Summary
De nombreuses nouvelles séquences pseudo-virales ont été trouvées chez les moustiques en raison de l’utilisation intensive des technologies de séquençage. Nous fournissons une procédure efficace pour isoler et amplifier les virus à l’aide de lignées cellulaires de vertébrés et de moustiques, qui pourrait servir de base à de futures études sur les virus associés aux moustiques, y compris les virus transmis par les moustiques et les virus spécifiques aux moustiques.
Abstract
Grâce à la vaste application des technologies de séquençage, de nombreuses nouvelles séquences virales ont été découvertes chez les arthropodes, y compris les moustiques. Les deux principales catégories de ces nouveaux virus associés aux moustiques sont les « virus transmis par les moustiques » et les « virus spécifiques aux moustiques (MSV) ». Ces nouveaux virus pourraient être pathogènes à la fois pour les vertébrés et les moustiques, ou ils pourraient simplement être symbiotiques avec les moustiques. Les virus d’entité sont essentiels pour confirmer les caractéristiques biologiques de ces virus. Ainsi, un protocole détaillé a été décrit ici pour l’isolement et l’amplification du virus à partir de moustiques collectés sur le terrain. Tout d’abord, les échantillons de moustiques ont été préparés en tant que surnageants d’homogénats de moustiques. Après une centrifugation à deux reprises, les surnageants ont ensuite été inoculés dans la lignée cellulaire de moustiques C6/36 ou la lignée cellulaire de vertébrés BHK-21 pour l’amplification du virus. Après 7 jours, les surnageants ont été collectés en tant que surnageants P1 et stockés à -80 °C. Ensuite, les surnageants P1 ont été passés deux fois de plus dans les cellules C6/36 ou BHK-21 pendant que l’état de la cellule était vérifié quotidiennement. Lorsque l’effet cytopathogène (ECP) sur les cellules a été découvert, ces surnageants ont été recueillis et utilisés pour identifier les virus. Ce protocole sert de base à la recherche future sur les virus associés aux moustiques, y compris les MBV et les MSV.
Introduction
Les moustiques sont un groupe d’arthropodes vecteurs pathogènes importants. Il existe environ 3 500 espèces de moustiques dans la famille Culicidae 1,2. Le développement de technologies de séquençage à haut débit a conduit à la découverte de nombreuses séquences nouvelles ressemblant à des virus chez des moustiques de différentes parties du monde3. En général, ces virus associés aux moustiques peuvent être classés en deux groupes principaux : les MBV et les MSV.
Les MBV sont un groupe de virus divers qui sont les agents responsables de nombreuses maladies humaines ou animales, telles que le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus de la dengue (DENV), le virus de l’encéphalite japonaise (JEV), le virus du Nil occidental (WNV) et le virus de la fièvre de la vallée du Rift (RVFV)4. Ils ont gravement menacé la santé publique en provoquant une morbidité et une mortalité graves chez les humains et les animaux à travers le monde. Les MBV entretiennent naturellement un cycle de vie entre divers hôtes par transmission d’un moustique infecté à un hôte naïf, ainsi que d’un hôte infecté par le virus et à un moustique nourricier5. Par conséquent, ces virus peuvent infecter à la fois les lignées cellulaires de moustiques et les lignées cellulaires de vertébrés en laboratoire1.
Les VHS, qui comprennent le virus Yichang (YCN), le flavivirus Culex (CxFV) et le virus Chaoyang (CHAOV), sont un sous-groupe de virus spécifiques aux insectes 1,6,7. Au cours des dernières années, il y a eu une augmentation de la découverte de nouveaux VHS, et certains de ces VHS ont eu un impact sur la transmission des MBV. Par exemple, le CxFV, qui peut être une infection persistante chez Culex pipiens, pourrait supprimer la réplication du VNO à un stade précoce8. Un autre flavivirus spécifique à un insecte, le virus de l’agent de fusion cellulaire (CFAV), inhibe la propagation du DENV et du virus Zika (ZIKV) chez les moustiques Aedes aegypti 9. Ainsi, ce protocole est une approche utile pour isoler les virus associés aux moustiques et peut aider à poursuivre la recherche sur la distribution des agents pathogènes liés aux moustiques et le contrôle des maladies transmises par les moustiques.
