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Biology

फील्ड-एकत्रित मच्छरों से मच्छर से जुड़े वायरस अलगाव

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/63852
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2
1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के व्यापक उपयोग के कारण मच्छरों में कई नया वायरस जैसे अनुक्रम पाए गए हैं। हम कशेरुक और मच्छर सेल लाइनों का उपयोग करके वायरस को अलग करने और बढ़ाने के लिए एक प्रभावी प्रक्रिया प्रदान करते हैं, जो मच्छर जनित और मच्छर-विशिष्ट वायरस सहित मच्छर से जुड़े वायरस पर भविष्य के अध्ययन के आधार के रूप में काम कर सकता है।

Abstract

अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के व्यापक अनुप्रयोग के साथ, मच्छरों सहित आर्थ्रोपोड में कई नया वायरस जैसे अनुक्रमों की खोज की गई है। इन नए मच्छर से जुड़े वायरस की दो मुख्य श्रेणियां "मच्छर-जनित वायरस (एमबीवी)" और "मच्छर-विशिष्ट वायरस (एमएसवी)" हैं। ये नए वायरस कशेरुक और मच्छरों दोनों के लिए रोगजनक हो सकते हैं, या वे मच्छरों के साथ सहजीवी हो सकते हैं। इन वायरस के जैविक पात्रों की पुष्टि करने के लिए इकाई वायरस आवश्यक हैं। इस प्रकार, क्षेत्र-एकत्रित मच्छरों से वायरस अलगाव और प्रवर्धन के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। सबसे पहले, मच्छर के नमूने मच्छर होमोजेनेट्स के सुपरनैटेंट के रूप में तैयार किए गए थे। दो बार सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुपरनैटेंट को वायरस प्रवर्धन के लिए या तो मच्छर सेल लाइन सी 6/36 या कशेरुक सेल लाइन बीएचके -21 में टीका लगाया गया था। 7 दिनों के बाद, सतह पर तैरने वालों को पी 1 सुपरनैटेंट के रूप में एकत्र किया गया और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। इसके बाद, पी 1 सुपरनैटेंट को सी 6/36 या बीएचके -21 कोशिकाओं में दो बार पारित किया गया था, जबकि सेल की स्थिति की दैनिक जांच की जा रही थी। जब कोशिकाओं पर साइटोपैथोजेनिक प्रभाव (सीपीई) की खोज की गई, तो इन सुपरनैटेंट को एकत्र किया गया और वायरस की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया। यह प्रोटोकॉल मच्छर से जुड़े वायरस पर भविष्य के शोध के लिए नींव के रूप में कार्य करता है, जिसमें एमबीवी और एमएसवी शामिल हैं।

Introduction

मच्छर महत्वपूर्ण रोगजनक आर्थ्रोपोड वैक्टर का एक समूह है। क्यूलिसाइड 1,2 परिवार में मच्छरों की लगभग 3,500 प्रजातियां हैं। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के विकासने दुनिया के विभिन्न हिस्सों से मच्छरों में कई नए, वायरस जैसे अनुक्रमों की खोज की है। आम तौर पर, इन मच्छर से जुड़े वायरस को दो मुख्य समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है: एमबीवी और एमएसवी।

एमबीवी विविध वायरस का एक समूह है जो कई मानव या पशु बीमारियों के प्रेरक एजेंट हैं, जैसे कि पीला बुखार वायरस (वाईएफवी), डेंगू वायरस (डीईएनवी), जापानी एन्सेफलाइटिस वायरस (जेईवी), वेस्ट नाइल वायरस (डब्ल्यूएनवी), और रिफ्ट वैली फीवर वायरस (आरवीएफवी)4। उन्होंने दुनिया भर में मनुष्यों और जानवरों दोनों में गंभीर रुग्णता और मृत्यु दर पैदा करके सार्वजनिक स्वास्थ्य को गंभीर रूप से खतरे में डाल दिया है। एमबीवी स्वाभाविक रूप से एक संक्रमित मच्छर से एक भोले मेजबान के साथ-साथ वायरस से संक्रमित मेजबान और एक खिलाने वाले मच्छर 5 तक संचरण के माध्यम से विभिन्न मेजबानों के बीच एक जीवन चक्र बनाए रखतेहैं। इसलिए, ये वायरस प्रयोगशाला1 में मच्छर सेल लाइनों और कशेरुक सेल लाइनों दोनों को संक्रमित कर सकते हैं।

