Summary
수많은 새로운 바이러스 유사 서열이 시퀀싱 기술의 광범위한 사용으로 인해 모기에서 발견되었습니다. 우리는 척추동물 및 모기 세포주를 사용하여 바이러스를 분리하고 증폭하는 효과적인 절차를 제공하며, 이는 모기 매개 및 모기 특이적 바이러스를 포함한 모기 관련 바이러스에 대한 향후 연구의 기초가 될 수 있습니다.
Abstract
시퀀싱 기술의 광범위한 적용으로 모기를 포함한 절지동물에서 많은 새로운 바이러스 유사 서열이 발견되었습니다. 이러한 새로운 모기 관련 바이러스의 두 가지 주요 범주는 "모기 매개 바이러스(MBV)"와 "모기 특이 바이러스(MSV)"입니다. 이 새로운 바이러스는 척추동물과 모기 모두에 병원성일 수도 있고 모기와 공생할 수도 있습니다. 엔티티 바이러스는 이러한 바이러스의 생물학적 특성을 확인하는 데 필수적입니다. 따라서, 현장에서 채취한 모기로부터 바이러스 분리 및 증폭을 위한 상세한 프로토콜이 여기에 설명되었다. 먼저, 모기 샘플을 모기 균질액의 상청액으로 제조하였다. 2회 원심분리 후, 상층액을 바이러스 증폭을 위해 모기 세포주 C6/36 또는 척추동물 세포주 BHK-21에 접종하였다. 7일 후, 상청액을 P1 상청액으로서 수집하고, -80°C에서 보관하였다. 다음으로, P1 상청액을 C6/36 또는 BHK-21 세포에 2회 더 계대배양하면서 세포 상태를 매일 확인했습니다. 세포에 대한 세포병리학적 효과(CPE)가 발견되었을 때, 이러한 상청액을 수집하여 바이러스를 식별하는 데 사용했습니다. 이 프로토콜은 MBV 및 MSV를 포함한 모기 관련 바이러스에 대한 향후 연구의 기초 역할을 합니다.
Introduction
모기는 중요한 병원성 절지 동물 벡터 그룹입니다. Culicidae 1,2과에는 약 3,500 종의 모기가 있습니다. 고처리량 염기서열 분석 기술의 개발로 인해 세계 여러 지역의 모기에서 바이러스와 유사한 새로운 염기서열이 많이 발견되었습니다3. 일반적으로 이러한 모기 관련 바이러스는 MBV와 MSV의 두 가지 주요 그룹으로 분류할 수 있습니다.
MBV는 황열병 바이러스(YFV), 뎅기열 바이러스(DENV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 웨스트 나일 바이러스(WNV) 및 리프트 밸리 열병 바이러스(RVFV)와 같은 많은 인간 또는 동물 질병의 원인 물질인 다양한 바이러스 그룹입니다4. 그들은 전 세계의 인간과 동물 모두에게 심각한 이환율과 사망률을 유발하여 공중 보건을 심각하게 위협했습니다. MBV는 감염된 모기에서 순진한 숙주로, 바이러스에 감염된 숙주와 먹이를 먹는 모기로 전염됨으로써 다양한 숙주 간의 수명 주기를 자연적으로 유지한다5. 따라서 이러한 바이러스는 실험실에서 모기 세포주와 척추동물 세포주를 모두 감염시킬 수 있다1.
이창 바이러스(Yichang virus, YCN), 쿨렉스 플라비바이러스(Culex flavivirus, CxFV) 및 차오양 바이러스(Chaoyang virus, CHAOV)를 포함하는 MSV는 곤충 특이적 바이러스의 하위군이다 1,6,7. 최근 몇 년 동안 새로운 MSV의 발견이 증가했으며 이러한 MSV 중 일부는 MBV의 전송에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다. 예를 들어, Culex pipiens에서 지속적인 감염이 될 수 있는 CxFV는 초기 단계에서 WNV 복제를 억제할 수 있다8. 또 다른 곤충 특이적 플라비바이러스인 세포융합제 바이러스(cell-fusing agent virus, CFAV)는 이집트숲모기에서 DENV와 지카 바이러스(Zika virus, ZIKV)의 번식을 억제하는 것으로 밝혀졌다9. 따라서 이 프로토콜은 모기 관련 바이러스를 분리하는 데 유용한 접근 방식이며 모기와 관련된 병원체의 분포 및 모기 매개 질병의 통제에 대한 추가 연구에 도움이 될 수 있습니다.
