Summary
Många nya virusliknande sekvenser har hittats i myggor på grund av den omfattande användningen av sekvenseringsteknik. Vi tillhandahåller ett effektivt förfarande för att isolera och förstärka virus med hjälp av ryggradsdjur och myggcellinjer, vilket kan tjäna som grund för framtida studier på myggassocierade virus, inklusive myggburna och myggspecifika virus.
Abstract
Med den breda tillämpningen av sekvenseringsteknik har många nya virusliknande sekvenser upptäckts hos leddjur, inklusive myggor. De två huvudkategorierna av dessa nya myggassocierade virus är "myggburna virus (MBV)" och "myggspecifika virus (MSV)". Dessa nya virus kan vara patogena för både ryggradsdjur och myggor, eller de kan bara vara symbiotiska med myggor. Enhetsvirus är viktiga för att bekräfta de biologiska egenskaperna hos dessa virus. Således har ett detaljerat protokoll beskrivits här för virusisolering och förstärkning från fältinsamlade myggor. Först framställdes myggproverna som supernatanter av mygghomogenat. Efter centrifugering två gånger inokulerades supernatanterna sedan i antingen myggcellinjen C6/36 eller ryggradsdjurcellinjen BHK-21 för virusamplifiering. Efter 7 dagar samlades supernatanterna in som P1-supernatanter och förvarades vid -80 °C. Därefter passerades P1-supernatanter två gånger till i C6/36- eller BHK-21-celler medan cellstatusen kontrollerades dagligen. När cytopatogen effekt (CPE) på cellerna upptäcktes samlades dessa supernatanter in och användes för att identifiera virus. Detta protokoll fungerar som grund för framtida forskning om myggassocierade virus, inklusive MBV och MSV.
Introduction
Myggor är en grupp viktiga patogena leddjursvektorer. Det finns cirka 3 500 myggarter i familjen Culicidae 1,2. Utvecklingen av sekvenseringsteknik med hög genomströmning har lett till upptäckten av många nya, virusliknande sekvenser i myggor från olika delar av världen3. I allmänhet kan dessa myggassocierade virus klassificeras i två huvudgrupper: MBV och MSV.
MBV är en grupp olika virus som är orsakande medel för många sjukdomar hos människor eller djur, såsom gula febervirus (YFV), denguevirus (DENV), japanskt encefalitvirus (JEV), West Nile-virus (WNV) och Rift Valley febervirus (RVFV)4. De har allvarligt hotat folkhälsan genom att orsaka allvarlig sjuklighet och dödlighet hos både människor och djur över hela världen. MBV upprätthåller naturligt en livscykel mellan olika värdar genom överföring från en infekterad mygga till en naiv värd, liksom från en virusinfekterad värd och till en matande mygga5. Därför kan dessa virus infektera både myggcellinjer och ryggradsdjurcellinjer i labb1.
MSV, som inkluderar Yichang-virus (YCN), Culex flavivirus (CxFV) och Chaoyang-virus (CHAOV), är en undergrupp av insektsspecifika virus 1,6,7. Under de senaste åren har upptäckten av nya MSV ökat, och några av dessa MSV har visat sig ha en inverkan på överföringen av MBV. Till exempel kan CxFV, som kan vara en ihållande infektion i Culex pipiens, undertrycka WNV-replikering i ett tidigt skede8. Ett annat insektsspecifikt flavivirus, cellfusionsmedelvirus (CFAV), har visat sig hämma spridningen av DENV- och Zika-virus (ZIKV) i Aedes aegypti-myggor 9. Således är detta protokoll ett användbart tillvägagångssätt för att isolera myggassocierade virus och kan hjälpa till i ytterligare forskning om fördelningen av patogener relaterade till myggor och kontroll av myggburna sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provtagning och sortering av myggor
- Fånga de vuxna myggorna genom ljusfångarna MXA-02 eller koldioxidmyggfällor i fältet.
