Summary
Numerose nuove sequenze simili a virus sono state trovate nelle zanzare a causa dell'ampio uso di tecnologie di sequenziamento. Forniamo una procedura efficace per isolare e amplificare i virus utilizzando linee cellulari di vertebrati e zanzare, che potrebbero servire come base per studi futuri sui virus associati alle zanzare, compresi i virus trasmessi dalle zanzare e specifici per le zanzare.
Abstract
Con l'ampia applicazione delle tecnologie di sequenziamento, molte nuove sequenze simili a virus sono state scoperte negli artropodi, comprese le zanzare. Le due categorie principali di questi nuovi virus associati alle zanzare sono "virus trasmessi dalle zanzare (MBV)" e "virus specifici delle zanzare (MSV)". Questi nuovi virus potrebbero essere patogeni sia per i vertebrati che per le zanzare, o potrebbero semplicemente essere simbiotici con le zanzare. I virus entità sono essenziali per confermare i caratteri biologici di questi virus. Pertanto, qui è stato descritto un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'amplificazione del virus dalle zanzare raccolte sul campo. In primo luogo, i campioni di zanzara sono stati preparati come surnatanti di omogenati di zanzare. Dopo due centrifugazioni, i surnatanti sono stati poi inoculati nella linea cellulare di zanzara C6/36 o nella linea cellulare di vertebrati BHK-21 per l'amplificazione del virus. Dopo 7 giorni, i surnatanti sono stati raccolti come supernatanti P1 e conservati a -80 °C. Successivamente, i supernatanti P1 sono stati fatti passare altre due volte nelle cellule C6/36 o BHK-21 mentre lo stato della cellula veniva controllato quotidianamente. Quando è stato scoperto l'effetto citopatogeno (CPE) sulle cellule, questi surnatanti sono stati raccolti e utilizzati per identificare i virus. Questo protocollo serve come base per la ricerca futura sui virus associati alle zanzare, inclusi MBV e MSV.
Introduction
Le zanzare sono un gruppo di importanti vettori di artropodi patogeni. Ci sono circa 3.500 specie di zanzare nella famiglia Culicidae 1,2. Lo sviluppo di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento ha portato alla scoperta di molte nuove sequenze simili a virus nelle zanzare provenienti da diverse parti del mondo3. Generalmente, questi virus associati alle zanzare possono essere classificati in due gruppi principali: MBV e MSV.
Gli MBV sono un gruppo di virus diversi che sono agenti causali di molte malattie umane o animali, come il virus della febbre gialla (YFV), il virus della dengue (DENV), il virus dell'encefalite giapponese (JEV), il virus del Nilo occidentale (WNV) e il virus della febbre della Rift Valley (RVFV)4. Hanno seriamente minacciato la salute pubblica causando gravi morbilità e mortalità sia negli esseri umani che negli animali in tutto il mondo. Gli MBV sostengono naturalmente un ciclo di vita tra diversi ospiti attraverso la trasmissione da una zanzara infetta a un ospite ingenuo, nonché da un ospite infetto da virus e da una zanzara nutriente5. Pertanto, questi virus possono infettare sia le linee cellulari di zanzara che le linee cellulari di vertebrati nel laboratorio1.
Gli MSV, che includono il virus Yichang (YCN), il flavivirus Culex (CxFV) e il virus Chaoyang (CHAOV), sono un sottogruppo di virus specifici per insetti 1,6,7. Negli ultimi anni, c'è stato un aumento nella scoperta di nuovi MSV e alcuni di questi MSV hanno avuto un impatto sulla trasmissione di MBV. Ad esempio, CxFV, che può essere un'infezione persistente in Culex pipiens, potrebbe sopprimere la replicazione WNV in una fase iniziale8. Un altro flavivirus specifico per insetti, il virus dell'agente di fusione cellulare (CFAV), è stato trovato per inibire la propagazione del virus DENV e Zika (ZIKV) nelle zanzare Aedes aegypti 9. Pertanto, questo protocollo è un approccio utile per isolare i virus associati alle zanzare e può aiutare in ulteriori ricerche sulla distribuzione di agenti patogeni legati alle zanzare e sul controllo delle malattie trasmesse dalle zanzare.
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Protocol
1. Campionamento e selezione delle zanzare
- Intrappola le zanzare adulte attraverso le trappole luminose MXA-02 o le trappole per zanzare ad anidride carbonica sul campo.