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Protocol
1. 모기 샘플링 및 분류
- 가벼운 함정 MXA-02 또는 현장의 이산화탄소 모기 함정을 통해 성인 모기를 잡으십시오.
- 액체 질소10,11에 담궈 수집 된 모기를 죽입니다. 콜드 체인 물류 시스템12에 의해 실험실로 운송합니다.
참고: 드라이아이스는 주로 콜드체인 물류 시스템에 사용되었습니다. - (선택 사항) 샘플 사이트가 실험실 근처에 있는 경우 그물 덫에 있는 살아있는 모기를 실험실로 직접 보내고 ≤-20°C에서 30분 동안 동결하여 안락사시킵니다4.
- 모기의 분류 및 식별을 위해 도구 책13 을 통해 수집 된 모기의 형태 학적 식별을하십시오.
참고: 필요하다면, DNA 바코드를 사용하여 모기를 분류하고 식별할 수 있다14,15. - 샘플링 날짜와 부위에 따라 다른 풀에 할당한 다음 2-5mL 튜브에 보관합니다.
- 모기 종, 수, 샘플링 코드, 날짜 및 장소로 각 튜브를 기록하는 표를 그립니다.
- 샘플링 코드가 있는 라벨을 인쇄하여 튜브에 부착합니다.
- 추가 분석이 있을 때까지 모기 샘플이 담긴 튜브를 -80°C에 보관하십시오.
2. 모기 연삭
- 20% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 용액이 포함된 1.5mL의 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI) 배지와 함께 3mm 세라믹 비드가 있는 각 20-50마리의 모기를 각 2mL 멸균 튜브에 넣습니다.
알림: 튜브를 얼음 또는 멋진 트레이에 보관하십시오. - 모기를 저온 조직 균질화기로 균질화하여 3 사이클 동안 4°C에서 70 Hz에서 30초 동안 분쇄한다16.
- 혼합물을 15,000 × g 에서 4 ° C에서 30 분 동안 원심 분리하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
- 상층액을 다시 15,000 × g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 모기 파편12,17을 제거하였다.
참고: 필요한 경우 0.22μm 필터를 사용하여 상층액을 여과할 수 있습니다. - 상층액(P0)을 2mL 스크류 캡 보관 튜브(튜브당 200μL)에 분취하여 -80°C에서 보관합니다.
3. 세포 및 세포배양 유지배지의 제조
참고: 모기 세포주 C6/36(Aedes albopictus RNAi 결핍) 및 척추동물 세포주 BHK-21(아기 햄스터 신장)을 바이러스 증폭 및 분리에 사용했습니다.
- 1 × 106 C6/36 세포를 75cm2 플라스크에 접종하고 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 보충된 10mL의 RPMI 배지를 5%CO2 가습 인큐베이터에서 28°C로 접종합니다.
- 1 ×10 6 BHK-21 세포를 5%CO2 가습 인큐베이터에서 37°C에서 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM) 10mL와 함께 75cm2 플라스크에 접종합니다.
참고: 세포를 주당 2-3회 계대배양하였다17,18. - 75cm2 플라스크에서 배양된 세포(C6/36 또는 BHK-21 세포)를 24-웰 플레이트에 시드(웰당 C6/36: 1.4 × 105; 웰 당 BHK-21 : 0.8 × 105).
- 24-웰 플레이트를 28°C 또는 37°C에서 하룻밤 동안 배치한다.
- 현미경으로 세포를 관찰하고 각 웰의 세포 밀도가 80%-90%인지 확인합니다.
- 세포 배양 유지 배지(500 mL)를 준비한다.
참고: C6/36의 경우, 배지는 2% FBS 및 2% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 용액으로 보충된 RPMI 배지였습니다. BHK-21의 경우, 배지는 2% FBS 및 2% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 용액으로 보충된 DMEM 배지였다.
4. 바이러스 격리
참고: 모든 단계는 생물안전 레벨 2(BSL-2) 실험실에서 수행되었습니다. 생물 안전 실험실의 안전 수준 요구 사항은 다른 국가 및 지역의 규정을 기반으로 한 생물 안전 위험 평가에 의해 결정되었습니다. 이 과정은 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.
- 24-웰 플레이트에서 세포 배양 배지를 제거하고, 각 웰에 100 μL의 세포 배양 유지 배지와 100 μL의 모기 균질액(P0)의 상청액을 첨가한다.
- 플레이트를 28°C 또는 37°C에서 60분 동안 배양하고 세포 건조를 방지하기 위해 15분마다 부드럽게 흔들어 줍니다.
