Summary
Talrijke nieuwe virusachtige sequenties zijn gevonden in muggen als gevolg van het uitgebreide gebruik van sequencing-technologieën. We bieden een effectieve procedure voor het isoleren en versterken van virussen met behulp van gewervelde en muggencellijnen, die als basis kunnen dienen voor toekomstige studies naar muggengerelateerde virussen, waaronder door muggen overgedragen en muggenspecifieke virussen.
Abstract
Met de brede toepassing van sequencingtechnologieën zijn veel nieuwe virusachtige sequenties ontdekt in geleedpotigen, waaronder muggen. De twee belangrijkste categorieën van deze nieuwe muggen-geassocieerde virussen zijn "mug-borne virussen (MBV's)" en "mug-specifieke virussen (MSV's)". Deze nieuwe virussen kunnen pathogeen zijn voor zowel gewervelde dieren als muggen, of ze kunnen gewoon symbiotisch zijn met muggen. Entiteitsvirussen zijn essentieel om de biologische kenmerken van deze virussen te bevestigen. Zo is hier een gedetailleerd protocol beschreven voor virusisolatie en versterking van in het veld verzamelde muggen. Eerst werden de muggenmonsters bereid als supernatanten van muggenhomogenaten. Na tweemaal centrifugeren werden de supernatanten vervolgens ingeënt in muggencellijn C6/36 of gewervelde cellijn BHK-21 voor virusversterking. Na 7 dagen werden de supernatanten verzameld als de P1-supernatanten en bewaard bij -80 °C. Vervolgens werden P1-supernatanten nog twee keer gepasseerd in C6/36- of BHK-21-cellen terwijl de celstatus dagelijks werd gecontroleerd. Toen cytopathogeen effect (CPE) op de cellen werd ontdekt, werden deze supernatanten verzameld en gebruikt om virussen te identificeren. Dit protocol dient als basis voor toekomstig onderzoek naar muggen-geassocieerde virussen, waaronder MBV's en MSV's.
Introduction
Muggen zijn een groep belangrijke pathogene geleedpotige vectoren. Er zijn ongeveer 3.500 soorten muggen in de familie Culicidae 1,2. De ontwikkeling van high-throughput sequencing-technologieën heeft geleid tot de ontdekking van vele nieuwe, virusachtige sequenties in muggen uit verschillende delen van de wereld3. Over het algemeen kunnen deze muggengerelateerde virussen worden ingedeeld in twee hoofdgroepen: MBV's en MSV's.
MBV's zijn een groep van diverse virussen die veroorzakers zijn van veel menselijke of dierlijke ziekten, zoals gelekoortsvirus (YFV), denguevirus (DENV), Japans encefalitisvirus (JEV), Westnijlvirus (WNV) en Rift Valley-koortsvirus (RVFV)4. Ze hebben de volksgezondheid ernstig bedreigd door ernstige morbiditeit en mortaliteit te veroorzaken bij zowel mensen als dieren over de hele wereld. MBV's ondersteunen van nature een levenscyclus tussen verschillende gastheren door overdracht van een geïnfecteerde mug naar een naïeve gastheer, evenals van een met virus geïnfecteerde gastheer en naar een voedende mug5. Daarom kunnen deze virussen zowel muggencellijnen als gewervelde cellijnen in het labinfecteren 1.
MSV's, waaronder Yichang-virus (YCN), Culex flavivirus (CxFV) en Chaoyang-virus (CHAOV), zijn een subgroep van insectenspecifieke virussen 1,6,7. In de afgelopen jaren is er een toename geweest in de ontdekking van nieuwe MSV's, en sommige van deze MSV's blijken een impact te hebben op de transmissie van MBV's. CxFV, dat een aanhoudende infectie in Culex pipiens kan zijn, kan bijvoorbeeld WNV-replicatie in een vroeg stadiumonderdrukken 8. Een ander insectspecifiek flavivirus, cell-fusing agent virus (CFAV), blijkt de verspreiding van DENV- en Zika-virus (ZIKV) in Aedes aegypti-muggen te remmen 9. Dit protocol is dus een nuttige benadering voor het isoleren van muggen-geassocieerde virussen en kan helpen bij verder onderzoek naar de verspreiding van pathogenen gerelateerd aan muggen en de bestrijding van door muggen overgedragen ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bemonstering en sortering van muggen
- Vang de volwassen muggen door de lichtvallen MXA-02 of kooldioxidemuggenvallen in het veld.
