Summary
シーケンシング技術の広範な使用により、蚊には多数の新しいウイルス様配列が見出されている。脊椎動物や蚊の細胞株を用いてウイルスを単離・増幅するための効果的な手順を提供し、蚊媒介性ウイルスや蚊特異的ウイルスを含む蚊関連ウイルスの将来の研究の基礎となる可能性があります。
Abstract
シーケンシング技術の幅広い応用により、蚊を含む節足動物において多くの新しいウイルス様配列が発見されている。これらの新しい蚊関連ウイルスの2つの主要なカテゴリは、「蚊媒介性ウイルス(MBV)」と「蚊特異的ウイルス(MSV)」です。これらの新しいウイルスは、脊椎動物と蚊の両方に病原性があるか、単に蚊と共生している可能性があります。エンティティウイルスは、これらのウイルスの生物学的特性を確認するために不可欠です。したがって、野外で収集された蚊からのウイルスの単離および増幅のための詳細なプロトコルがここに記載されている。まず、蚊試料を蚊ホモジネートの上清として調製した。2回遠心分離した後、上清をウイルス増幅のために蚊細胞株C6/36または脊椎動物細胞株BHK-21のいずれかに接種した。7日後、上清をP1上清として回収し、-80°Cで保存した。 次に、P1上清をC6/36またはBHK-21細胞にさらに2回継代し、細胞の状態を毎日チェックしました。細胞に対する細胞病原性効果(CPE)が発見されたとき、これらの上清を回収し、ウイルスを同定するために使用しました。このプロトコルは、MBVやMSVを含む蚊関連ウイルスに関する将来の研究の基礎として機能します。
Introduction
蚊は重要な病原性節足動物ベクターのグループです。Culicidae 1,2科には約3,500種の蚊がいます。ハイスループットシーケンシング技術の開発により、世界各地の蚊で多くの新しいウイルス様配列が発見されました3。一般に、これらの蚊関連ウイルスは、MBVとMSVの2つの主要なグループに分類できます。
MBVは、黄熱病ウイルス(YFV)、デング熱ウイルス(DENV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、リフトバレー熱ウイルス(RVFV)など、多くのヒトまたは動物の病気の原因となる多様なウイルスのグループです4。彼らは、世界中の人間と動物の両方に深刻な罹患率と死亡率を引き起こすことにより、公衆衛生を深刻に脅かしてきました。MBVは、感染した蚊からナイーブな宿主、およびウイルスに感染した宿主から摂食蚊への感染を通じて、多様な宿主間のライフサイクルを自然に維持します5。したがって、これらのウイルスは、実験室1で蚊細胞株と脊椎動物細胞株の両方に感染する可能性があります。
宜昌ウイルス(YCN)、アカイエカフラビウイルス(CxFV)、および朝陽ウイルス(CHAOV)を含むMSVは、昆虫特異的ウイルスのサブグループです1,6,7。近年、新規MSVの発見が増加しており、これらのMSVのいくつかはMBVの伝送に影響を与えることがわかっています。たとえば、アカイエカの持続感染である可能性があるCxFVは、WNV複製を早期に抑制する可能性があります8。別の昆虫特異的フラビウイルスである細胞融合剤ウイルス(CFAV)は、ネッタイシマカにおけるDENVおよびジカウイルス(ZIKV)の増殖を阻害することがわかっています9。したがって、このプロトコルは、蚊関連ウイルスを分離するための有用なアプローチであり、蚊に関連する病原体の分布および蚊媒介性疾患の制御に関するさらなる研究に役立つ可能性がある。
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Protocol
1.蚊のサンプリングと選別
- ライトトラップMXA-02または現場の二酸化炭素蚊トラップを通して成虫の蚊を捕まえます。
- 液体窒素10,11に浸して集めた蚊を殺します。コールドチェーン物流システム12によって実験室に輸送する。
注:ドライアイスは主にコールドチェーンロジスティクスシステムで使用されていました。 - (オプション)サンプルサイトがラボの近くにある場合は、ネットトラップ内の生きている蚊を直接ラボに送り、≤〜20°Cで30分間凍結して安楽死させます4。
- 蚊の分類及び識別のためのツールブック13 を介して採取された蚊の形態学的識別を行う。
注:必要に応じて、DNAバーコードを使用して蚊を分類および識別することができます14,15。 - サンプリングの日付とサイトに基づいて、それらを異なるプールに割り当ててから、2〜5 mLチューブに保管します。
- 表を描き、各チューブに蚊の種、数、サンプリングコード、日付、およびサイトを記録します。
- サンプリングコード付きのラベルを印刷し、チューブに貼り付けます。
- さらに分析するまで、蚊のサンプルを入れたチューブを-80°Cに保ちます。
2.蚊の粉砕
- 20%ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB溶液を含む1.5 mLのロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地を含む3 mmセラミックビーズを含む各2 mL滅菌チューブに20〜50匹の蚊を入れます。
注意: チューブを氷またはアニーストレイに置いてください。 - 低温組織ホモジナイザーで蚊をホモジナイズし、4°Cで70Hzで30秒間粉砕し、3サイクル16。
- 混合物を15,000 × g で4°Cで30分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。
- 上清を再度15,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、蚊の残骸12、17を除去した。