- Döda de uppsamlade myggorna genom att doppa i flytande kväve10,11. Transportera dem till laboratoriet med kylkedjelogistiksystemet12.
OBS: Torris användes främst i kylkedjelogistiksystemet. - (Valfritt) Om provplatserna var nära laboratoriet, skicka direkt de levande myggorna i nätfällorna till laboratoriet och avliva dem genom att frysa vid ≤-20 ° C i 30 min4.
- Gör en morfologisk identifiering av de insamlade myggorna genom verktygsboken13 för klassificering och identifiering av myggor.
OBS: Vid behov kan DNA-streckkodning användas för att klassificera och identifiera myggor14,15. - Baserat på provtagningsdatum och platser, tilldela dem i olika pooler och lagra dem sedan i 2-5 ml rör.
- Rita en tabell för att registrera varje rör med myggarter, nummer, provtagningskod, datum och platser.
- Skriv ut etiketterna med provtagningskoder och fäst dem på rören.
- Håll rören med myggproverna vid -80 °C tills ytterligare analys.
2. Mygga slipning
- Placera 20-50 myggor i varje 2 ml sterilt rör med 3 mm keramiska pärlor med 1,5 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium innehållande 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-lösning.
OBS: Håll rören på is eller på anice bricka. - Homogenisera myggorna med en lågtemperaturhomogenisator genom malning i 30 s vid 70 Hz vid 4 °C i tre cykler16.
- Centrifugera blandningarna vid 15 000 × g i 30 minuter vid 4 °C och överför supernatanterna till nya rör.
- Centrifugera supernatanterna igen vid 15 000 × g i 10 minuter vid 4 °C för att avlägsna myggskräpet12,17.
OBS: Vid behov kan supernatanterna filtreras med 0,22 μm filter. - Alikvotera supernatanterna (P0) i 2 ml förvaringsrör med skruvlock (200 μl per rör) och förvara dem vid -80 °C.
3. Beredning av celler och underhållsmedium för cellodling
OBS: Myggcellinje C6/36 (Aedes albopictus RNAi-brist) och ryggradsdjurcellinje BHK-21 (baby hamsternjure) användes för virusförstärkning och isolering.
- Inokulera 1 ×10 6 C6/36-celler i en 75 cm 2-kolv med 10 ml RPMI-medium kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin/streptomycin (P/S) vid 28 °C i en 5 % CO2-fuktad inkubator.
- Inokulera 1 ×10 6 BHK-21-celler i en 75 cm 2-kolv med 10 ml Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kompletterat med 10 % FBS och 1 % P/S vid 37 °C i en 5 % CO2-fuktad inkubator.
OBS: Cellerna passerades två eller tre gånger per vecka17,18. - Ympa cellerna odlade i en 75 cm2 kolv (C6/36- eller BHK-21-celler) i plattorna med 24 brunnar (C6/36 per brunn: 1,4 × 105; BHK-21 per brunn: 0,8 × 105).
- Placera plattorna med 24 brunnar vid 28 °C eller 37 °C över natten.
- Observera cellerna under mikroskopet och bekräfta om cellflödet i varje brunn är 80% -90%.
- Förbered cellodlingsunderhållsmediet (500 ml).
OBS: För C6/36 var mediet RPMI-medium kompletterat med 2% FBS och 2% Penicillin-Streptomycin-Amfotericin B-lösning. För BHK-21 var mediet DMEM-medium kompletterat med 2% FBS och 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-lösning.
4. Virusisolering
OBS: Alla steg utfördes i ett laboratorium för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). Säkerhetsnivåkravet för biosäkerhetslaboratoriet bestämdes av biosäkerhetsriskbedömningen baserat på bestämmelserna i olika länder och regioner. Processen måste utföras i ett biosäkerhetsskåp.
- Avlägsna cellodlingsmediet från plattorna med 24 brunnar och tillsätt 100 μl av cellodlingsmediet och 100 μl av mygghomogenatets supernatant (P0) till varje brunn.