- Dood de verzamelde muggen door te dopen in vloeibare stikstof10,11. Transporteer ze naar het laboratorium door het logistieke systeem van de koelketen12.
OPMERKING: Droogijs werd voornamelijk gebruikt in het logistieke systeem van de koelketen. - (Optioneel) Als de monsterlocaties zich in de buurt van het laboratorium bevonden, stuur de levende muggen in de netvallen rechtstreeks naar het laboratorium en euthanaseer ze door ze gedurende 30minuten 4 bij ≤-20 °C in te vriezen.
- Maak een morfologische identificatie van de verzamelde muggen via het gereedschapsboek13 voor classificatie en identificatie van muggen.
OPMERKING: Indien nodig kan DNA-barcodering worden gebruikt om muggen te classificeren en te identificeren14,15. - Wijs ze op basis van bemonsteringsdatums en -locaties toe aan verschillende pools en bewaar ze vervolgens in buizen van 2-5 ml.
- Teken een tabel om elke buis vast te leggen met muggensoort, aantal, bemonsteringscode, datum en locaties.
- Druk de etiketten af met bemonsteringscodes en bevestig ze aan de buizen.
- Bewaar de buisjes met de muggenmonsters op -80 °C tot verdere analyse.
2. Muggen slijpen
- Plaats 20-50 muggen in elke 2 ml steriele buis met 3 mm keramische kralen met 1,5 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium met 2% penicilline-streptomycine-amfotericine B-oplossing.
LET OP: Bewaar de tubes op ijs of op een anice tray. - Homogeniseer de muggen met een weefselhomogenisator bij lage temperatuur door gedurende drie cycli 30 s bij 70 Hz bij 4 °C te malen16.
- Centrifugeer de mengsels gedurende 30 minuten bij 4 °C bij 15.000 × g en breng de supernatanten over in nieuwe buizen.
- Centrifugeer de supernatanten opnieuw bij 15.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het muggenrestente verwijderen 12,17.
OPMERKING: Indien nodig kunnen de supernatanten worden gefilterd met behulp van 0,22 μm filters. - Aliquoteer de supernatanten (P0) in opslagbuizen met schroefdop van 2 ml (200 μL per buis) en bewaar ze bij -80 °C.
3. Bereiding van cellen en celkweekonderhoudsmedium
OPMERKING: Muggencellijn C6/36 (Aedes albopictus RNAi-deficiënt) en gewervelde cellijn BHK-21 (babyhamsternier) werden gebruikt voor de virusversterking en -isolatie.
- Ent 1 × 106 C6/36 cellen in een kolf van75 cm 2 met 10 ml RPMI-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S) bij 28 °C in een 5% CO2 bevochtigde couveuse.
- Ent 1 × 106 BHK-21 cellen in een 75 cm 2 kolf met 10 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS en 1% P/S bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
OPMERKING: De cellen werden twee of drie keer per week gepasseerd17,18. - Zaai de in een erlenmeyervan 75 cm 2 (C6/36- of BHK-21-cellen) gekweekte cellen in de 24-putplaten (C6/36 per put: 1,4 × 105; BHK-21 per put: 0,8 × 105).
- Plaats de 24-putplaten een nacht op 28 °C of 37 °C.
- Observeer de cellen onder de microscoop en bevestig of de celconfluentie in elke put 80% -90% is.
- Bereid het onderhoudsmedium voor de celkweek (500 ml).
OPMERKING: Voor C6/36 was het medium RPMI-medium aangevuld met 2% FBS en 2% penicilline-streptomycine-amfotericine B-oplossing. Voor BHK-21 was het medium DMEM-medium aangevuld met 2% FBS en 2% penicilline-streptomycine-amfotericine B-oplossing.
4. Virusisolatie
OPMERKING: Alle stappen werden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) laboratorium. De veiligheidsniveau-eis van het bioveiligheidslaboratorium werd bepaald door de bioveiligheidsrisicobeoordeling op basis van de regelgeving van verschillende landen en regio's. Het proces moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast.
