Summary
Tallrike nye viruslignende sekvenser har blitt funnet i mygg på grunn av den omfattende bruken av sekvenseringsteknologier. Vi tilbyr en effektiv prosedyre for å isolere og forsterke virus ved hjelp av virveldyr og myggcellelinjer, som kan tjene som grunnlag for fremtidige studier på myggassosierte virus, inkludert myggbårne og myggspesifikke virus.
Abstract
Med den brede anvendelsen av sekvenseringsteknologier har mange nye viruslignende sekvenser blitt oppdaget i leddyr, inkludert mygg. De to hovedkategoriene av disse nye myggassosierte virusene er "myggbårne virus (MBV)" og "myggspesifikke virus (MSV)". Disse nye virusene kan være patogene for både vertebrater og mygg, eller de kan bare være symbiotiske med mygg. Entitetsvirus er avgjørende for å bekrefte de biologiske tegnene til disse virusene. Det er derfor beskrevet en detaljert protokoll her for virusisolering og amplifisering fra feltinnsamlet mygg. Først ble myggprøvene fremstilt som supernatanter av mygghomogenater. Etter sentrifugering to ganger ble supernatantene deretter inokulert i enten myggcellelinje C6/36 eller virveldyrcellelinje BHK-21 for virusforsterkning. Etter 7 dager ble supernatantene samlet som P1-supernatanter og lagret ved -80 °C. Deretter ble P1-supernatanter passert to ganger til i C6/36- eller BHK-21-celler mens cellestatusen ble sjekket daglig. Når cytopatogen effekt (CPE) på cellene ble oppdaget, ble disse supernatantene samlet og brukt til å identifisere virus. Denne protokollen tjener som grunnlag for fremtidig forskning på myggassosierte virus, inkludert MBV og MSV.
Introduction
Mygg er en gruppe viktige patogene leddyrvektorer. Det er ca. 3 500 myggarter i familien Culicidae 1,2. Utviklingen av høykapasitets sekvenseringsteknologier har ført til oppdagelsen av mange nye, viruslignende sekvenser i mygg fra forskjellige deler av verden3. Vanligvis kan disse myggassosierte virusene klassifiseres i to hovedgrupper: MBV og MSV.
MBV er en gruppe forskjellige virus som er årsaksmessige midler til mange sykdommer hos mennesker eller dyr, for eksempel gulfebervirus (YFV), denguevirus (DENV), japansk encefalittvirus (JEV), West Nile-virus (WNV) og Rift Valley febervirus (RVFV)4. De har alvorlig truet folkehelsen ved å forårsake alvorlig sykelighet og dødelighet hos både mennesker og dyr over hele verden. MBV-er opprettholder naturlig en livssyklus mellom ulike verter gjennom overføring fra en infisert mygg til en naiv vert, samt fra en virusinfisert vert og til en fôringsmygg5. Derfor kan disse virusene infisere både myggcellelinjer og virveldyrcellelinjer i laboratoriet1.
MSVer, som inkluderer Yichang-virus (YCN), Culex flavivirus (CxFV) og Chaoyang-virus (CHAOV), er en undergruppe av insektspesifikke virus 1,6,7. I de senere år har det vært en økning i oppdagelsen av nye muskel- og skjelettlidelser, og noen av disse muskel- og skjelettbedriftene har vist seg å ha innvirkning på overføringen av MBV. For eksempel kan CxFV, som kan være en vedvarende infeksjon i Culex pipiens, undertrykke WNV-replikasjon på et tidlig stadium8. Et annet insektspesifikt flavivirus, cellefusjonsmiddelvirus (CFAV), har vist seg å hemme forplantningen av DENV og Zika-virus (ZIKV) i Aedes aegypti-mygg 9. Dermed er denne protokollen en nyttig tilnærming for å isolere myggassosierte virus og kan bidra til videre forskning på fordelingen av patogener relatert til mygg og kontroll av myggbårne sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Myggprøvetaking og sortering
- Fang de voksne myggene gjennom lysfellene MXA-02 eller karbondioksidmyggfeller i felt.