- 상층액을 제거하고 600 μL의 세포 배양 유지 배지로 각 웰을 부드럽게 헹구어 파편을 완전히 제거한다.
- 800 μL의 세포 배양 유지 배지를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 28°C 또는 37°C에서 7일 동안 5%CO2 가습 인큐베이터에 보관한다.
- 현미경으로 각 웰의 세포 상태를 매일모니터링한다 15.
- 7일째 에 세포의 상층액(P1 상층액)을 수집하고, 상층액을 -80°C에서 보관한다.
- 4.1-4.6 단계를 2x 반복하여 P2 및 P3 상청액을 얻습니다.
참고: 4.3 단계에서, 600 μL의 세포 배양 유지 배지로 각 웰을 부드럽게 헹구는 것은 P2 및 P3에 대해 선택적이었다. - 세포 병원성 효과 (CPE)를 잘 나타내는 것에 따라 - 세포는 죽고, pyknosis 및 표면에서 분리됩니다. syncytia를 형성하기 위해 인접한 세포와의 융합; 또는 핵 또는 세포질 봉입체의 출현 — 이 CPE 웰의 상청액 300-400μL을 세포를 포함하는 새로운 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다(세포 밀도는 80%-90%).
- 상층액을 수집하고 2mL 스크류 캡 보관 튜브(튜브당 500μL)에 분취합니다. -80 °C에서 보관하십시오.
참고: 세포에서 3세대에 걸친 연속적인 계대배양 후, CPE를 유도하지 않은 샘플은 폐기되었습니다. 필요한 경우 세포에서 연속적인 계대 세대를 늘릴 수 있습니다.
5. RT-PCR에 의한 바이러스 서열 검출
- 바이러스 RNA 미니 키트16을 사용하여 바이러스 상청액 200 μL로부터 총 RNA를 추출한다.
참고: 여기서는 기기 제조업체의 지침에 따라 총 RNA를 추출하기 위해 자동 핵산 추출 시스템을 사용했습니다. - PCR 기기를 사용하여 RT-PCR 키트 지침에 따라 RNA를 cDNA로 전환시킵니다.
- 1 μL의 무작위 프라이머와 혼합된 15 μL의 RNA를 PCR 튜브에 추가합니다. 튜브를 70°C에서 5분 동안 놓은 다음 5분 동안 얼음 위에 놓습니다.
- 5x 완충액 5μL와 혼합물 25μL(10mM dNTP, 40U/μL RNase 억제제 및 200U/μL M-MLV)를 튜브에 넣고 튜브를 42°C에서 60분, 95°C에서 10분 동안 놓습니다.
- 튜브를 -20 °C에서 보관하십시오.
- PCR 키트와 범용 프라이머(표 1)를 사용하여 PCR로 바이러스를 검출합니다.
- 아르보 바이러스의 경우, 다음 성분으로 PCR 반응 시스템(총 30 μL)을 설정합니다: 3 μL의 10x Taq 완충액, 3 μL의 dNTP(1mM), 1 μL의 정방향 프라이머(10 μm), 1 μL의 역방향 프라이머(10 μm), 0.3 μL의 Taq(10 U/μL), 19.7 μL의 ddH2O 및 2 μL의 cDNA.
- 플라비바이러스의 검출을 위해, 반응 과정을 다음과 같이 설정한다: 단계 1: 30초 동안 94°C, 30초 동안 52°C, 30초 동안 72°C의 35 사이클; 2단계: 72°C에서 10분 동안
- 알파 바이러스의 검출을 위해, 반응 과정을 다음과 같이 설정하십시오 : 1 단계 : 30 초 동안 94 °C, 30 초 동안 50 °C, 30 초 동안 72 °C의 35 사이클; 2단계: 72°C에서 10분 동안
- 분야바이러스의 검출을 위해, 반응 과정을 다음과 같이 설정한다: 단계 1: 30초 동안 94°C, 30초 동안 50°C, 30초 동안 72°C의 35 사이클; 2단계: 72°C에서 10분 동안
- PCR 증폭 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동으로 검출하고 시퀀싱 분석을 위해 보냅니다.
참고: 조건이 허락하는 경우 상층액을 차세대 시퀀싱 분석을 통해 새로운 바이러스를 식별하고 전체 바이러스 게놈 서열을 얻을 수 있습니다.