注:必要に応じて、0.22μmフィルターを使用して上清をろ過できます。 - 上清(P0)を2 mLスクリューキャップ保存チューブ(チューブあたり200 μL)に分注し、-80°Cで保存します。
3. 細胞および細胞培養維持培地の調製
注:ウイルスの増幅と分離には、蚊細胞株C6 / 36(ネッタイシマカ RNAi欠損)および脊椎動物細胞株BHK-21(ベビーハムスター腎臓)を使用しました。
- 1 ×10 6 C6/36細胞を75 cm2 フラスコに接種し、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を添加した10 mLのRPMI培地を5%CO2 加湿インキュベーターで28°Cで行います。
- 1 ×10 6 BHK-21細胞を、10%FBSおよび1%P / Sを添加した10 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)とともに75 cm2 フラスコに接種し、5%CO2 加湿インキュベーター内で37°Cで行います。
注:細胞は週に2〜3回継代されました17,18。 - 75 cm2 フラスコで培養した細胞(C6/36またはBHK-21細胞)を24ウェルプレート(ウェルあたりC6/36:1.4 × 105;ウェル当たりBHK-21:0.8 ×10 5)。
- 24ウェルプレートを28°Cまたは37°Cで一晩置きます。
- 顕微鏡下で細胞を観察し、各ウェルの細胞コンフルエントが80%〜90%であるかどうかを確認します。
- 細胞培養維持培地(500mL)を調製する。
注:C6 / 36の場合、培地は2%FBSおよび2%ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB溶液を補充したRPMI培地でした。BHK-21の場合、培地は、2%FBSおよび2%ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB溶液を補充したDMEM培地であった。
4.ウイルス分離
注:すべてのステップは、バイオセーフティレベル2(BSL-2)の実験室で実施されました。バイオセーフティ研究所の安全レベル要件は、さまざまな国や地域の規制に基づくバイオセーフティリスク評価によって決定されました。このプロセスは、バイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。
- 24ウェルプレートから細胞培養培地を取り出し、細胞培養維持培地100 μLと蚊ホモジネート(P0)の上清100 μLを各ウェルに加えます。
- プレートを28°Cまたは37°Cで60分間インキュベートし、細胞の乾燥を防ぐために15分ごとに静かに振とうします。
- 上清を取り除き、600 μLの細胞培養維持培地で各ウェルを穏やかにすすぎ、破片を完全に除去します。
- 800 μLの細胞培養維持培地を各ウェルに加え、プレートを5%CO2 加湿インキュベーターに28°Cまたは37°Cで7日間保持します。
- 各ウェルの細胞状態を顕微鏡下で毎日15回モニターする。
- 7日目 に細胞の上清(P1上清)を採取し、上清を-80°Cで保存した。
- 手順4.1〜4.6を2回繰り返して、P2およびP3上清を取得します。
注:ステップ4.3では、600 μLの細胞培養維持培地で各ウェルを穏やかにすすぐことは、P2およびP3ではオプションでした。 - どのウェルが細胞病原性効果(CPE)を示すかに応じて、細胞は死に、ピクノーシス、および表面から剥離する。隣接する細胞と融合してシンシチウムを形成する。または核内封入体または細胞質封入体の出現—このCPEの上清300〜400μLを、細胞を含む新しい6ウェルプレートの各ウェルに追加します(細胞コンフルエンシーは80%〜90%)ウイルスを大幅に増幅します。
- 上清を回収し、2 mLスクリューキャップ保存チューブ(チューブあたり500 μL)に分注します。-80°Cで保管してください。
注:細胞内で3世代連続継代を行った後、CPEを誘導しなかったサンプルは廃棄されました。必要に応じて、細胞内の連続継代の世代を増やすことができます。
5. RT-PCRによるウイルス配列の検出
- ウイルスRNAミニキット16を用いて200 μLのウイルス上清から全RNAを抽出する。
注:ここでは、自動核酸抽出システムを使用して、機器メーカーの指示に従って全RNAを抽出しました。 - PCR装置を使用して、RT-PCRキットの指示に従ってRNAをcDNAに変換します。
- 15 μLのRNAと1 μLのランダムプライマーを混合してPCRチューブに加えます。チューブを70°Cで5分間置き、氷上に5分間置きます。
- 5 μLの5xバッファーと25 μLの混合物(10 mM dNTP、40 U/μL RNase阻害剤、および200 U/μL M-MLV)をチューブに加え、チューブを42°Cで60分間、95°Cで10分間置きます。
- チューブは-20°Cで保管してください。
- PCRキットとユニバーサルプライマー(表1)を使用して、PCRでウイルスを検出します。
- アルボウイルスの場合、3 μLの10x Taqバッファー、3 μLのdNTP(1mM)、1 μLのフォワードプライマー(10 μm)、1 μLのリバースプライマー(10 μm)、0.3 μLのTaq(10 U/μL)、19.7 μLのddH 2 O、および2μLのcDNAを使用してPCR反応システム(合計30 μL)をセットアップします。
- フラビウイルスの検出のために、反応プロセスを次のように設定します:ステージ1:94°Cで30秒、52°Cで30秒、72°Cで30秒の35サイクル。ステージ2:72°Cで10分間。