- Drep de oppsamlede myggene ved å dyppe i flytende nitrogen10,11. Transporter dem til laboratoriet med kjølekjedelogistikksystemet12.
MERK: Tørris ble først og fremst brukt i kjølekjedelogistikksystemet. - (Valgfritt) Hvis prøvestedene var i nærheten av laboratoriet, send de levende myggene direkte i notfellene til laboratoriet og avlive dem ved å fryse ved ≤-20 °C i 30 min4.
- Foreta en morfologisk identifikasjon av de innsamlede myggene gjennom verktøybok13 for klassifisering og identifisering av mygg.
MERK: Om nødvendig kan DNA-strekkoding brukes til å klassifisere og identifisere mygg14,15. - Basert på prøvetakingsdatoer og steder, tilordne dem i forskjellige bassenger, og lagre dem deretter i 2-5 ml rør.
- Tegn en tabell for å registrere hvert rør med myggarter, nummer, prøvetakingskode, dato og steder.
- Skriv ut etikettene med prøvetakingskoder og fest dem til rørene.
- Hold rør med myggprøvene ved -80 °C inntil videre analyse.
2. Myggsliping
- Plasser 20-50 mygg i hvert 2 ml sterilt rør med 3 mm keramiske perler med 1,5 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium som inneholder 2% penicillin-streptomycin-amfotericin B-løsning.
MERK: Hold rørene på is oron anice skuff. - Homogeniser myggene med en lavtemperatur vevshomogenisator ved å male i 30 s ved 70 Hz ved 4 ° C i tre sykluser16.
- Sentrifuger blandingene ved 15 000 × g i 30 minutter ved 4 °C og overfør supernatantene til nye rør.
- Sentrifuger supernatantene igjen ved 15 000 × g i 10 minutter ved 4 °C for å fjerne myggrestene12,17.
MERK: Om nødvendig kan supernatantene filtreres ved hjelp av 0,22 μm filtre. - Aliquot supernatantene (P0) i 2 ml skrukorklagringsrør (200 μL per rør) og oppbevar dem ved -80 °C.
3. Fremstilling av celler og vedlikeholdsmedium for cellekultur
MERK: Myggcellelinje C6/36 (Aedes albopictus RNAi-mangelfull) og virveldyrcellelinje BHK-21 (baby hamsternyre) ble brukt til virusforsterkning og isolering.
- Inokuler 1 × 106 C6/36 celler i en 75 cm 2 kolbe med 10 ml RPMI medium supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S) ved 28 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator.
- Inokuler 1 × 106 BHK-21 celler i en 75 cm 2 kolbe med 10 ml Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% FBS og 1% P / S ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator.
MERK: Cellene ble passert to eller tre ganger per uke17,18. - Frø cellene dyrket i en 75 cm2 kolbe (C6/36 eller BHK-21 celler) inn i 24-brønnplatene (C6/36 per brønn: 1,4 × 105; BHK-21 per brønn: 0,8 × 105).
- Plasser platene ved 24 brønner ved 28 °C eller 37 °C over natten.
- Observer cellene under mikroskopet og bekreft om cellekonfluens i hver brønn er 80% -90%.
- Forbered vedlikeholdsmediet for cellekultur (500 ml).
MERK: For C6/36 var mediet RPMI-medium supplert med 2% FBS og 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution. For BHK-21 var mediet DMEM-medium supplert med 2% FBS og 2% penicillin-streptomycin-amfotericin B-løsning.
4. Virus isolasjon
MERK: Alle trinnene ble utført i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) laboratorium. Sikkerhetsnivåkravet til biosikkerhetslaboratoriet ble bestemt av biosikkerhetsrisikovurderingen basert på forskrifter i forskjellige land og regioner. Prosessen må utføres i et biosikkerhetsskap.
- Fjern cellekulturmediet fra 24-brønnplatene og tilsett 100 μL av vedlikeholdsmediet for cellekultur og 100 μL av supernatanten av mygghomogenatet (P0) til hver brønn.
