दिखाए गए हैं। N = गिनी गई घटनाओं की संख्या। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एसएफ 9 शुद्ध किनेसिन -3 मोटर्स का उपयोग करके इन विट्रो माइक्रोट्यूबुल्स ग्लाइडिंग परख: (ए) ग्लास स्लाइड, डबल-साइडेड टेप और ग्लास कवरस्लिप का उपयोग करके तैयार प्रवाह सेल कक्ष का योजनाबद्ध। (बी) कार्टून आरेख जो संवैधानिक रूप से सक्रिय किनेसिन -3 मोटर्स की सतह पर रोडामाइन-लेबल सूक्ष्मनलिकाएं ग्लाइडिंग को दर्शाता है। चूंकि किन्सिन -3 मोटर्स को एमसिट्रीन के साथ सी-टर्मिनल रूप से टैग किया जाता है, जीएफपी-नैनोबॉडीज का उपयोग उन्हें कांच की सतह से जोड़ने के लिए किया जाता था। इसके बाद, कतरनी रोडामाइन-लेबल सूक्ष्मनलिकाएं प्रवाह कक्ष में पेश की गईं और सूक्ष्मनलिकाएं ग्लाइडिंग आंदोलन की छवियों को टीआईआरएफ रोशनी के तहत कैप्चर किया गया। (सी) किमोग्राफ काइन्सिन -3 मोटर्स द्वारा चिकनी सूक्ष्मनलिका ग्लाइडिंग (विकर्ण सफेद पट्टी) का प्रतिनिधित्व करता है। वाई-अक्ष पर समय (ऊर्ध्वाधर तीर) और एक्स-अक्ष (क्षैतिज तीर) पर दूरी। डी। वेग के हिस्टोग्राम को सूक्ष्मनलिकाएं की आबादी के लिए प्लॉट किया गया था और एक गॉसियन चोटी पर फिट किया गया था। औसत ग्लाइडिंग वेग को ऊपरी-बाएं कोने पर एसईएम ± माध्य के रूप में दर्शाया गया है। N = गिने गए अणुओं की संख्या। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: पॉलिमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल्स। गतिशीलता परख के लिए पतला करने से पहले पॉलीमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल्स की टीआईआरएफ इमेजिंग। फिल्म को 100 एमएस एक्सपोजर पर हासिल किया गया था और वीडियो को 60 फ्रेम / सेकंड पर चलाया जाता है। स्केल बार, 10 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 2: संवैधानिक रूप से सक्रिय किन्सिन -3 मोटर के इन विट्रो एकल-अणु परख। फ्लोरोसेंटली-टैग किए गए केआईएफ 1 ए (1-393 एलजेड) मोटर्स को एसएफ 9 कोशिकाओं से शुद्ध किया जाता है जो एक गतिशीलता परख कक्ष में कवरस्लिप पर अधिशोषित सूक्ष्मनलिका सतह (बिना लेबल वाले) के साथ उत्तरोत्तर आगे बढ़ते हैं। इमेजिंग टीआईआरएफ रोशनी में किया गया था और छवियों को 100 एमएस एक्सपोजर पर प्राप्त किया गया था। वीडियो 30 फ्रेम / सेकंड पर चलाया जाता है। स्केल बार, 10 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 3: संवैधानिक रूप से सक्रिय किनेसिन -3 मोटर की सूक्ष्मनलिका ग्लाइडिंग परख। रोडामाइन-लेबल सूक्ष्मनलिकाएं आसानी से ग्लास कवरस्लिप की सतह पर ग्लाइडिंग करती हैं, जो एसएफ 9 शुद्ध केआईएफ 1 ए (1-393 एलजेड) मोटर के साथ लेपित होती हैं। इमेजिंग टीआईआरएफ रोशनी में किया गया था और छवियों को 100 एमएस एक्सपोजर पर प्राप्त किया गया था। वीडियो 60 फ्रेम / सेकंड पर चलाया जाता है। स्केल बार, 10 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: बफर और अभिकर्मकों की संरचना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एसएफ 9-बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति प्रणाली उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन उत्पादन 19,36,37 के लिए सबसे बहुमुखी और सफल तरीकों में से एक है। एसएफ 9 कोशिकाओं की पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन क्षमता स्तनधारी प्रणाली15 के लिए अत्यधिक तुलनीय है। इस प्रणाली का उपयोग करने का एक बड़ा नुकसान यह है कि यह धीमा है और संदूषण के प्रति संवेदनशील है। सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक एसएफ 9 कोशिकाओं में कुशल संक्रमण और सफल अभिव्यक्ति है, जिसके लिए किसी भी संदूषण के बिना एसएफ 9 कोशिकाओं के उचित हैंडलिंग और रखरखाव की आवश्यकता होती है। सिस्टम को समर्पित धूल मुक्त स्थान और तापमान-नियंत्रित इनक्यूबेटर और शेकर जैसे उपकरणों की आवश्यकता होती है। अनियमित सेल कल्चर अभ्यास और ओवरग्रोन कल्चर के उपयोग के परिणामस्वरूप खराब संक्रमण, धीमी वृद्धि और महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु होगी।

