Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل الخلايا الدهنية من الأنسجة الدهنية في أجنة اللاحم. تتيح هذه الطريقة العزل مع غلة عالية ، والثقافة الأولية ، والتمايز الشحمي للخلايا الدهنية. قام تلطيخ الزيت الأحمر O وبقع الدهون / الحمض النووي بقياس القدرة الشحمية للخلايا المعزولة المستحثة بوسائط التمايز.
Abstract
الخلايا الشحمية الأولية هي نظام تجريبي قيم لفهم المسارات الجزيئية التي تتحكم في تمايز الخلايا الشحمية والتمثيل الغذائي. توفر أجنة الدجاج الفرصة لعزل الخلايا الشهية من المرحلة المبكرة من التطور الدهني. يمكن استخدام هذه الخلية الأولية لتحديد العوامل التي تؤثر على انتشار الخلايا ما قبل الشحمية والتمايز الشحمي المنشأ ، مما يجعلها نموذجا قيما للدراسات المتعلقة بالسمنة في مرحلة الطفولة والسيطرة على ترسب الدهون الزائدة في الدواجن. النمو السريع للأنسجة الدهنية بعد الولادة يهدر الأعلاف بشكل فعال عن طريق تخصيصها بعيدا عن نمو العضلات في الدجاج اللاحم. لذلك ، قد توفر طرق فهم المراحل المبكرة من تطور الأنسجة الدهنية أدلة لتنظيم هذا الميل وتحديد طرق للحد من توسع الدهون في وقت مبكر من الحياة. تم تصميم هذه الدراسة لتطوير طريقة فعالة للعزل ، والثقافة الأولية ، والتمايز الشحمي المنشأ للخلايا الشهية المعزولة عن تطوير الأنسجة الدهنية لأجنة الدجاج اللاحم التجاري (نوع اللحوم). تم تحسين الإجراء لإنتاج خلايا ذات صلاحية عالية (~ 98٪) وزيادة القدرة على التمايز إلى خلايا دهنية ناضجة. تدعم هذه الطريقة البسيطة لعزل الخلايا المعقدة، وثقافتها، وتمايزها التحليلات الوظيفية لنمو الدهون وتطورها في الحياة المبكرة.
Introduction
السمنة هي تهديد صحي عالمي لكل من البالغين والأطفال. الأطفال الذين يعانون من زيادة الوزن أو السمنة هم أكثر عرضة بخمس مرات تقريبا للإصابة بالسمنة مثل البالغين ، مما يعرضهم لخطر متزايد بشكل كبير للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية والسكري والعديد من الأمراض المصاحبة الأخرى. حوالي 13.4٪ من الأطفال الأمريكيين الذين تتراوح أعمارهم بين 2-5 يعانون من السمنة1 ، مما يدل على أن الميل إلى تراكم الدهون الزائدة في الجسم يمكن أن يبدأ في وقت مبكر جدا من الحياة. لأسباب مختلفة جدا ، فإن تراكم الأنسجة الدهنية الزائدة هو مصدر قلق للدجاج اللاحم (نوع اللحوم). اللاحم الحديث فعال بشكل لا يصدق ولكن لا يزال يتراكم المزيد من الدهون مما هو ضروري من الناحية الفسيولوجية 2,3. يبدأ هذا الاتجاه بعد فترة وجيزة من الفقس ويهدر الأعلاف بشكل فعال ، وهو أغلى مكون إنتاج ، عن طريق تخصيصه بعيدا عن نمو العضلات. لذلك ، بالنسبة لكل من الأطفال والدجاج اللاحم ، وإن كان ذلك لأسباب مختلفة للغاية ، هناك حاجة لفهم العوامل التي تؤثر على نمو الأنسجة الدهنية وتحديد طرق للحد من توسع الدهون في وقت مبكر من الحياة.