एमएसवी, जिसमें यिचांग वायरस (वाईसीएन), क्यूलेक्स फ्लेविवायरस (सीएक्सएफवी), और चाओयांग वायरस (चाओवी) शामिल हैं, कीट-विशिष्ट वायरस 1,6,7 का एक उपसमूह हैं। हाल के वर्षों में, नए एमएसवी की खोज में वृद्धि हुई है, और इनमें से कुछ एमएसवी को एमबीवी के संचरण पर प्रभाव पाया गया है। उदाहरण के लिए, सीएक्सएफवी, जो क्यूलेक्स पिपियन्स में लगातार संक्रमण हो सकता है, प्रारंभिक चरण8 में डब्ल्यूएनवी प्रतिकृति को दबा सकता है। एक अन्य कीट-विशिष्ट फ्लेविवायरस, सेल-फ्यूजिंग एजेंट वायरस (सीएफएवी), एडीज एजिप्टी मच्छरों में डीईएनवी और जीका वायरस (जेडआईकेवी) के प्रसार को रोकने के लिए पाया गयाहै। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल मच्छर से जुड़े वायरस को अलग करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है और मच्छरों से संबंधित रोगजनकों के वितरण और मच्छर जनित बीमारियों के नियंत्रण में आगे के शोध में मदद कर सकता है।

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Protocol

1. मच्छर ों का नमूना लेना और छंटाई

  1. खेत में एमएक्सए -02 या कार्बन डाइऑक्साइड मच्छर जाल के प्रकाश जाल के माध्यम से वयस्क मच्छरों को फंसाएं।
  2. तरल नाइट्रोजन10,11 में डुबोकर एकत्रित मच्छरों को मार दें। उन्हें कोल्ड-चेन लॉजिस्टिक्स सिस्टम12 द्वारा प्रयोगशाला में ले जाएं।
    नोट: सूखी बर्फ का उपयोग मुख्य रूप से कोल्ड-चेन लॉजिस्टिक्स सिस्टम में किया गया था।
  3. (वैकल्पिक) यदि नमूना स्थल प्रयोगशाला के पास थे, तो सीधे जाल जाल में जीवित मच्छरों को प्रयोगशाला में भेजें और 30 मिनट4 के लिए ≤-20 डिग्री सेल्सियस पर ठंड लगाकर उन्हें इच्छामृत्यु दें।
  4. मच्छरों के वर्गीकरण और पहचान के लिए टूल बुक13 के माध्यम से एकत्र किए गए मच्छरों की रूपात्मक पहचान करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो डीएनए बारकोडिंग का उपयोग मच्छरों को वर्गीकृत करने और पहचाननेके लिए किया जा सकता है।
  5. नमूना तिथियों और साइटों के आधार पर, उन्हें विभिन्न पूलों में असाइन करें, और फिर उन्हें 2-5 एमएल ट्यूबों में स्टोर करें।
  6. मच्छर की प्रजातियों, संख्या, नमूना कोड, तिथि और साइटों के साथ प्रत्येक ट्यूब को रिकॉर्ड करने के लिए एक तालिका बनाएं।
  7. नमूना कोड के साथ लेबल प्रिंट करें और उन्हें ट्यूबों से संलग्न करें।
  8. आगे के विश्लेषण तक मच्छर के नमूनों के साथ ट्यूब ों को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