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Representative Results
모기 균질액(P0)의 상층액을 접종한 후, C6/36 세포는 넓은 세포간 공간을 나타내었고, 박리된 세포는 접종되지 않은 세포(대조군)에 비해 120시간(그림 1A)에서 동시에 관찰되었습니다(그림 1B). BHK-21 세포를 P3 상층액과 함께 배양한 후, 대조군 세포(도 1D)와 대조적으로 48시간(그림 1C)에 BHK-21 세포에서 가시적인 CPE가 관찰되었습니다. 바이러스 종을 결정하기 위해 PCR을 수행하였다. 플라비바이러스, 알파바이러스 및 분야바이러스의 검출을 위한 범용 프라이머를 상업적으로 합성하였다(표 1). 분야바이러스 에비누르 레이크 바이러스에 대한 PCR 산물을 양성 대조군으로 설정하고 레인 1에 첨가하였다. 부냐바이러스, 플라비바이러스 및 알파바이러스에 대한 범용 프라이머를 사용하여 바이러스 상청액에 대한 PCR 산물을 생성한 다음 각각 레인 2, 3 및 4에 첨가했습니다. 플라비바이러스, 알파바이러스 및 분야바이러스에 대한 PCR 산물의 추정 크기는 각각 266bp, 434bp 및 251bp였습니다. 밴드는 레인 2와 양성 대조군 레인 1에서만 볼 수 있었습니다. 그 결과, 상층액의 바이러스는 분야바이러스일 가능성이 높습니다(그림 2).
그림 1: 바이러스 상층액과 함께 배양한 후 세포의 CPE 관찰. 감염 후 120시간(CPE)의 C6/36 세포 상태(A)와 동시에 대조군 세포의 상태(B). 48 hpi에서 BHK-21 세포의 상태(C)와 대조군 세포(D)의 상태. 스케일 바 = 100 μm. 약어: CPE = 세포병원성 효과; HPI = 감염 후 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 바이러스 상청액에 대한 PCR 결과. 레인 1은 에비누르 레이크 바이러스(Ebinur Lake Virus)의 양성 대조군을 나타낸다. 레인 2-4는 분야바이러스(251 bp), 플라비바이러스(266 bp) 및 알파바이러스(434 bp)에 대한 유니버셜 프라이머를 사용하여 상층액의 PCR 결과를 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 바이러스 | 입문서 | 올리고뉴클레오티드(5'→3') | PCR 산물의 크기(bp) | ||
| 플라 비 바이러스 | F1 키 | 타카캇갓가가아아가아 | 266 | ||
| F2 키 | GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC | ||||
| 알파 바이러스 | M2w (엠투더블) | YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| 부냐바이러스 | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V (영문) | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
표 1: 아르보 바이러스 검출을 위한 범용 프라이머.
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Discussion
이 방법의 목적은 다양한 세포주를 사용하여 모기 관련 바이러스를 분리하는 실용적인 방법을 제공하는 것이었습니다. 박테리아나 곰팡이에 의한 오염을 피하기 위해 모기 균질액의 상층액에 항생제-항진균제(페니실린-스트렙토마이신-암포테리신)를 첨가하는 것이 중요합니다. 현장에서 얻은 모기와 바이러스 상층액은 반복되는 동결-해동 주기를 피하기 위해 -80°C에서 냉장 보관해야 합니다.
프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 연삭이었습니다. 모기 샘플은 철저히 가루로 만들어 얼음에 보관해야합니다. 불충분하게 분쇄된 모기 조직은 세포 사멸을 유도할 수 있으며 CPE 분석 결과를 왜곡할 수 있습니다. 바이러스를 분리하기 전에 분쇄 매개 변수를 확인하기 위해 일반 모기를 사용해야합니다. 분쇄는 공정 중에 바이러스가 비활성화되는 것을 방지하기 위해 저온에서 이루어져야 합니다.
이 접근법은 모기 관련 바이러스를 효과적으로 분리하고 증폭할 수 있지만 포유류 또는 곤충 세포주에서 CPE를 나타낼 수 있는 바이러스에만 허용됩니다. 이 접근법은 CPE를 유도하지 않는 바이러스에는 적합하지 않습니다. 프로토콜을 사용하여 한 가지 바이러스 유형만 포함하거나 다른 바이러스와 혼합된 바이러스 후보를 얻을 수 있습니다. 정제된 바이러스를 얻기 위해서는 바이러스 정제, 형태학적 식별 및 플라크 분석과 같은 추가 조사가 여전히 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 우한 과학 기술 계획 프로젝트 (2018201261638501)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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