- Uccidere le zanzare raccolte immergendo nell'azoto liquido10,11. Trasportarli in laboratorio con il sistema logistico della catena del freddo12.
NOTA: il ghiaccio secco è stato utilizzato principalmente nel sistema logistico della catena del freddo. - (Facoltativo) Se i siti di campionamento erano vicini al laboratorio, inviare direttamente le zanzare vive nelle trappole di rete al laboratorio e eutanasizzarle congelandole a ≤-20 ° C per 30 minuti4.
- Fare un'identificazione morfologica delle zanzare raccolte attraverso il libro degli strumenti13 per la classificazione e l'identificazione delle zanzare.
NOTA: Se necessario, il codice a barre del DNA potrebbe essere utilizzato per classificare e identificare le zanzare14,15. - In base alle date e ai siti di campionamento, assegnarli in diversi pool e quindi conservarli in tubi da 2-5 ml.
- Disegna una tabella per registrare ogni tubo con specie di zanzare, numero, codice di campionamento, data e siti.
- Stampare le etichette con i codici di campionamento e attaccarle ai tubi.
- Conservare provette con i campioni di zanzara a -80 °C fino a ulteriori analisi.
2. Macinazione delle zanzare
- Posizionare 20-50 zanzare in ogni tubo sterile da 2 ml con perline di ceramica da 3 mm con 1,5 ml di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenente il 2% di soluzione di penicillina-streptomicina-amfotericina B.
NOTA: Tenere i tubi su ghiaccio o su un bel vassoio. - Omogeneizzare le zanzare con un omogeneizzatore tissutale a bassa temperatura macinando per 30 s a 70 Hz a 4 °C per tre cicli16.
- Centrifugare le miscele a 15.000 × g per 30 minuti a 4 °C e trasferire i surnatanti in nuovi provette.
- Centrifugare nuovamente i surnatanti a 15.000 × g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti di zanzara12,17.
NOTA: Se necessario, i surnatanti possono essere filtrati utilizzando filtri da 0,22 μm. - Aliquotare i surnatanti (P0) in provette di stoccaggio con tappo a vite da 2 mL (200 μL per provetta) e conservarle a -80 °C.
3. Preparazione delle cellule e terreno di mantenimento della coltura cellulare
NOTA: La linea cellulare di zanzara C6/36 (Aedes albopictus RNAi-carente) e la linea cellulare di vertebrati BHK-21 (rene di criceto) sono state utilizzate per l'amplificazione e l'isolamento del virus.
- Inoculare 1 × 106 cellule C6/36 in un matraccio da 75 cm 2 con 10 ml di terreno RPMI integrato con siero fetale fetale (FBS) al 10% e penicillina/streptomicina (P/S) all'1% a 28 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2.
- Inoculare 1 × 106 cellule BHK-21 in un matraccio da 75 cm 2 con 10 ml di terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con 10% FBS e 1% P/S a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2.
NOTA: Le celle sono state fatte passare due o tre volte alla settimana17,18. - Seminare le cellule coltivate in un matraccio da 75 cm2 (cellule C6/36 o BHK-21) nelle piastre a 24 pozzetti (C6/36 per pozzetto: 1,4 × 105; BHK-21 per pozzetto: 0,8 × 105).
- Posizionare le piastre a 24 pozzetti a 28 °C o 37 °C durante la notte.
- Osservare le cellule al microscopio e confermare se la confluenza cellulare in ciascun pozzetto è dell'80% -90%.
- Preparare il terreno di mantenimento della coltura cellulare (500 ml).
NOTA: Per C6/36, il mezzo era RPMI medio integrato con 2% FBS e 2% Penicillina-streptomicina-amfotericina B soluzione. Per BHK-21, il mezzo era DMEM medio integrato con 2% FBS e 2% Penicillina-streptomicina-amfotericina B soluzione.
4. Isolamento del virus
NOTA: Tutte le fasi sono state eseguite in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Il requisito del livello di sicurezza del laboratorio di biosicurezza è stato determinato dalla valutazione del rischio di biosicurezza basata sulle normative di diversi paesi e regioni. Il processo deve essere eseguito in un armadio di biosicurezza.