2. मच्छर पीसना

  1. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) माध्यम के 1.5 मिलीलीटर के साथ 3 मिमी सिरेमिक मोतियों के साथ प्रत्येक 2 एमएल बाँझ ट्यूब में 20-50 मच्छरों को 2% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-एम्फोटेरिसिन बी समाधान युक्त रखें।
    नोट: ट्यूब ों को बर्फ या एक अच्छी ट्रे पर रखें।
  2. मच्छरों को कम तापमान वाले ऊतक होमोजिनाइज़र के साथ तीन चक्रों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 70 हर्ट्ज पर 30 सेकंड के लिए पीसकर होमोजिनाइज़रकरें।
  3. मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को नए ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  4. मच्छर के मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,000 × ग्राम पर फिर से सतह पर तैरने वालों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो सतह पर तैरने वाले को 0.22 μm फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया जा सकता है।
  5. सुपरनैटेंट (पी 0) को 2 एमएल स्क्रू कैप स्टोरेज ट्यूब (200 μL प्रति ट्यूब) में एलिकोट करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. कोशिकाओं और सेल संस्कृति रखरखाव माध्यम की तैयारी

नोट: मच्छर सेल लाइन सी 6/36 (एडीज एल्बोपिक्टस आरएनएआई-कमी) और कशेरुक सेल लाइन बीएचके -21 (बेबी हैम्स्टर किडनी) का उपयोग वायरस प्रवर्धन और अलगाव के लिए किया गया था।

  1. 1 × 106 सी6/36 कोशिकाओं को 75 सेमी 2 फ्लास्क में 10 मिलीलीटर आरपीएमआई माध्यम के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में टीका लगाएं।
  2. 1 ×10 6 बीएचके-21 कोशिकाओं को 75 सेमी 2 फ्लास्क में 10 मिलीलीटर डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के साथ 10% एफबीएस और 5% सीओ2 ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1% पी / एस के साथ पूरक करें।
    नोट: कोशिकाओं को प्रति सप्ताह दो या तीन बार पारित किया गया था17,18.
  3. कोशिकाओं को 75 सेमी2 फ्लास्क (सी 6/36 या बीएचके -21 कोशिकाओं) में 24-वेल प्लेटों (सी 6/36 प्रति कुएं: 1.4 × 105) में संवर्धित करें; बीएचके -21 प्रति कुआं: 0.8 × 105)।
  4. 24-वेल प्लेटों को 28 डिग्री सेल्सियस या 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें।
  5. माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें और पुष्टि करें कि प्रत्येक कुएं में सेल कंफ्लुएंसी 80% -90% है या नहीं।
  6. सेल संस्कृति रखरखाव माध्यम (500 एमएल) तैयार करें।
    नोट: सी 6/36 के लिए, माध्यम आरपीएमआई माध्यम था जो 2% एफबीएस और 2% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-एम्फोटेरिसिन बी समाधान के साथ पूरक था। बीएचके -21 के लिए, माध्यम डीएमईएम माध्यम था जो 2% एफबीएस और 2% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-एम्फोटेरिसिन बी समाधान के साथ पूरक था।

4. वायरस अलगाव

नोट: सभी कदम एक जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) प्रयोगशाला में किए गए थे। जैव सुरक्षा प्रयोगशाला की सुरक्षा स्तर की आवश्यकता विभिन्न देशों और क्षेत्रों के नियमों के आधार पर जैव सुरक्षा जोखिम मूल्यांकन द्वारा निर्धारित की गई थी। प्रक्रिया को जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए।