एसएफ 9 कोशिकाओं में व्यक्त प्रोटीन के फ्लैग टैग शुद्धिकरण के कई फायदे हैं। सबसे पहले, एसएफ 9 कोशिकाओं को अपने सक्रिय और घुलनशील रूप में अधिकांश प्रोटीन प्राप्त करने के लिए कुशलता से लाइज किया जा सकता है। दूसरे, फ्लैग राल में एचआईएस और जीएसटी राल38 की तुलना में कम गैर-विशिष्ट प्रोटीन सोखना है। नतीजतन, प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण मात्रा अपने शुद्ध रूप में एकल-चरण क्षालन में जारी की जाती है। एसएफ 9-शुद्ध किन्सिन -3 मोटर्स ने जैव रासायनिक एटीपीस परख14 में मजबूत सूक्ष्मनलिका-उत्तेजित एटीपी टर्नओवर दर दिखाई। इसी तरह, इन विट्रो एकल-अणु गतिशीलता परख में, इन मोटर्स ने सूक्ष्मनलिका की सतह पर तेज और सुपरप्रोसेसिव गतिशीलता दिखाई। दिलचस्प बात यह है कि इन गतिशीलता गुणों ने स्तनधारी सेल लाइसेट 11,12,13 से तैयार मोटर्स का उपयोग करके मापा गया गतिशीलता गुणों के साथ उल्लेखनीय समानता दिखाई। इसके अतिरिक्त, इन विट्रो एकल-अणु गतिशीलता परख में काइन्सिन -3 मोटर्स की मापा चरण दर जैव रासायनिक एटीपीस परख में मापा एटीपी हाइड्रोलिसिस की दर से निकटता से मेल खाती है, जिससे मोटर्स प्रति चरण14 में एक एटीपी अणु को हाइड्रोलाइज करते हैं। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि एसएफ 9-बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति प्रणाली से शुद्ध किन्सिन 3 मोटर्स ने सक्रिय और घुलनशील प्रोटीन की काफी बड़ी आबादी उत्पन्न की। इसलिए, हम मानते हैं कि एसएफ 9-बैकुलोवायरस प्रणाली को आवश्यक संशोधनों के साथ रुचि के मोटर प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