- Inkuber platene ved 28 °C eller 37 °C i 60 minutter og rist dem forsiktig hvert 15. minutt for å unngå celletørking.
- Fjern supernatanten og skyll hver brønn forsiktig med 600 mikrol cellekulturvedlikeholdsmedium for å fjerne ruskene helt.
- Tilsett 800 μL cellekulturvedlikeholdsmedium til hver brønn og oppbevar platene i en 5 % CO2 fuktet inkubator ved 28 °C eller 37 °C i 7 dager.
- Overvåk celletilstanden til hver brønn under mikroskopet daglig15.
- Samle supernatanter av celler (P1 supernatanter) på den 7. dagen og oppbevar supernatantene ved -80 ° C.
- Gjenta trinn 4.1-4.6 2x for å få P2- og P3-supernatanter.
MERK: I trinn 4.3 var det valgfritt å skylle hver brønn forsiktig med 600 μL vedlikeholdsmedium for cellekultur for P2 og P3. - Avhengig av hvilken brønn som viser den cytopatogene effekten (CPE) - celler dør, pyknosis og løsner fra overflaten; fusjon med tilstøtende celler for å danne syncyti; eller utseendet til nukleære eller cytoplasmatiske inklusjonslegemer - tilsett 300-400 μL av supernatanten til denne CPE-brønnen godt inn i hver brønn av de nye 6-brønnplatene som inneholder celler (cellekonfluensen var 80% -90%) for å forsterke virusene sterkt.
- Samle supernatantene og alikot dem i 2 ml skrukorklagringsrør (500 μL per rør). Oppbevares ved -80 °C.
MERK: Etter tre generasjoner med suksessiv passasje i celler, ble prøvene som ikke induserte CPE kassert. Om nødvendig kan generasjonene av suksessiv passasje i celler økes.
5. Oppdage virale sekvenser ved RT-PCR
- Trekk ut totalt RNA fra 200 μL av den virale supernatanten ved hjelp av et viralt RNA-minisett16.
MERK: Her ble et automatisert nukleinsyreekstraksjonssystem brukt til å trekke ut totalt RNA i henhold til instrumentprodusentens instruksjoner. - Konverter RNA til cDNA ved å følge instruksjonene for RT-PCR-settet ved hjelp av et PCR-instrument.
- Tilsett 15 μL RNA blandet med 1 μL tilfeldige primere i PCR-røret. Plasser tuben på 70 °C i 5 min og legg den deretter på is i 5 min.
- Tilsett 5 μL 5x buffer og 25 μL blanding (10 mM dNTP, 40 U / μL RNase-hemmer og 200 U / μL M-MLV) i røret og sett røret ved 42 ° C i 60 minutter og 95 ° C i 10 minutter.
- Oppbevar tuben ved -20 °C.
- Bruk et PCR-sett og universelle primere (tabell 1) for å oppdage virus ved PCR.
- For arbovirus, sett opp PCR-reaksjonssystemet (totalt 30 μL) med følgende komponenter: 3 μL 10x Taq-buffer, 3 μL dNTP (1mM), 1 μL fremoverprimer (10 μm), 1 μL reversprimer (10 μm), 0,3 μL Taq (10 U / μL), 19,7 μLddH2O og 2 μL cDNA.
- For påvisning av flavivirus, sett opp reaksjonsprosessen som: trinn 1: 35 sykluser på 94 °C i 30 s, 52 °C i 30 s og 72 °C i 30 s; trinn 2: 72 °C i 10 min.
- For påvisning av alfavirus, sett opp reaksjonsprosessen som: trinn 1: 35 sykluser på 94 ° C i 30 s, 50 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s; trinn 2: 72 °C i 10 min.
- For påvisning av bunyavirus, sett opp reaksjonsprosessen som: trinn 1: 35 sykluser på 94 °C i 30 s, 50 °C i 30 s og 72 °C i 30 s; trinn 2: 72 °C i 10 min.
- Oppdag PCR-amplifikasjonsproduktene ved 1% agarosegelelektroforese og send dem til sekvenseringsanalyse.