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Protocol
1. Échantillonnage et tri des moustiques
- Piègez les moustiques adultes à travers les pièges lumineux MXA-02 ou les pièges à moustiques au dioxyde de carbone sur le terrain.
- Tuez les moustiques collectés en trempant dans de l’azote liquide10,11. Les transporter au laboratoire par le système logistique de la chaîne du froid12.
NOTE: La glace sèche était principalement utilisée dans le système logistique de la chaîne du froid. - (Facultatif) Si les sites d’échantillonnage se trouvaient à proximité du laboratoire, envoyer directement les moustiques vivants dans les pièges à moustiquaires au laboratoire et les euthanasier par congélation à ≤-20 °C pendant 30 min4.
- Faire une identification morphologique des moustiques collectés grâce au manueld’outils 13 pour la classification et l’identification des moustiques.
NOTE: Si nécessaire, le codage à barres ADN pourrait être utilisé pour classer et identifier les moustiques14,15. - En fonction des dates d’échantillonnage et des sites, répartissez-les dans différents bassins, puis stockez-les dans des tubes de 2 à 5 mL.
- Dessinez un tableau pour enregistrer chaque tube avec les espèces de moustiques, le nombre, le code d’échantillonnage, la date et les sites.
- Imprimez les étiquettes avec les codes d’échantillonnage et fixez-les aux tubes.
- Conserver les tubes contenant les échantillons de moustiques à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
2. Broyage des moustiques
- Placer 20 à 50 moustiques dans chaque tube stérile de 2 ml avec des billes de céramique de 3 mm contenant 1,5 ml de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenant 2 % de solution de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B.
REMARQUE: Gardez les tubes sur de la glace ou sur un plateau d’anice. - Homogénéiser les moustiques avec un homogénéisateur tissulaire à basse température en broyant pendant 30 s à 70 Hz à 4 °C pendant trois cycles16.
- Centrifuger les mélanges à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C et transférer les surnageants dans de nouveaux tubes.
- Centrifuger à nouveau les surnageants à 15 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris de moustiques12,17.
NOTE: Si nécessaire, les surnageants peuvent être filtrés à l’aide de filtres de 0,22 μm. - Aliquote des surnageants (P0) dans des tubes de stockage à bouchon à vis de 2 mL (200 μL par tube) et les stocker à -80 °C.
3. Préparation des cellules et du milieu de maintenance de la culture cellulaire
NOTE: La lignée cellulaire de moustique C6/36 (déficiente en ARNi d’Aedes albopictus ) et la lignée cellulaire de vertébrés BHK-21 (rein de bébé hamster) ont été utilisées pour l’amplification et l’isolement du virus.
- Inoculer 1 × 106 cellules en C6/36 dans une fiole de 75 cm 2 contenant 10 ml de milieu RPMI additionné de sérum fœtal bovin (FBS) à 10 % et de 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) à 28 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2.
- Inoculer 1 × 106 cellules BHK-21 dans une fiole de 75 cm 2 avec 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de FBS et 1 % P/S à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2.
NOTE: Les cellules ont été passées deux ou trois fois par semaine17,18. - Ensemencer les cellules cultivées dans une fiole de 75cm2 (cellules C6/36 ou BHK-21) dans les plaques à 24 puits (C6/36 par puits: 1,4 × 105; BHK-21 par puits: 0,8 × 105).
- Placez les plaques à 24 puits à 28 °C ou 37 °C pendant la nuit.
- Observez les cellules au microscope et confirmez si la confluence cellulaire dans chaque puits est de 80% à 90%.
- Préparer le milieu de maintien de la culture cellulaire (500 mL).
NOTE: Pour C6/36, le milieu était RPMI complété par 2% FBS et 2% Penicilline-Streptomycin-Amphotéricine B Solution. Pour BHK-21, le milieu était DMEM complété par 2% FBS et 2% Penicilline-Streptomycin-Amphotéricine B Solution.
4. Isolement du virus
REMARQUE : Toutes les étapes ont été effectuées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). L’exigence de niveau de sécurité du laboratoire de biosécurité a été déterminée par l’évaluation des risques de biosécurité basée sur les réglementations de différents pays et régions. Le processus doit être effectué dans une enceinte de biosécurité.