- Rimuovere il terreno di coltura cellulare dalle piastre a 24 pozzetti e aggiungere 100 μL del terreno di mantenimento della coltura cellulare e 100 μL del surnatante dell'omogenato di zanzara (P0) a ciascun pozzetto.
- Incubare le piastre a 28 °C o 37 °C per 60 minuti e agitarle delicatamente ogni 15 minuti per evitare l'essiccazione delle cellule.
- Rimuovere il surnatante e sciacquare delicatamente ciascuno con 600 μL di terreno di mantenimento della coltura cellulare per rimuovere completamente i detriti.
- Aggiungere 800 μL di terreno di mantenimento della coltura cellulare a ciascun pozzetto e conservare le piastre in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 28 °C o 37 °C per 7 giorni.
- Monitorare quotidianamente lo stato cellulare di ciascun pozzetto al microscopio15.
- Raccogliere i surnatanti delle cellule (supernatanti P1) il 7 ° giorno e conservare i surnatanti a -80° C.
- Ripetere i passaggi 4.1-4.6 2x per ottenere i supernatanti P2 e P3.
NOTA: Nella fase 4.3, il risciacquo delicato di ciascun pozzetto con 600 μL di terreno di mantenimento della coltura cellulare era facoltativo per P2 e P3. - A seconda di quale pozzo mostra l'effetto citopatogeno (CPE) - le cellule muoiono, la picnosi e si staccano dalla superficie; fusione con cellule adiacenti per formare sincizia; o la comparsa di corpi di inclusione nucleare o citoplasmatica - aggiungere 300-400 μL del surnatante di questo pozzo CPE in ciascun pozzetto delle nuove piastre a 6 pozzetti contenenti cellule (la confluenza cellulare era 80% -90%) per amplificare notevolmente i virus.
- Raccogliere i surnatanti e distribuirli in provette di stoccaggio con tappo a vite da 2 ml (500 μL per provetta). Conservarli a -80 °C.
NOTA: Dopo tre generazioni di passaggi successivi nelle cellule, i campioni che non hanno indotto CPE sono stati scartati. Se necessario, le generazioni di passaggio successivo nelle cellule possono essere aumentate.
5. Rilevamento di sequenze virali mediante RT-PCR
- Estrarre l'RNA totale da 200 μL del surnatante virale utilizzando un mini kit di RNA virale16.
NOTA: Qui, è stato utilizzato un sistema automatizzato di estrazione degli acidi nucleici per estrarre l'RNA totale seguendo le istruzioni del produttore dello strumento. - Convertire l'RNA in cDNA seguendo le istruzioni del kit RT-PCR utilizzando uno strumento PCR.
- Aggiungere 15 μL di RNA mescolato con 1 μL di primer casuali nella provetta PCR. Posizionare il tubo a 70 °C per 5 minuti e poi metterlo in ghiaccio per 5 minuti.
- Aggiungere 5 μL di tampone 5x e 25 μL di miscela (10 mM dNTP, 40 U/μL RNasi inibitore e 200 U/μL M-MLV) nel tubo e posizionare il tubo a 42 °C per 60 minuti e 95 °C per 10 minuti.
- Conservare il tubo a -20 °C.
- Utilizzare un kit PCR e primer universali (Tabella 1) per rilevare i virus mediante PCR.
- Per gli arbovirus, impostare il sistema di reazione PCR (totale 30 μL) con i seguenti componenti: 3 μL di tampone Taq 10x, 3 μL di dNTP (1mM), 1 μL di primer diretto (10 μm), 1 μL di primer inverso (10 μm), 0,3 μL di Taq (10 U/μL), 19,7 μL di ddH 2 O e2μL di cDNA.
- Per la rilevazione di flavivirus, impostare il processo di reazione come: fase 1: 35 cicli di 94 °C per 30 s, 52 °C per 30 s e 72 °C per 30 s; tappa 2: 72 °C per 10 min.
- Per la rilevazione di alfavirus, impostare il processo di reazione come: fase 1: 35 cicli di 94 °C per 30 s, 50 °C per 30 s e 72 °C per 30 s; tappa 2: 72 °C per 10 min.
- Per la rilevazione di bunyavirus, impostare il processo di reazione come: fase 1: 35 cicli di 94 °C per 30 s, 50 °C per 30 s e 72 °C per 30 s; tappa 2: 72 °C per 10 min.