- Verwijder het celkweekmedium uit de 24-putplaten en voeg 100 μL van het celkweekonderhoudsmedium en 100 μL van het supernatant van het muggenhomogenaat (P0) toe aan elk putje.
- Incubeer de platen bij 28 °C of 37 °C gedurende 60 minuten en schud ze voorzichtig om de 15 minuten om uitdroging van de cellen te voorkomen.
- Verwijder het supernatant en spoel elk putje voorzichtig af met 600 μL celkweekonderhoudsmedium om het vuil volledig te verwijderen.
- Voeg 800 μL celkweekonderhoudsmedium toe aan elke put en bewaar de platen gedurende 7 dagen in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 28 °C of 37 °C.
- Controleer de celtoestand van elke put dagelijks onder de microscoop15.
- Verzamel de supernatanten van cellen (P1 supernatanten) op de 7edag en bewaar de supernatanten bij -80 °C.
- Herhaal stap 4.1-4.6 2x om P2- en P3-supernatanten te krijgen.
OPMERKING: In stap 4.3 was het voorzichtig spoelen van elke put met 600 μL celkweekonderhoudsmedium optioneel voor de P2 en P3. - Afhankelijk van welke put het cytopathogene effect (CPE) vertoont - cellen sterven, pyknosis en maken los van het oppervlak; fusie met aangrenzende cellen om syncytie te vormen; of het uiterlijk van nucleaire of cytoplasmatische inclusielichamen - voeg 300-400 μL van het supernatant van deze CPE toe aan elke put van de nieuwe 6-putplaten met cellen (de celconfluentie was 80% -90%) om de virussen sterk te versterken.
- Verzamel de supernatanten en aliquot ze in 2 ml schroefdop opslagbuizen (500 μL per buis). Bewaar ze bij -80 °C.
OPMERKING: Na drie generaties van opeenvolgende passaging in cellen werden de monsters die geen CPE induceerden weggegooid. Indien nodig kunnen de generaties van opeenvolgende passaging in cellen worden verhoogd.
5. Detectie van virale sequenties door RT-PCR
- Extraheer totaal RNA uit 200 μL van het virale supernatant met behulp van een virale RNA-minikit16.
OPMERKING: Hier werd een geautomatiseerd nucleïnezuurextractiesysteem gebruikt om totaal RNA te extraheren volgens de instructies van de instrumentfabrikant. - Converteer het RNA naar cDNA volgens de instructies van de RT-PCR-kit met behulp van een PCR-instrument.
- Voeg 15 μL RNA gemengd met 1 μL willekeurige primers toe aan de PCR-buis. Plaats de buis gedurende 5 minuten op 70 °C en plaats hem vervolgens gedurende 5 minuten op ijs.
- Voeg 5 μL 5x buffer en 25 μL mengsel (10 mM dNTP, 40 U/μL RNaseremmer en 200 U/μL M-MLV) toe aan de buis en plaats de buis op 42 °C gedurende 60 minuten en 95 °C gedurende 10 minuten.
- Bewaar de tube bij -20 °C.
- Gebruik een PCR-kit en universele primers (tabel 1) om virussen met PCR te detecteren.
- Stel voor arbovirussen het PCR-reactiesysteem (totaal 30 μL) in met de volgende componenten: 3 μL 10x Taq-buffer, 3 μL dNTP (1mM), 1 μL voorwaartse primer (10 μm), 1 μL omgekeerde primer (10 μm), 0,3 μL Taq (10 U/μL), 19,7 μL ddH 2 O en2μL cDNA.
- Stel voor de detectie van flavivirussen het reactieproces in als: stadium 1: 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 52 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; fase 2: 72 °C gedurende 10 min.
- Stel voor de detectie van alfavirussen het reactieproces in als: fase 1: 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 50 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; fase 2: 72 °C gedurende 10 min.
- Stel voor de detectie van bunyavirussen het reactieproces in als: fase 1: 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 50 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; fase 2: 72 °C gedurende 10 min.
- Detecteer de PCR-amplificatieproducten met 1% agarosegel-elektroforese en stuur ze op voor sequencinganalyse.