- Retirer le milieu de culture cellulaire des plaques de 24 puits et ajouter 100 μL du milieu de maintien de la culture cellulaire et 100 μL du surnageant de l’homogénat de moustiques (P0) à chaque puits.
- Incuber les plaques à 28 °C ou 37 °C pendant 60 min et les agiter doucement toutes les 15 minutes pour éviter le dessèchement cellulaire.
- Retirer le surnageant et rincer chaque puits doucement avec 600 μL de milieu de maintien de culture cellulaire pour éliminer complètement les débris.
- Ajouter 800 μL de milieu de maintien de culture cellulaire à chaque puits et conserver les plaques dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 à 28 °C ou 37 °C pendant 7 jours.
- Surveiller quotidiennement l’état cellulaire de chaque puits au microscope15.
- Recueillir les surnageants des cellules (surnageants P1) le 7ème jour et stocker les surnageants à -80 °C.
- Répétez les étapes 4.1-4.6 2x pour obtenir les surnageants P2 et P3.
REMARQUE : À l’étape 4.3, le rinçage de chaque puits avec 600 μL de milieu de maintenance de culture cellulaire était facultatif pour les P2 et P3. - Selon le puits qui montre l’effet cytopathogène (CPE) - les cellules meurent, pyknose et se détachent de la surface; fusion avec des cellules adjacentes pour former une syncytie; ou l’apparition de corps d’inclusion nucléaires ou cytoplasmiques — ajouter 300 à 400 μL du surnageant de ce puits CPE dans chaque puits des nouvelles plaques à 6 puits contenant des cellules (la confluence cellulaire était de 80% à 90%) pour amplifier considérablement les virus.
- Recueillir les surnageants et les aliquotes dans des tubes de stockage à bouchon à vis de 2 mL (500 μL par tube). Conservez-les à -80 °C.
NOTE: Après trois générations de passages successifs dans les cellules, les échantillons qui n’ont pas induit de CPE ont été jetés. Si nécessaire, les générations de passage successifs dans les cellules peuvent être augmentées.
5. Détection des séquences virales par RT-PCR
- Extraire l’ARN total de 200 μL du surnageant viral à l’aide d’un mini kit d’ARN viral16.
REMARQUE: Ici, un système automatisé d’extraction d’acide nucléique a été utilisé pour extraire l’ARN total en suivant les instructions du fabricant de l’instrument. - Convertissez l’ARN en ADNc en suivant les instructions du kit RT-PCR à l’aide d’un instrument de PCR.
- Ajouter 15 μL d’ARN mélangé avec 1 μL d’amorces aléatoires dans le tube de PCR. Placez le tube à 70 °C pendant 5 min, puis placez-le sur la glace pendant 5 min.
- Ajouter 5 μL de tampon 5x et 25 μL de mélange (10 mM de dNTP, 40 U/μL d’inhibiteur de RNase et 200 U/μL DE M-MLV) dans le tube et placer le tube à 42 °C pendant 60 min et à 95 °C pendant 10 min.
- Conserver le tube à -20 °C.
- Utilisez un kit de PCR et des amorces universelles (Tableau 1) pour détecter les virus par PCR.
- Pour les arbovirus, mettre en place le système de réaction PCR (total 30 μL) avec les composants suivants : 3 μL de tampon Taq 10x, 3 μL de dNTP (1mM), 1 μL d’amorce directe (10 μm), 1 μL d’amorce inverse (10 μm), 0,3 μL de Taq (10 U/μL), 19,7 μL deddH2Oet 2 μL d’ADNc.
- Pour la détection des flavivirus, configurer le processus de réaction comme suit: stade 1: 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 52 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s; étape 2: 72 °C pendant 10 min.
- Pour la détection des alphavirus, configurer le processus de réaction comme suit: stade 1: 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 50 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s; étape 2: 72 °C pendant 10 min.
- Pour la détection des bunyavirus, configurer le processus de réaction comme suit: stade 1: 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 50 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s; étape 2: 72 °C pendant 10 min.
- Détecter les produits d’amplification PCR par électrophorèse sur gel d’agarose à 1% et les envoyer pour analyse de séquençage.