  1. 24-वेल प्लेटों से सेल कल्चर माध्यम को हटा दें और प्रत्येक कुएं में सेल कल्चर रखरखाव माध्यम के 100 μL और मच्छर होमोजेनेट (P0) के सुपरनैटेंट के 100 μL जोड़ें।
  2. 60 मिनट के लिए प्लेटों को 28 डिग्री सेल्सियस या 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और सेल सूखने से रोकने के लिए हर 15 मिनट में उन्हें धीरे से हिलाएं।
  3. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और मलबे को पूरी तरह से हटाने के लिए 600 μL सेल कल्चर रखरखाव माध्यम के साथ प्रत्येक को धीरे से अच्छी तरह से कुल्ला करें।
  4. प्रत्येक कुएं में 800 μL सेल कल्चर रखरखाव माध्यम जोड़ें और प्लेटों को 7 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस या 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में रखें।
  5. दैनिकमाइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक कुएं की कोशिका स्थिति की निगरानी करें।
  6. 7वें दिन कोशिकाओं (पी 1 सुपरनैटेंट) के सुपरनैटेंट एकत्र करें और सतह पर तैरनेवालों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. P2 और P3 सुपरनैटेंट प्राप्त करने के लिए चरण 4.1-4.6 2x दोहराएं।
    नोट: चरण 4.3 में, प्रत्येक को 600 μL सेल कल्चर रखरखाव माध्यम के साथ धीरे से धोना P2 और P3 के लिए वैकल्पिक था।
  8. इस बात पर निर्भर करता है कि साइटोपैथोजेनिक प्रभाव (सीपीई) कितनी अच्छी तरह से दिखाता है - कोशिकाएं मर जाती हैं, पाइकनोसिस, और सतह से अलग हो जाती हैं; सिंकिटिया बनाने के लिए आसन्न कोशिकाओं के साथ संलयन; या परमाणु या साइटोप्लाज्मिक समावेशनिकायों की उपस्थिति - वायरस को बढ़ाने के लिए कोशिकाओं वाली नई 6-वेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं में इस सीपीई के सतह पर तैरनेवाला के 300-400 μL अच्छी तरह से जोड़ें (सेल कंफ्लुएंसी 80% -90% थी)।
  9. सुपरनैटेंट इकट्ठा करें और उन्हें 2 एमएल स्क्रू कैप स्टोरेज ट्यूब (500 μL प्रति ट्यूब) में एलिकोट करें। उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: कोशिकाओं में लगातार पासिंग की तीन पीढ़ियों के बाद, सीपीई को प्रेरित नहीं करने वाले नमूनों को छोड़ दिया गया था। यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं में क्रमिक पासिंग की पीढ़ियों को बढ़ाया जा सकता है।

5. आरटी-पीसीआर द्वारा वायरल अनुक्रमों का पता लगाना

  1. वायरल आरएनए मिनी किट16 का उपयोग करके वायरल सुपरनैटेंट के 200 μL से कुल आरएनए निकालें।
    नोट: यहां, उपकरण निर्माता के निर्देशों के बाद कुल आरएनए निकालने के लिए एक स्वचालित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रणाली का उपयोग किया गया था।
  2. पीसीआर उपकरण का उपयोग करके आरटी-पीसीआर किट निर्देशों का पालन करते हुए आरएनए को सीडीएनए में परिवर्तित करें।
    1. पीसीआर ट्यूब में यादृच्छिक प्राइमरों के 1 μL के साथ मिश्रित आरएनए के 15 μL जोड़ें। ट्यूब को 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर रखें और फिर इसे 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
    2. ट्यूब में 5 μL 5x बफर और 25 μL मिश्रण (10 mM dNTP, 40 U/μL RNase अवरोधक, और 200 U/μL M-MLV) जोड़ें और ट्यूब को 60 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    3. ट्यूब को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. पीसीआर द्वारा वायरस का पता लगाने के लिए पीसीआर किट और सार्वभौमिक प्राइमर (तालिका 1) का उपयोग करें।
    1. अर्बोवायरस के लिए, निम्नलिखित घटकों के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली (कुल 30 μL) सेट करें: 10x Taq बफर का 3 μL, dNTP का 3 μL (1mM), फॉरवर्ड प्राइमर का 1 μL (10 μm), रिवर्स प्राइमर का 1 μL (10 μm), 0.3 μL Taq (10 U / μL), 19.7 μL का ddH2O, और 2 μL
    2. फ्लेविवायरस का पता लगाने के लिए, प्रतिक्रिया प्रक्रिया को इस प्रकार सेट करें: चरण 1: 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 30 सेकंड के लिए 52 डिग्री सेल्सियस और 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; चरण 2: 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
    3. अल्फावायरस का पता लगाने के लिए, प्रतिक्रिया प्रक्रिया को इस प्रकार सेट करें: चरण 1: 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 30 एस के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, और 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; चरण 2: 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
    4. बुनियावायरस का पता लगाने के लिए, प्रतिक्रिया प्रक्रिया को इस प्रकार सेट करें: चरण 1: 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 30 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, और 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; चरण 2: 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
  4. 1% एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों का पता लगाएं और उन्हें अनुक्रमण विश्लेषण के लिए भेजें।
    नोट: यदि स्थितियां अनुमति देती हैं, तो सतह पर तैरने वालों को अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विश्लेषण से गुजरना पड़ सकता है ताकि नए वायरस की पहचान की जा सके और पूरे वायरल जीनोम को प्राप्त किया जा सके।