OPMERKING: Als de omstandigheden het toelaten, kunnen de supernatanten een sequencinganalyse van de volgende generatie ondergaan om nieuwe virussen te identificeren en de volledige virale genoomseqeunces te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na inenting met de supernatanten van de muggenhomogenaten (P0) vertoonden de C6/36-cellen een brede intercellulaire ruimte en geëxfolieerde cellen werden waargenomen na 120 uur (figuur 1A) in vergelijking met de niet-geënte cellen (controle) op hetzelfde moment (figuur 1B). Na het incuberen van de BHK-21-cellen met de P3-supernatanten werd zichtbare CPE waargenomen in de BHK-21-cellen na 48 uur (figuur 1C) in tegenstelling tot de controlecellen (figuur 1D). PCR werd uitgevoerd om virale soorten te bepalen. De universele primers voor de detectie van flavivirussen, alfavirussen en bunyavirussen werden commercieel gesynthetiseerd (tabel 1). Een PCR-product voor het bunyavirus Ebinur Lake Virus werd ingesteld als een positieve controle en toegevoegd aan Lane 1. De universele primers voor bunyavirussen, flavivirussen en alfavirussen werden gebruikt om de PCR-producten voor het virale supernatant te genereren, die vervolgens werden toegevoegd aan respectievelijk Lane 2, 3 en 4. De geschatte grootte van de PCR-producten voor flavivirussen, alfavirussen en bunyavirussen was respectievelijk 266 bp, 434 bp en 251 bp. De banden waren alleen zichtbaar in Lane 2 en de positieve controle Lane 1. Als gevolg hiervan is het virus in de supernatanten waarschijnlijk een bunyavirus (figuur 2).
Figuur 1: CPE-observatie van cellen na de incubatie met de virale supernatanten. De status van C6/36-cellen op 120 h na infectie (CPE) (A) en die van de controlecellen tegelijkertijd (B). De status van BHK-21 cellen bij 48 hpi (C) en die van de controlecellen (D). Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: CPE = cytopathogeen effect; HPI = uur na infectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: PCR-resultaten voor virale supernatanten. Baan 1 vertegenwoordigt de positieve bestrijding van bunyavirussen (Ebinur Lake Virus). Lanes 2-4 vertegenwoordigden de PCR-resultaten van supernatanten door universele primers te gebruiken voor bunyavirussen (251 bp), flavivirussen (266 bp) en alfavirussen (434 bp). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Virus | Abc | Oligonucleotide (5'→3') | De grootte van het PCR-product (bp) | ||
| Flavivirussen | F1 | TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA | 266 | ||
| F2 | GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC | ||||
| Alfavirussen | M2W | YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| Bunyavirussen | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
Tabel 1: Universele primers voor de arbovirusdetectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van deze methode was om een praktische manier te bieden voor het isoleren van muggen-geassocieerde virussen met behulp van verschillende cellijnen. Het is van cruciaal belang om het antibioticum-antimycoticum (penicilline-streptomycine-amfotericine) toe te voegen aan de supernatanten van de muggenhomogenaten om besmetting door bacteriën of schimmels te voorkomen. Muggen en virale supernatanten die in het veld worden verkregen, moeten bij -80 °C worden gekoeld om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen.
Een andere cruciale stap in het protocol was slijpen. Muggenmonsters moeten grondig worden gepoederd en op ijs worden bewaard. Onvoldoende gemalen muggenweefsels kunnen celdood veroorzaken en kunnen de bevindingen van CPE-analyse vertekenen. Voorafgaand aan virusisolatie is het noodzakelijk om normale muggen te gebruiken om de maalparameters te bevestigen. Het malen moet bij lage temperaturen gebeuren om te voorkomen dat het virus tijdens het proces inactief wordt.
Deze aanpak kan muggengerelateerde virussen effectief isoleren en versterken, maar is alleen acceptabel voor virussen die CPE kunnen vertonen in zoogdier- of insectencellijnen. Deze aanpak is niet geschikt voor virussen die geen CPE induceren. Met behulp van het protocol kunnen we virale kandidaten verkrijgen die slechts één virustype of een mengsel met verschillende virussen bevatten. Verder onderzoek - virale zuivering, morfologische identificatie en plaque-analyse - is nog steeds nodig om het gezuiverde virus te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z.
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E.
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , Suzhou University Press. (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