इन विट्रो एकल-अणु गतिशीलता परख काइन्सिन -3 मोटर्स जो सुपरप्रोसेसिव गतिशीलता प्रदर्शित करते हैं, को लंबे पॉलीमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल्स के पोलीमराइजेशन की आवश्यकता होती है। लंबे सूक्ष्मनलिकाएं के इन विट्रो पोलीमराइजेशन में एक महत्वपूर्ण कदम महत्वपूर्ण ट्यूबुलिन एकाग्रता, इनक्यूबेशन समय और उचित बफर पीएच के साथ एक पोलीमराइजेशन मिश्रण तैयार करना है। सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्यूबुलिन को अत्यधिक सक्षम, शुद्ध होना चाहिए, और ठंड और पिघलने से बचने के लिए छोटे एलिकोट में तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जाना चाहिए। ट्यूबुलिन, एक बार पिघलने के बाद, भविष्य के पोलीमराइजेशन के लिए वापस जमे हुए नहीं होना चाहिए क्योंकि ट्यूबुलिन हर फ्रीज-पिघलना चक्र में अपनी योग्यता खो देता है। अक्षम ट्यूबुलिन सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन में योगदान नहीं देगा, लेकिन पोलीमराइजेशन प्रक्रिया में बाधा डालेगा और इसके परिणामस्वरूप अज्ञात दोषों के साथ छोटे सूक्ष्मनलिकाएं होंगी। पोलीमराइजेशन मिश्रण में इष्टतम ट्यूबुलिन एकाग्रता 2.5-3 मिलीग्राम / एमएल के बीच होनी चाहिए और मिश्रण को पोलीमराइजेशन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने से पहले 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए। सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन की अवधि 20-30 मिनट के बीच होनी चाहिए और 30 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए, क्योंकि लंबे समय तक पोलीमराइजेशन के परिणामस्वरूप अक्सर छोटे और खंडित सूक्ष्मनलिकाएं बनती हैं।

इसके बाद, बहुलक सूक्ष्मनलिकाएं का स्थिरीकरण एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम है। टैक्सोल पानी में खराब घुलनशील है और एक जलीय घोल39 में अवक्षेपित होता है। इसलिए, स्थिरीकरण बफर को 10 μM taxol के साथ ताजा तैयार करें, बहुलकीकृत सूक्ष्मनलिकाएं मिश्रण पर धीरे से जोड़ें, और परेशान किए बिना आगे से सेने। स्थिरीकरण बफर तैयार करने के लिए हमेशा -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से जमे हुए टैक्सोल एलिकोट का उपयोग करें, क्योंकि पिघले हुए एलिकोट के परिणामस्वरूप बहुलकीकृत सूक्ष्मनलिकाएं वर्षा / एकत्रीकरण होता है। टूटने से बचने के लिए हमेशा बेवेल्ड युक्तियों का उपयोग करके बहुलक सूक्ष्मनलिकाएं संभालें। इस विधि का उपयोग करके पॉलीमराइज्ड सूक्ष्मनलिकाएं सुपरप्रोसेसिव गतिशीलता विश्लेषण के लिए उपयुक्त 60-70 μm लंबे माइक्रोट्यूबुल्स उत्पन्न करती हैं। अगला महत्वपूर्ण कदम गतिशीलता कक्ष में कवरस्लिप सतह पर सूक्ष्मनलिकाएं का स्थिर सोखना है। इसे प्राप्त करने के लिए, कवरलिप्स को सूखी जगह में संग्रहीत किया जाना चाहिए क्योंकि आर्द्र वातावरण में कवरलिप्स के संपर्क में आने से सूक्ष्मनलिका सोखना दक्षता और उनकी स्थिरता में काफी कमी आती है।

विशेष सांद्रता और इष्टतम मोटर प्रोटीन एकाग्रता पर उचित अवयवों के साथ एक गतिशीलता परख मिश्रण तैयार करना सूक्ष्मनलिका सतह के साथ मजबूत गतिशीलता घटनाओं को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। चिकनी और प्रक्रियात्मक गतिशीलता उत्पन्न करने में सबसे महत्वपूर्ण घटक परख मिश्रण में एक स्थिर एटीपी समाधान का उपयोग कर रहा है। (इस प्रकार, एटीपी स्टॉक तैयार करते समय सावधानी बरतनी चाहिए। एटीपी के सोडियम नमक को 10 एमएम पाइप बफर पीएच 6.9 में घोलने से बहुत कम पीएच के साथ एक स्पष्ट समाधान मिलता है। एटीपी कम पीएच पर बेहद अस्थिर है और तेजी से एडीपी और फॉस्फेट में हाइड्रोलाइज करता है, इस प्रकार समाधान को ठंडा रखता है और केंद्रित कोएच का उपयोग करके पीएच को तुरंत 7.0 तक समायोजित करना हाइड्रोलिसिस को रोकता है। गतिशीलता मिश्रण को प्रवाह सेल में प्रवाहित करें और टीआईआरएफ रोशनी के तहत इमेजिंग करते समय तरल प्रवाह और कक्ष के सूखने को रोकने के लिए तरल पैराफिन के साथ दोनों किनारों को सील करें।