NOTE: Si les conditions le permettent, les surnageants peuvent subir une analyse de séquençage de nouvelle génération pour identifier les nouveaux virus et obtenir l’ensemble des séquences du génome viral.
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Representative Results
Après inoculation avec les surnageants des homogénats de moustiques (P0), les cellules C6/36 présentaient un large espace intercellulaire, et des cellules exfoliées ont été observées à 120 h (Figure 1A) par rapport aux cellules non inoculées (témoin) en même temps (Figure 1B). Après incubation des cellules BHK-21 avec les surnageants P3, une CPE visible a été observée dans les cellules BHK-21 à 48 h (Figure 1C) contrairement aux cellules témoins (Figure 1D). La PCR a été réalisée pour déterminer les espèces virales. Les amorces universelles pour la détection des flavivirus, des alphavirus et des bunyavirus ont fait l’objet d’une synthèse commerciale (tableau 1). Un produit de PCR pour le virus du lac Ebinur a été défini comme témoin positif et ajouté à la voie 1. Les amorces universelles pour les bunyavirus, les flavivirus et les alphavirus ont été utilisées pour générer les produits de PCR pour le surnageant viral, qui ont ensuite été ajoutés dans les voies 2, 3 et 4, respectivement. Les tailles estimées des produits de PCR pour les flavivirus, les alphavirus et les bunyavirus étaient de 266 pb, 434 pb et 251 pb, respectivement. Les bandes n’étaient visibles que dans la voie 2 et la voie de contrôle positif 1. Par conséquent, le virus dans les surnageants est probablement un bunyavirus (Figure 2).
Figure 1 : Observation CPE des cellules après l’incubation avec les surnageants viraux. L’état des cellules C6/36 à 120 h après l’infection (CPE) (A) et celui des cellules témoins en même temps (B). L’état des cellules BHK-21 à 48 hpi (C) et celui des cellules témoins (D). Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : CPE = effet cytopathogène; IPH = heures après l’infection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résultats de la PCR pour les surnageants viraux. La voie 1 représente le contrôle positif des bunyavirus (virus du lac Ebinur). Les voies 2 à 4 représentaient les résultats de PCR des surnageants en utilisant des amorces universelles pour les bunyavirus (251 pb), les flavivirus (266 pb) et les alphavirus (434 pb). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Virus | Amorce | Oligonucléotide (5'→3') | La taille du produit PCR (pb) | ||
| Flavivirus | F1 | TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA | 266 | ||
| F2 | GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC | ||||
| Alphavirus | M2w | YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| Bunyavirus | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
Tableau 1 : Amorces universelles pour la détection des arbovirus.
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Discussion
L’objectif de cette méthode était d’offrir un moyen pratique d’isoler les virus associés aux moustiques à l’aide de diverses lignées cellulaires. Il est essentiel d’ajouter l’antibiotique-antimycotique (pénicilline-streptomycine-amphotéricine) aux surnageants des homogénats de moustiques pour éviter la contamination par des bactéries ou des champignons. Les moustiques et les surnageants viraux obtenus sur le terrain doivent être réfrigérés à -80 °C pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.
Une autre étape critique du protocole était le broyage. Les échantillons de moustiques doivent être soigneusement réduits en poudre et stockés sur de la glace. Des tissus de moustiques insuffisamment broyés peuvent induire la mort cellulaire et peuvent fausser les résultats de l’analyse CPE. Avant l’isolement du virus, il est nécessaire d’utiliser des moustiques normaux pour confirmer les paramètres de broyage. Le broyage doit être effectué à basse température pour éviter que le virus ne devienne inactif pendant le processus.
Cette approche peut isoler et amplifier efficacement les virus associés aux moustiques, mais n’est acceptable que pour les virus qui peuvent présenter une ECP dans des lignées cellulaires de mammifères ou d’insectes. Cette approche est inappropriée pour les virus qui n’induisent pas d’EPC. En utilisant le protocole, nous pouvons obtenir des candidats viraux qui ne contiennent qu’un seul type de virus ou un mélange avec différents virus. D’autres recherches – purification virale, identification morphologique et analyse de la plaque – sont encore nécessaires pour obtenir le virus purifié.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le projet de plan scientifique et technologique de Wuhan (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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