- Inkubera plattorna vid 28 °C eller 37 °C i 60 minuter och skaka dem försiktigt var 15:e minut för att förhindra celltorkning.
- Ta bort supernatanten och skölj försiktigt varje brunn med 600 μl cellodlingsmedium för att avlägsna skräpet helt.
- Tillsätt 800 μL cellodlingsmedium till varje brunn och förvara plattorna i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 28 °C eller 37 °C i 7 dagar.
- Övervaka celltillståndet för varje brunn under mikroskopet dagligen15.
- Samla upp cellernas supernatanter (P1-supernatanterna) den 7:e dagen och förvara supernatanterna vid -80 °C.
- Upprepa steg 4.1-4.6 2x för att få P2- och P3-supernatanter.
OBS: I steg 4.3 var sköljning av varje brunn försiktigt med 600 μL cellodlingsunderhållsmedium valfritt för P2 och P3. - Beroende på vilken brunn som visar den cytopatogena effekten (CPE) - celler dör, pyknos och lossnar från ytan; fusion med intilliggande celler för att bilda syncytia; eller utseendet på kärn- eller cytoplasmatiska inklusionskroppar - tillsätt 300-400 μL av supernatanten för denna CPE-brunn i varje brunn av de nya 6-brunnsplattorna innehållande celler (cellsammanflödet var 80% -90%) för att kraftigt förstärka virusen.
- Samla upp supernatanterna och fördela dem i 2 ml förvaringsrör med skruvlock (500 μl per rör). Förvara dem vid -80 °C.
OBS: Efter tre generationer av successiv passering i celler kasserades de prover som inte inducerade CPE. Vid behov kan generationerna av successiv passaging i celler ökas.
5. Detektering av virala sekvenser med RT-PCR
- Extrahera totalt RNA från 200 μL av virussupernatanten med hjälp av ett viralt RNA-minikit16.
OBS: Här användes ett automatiserat nukleinsyraextraktionssystem för att extrahera totalt RNA enligt instrumenttillverkarens instruktioner. - Konvertera RNA till cDNA enligt RT-PCR-kitinstruktionerna med ett PCR-instrument.
- Tillsätt 15 μL RNA blandat med 1 μL slumpmässiga primrar i PCR-röret. Placera tuben vid 70 °C i 5 min och lägg den sedan på is i 5 min.
- Tillsätt 5 μL 5x buffert och 25 μL blandning (10 mM dNTP, 40 E/μL RNas-hämmare och 200 E/μL M-MLV) i röret och placera röret vid 42 °C i 60 min och 95 °C i 10 minuter.
- Förvara tuben vid -20 °C.
- Använd ett PCR-kit och universella primers (tabell 1) för att upptäcka virus med PCR.
- För arbovirus, ställ in PCR-reaktionssystemet (totalt 30 μL) med följande komponenter: 3 μL 10x Taq-buffert, 3 μL dNTP (1mM), 1 μL framåtprimer (10 μm), 1 μL omvänd primer (10 μm), 0,3 μL Taq (10 U / μL), 19,7 μL ddH 2O och2μL cDNA.
- För detektion av flavivirus, ställ in reaktionsprocessen som: Steg 1: 35 cykler på 94 °C i 30 s, 52 °C i 30 s och 72 °C i 30 s. Steg 2: 72 °C i 10 min.
- För påvisande av alfavirus ställs reaktionsprocessen in enligt Steg 1: 35 cykler på 94 °C under 30 s, 50 °C under 30 sekunder och 72 °C under 30 sekunder. Steg 2: 72 °C i 10 min.
- För detektion av bunyavirus, ställ in reaktionsprocessen som: Steg 1: 35 cykler på 94 °C under 30 s, 50 °C under 30 sekunder och 72 °C under 30 sekunder. Steg 2: 72 °C i 10 min.
- Upptäck PCR-amplifieringsprodukterna med 1% agarosgelelektrofores och skicka dem för sekvenseringsanalys.
