Summary
Zahlreiche neuartige virusähnliche Sequenzen wurden aufgrund des umfangreichen Einsatzes von Sequenzierungstechnologien in Stechmücken gefunden. Wir stellen ein effektives Verfahren zur Isolierung und Amplifikation von Viren unter Verwendung von Wirbeltier- und Mückenzelllinien zur Verfügung, das als Grundlage für zukünftige Studien zu Stechmücken-assoziierten Viren, einschließlich mückenübertragener und mückenspezifischer Viren, dienen könnte.
Abstract
Mit der breiten Anwendung von Sequenzierungstechnologien wurden viele neue virusähnliche Sequenzen in Arthropoden, einschließlich Mücken, entdeckt. Die beiden Hauptkategorien dieser neuen Mücken-assoziierten Viren sind "durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs)" und "Mückenspezifische Viren (MSVs)". Diese neuartigen Viren könnten sowohl für Wirbeltiere als auch für Mücken pathogen sein, oder sie könnten einfach eine Symbiose mit Mücken eingehen. Entitätsviren sind unerlässlich, um die biologischen Eigenschaften dieser Viren zu bestätigen. Daher wurde hier ein detailliertes Protokoll zur Virusisolierung und -vermehrung von im Feld gesammelten Stechmücken beschrieben. Zunächst wurden die Mückenproben als Überstände von Mückenhomogenaten präpariert. Nach zweimaliger Zentrifugation wurden die Überstände entweder in die Mückenzelllinie C6/36 oder in die Wirbeltierzelllinie BHK-21 zur Virusamplifikation inokuliert. Nach 7 Tagen wurden die Überstände als P1-Überstände gesammelt und bei -80 °C gelagert. Als nächstes wurden P1-Überstände noch zweimal in C6/36- oder BHK-21-Zellen passageiert, während der Zellstatus täglich überprüft wurde. Als die zytopathogene Wirkung (CPE) auf die Zellen entdeckt wurde, wurden diese Überstände gesammelt und zur Identifizierung von Viren verwendet. Dieses Protokoll dient als Grundlage für zukünftige Forschungen zu Mücken-assoziierten Viren, einschließlich MBVs und MSVs.
Introduction
Stechmücken sind eine Gruppe wichtiger pathogener Arthropoden-Vektoren. Es gibt ungefähr 3.500 Arten von Stechmücken in der Familie Culicidae 1,2. Die Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien hat zur Entdeckung vieler neuartiger, virusähnlicher Sequenzen in Stechmücken aus verschiedenen Teilen der Welt geführt3. Im Allgemeinen können diese Mücken-assoziierten Viren in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden: MBVs und MSVs.
MBVs sind eine Gruppe verschiedener Viren, die Erreger vieler menschlicher oder tierischer Krankheiten sind, wie z. B. das Gelbfiebervirus (YFV), das Dengue-Virus (DENV), das Japanische Enzephalitisvirus (JEV), das West-Nil-Virus (WNV) und das Rift-Valley-Fiebervirus (RVFV)4. Sie haben die öffentliche Gesundheit ernsthaft bedroht, indem sie schwere Morbidität und Mortalität bei Menschen und Tieren auf der ganzen Welt verursacht haben. MBVs halten auf natürliche Weise einen Lebenszyklus zwischen verschiedenen Wirten aufrecht, indem sie von einer infizierten Mücke auf einen naiven Wirt sowie von einem virusinfizierten Wirt und auf eine fressende Mücke übertragenwerden 5. Daher können diese Viren sowohl Mückenzelllinien als auch Wirbeltierzelllinien im Labor infizieren1.
MSVs, zu denen das Yichang-Virus (YCN), das Culex-Flaviviren (CxFV) und das Chaoyang-Virus (CHAOV) gehören, sind eine Untergruppe insektenspezifischer Viren 1,6,7. In den letzten Jahren hat die Entdeckung neuartiger MSVs zugenommen, und es wurde festgestellt, dass einige dieser MSVs einen Einfluss auf die Übertragung von MBVs haben. Zum Beispiel könnte CxFV, eine persistierende Infektion bei Culex pipiens, die WNV-Replikation in einem frühen Stadium unterdrücken8. Ein weiteres insektenspezifisches Flavivirus, das Cell-Fusing Agent Virus (CFAV), hemmt die Ausbreitung des DENV- und Zika-Virus (ZIKV) in Aedes aegypti-Mücken 9. Daher ist dieses Protokoll ein nützlicher Ansatz zur Isolierung von Mücken-assoziierten Viren und kann bei der weiteren Erforschung der Verbreitung von Krankheitserregern, die mit Stechmücken verwandt sind, und der Kontrolle von durch Stechmücken übertragenen Krankheiten helfen.