MERK: Hvis forholdene tillater det, kan supernatantene gjennomgå neste generasjons sekvenseringsanalyse for å identifisere nye virus og oppnå hele virusgenomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter inokulering med mygghomogenatenes supernatanter (P0) viste C6/36-cellene et bredt intercellulært rom, og eksfolierte celler ble observert ved 120 timer (figur 1A) sammenlignet med de ikke-inokulerte cellene (kontroll) samtidig (figur 1B). Etter å ha inkubert BHK-21-cellene med P3-supernatantene, ble synlig CPE observert i BHK-21-cellene ved 48 timer (figur 1C) i motsetning til kontrollcellene (figur 1D). PCR ble utført for å bestemme virusarter. De universelle primerne for påvisning av flavivirus, alfavirus og bunyavirus ble kommersielt syntetisert (tabell 1). Et PCR-produkt for bunyavirus Ebinur Lake Virus ble satt som en positiv kontroll og lagt til i Lane 1. De universelle primerne for bunyavirus, flavivirus og alfavirus ble brukt til å generere PCR-produktene for viral supernatant, som deretter ble lagt til henholdsvis Lane 2, 3 og 4. De estimerte størrelsene på PCR-produktene for flavivirus, alfavirus og bunyavirus var henholdsvis 266 bp, 434 bp og 251 bp. Båndene var bare synlige i Lane 2 og den positive kontrollen Lane 1. Som et resultat er viruset i supernatantene sannsynligvis et bunyavirus (figur 2).
Figur 1 CPE-observasjon av celler etter inkubasjonen med virale supernatanter. Status for C6/36-celler ved 120 timer etter infeksjon (CPE) (A) og status for kontrollcellene samtidig (B). Statusen til BHK-21-celler ved 48 hpi (C) og kontrollcellene (D). Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: CPE = cytopatogen effekt; HPI = timer etter infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: PCR-resultater for virale supernatanter. Lane 1 representerer den positive kontrollen av bunyavirus (Ebinur Lake Virus). Banene 2-4 representerte PCR-resultatene av supernatanter ved å bruke universelle primere for bunyavirus (251 bp), flavivirus (266 bp) og alfavirus (434 bp). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Virus | Grunning | Oligonukleotid (5'→3') | Størrelsen på PCR-produktet (bp) | ||
| Flavivirus | F1 | TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA | 266 | ||
| F2 | GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC | ||||
| Alfavirus | M2W | YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| Bunyavirus | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
Tabell 1: Universelle primere for påvisning av arbovirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne metoden var å tilby en praktisk måte å isolere myggassosierte virus ved hjelp av forskjellige cellelinjer. Det er viktig å legge til antibiotika-antimykotisk (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin) til supernatanter av mygghomogenatene for å unngå forurensning av bakterier eller sopp. Mygg og virale supernatanter oppnådd i felt må oppbevares i kjøleskap ved -80 °C for å unngå gjentatte fryse-tine-sykluser.
Et annet kritisk skritt i protokollen var sliping. Myggprøver skal pulveriseres grundig og lagres på is. Utilstrekkelig malt myggvev kan indusere celledød og kan forskyve funnene av CPE-analyse. Før virusisolering er det nødvendig å bruke vanlige mygg for å bekrefte slipeparametrene. Sliping må gjøres ved lave temperaturer for å forhindre at viruset blir inaktivt under prosessen.
Denne tilnærmingen kan effektivt isolere og forsterke myggassosierte virus, men er bare akseptabelt for virus som kan vise CPE i pattedyr- eller insektcellelinjer. Denne tilnærmingen er upassende for virus som ikke induserer CPE. Ved hjelp av protokollen kan vi få viruskandidater som bare inneholder en virustype eller en blanding med forskjellige virus. Ytterligere undersøkelser - viral rensing, morfologisk identifikasjon og plakkanalyse - er fortsatt nødvendig for å oppnå det rensede viruset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z.
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E.
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , Suzhou University Press. (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