- アルファウイルスの検出のために、反応プロセスを次のように設定します:ステージ1:94°Cで30秒、50°Cで30秒、72°Cで30秒の35サイクル。ステージ2:72°Cで10分間。
- ブニヤウイルスの検出のために、反応プロセスを次のように設定します:ステージ1:94°Cで30秒、50°Cで30秒、72°Cで30秒の35サイクル。ステージ2:72°Cで10分間。
- 1%アガロースゲル電気泳動でPCR増幅産物を検出し、シーケンシング解析に送ります。
注:条件が許せば、上清は次世代シーケンシング分析を受けて新しいウイルスを特定し、ウイルスゲノムシーケンス全体を取得できます。
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Representative Results
蚊のホモジネート(P0)の上清を接種した後、C6/36細胞は広い細胞間空間を示し、同時に接種していない細胞(コントロール)と比較して120時間(図1A)で剥離細胞が観察されました(図1B)。BHK-21細胞をP3上清とともにインキュベートした後、対照細胞(図1D)とは対照的に、48時間でBHK-21細胞(図1C)に目に見えるCPEが観察された。PCRを実施してウイルス種を決定した。フラビウイルス、アルファウイルス、およびブニヤウイルスを検出するためのユニバーサルプライマーを商業的に合成した(表1)。ブニヤウイルスエビヌール湖ウイルスのPCR産物をポジティブコントロールとして設定し、レーン1に追加しました。ブニヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルスのユニバーサルプライマーを使用してウイルス上清のPCR産物を生成し、それぞれレーン2、3、および4に追加しました。フラビウイルス、アルファウイルス、およびブニヤウイルスのPCR産物の推定サイズは、それぞれ266 bp、434 bp、および251 bpでした。バンドはレーン2とポジティブコントロールレーン1でのみ見えました。その結果、上清中のウイルスはブニヤウイルスである可能性が高い(図2)。
図1:ウイルス上清とのインキュベーション後の細胞のCPE観察。 感染後120時間(CPE)におけるC6/36細胞の状態(A)と対照細胞の状態(B)を同時に示す。48 hpiでのBHK-21細胞の状態(C)とコントロール細胞の状態(D)。スケールバー= 100μm。略語:CPE =細胞病原性効果;HPI =感染後時間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ウイルス上清のPCR結果。 レーン1は、ブニヤウイルス(エビヌール湖ウイルス)の陽性対照を表す。レーン2〜4は、ブニヤウイルス(251 bp)、フラビウイルス(266 bp)、およびアルファウイルス(434 bp)のユニバーサルプライマーを使用した上清のPCR結果を表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ウイルス | 入門 | オリゴヌクレオチド (5'→3') | PCR産物のサイズ(bp) | ||
| フラビウイルス | F1 キー | タカアカガアアガガア | 266 | ||
| F2 キー | GTGTCCCAGCCGGCGTGTCATCAGC | ||||
| アルファウイルス | M2w | ヤガグドッテッテッチャッガッハ | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| ブニヤウイルス | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
表1:アルボウイルス検出用のユニバーサルプライマー。
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Discussion
この方法の目的は、さまざまな細胞株を使用して蚊関連ウイルスを分離するための実用的な方法を提供することでした。細菌や真菌による汚染を避けるために、抗生物質-抗真菌剤(ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシン)を蚊のホモジネートの上清に加えることが重要です。.現場で得られた蚊やウイルス上清は、凍結融解サイクルの繰り返しを避けるために、-80°Cで冷蔵する必要があります。
プロトコルのもう一つの重要なステップは粉砕でした。蚊のサンプルは完全に粉末にして氷の上に保管する必要があります。不十分に粉砕された蚊組織は細胞死を誘発する可能性があり、CPE分析の所見を歪める可能性があります。ウイルスを分離する前に、粉砕パラメータを確認するために通常の蚊を使用する必要があります。プロセス中にウイルスが不活性になるのを防ぐために、研削は低温で行う必要があります。
このアプローチは、蚊関連ウイルスを効果的に分離および増幅することができますが、哺乳類または昆虫細胞株でCPEを表示する可能性のあるウイルスにのみ許容されます。このアプローチは、CPEを誘発しないウイルスには不適切です。このプロトコルを使用して、1つのウイルスタイプのみまたは異なるウイルスとの混合物を含むウイルス候補を取得できます。精製されたウイルスを入手するには、ウイルス精製、形態学的同定、プラーク分析などのさらなる調査が必要です。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この作業は、武漢科学技術計画プロジェクト(2018201261638501)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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