OBS: Om förhållandena tillåter kan supernatanterna genomgå nästa generations sekvenseringsanalys för att identifiera nya virus och erhålla hela virusgenomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter inokulering med supernatanterna hos mygghomogenaten (P0) uppvisade C6/36-cellerna ett brett intercellulärt utrymme och exfolierade celler observerades vid 120 timmar (figur 1A) jämfört med de oinokulerade cellerna (kontroll) samtidigt (figur 1B). Efter inkubation av BHK-21-cellerna med P3-supernatanterna observerades synlig CPE i BHK-21-cellerna vid 48 timmar (figur 1C) i motsats till kontrollcellerna (figur 1D). PCR utfördes för att bestämma virala arter. De universella primrarna för detektion av flavivirus, alfavirus och bunyavirus syntetiserades kommersiellt (tabell 1). En PCR-produkt för bunyaviruset Ebinur Lake Virus sattes som en positiv kontroll och lades till i Lane 1. De universella primrarna för bunyavirus, flavivirus och alfavirus användes för att generera PCR-produkterna för den virala supernatanten, som sedan tillsattes i Lane 2, 3 respektive 4. De uppskattade storlekarna på PCR-produkterna för flavivirus, alfavirus och bunyavirus var 266 bp, 434 bp respektive 251 bp. Banden var bara synliga i Lane 2 och den positiva kontrollen Lane 1. Som ett resultat är viruset i supernatanterna sannolikt ett bunyavirus (figur 2).
Figur 1: CPE-observation av celler efter inkubation med virala supernatanter. Status för C6/36-celler vid 120 timmar efter infektion (CPE) (A) och kontrollcellernas status samtidigt (B). Status för BHK-21-celler vid 48 hpi (C) och kontrollcellerna (D). Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: CPE = cytopatogen effekt; HPI = timmar efter infektion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: PCR-resultat för virala supernatanter. Lane 1 representerar den positiva kontrollen av bunyavirus (Ebinur Lake Virus). Banorna 2-4 representerade PCR-resultaten för supernatanter genom att använda universella primers för bunyavirus (251 bp), flavivirus (266 bp) och alfavirus (434 bp). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Virus | Abc-bok | Oligonukleotid (5'→3') | Storleken på PCR-produkten (bp) | ||
| Flavivirus | F1 | TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA | 266 | ||
| F2 | GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC | ||||
| Alfavirus | M2w | YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| Bunyavirus | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
Tabell 1: Universella primers för arbovirusdetektering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med denna metod var att erbjuda ett praktiskt sätt att isolera myggassocierade virus med hjälp av olika cellinjer. Det är viktigt att tillsätta antibiotika-antimykotiska (penicillin-streptomycin-amfotericin) till supernatanterna i mygghomogenaten för att undvika kontaminering av bakterier eller svampar. Myggor och virussupernatanter som erhållits på fältet måste kylas vid -80 °C för att undvika upprepade frys-tö-cykler.
Ett annat kritiskt steg i protokollet var slipning. Myggprover ska pulveriseras noggrant och förvaras på is. Otillräckligt malda myggvävnader kan inducera celldöd och kan snedvrida resultaten av CPE-analys. Före virusisolering är det nödvändigt att använda normala myggor för att bekräfta slipparametrarna. Malning måste göras vid låga temperaturer för att förhindra att viruset blir inaktivt under processen.
Detta tillvägagångssätt kan effektivt isolera och förstärka myggassocierade virus, men är endast acceptabelt för virus som kan visa CPE i däggdjurs- eller insektcellinjer. Detta tillvägagångssätt är olämpligt för virus som inte inducerar CPE. Med hjälp av protokollet kan vi få virala kandidater som endast innehåller en virustyp eller en blandning med olika virus. Ytterligare undersökningar - viral rening, morfologisk identifiering och plackanalys - behövs fortfarande för att erhålla det renade viruset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z.
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E.
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , Suzhou University Press. (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