- Rilevare i prodotti di amplificazione PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio all'1% e inviarli per l'analisi di sequenziamento.
NOTA: Se le condizioni lo consentono, i surnatanti possono essere sottoposti ad analisi di sequenziamento di nuova generazione per identificare nuovi virus e ottenere l'intero genoma virale.
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Representative Results
Dopo l'inoculazione con i surnatanti degli omogenati di zanzara (P0), le cellule C6/36 hanno mostrato un ampio spazio intercellulare e le cellule esfoliate sono state osservate a 120 ore (Figura 1A) rispetto alle cellule non inoculate (controllo) allo stesso tempo (Figura 1B). Dopo aver incubato le cellule BHK-21 con i supernatanti P3, è stato osservato CPE visibile nelle cellule BHK-21 a 48 ore (Figura 1C) in contrasto con le cellule di controllo (Figura 1D). La PCR è stata eseguita per determinare le specie virali. I primer universali per la rilevazione di flavivirus, alfavirus e bunyavirus sono stati sintetizzati commercialmente (Tabella 1). Un prodotto PCR per il bunyavirus Ebinur Lake Virus è stato impostato come controllo positivo e aggiunto nella corsia 1. I primer universali per bunyavirus, flavivirus e alfavirus sono stati utilizzati per generare i prodotti PCR per il surnatante virale, che sono stati poi aggiunti rispettivamente nella corsia 2, 3 e 4. Le dimensioni stimate dei prodotti PCR per flavivirus, alfavirus e bunyavirus erano rispettivamente di 266 bp, 434 bp e 251 bp. Le bande erano visibili solo nella corsia 2 e nella corsia di controllo positivo 1. Di conseguenza, è probabile che il virus nei surnatanti sia un bunyavirus (Figura 2).
Figura 1: Osservazione CPE delle cellule dopo l'incubazione con i surnatanti virali. Lo stato delle cellule C6/36 a 120 ore dopo l'infezione (CPE) (A) e quello delle cellule di controllo allo stesso tempo (B). Lo stato delle cellule BHK-21 a 48 hpi (C) e quello delle celle di controllo (D). Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: CPE = effetto citopatogeno; HPI = ore dopo l'infezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Risultati della PCR per i surnatanti virali. La corsia 1 rappresenta il controllo positivo dei bunyavirus (Ebinur Lake Virus). Le corsie 2-4 rappresentavano i risultati della PCR dei supernatanti utilizzando primer universali per bunyavirus (251 bp), flavivirus (266 bp) e alfavirus (434 bp). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Virus | Abbecedario | Oligonucleotide (5'→3') | La dimensione del prodotto PCR (bp) | ||
| Flavivirus | F1 | TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAGAA | 266 | ||
| F2 | GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC | ||||
| Alfavirus | M2w | YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| Bunyavirus | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
Tabella 1: Primer universali per il rilevamento di arbovirus.
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Discussion
L'obiettivo di questo metodo era quello di offrire un modo pratico per isolare i virus associati alle zanzare utilizzando varie linee cellulari. È fondamentale aggiungere l'antibiotico-antimicotico (penicillina-streptomicina-amfotericina) ai surnatanti degli omogenati di zanzara per evitare la contaminazione da batteri o funghi. Le zanzare e i supernatanti virali ottenuti sul campo devono essere refrigerati a -80 °C per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo.
Un altro passo fondamentale nel protocollo è stato il macinamento. I campioni di zanzara devono essere accuratamente polverizzati e conservati sul ghiaccio. I tessuti delle zanzare non sufficientemente macinati possono indurre la morte cellulare e possono distorcere i risultati dell'analisi CPE. Prima dell'isolamento del virus, è necessario impiegare zanzare normali per confermare i parametri di macinazione. La macinazione deve essere eseguita a basse temperature per evitare che il virus diventi inattivo durante il processo.
Questo approccio può isolare e amplificare efficacemente i virus associati alle zanzare, ma è accettabile solo per i virus che possono mostrare CPE in linee cellulari di mammiferi o insetti. Questo approccio non è appropriato per i virus che non inducono CPE. Utilizzando il protocollo, possiamo ottenere candidati virali che contengono un solo tipo di virus o una miscela con virus diversi. Ulteriori indagini – purificazione virale, identificazione morfologica e analisi della placca – sono ancora necessarie per ottenere il virus purificato.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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