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Protocol
1. Mückenprobenahme und -sortierung
- Fangen Sie die erwachsenen Mücken durch die Lichtfallen MXA-02 oder Kohlendioxid-Mückenfallen im Feld ein.
- Töten Sie die gesammelten Mücken, indem Sie sie in flüssigen Stickstoff tauchen10,11. Transportieren Sie sie mit dem Kühlketten-Logistiksystem12 ins Labor.
HINWEIS: Trockeneis wurde hauptsächlich in der Kühlkettenlogistik verwendet. - (Optional) Wenn sich die Probenahmestellen in der Nähe des Labors befanden, schicken Sie die lebenden Mücken in den Netzfallen direkt ins Labor und schläfern Sie sie ein, indem Sie sie 30 Minuten lang bei ≤-20 °C einfrieren4.
- Nehmen Sie eine morphologische Identifizierung der gesammelten Mücken durch das Werkzeugbuch13 zur Klassifizierung und Identifizierung von Mücken vor.
HINWEIS: Bei Bedarf kann DNA-Barcoding verwendet werden, um Mücken zu klassifizieren und zu identifizieren14,15. - Ordnen Sie sie auf der Grundlage von Probenahmedaten und -standorten verschiedenen Pools zu und lagern Sie sie dann in 2-5-ml-Röhrchen.
- Zeichnen Sie eine Tabelle, um jede Röhre mit Mückenart, Anzahl, Probenahmecode, Datum und Standorten aufzuzeichnen.
- Drucken Sie die Etiketten mit Probenahmecodes aus und kleben Sie sie auf die Röhrchen.
- Bewahren Sie die Röhrchen mit den Mückenproben bis zur weiteren Analyse bei -80 °C auf.
2. Mücken-Schleifen
- Geben Sie 20-50 Mücken in jedes sterile 2-ml-Röhrchen mit 3-mm-Keramikkügelchen mit 1,5 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-Medium, das 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin-B-Lösung enthält.
Anmerkungen: Bewahren Sie die Röhrchen auf Eis oder auf einem schönen Tablett auf. - Homogenisieren Sie die Mücken mit einem Niedertemperatur-Gewebehomogenisator, indem Sie 30 s bei 70 Hz bei 4 °C für drei Zyklen mahlen16.
- Zentrifugieren Sie die Mischungen bei 15.000 × g für 30 min bei 4 °C und überführen Sie die Überstände in neue Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Überstände erneut bei 15.000 × g für 10 min bei 4 °C, um die Mückenreste zu entfernen12,17.
HINWEIS: Bei Bedarf können die Überstände mit 0,22-μm-Filtern gefiltert werden. - Aliquotieren Sie die Überstände (P0) in 2 mL Schraubverschluss-Vorratsröhrchen (200 μL pro Röhrchen) und lagern Sie sie bei -80 °C.
3. Präparation von Zellen und Zellkultur-Pflegemedium
HINWEIS: Für die Virusamplifikation und -isolierung wurden die Mückenzelllinie C6/36 (Aedes albopictus RNAi-defizient) und die Wirbeltierzelllinie BHK-21 (Babyhamsterniere) verwendet.
- 1 × 106 C6/36-Zellen werden in einen 75-cm-2-Kolben mit 10 ml RPMI-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S), bei 28 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 beimpft.
- Beimpfen Sie 1 × 106 BHK-21-Zellen in einen 75 cm 2-Kolben mit 10 ml modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2.
ANMERKUNG: Die Zellen wurden zwei- bis dreimal pro Woche durchgelassen17,18. - Die in einem 75-cm-2-Kolben (C6/36- oder BHK-21-Zellen) kultivierten Zellen werden in die 24-Well-Platten (C6/36 pro Well: 1,4 × 105; BHK-21 pro Well: 0,8 × 105).
- Legen Sie die 24-Well-Platten über Nacht auf 28 °C oder 37 °C.
- Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop und vergewissern Sie sich, dass die Zellkonfluenz in jeder Vertiefung 80%-90% beträgt.
- Bereiten Sie das Zellkultur-Erhaltungsmedium (500 ml) vor.
HINWEIS: Für C6/36 war das Medium RPMI-Medium, das mit 2 % FBS und 2 % Penicillin-Streptomycin-Amphotericin-B-Lösung ergänzt wurde. Für BHK-21 wurde das Medium DMEM-Medium mit 2% FBS und 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-Lösung ergänzt.
4. Virusisolierung
HINWEIS: Alle Schritte wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Die Anforderungen an das Sicherheitsniveau des Biosicherheitslabors wurden durch die Biosicherheitsrisikobewertung auf der Grundlage der Vorschriften verschiedener Länder und Regionen bestimmt. Der Prozess muss in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.
- Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus den 24-Well-Platten und geben Sie 100 μl des Zellkulturpflegemediums und 100 μl des Überstands des Mückenhomogenats (P0) in jede Vertiefung.
- Inkubieren Sie die Platten bei 28 °C oder 37 °C für 60 Minuten und schütteln Sie sie alle 15 Minuten vorsichtig, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern.
- Entfernen Sie den Überstand und spülen Sie jede Vertiefung vorsichtig mit 600 μl Zellkulturpflegemedium aus, um die Ablagerungen vollständig zu entfernen.
- Geben Sie 800 μl Zellkulturerhaltungsmedium in jede Vertiefung und bewahren Sie die Platten 7 Tage lang in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 28 °C oder 37 °C auf.
- Überwachen Sie den Zellzustand jeder Vertiefung täglich unter dem Mikroskop15.
- Sammeln Sie die Überstände der Zellen (P1-Überstände) am 7. Tag und lagern Sie die Überstände bei -80 °C.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.6 2x, um P2- und P3-Überstände zu erhalten.
Anmerkungen: In Schritt 4.3 war das vorsichtige Spülen jeder Vertiefung mit 600 μl Zellkultur-Erhaltungsmedium für P2 und P3 optional. - Je nachdem, welche Vertiefung die zytopathogene Wirkung (CPE) zeigt, sterben Zellen ab, Pyknose und lösen sich von der Oberfläche; Verschmelzung mit benachbarten Zellen zur Bildung von Synzytien; oder das Auftreten von nukleären oder zytoplasmatischen Einschlusskörpern – fügen Sie 300-400 μl des Überstands dieser CPE-Vertiefung in jede Vertiefung der neuen 6-Well-Platten hinzu, die Zellen enthalten (die Zellkonfluenz betrug 80%-90%), um die Viren stark zu vermehren.
- Sammeln Sie die Überstände und aliquotieren Sie sie in 2-ml-Aufbewahrungsröhrchen mit Schraubverschluss (500 μl pro Röhrchen). Lagern Sie sie bei -80 °C.
ANMERKUNG: Nach drei Generationen aufeinanderfolgender Passage in den Zellen wurden die Proben, die keine CPE induzierten, verworfen. Bei Bedarf können die Generationen der sukzessiven Passage in den Zellen erhöht werden.
5. Nachweis von Virussequenzen mittels RT-PCR
- Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus 200 μl des viralen Überstands mit einem viralen RNA-Mini-Kit16.
HINWEIS: Hier wurde ein automatisiertes Nukleinsäure-Extraktionssystem verwendet, um die Gesamt-RNA gemäß den Anweisungen des Geräteherstellers zu extrahieren. - Wandeln Sie die RNA gemäß den Anweisungen des RT-PCR-Kits mit einem PCR-Gerät in cDNA um.
- Geben Sie 15 μl RNA gemischt mit 1 μl zufälligen Primern in das PCR-Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen für 5 min auf 70 °C und legen Sie es dann für 5 min auf Eis.
- Geben Sie 5 μl 5x Puffer und 25 μl Gemisch (10 mM dNTP, 40 U/μl RNase-Inhibitor und 200 U/μL M-MLV) in das Röhrchen und stellen Sie das Röhrchen für 60 min bei 42 °C und 10 min bei 95 °C ein.
- Lagern Sie das Röhrchen bei -20 °C.
- Verwenden Sie ein PCR-Kit und universelle Primer (Tabelle 1), um Viren mittels PCR nachzuweisen.
- Für Arboviren wird das PCR-Reaktionssystem (insgesamt 30 μl) mit den folgenden Komponenten aufgebaut: 3 μl 10x Taq-Puffer, 3 μl dNTP (1 mM), 1 μl Vorwärtsprimer (10 μm), 1 μl Reverse-Primer (10 μm), 0,3 μl Taq (10 U/μl), 19,7 μlddH2Ound 2 μl cDNA.
- Für den Nachweis von Flaviviren ist der Reaktionsprozess wie folgt einzurichten: Stufe 1: 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, 52 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; Stufe 2: 72 °C für 10 Min.
- Für den Nachweis von Alphaviren ist der Reaktionsprozess wie folgt einzurichten: Stufe 1: 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, 50 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; Stufe 2: 72 °C für 10 Min.
- Für den Nachweis von Bunyaviren ist der Reaktionsprozess wie folgt einzurichten: Stufe 1: 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, 50 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; Stufe 2: 72 °C für 10 Min.
- Weisen Sie die PCR-Amplifikationsprodukte durch 1%ige Agarose-Gelelektrophorese nach und senden Sie sie zur Sequenzierungsanalyse.