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Representative Results

मच्छर होमोजेनेट्स (पी 0) के सुपरनैटेंट के साथ टीकाकरण के बाद, सी 6/36 कोशिकाओं ने एक विस्तृत अंतरकोशिकीय स्थान का प्रदर्शन किया, और एक्सफोलिएटेड कोशिकाओं को एक ही समय में बिना टीकाकरण वाली कोशिकाओं (नियंत्रण) की तुलना में 120 घंटे (चित्रा 1 ए) पर देखा गया (चित्रा 1 बी)। पी 3 सुपरनैटेंट के साथ बीएचके -21 कोशिकाओं को इंजेक्ट करने के बाद, नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 1 डी) के विपरीत 48 घंटे (चित्रा 1 सी) पर बीएचके -21 कोशिकाओं में दृश्यमान सीपीई देखा गया था। वायरल प्रजातियों को निर्धारित करने के लिए पीसीआर किया गया था। फ्लेविवायरस, अल्फावायरस और बुनियावायरस का पता लगाने के लिए सार्वभौमिक प्राइमरों को व्यावसायिक रूप से संश्लेषित किया गया था (तालिका 1)। बुनियावायरस एबिनुर लेक वायरस के लिए एक पीसीआर उत्पाद को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेट किया गया था और लेन 1 में जोड़ा गया था। वायरल सुपरनैटेंट के लिए पीसीआर उत्पादों को उत्पन्न करने के लिए बुनियावायरस, फ्लेविवायरस और अल्फावायरस के लिए सार्वभौमिक प्राइमरों का उपयोग किया गया था, जिन्हें बाद में क्रमशः लेन 2, 3 और 4 में जोड़ा गया था। फ्लेविवायरस, अल्फावायरस और बनयावायरस के लिए पीसीआर उत्पादों का अनुमानित आकार क्रमशः 266 बीपी, 434 बीपी और 251 बीपी था। बैंड केवल लेन 2 और सकारात्मक नियंत्रण लेन 1 में दिखाई दे रहे थे। नतीजतन, सुपरनैटेंट में वायरस एक बुनियावायरस होने की संभावना है (चित्रा 2)।

Figure 1
चित्रा 1: वायरल सुपरनैटेंट के साथ इनक्यूबेशन के बाद कोशिकाओं का सीपीई अवलोकन। संक्रमण के बाद 120 घंटे में सी 6/36 कोशिकाओं की स्थिति (सीपीई) (ए) और एक ही समय में नियंत्रण कोशिकाओं की स्थिति (बी)। 48 एचपीआई (सी) पर बीएचके -21 कोशिकाओं की स्थिति और नियंत्रण कोशिकाओं (डी) की स्थिति। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: सीपीई = साइटोपैथोजेनिक प्रभाव; एचपीआई = संक्रमण के बाद के घंटे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वायरल सुपरनैटेंट के लिए पीसीआर परिणाम। लेन 1 बुनियावायरस (एबिनुर झील वायरस) के सकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है। लेन 2-4 ने बुनियावायरस (251 बीपी), फ्लेविवायरस (266 बीपी), और अल्फावायरस (434 बीपी) के लिए सार्वभौमिक प्राइमरों का उपयोग करके सुपरनैटेंट के पीसीआर परिणामों का प्रतिनिधित्व किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वायरस प्रवेशिका ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (5'→3') पीसीआर उत्पाद (बीपी) का आकार
फ्लेविवायरस F1 TACACATGGGGGAAGAGA 266
F2 GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC
अल्फावायरस M2w YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW 434
cMw3 ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC
बुनियावायरस BCS82C ATGACTGAGTTGGGGTTTTCATGATGTCGC 251
BCS332V TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT

तालिका 1: अर्बोवायरस का पता लगाने के लिए सार्वभौमिक प्राइमर।

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Discussion

इस विधि का उद्देश्य विभिन्न सेल लाइनों का उपयोग करके मच्छर से जुड़े वायरस को अलग करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका प्रदान करना था। बैक्टीरिया या कवक द्वारा संदूषण से बचने के लिए मच्छर होमोजेनेट्स के सुपरनैटेंट में एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-एम्फोटेरिसिन) जोड़ना महत्वपूर्ण है। क्षेत्र में प्राप्त मच्छरों और वायरल सुपरनैटेंट को बार-बार फ्रीज-पिघलने चक्र से बचने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर प्रशीतित किया जाना चाहिए।

प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम पीसना था। मच्छर के नमूनों को अच्छी तरह से पाउडर किया जाना चाहिए और बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। अपर्याप्त रूप से ग्राउंड मच्छर ऊतक कोशिका मृत्यु को प्रेरित कर सकते हैं और सीपीई विश्लेषण के निष्कर्षों को कम कर सकते हैं। वायरस अलगाव से पहले, पीसने के मापदंडों की पुष्टि करने के लिए सामान्य मच्छरों को नियोजित करना आवश्यक है। प्रक्रिया के दौरान वायरस को निष्क्रिय होने से रोकने के लिए कम तापमान पर पीसना चाहिए।

यह दृष्टिकोण मच्छर से जुड़े वायरस को प्रभावी ढंग से अलग और बढ़ा सकता है, लेकिन केवल वायरस के लिए स्वीकार्य है जो स्तनधारी या कीट सेल लाइनों में सीपीई प्रदर्शित कर सकते हैं। यह दृष्टिकोण उन वायरस के लिए अनुचित है जो सीपीई को प्रेरित नहीं करते हैं। प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम वायरल उम्मीदवारों को प्राप्त कर सकते हैं जिनमें केवल एक वायरस प्रकार या विभिन्न वायरस के साथ मिश्रण होता है। शुद्ध वायरस प्राप्त करने के लिए आगे की जांच - वायरल शुद्धिकरण, रूपात्मक पहचान और पट्टिका विश्लेषण - अभी भी आवश्यक है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को वुहान विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना (2018201261638501) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm membrane filter Millipore SLGP033RB Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.
24-well plates CORNING 3524 Containers for cell
75 cm2 flasks CORNING 430641 Containers for cell
a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi
Automated nucleic acid extraction system NanoMagBio S-48
BHK-21 cells National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
C6/36 cells National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Centrifugal machine Himac CF16RN Instrument for centrifugation of mosquito samples
CO2
Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) Gibco C11995500BT medium for vertebrate cell lines
Ebinur Lake virus Cu20-XJ isolation
Feta Bovine Serum (FBS) Gibco 10099141C

Provide nutrition for cells
high-speed low-temperature tissue homogenizer servicebio KZ-III-F Instrument for grinding
incubator (28 °C) Panasonic MCO-18AC Instrument for cell culture
incubator (37 °C) Panasonic MCO-18AC Instrument for cell culture
PCR tube
penicillin-streptomycin Gibco 15410-122 Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution Gibco 15240096
Refrigerator (-80 °C) sanyo MDF-U54V
Roswell Park Memorial Institute  medium (RPMI) Gibco C11875500BT medium for mosiquto cell lines
Screw cap storage tubes (2 mL) biofil  FCT010005
sterile pestles Tiangen OSE-Y004 Consumables  for grinding
TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder Tiangen OSE-Y30 Instrument for grinding
The dissecting microscope ZEISS stemi508
the light traps MXA-02 Maxttrac
The mosquito absorbing machine Ningbo Bangning
The pipette tips Axygen TF
The QIAamp viral RNA mini kit QIAGEN 52906
Tweezers Dumont 0203-5-PO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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