चूंकि किन्सिन -3 मोटर्स सूक्ष्मनलिका पटरियों के साथ तेज और सुपरप्रोसेसिव हैं, इसलिए उनकी इमेजिंग, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण कई चुनौतियां पैदा करते हैं। मोटर के अपने प्रक्रियात्मक रन को पूरा करने से पहले फ्लोरोसेंट प्रोटीन के फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए कम लेजर तीव्रता के तहत एकल-अणु इमेजिंग और डेटा अधिग्रहण किया जाना चाहिए। अधिग्रहित डेटा खराब सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ कम तीव्रता का होगा। नतीजतन, उनकी गतिशीलता घटनाओं को चिह्नित करने के लिए मौजूदा स्वचालित ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इन व्यक्तिगत गतिशीलता घटनाओं को ट्रैक करना मुश्किल होगा। इसलिए, न्यूनतम त्रुटियों के साथ माइक्रोट्यूबुल्स ट्रैक फ्रेम-बाय-फ्रेम के साथ चलने वाले फ्लोरोसेंटली टैग किए गए मोटर स्पॉट को सटीक रूप से ट्रैक करके डेटा विश्लेषण मैन्युअल रूप से किया जाना चाहिए। डेटा विश्लेषण के लिए, अधिमानतः, लंबे सूक्ष्मनलिका पटरियों पर गतिशीलता घटनाओं का चयन करें ताकि मोटर्स को उनके रन को पूरा करने से पहले सूक्ष्मनलिकाएं अंत तक पहुंचने से बचा जा सके। सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए, कम से कम, अंतिम 10 फ्रेम (500 एमएस) को ट्रैक करने के लिए केवल उन गतिशीलता घटनाओं पर विचार करें, जिसमें प्रक्रियात्मक रन की स्पष्ट शुरुआत और अंत हो।

कुल मिलाकर, विधि मौजूदा विधि पर कई फायदे प्रदान करती है, जैसे कि सक्रिय मोटर प्रोटीन का सरल और एक-चरण शुद्धिकरण, लंबे सूक्ष्मनलिकाएं तैयार करना, और अच्छी गतिशीलता प्राप्त करने के निर्देशों के साथ विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल। सिद्धांत रूप में, विधि को किसी भी वर्ग और प्रकार के प्रोटीन को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें मायोसिन, काइन्सिन और डायनिन शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। दरअसल, कई वायरल टीकों, जीन थेरेपी वैक्टर और अन्य दवा प्रोटीन20 को शुद्ध करने के लिए बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति प्रणाली को सफलतापूर्वक स्थापित किया गया है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