HINWEIS: Wenn die Bedingungen es zulassen, können die Überstände einer Next-Generation-Sequencing-Analyse unterzogen werden, um neue Viren zu identifizieren und die gesamten viralen Genomsequenzen zu erhalten.
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Representative Results
Nach der Inokulation mit den Überständen der Mückenhomogenate (P0) wiesen die C6/36-Zellen einen großen interzellulären Raum auf, und exfoliierte Zellen wurden nach 120 h beobachtet (Abbildung 1A) im Vergleich zu den nicht inokulierten Zellen (Kontrolle) zur gleichen Zeit (Abbildung 1B). Nach Inkubation der BHK-21-Zellen mit den P3-Überständen wurde in den BHK-21-Zellen nach 48 h sichtbares CPE beobachtet (Abbildung 1C) im Gegensatz zu den Kontrollzellen (Abbildung 1D). Zur Bestimmung der Virusspezies wurde eine PCR durchgeführt. Die universellen Primer für den Nachweis von Flaviviren, Alphaviren und Bunyaviren wurden kommerziell synthetisiert (Tabelle 1). Ein PCR-Produkt für das Bunyavirus Ebinur Lake Virus wurde als Positivkontrolle eingestellt und in Lane 1 hinzugefügt. Die universellen Primer für Bunyaviren, Flaviviren und Alphaviren wurden verwendet, um die PCR-Produkte für den viralen Überstand zu erzeugen, die dann in Spur 2, 3 bzw. 4 hinzugefügt wurden. Die geschätzten Größen der PCR-Produkte für Flaviviren, Alphaviren und Bunyaviren betrugen 266 bp, 434 bp bzw. 251 bp. Die Bänder waren nur in Spur 2 und der Positivkontrollspur 1 sichtbar. Infolgedessen handelt es sich bei dem Virus in den Überständen wahrscheinlich um ein Bunyavirus (Abbildung 2).
Abbildung 1: CPE-Beobachtung von Zellen nach der Inkubation mit den viralen Überständen. Der Status der C6/36-Zellen 120 h nach der Infektion (CPE) (A) und der der Kontrollzellen gleichzeitig (B). Der Status der BHK-21-Zellen bei 48 hpi (C) und der der Kontrollzellen (D). Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: CPE = zytopathogene Wirkung; HPI = Stunden nach der Infektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: PCR-Ergebnisse für virale Überstände. Bahn 1 stellt die Positivkontrolle von Bunyaviren (Ebinur Lake Virus) dar. Die Bahnen 2-4 stellten die PCR-Ergebnisse von Überständen unter Verwendung von Universalprimern für Bunyaviren (251 bp), Flaviviren (266 bp) und Alphaviren (434 bp) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Virus | Fibel | Oligonukleotid (5'→3') | Die Größe des PCR-Produkts (bp) | ||
| Flaviviren | Formel 1 | TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA | 266 | ||
| F2 | GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC | ||||
| Alphaviren | M2w | YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| Bunyaviren | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
Tabelle 1: Universelle Primer für den Arbovirus-Nachweis.
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Discussion
Ziel dieser Methode war es, eine praktikable Möglichkeit zu bieten, Mücken-assoziierte Viren mit Hilfe verschiedener Zelllinien zu isolieren. Es ist wichtig, das Antibiotikum-Antimykotikum (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin) zu den Überständen der Mückenhomogenate hinzuzufügen, um eine Kontamination durch Bakterien oder Pilze zu vermeiden. Stechmücken und virale Überstände, die im Feld gewonnen werden, müssen bei -80 °C gekühlt werden, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
Ein weiterer kritischer Schritt im Protokoll war das Schleifen. Mückenproben sollten gründlich gepudert und auf Eis gelagert werden. Unzureichend gemahlenes Mückengewebe kann den Zelltod induzieren und die Ergebnisse der CPE-Analyse verzerren. Vor der Virusisolierung ist es notwendig, normale Stechmücken zu beschäftigen, um die Mahlparameter zu bestätigen. Das Mahlen muss bei niedrigen Temperaturen erfolgen, um zu verhindern, dass das Virus während des Prozesses inaktiv wird.
Dieser Ansatz kann Mücken-assoziierte Viren effektiv isolieren und verstärken, ist aber nur für Viren akzeptabel, die CPE in Säugetier- oder Insektenzelllinien aufweisen können. Dieser Ansatz ist für Viren, die kein CPE induzieren, ungeeignet. Mit Hilfe des Protokolls können wir Viruskandidaten erhalten, die nur einen Virustyp oder eine Mischung mit verschiedenen Viren enthalten. Weitere Untersuchungen – Virusreinigung, morphologische Identifizierung und Plaque-Analyse – sind noch erforderlich, um das gereinigte Virus zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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