वी.एस. और पी.एस. ने प्रोफेसर क्रिस्टन जे. वेरहे (मिशिगन विश्वविद्यालय, एन आर्बर, एमआई, यूएसए) और प्रोफेसर रूप मलिक (भारतीय प्रौद्योगिकी संस्थान बॉम्बे (आईआईटीबी), मुंबई, भारत) को पूरे अध्ययन में उनके बिना शर्त समर्थन के लिए धन्यवाद दिया। पी.एस. ने डॉ. शिवप्रिया किरुबाकरन को परियोजना के दौरान उनके समर्थन के लिए धन्यवाद दिया। वी.एस. डीबीटी (अनुदान संख्या: बीटी/पीआर15214/बीआरबी/10/1449/2015 और बीटी/आरएलएफ/री-एंट्री/45/2015) और डीएसटी-एसईआरबी (अनुदान संख्या: ईसीआर/2016/000913) के माध्यम से वित्त पोषण स्वीकार करता है। पीकेएन वित्त पोषण के लिए आईसीएमआर को स्वीकार करता है (अनुदान संख्या 5/13/13/2019/एनसीडी-III)। पीएस डीएसटी से वित्त पोषण स्वीकार करता है (अनुदान संख्या: एसआर / डब्ल्यूओएस-ए / एलएस -73/2017)। डीजेएस ने आईआईटी गांधीनगर से फैलोशिप स्वीकार की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinity Biolegend 651502 For protein purification
Aprotinin Sigma A6279 For protein purification
Cellfectin Invitrogen 10362100 For Sf9 transfection
DTT Sigma D5545 For motility assays and protein purification
FLAG peptide Sigma F3290 For protein purification
Glycerol Sigma G5516 To freeze the protein
HEPES Sigma H3375 For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630 Sigma I8896 For Sf9 lysis buffer
KCl Sigma P9541 For buffers preparation
Leupeptin Sigma L2884 For protein purification
MgCl2 Sigma M2670 For buffers preparation
NaCl Sigma S7653 For preparing lysis buffer
PMSF Sigma P7626 For protein purification
Sf9 cells Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottles Thermo Scientific 4115-0125 For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X) Thermo Scientific 10902-096 -500ml For culturing Sf9 cells
Sucrose Sigma S1888 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s media Thermo Scientific 11595030 -500ml For Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATP Sigma A2647 For motility and gliding assay
BSA Sigma A2153 For blocking motility chamber
Catalase Sigma C9322 For motility and gliding assay
DMSO Sigma D5879 For dissolving Rhodamine
EGTA Sigma 3777 For preparing buffers
Glucose Sigma G7021 For motility and gliding assay
Glucose oxidase Sigma G2133 For motility and gliding assay
GTP Sigma G8877 For microtubule polymerization
KOH Sigma P1767 Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPES Sigma P6757 For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needle Dispovan For shearing microtubules
Casein Sigma C3400 For microtubule glidning assay
GFP nanobodies Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) For attaching motors to the coverslip
Rhodamine Thermo Scientific 46406 For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tips Eppendorf For Sf9 culture and purification
15ml concal tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
35mm cell culture dish Cole Palmer 15179-39 For Sf9 culture
Balance Sartorious 0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubator REMI For Sf9 suspenculture at 28oC
Camera EMCCD Andor iXon Ultra 897 For TIRF imaging and acquesition
Double sided tape Scotch For making motility chamber
Glass coverslip Fisherfinest 12-548-5A size; 22X30
Glass slide Blue Star For making motility chamber
Heating block Neuation Dissolving paraffin wax
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti- U To check protein expression
Lasers 488nm (100mW) For TIRF imaging
Liquid nitrogen For sample freezing and storage
Microcapillary loading tip Eppendorf EP022491920 For shearing microtubules
Microscope Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up For TIRF imaging
Mini spin Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd For quick spin
Objective 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion For TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XE Beckman Coulter For protein purification
Parafilm Eppendorf
pH-meter Corning Coring 430 To adjust pH
Pipette-boy VWR For Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21 Thermo Scientific For protein purification
Sorvall ST8R centrifuge Thermo Scientific Protein purification
ThermoMixer Eppendorf For microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotor Beckman coulter SW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixer Neuation Sample mixing
Wax Sigma V001228 To seal motility chamber

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References

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जैव रसायन अंक 185
एसएफ 9 शुद्ध सुपरप्रोसेसिव किन्सिन -3 फैमिली मोटर्स का एकल-अणु विश्लेषण
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Soppina, P., Shewale, D. J., Naik,… More

Soppina, P., Shewale, D. J., Naik, P. K., Soppina, V. Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors. J. Vis. Exp. (185), e63837, doi:10.3791/63837 (2022).

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