تتشكل الخلايا الشحمية من الخلايا الدهنية ، وهي خلايا جذعية مشتقة من الأنسجة الدهنية تخضع للتمايز لتطوير خلايا دهنية ناضجة تخزن الدهون. وفقا لذلك ، فإن الخلايا البدائية في المختبر هي نموذج تجريبي قيم لدراسات السمنة. هذه الخلايا ، المعزولة عن الجزء الوعائي اللحمية من المستودعات الدهنية ، يمكن أن توفر فهما أساسيا للمسارات الجزيئية التي تتحكم في تمايز الخلايا الشحمية والتمثيل الغذائي 4,5. تعتبر أجنة الكتاكيت نموذجا تجريبيا مواتيا في الدراسات التنموية لأن زراعة البيض وفقا للجدول الزمني المطلوب يجعل التلاعب التجريبي أسهل ، لأنه يتيح الحصول على الأجنة دون تضحية الأم لمراقبة سلسلة من مراحل نمو الأجنة. علاوة على ذلك ، لا يلزم إجراء عمليات جراحية معقدة وفترات زمنية طويلة للحصول على الأجنة مقارنة بالنماذج الحيوانية الأكبر. لذلك ، يقدم جنين الفرخ فرصة للحصول على الخلايا الدهنية من المراحل المبكرة من تطور الأنسجة الدهنية. تصبح الأنسجة الدهنية تحت الجلد مرئية في الفرخ حول اليوم الجنيني 12 (E12) كمستودع محدد بوضوح يقع حول الفخذ. يتم إثراء هذا المستودع في الخلايا الشحمية عالية التكاثر التي تخضع بنشاط للتمايز تحت إشارات تنموية لتشكيل الخلايا الشحمية الناضجة 6,7. عملية التمايز الشحمي قابلة للمقارنة بين الدجاج والبشر. لذلك ، يمكن استخدام الخلايا البدائية المعزولة من أجنة الكتاكيت كنموذج مزدوج الغرض للدراسات ذات الصلة بالبشر والدواجن. ومع ذلك ، فإن غلة الخلايا الدهنية الأولية تنخفض مع الشيخوخة حيث تنمو الخلايا إلى الخلايا الشحمية الناضجة5.
يعمل البروتوكول الحالي على تحسين عزل الخلايا الدهنية عن الأنسجة الدهنية خلال المرحلة (E16-E18) التي يكون فيها التمايز الشحمي المنشأ وتضخم الخلايا الشحمية في ذروتهما في أجنة الفرخ اللاحم8. يمكن لهذا الإجراء تقييم آثار العوامل التي يتعرض لها الجنين النامي في البيضاوة ، مثل النظام الغذائي للدجاجة ، على تطور الخلايا الشحمية والإمكانات الشحمية خارج الجسم الحي. ويمكنه أيضا اختبار تأثير التلاعب المختلفة (على سبيل المثال ، نقص الأكسجة ، وإضافات المغذيات ، والناهضات الدوائية ، والخصوم) على تكوين الدهون أو مختلف 'omes' (على سبيل المثال ، transcriptome ، metabolome ، methylome) من أسلاف الخلايا الشحمية. كتمثيل للمرحلة المبكرة من تكوين الدهون ، تعد الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول نماذج قيمة للدراسات ذات الصلة بالدواجن والبشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة تينيسي. تم الحصول على بيض اللاحم التجاري المخصب حديثا (Cobb 500) من مفرخ محلي. تم احتضان البيض عند 38 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 60٪ حتى تشريحه في الأيام الجنينية 16-18 (E16-E18). تم جمع الأنسجة الدهنية من المستودع تحت الجلد (الفخذي).
1. الاستعداد للعزلة والثقافة
- إعداد غطاء الثقافة والأدوات.
- قبل البدء في التشريح ، قم بإعداد منطقة عمل في غطاء محرك السيارة الرقائقي. تطهير منطقة العمل وجميع الأدوات عن طريق مسحة مع 70 ٪ من الإيثانول. تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام مواد معقمة.
ملاحظة: قم دائما بمسح الحاويات والأدوات باستخدام 70٪ من الإيثانول قبل وضعها مرة أخرى في غطاء زراعة الخلية. يوصى بوضع جهاز تعقيم على الطاولة في غطاء المحرك بحيث يمكن تعقيم الأدوات بسهولة بين الأجنة.
تنبيه: عند استخدام أداة تعقيم، قم بتبريد الأداة الساخنة بشكل صحيح لمنع إصابة الحروق وتلف الأنسجة. يوصى بوقت تبريد لا يقل عن 3 دقائق. مسحة مع 70٪ الإيثانول قبل الاستخدام. - قم بتجميع الأدوات والأوعية التالية في غطاء المحرك: ملقط مستقيم (120 مم) ، ملاقط (110 مم) ، زوجان من الملقط المنحني (100 مم) ، زوجان من المقص المستقيم (140 مم) ، مقص جراحي منحني (115 مم) ، مصفاة الأنسجة (شبكة نايلون 250 ميكرومتر) ، مصفاة خلية (شبكة نايلون 40 ميكرومتر) ، أنابيب طرد مركزي مخروطية (15 مل و 50 مل) ، أطباق بتري (60 مم و 100 مم) ، كوب صغير (100 مل) ، رذاذ الإيثانول 70٪ وشاش معقم ، منشفة ورقية ، وممسحة على الطاولة (انظر جدول المواد).
- قبل البدء في التشريح ، قم بإعداد منطقة عمل في غطاء محرك السيارة الرقائقي. تطهير منطقة العمل وجميع الأدوات عن طريق مسحة مع 70 ٪ من الإيثانول. تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام مواد معقمة.
- قم بإعداد الحل الإنزيمي ووسائط التجميع والوسائط الثقافية باتباع الخطوات أدناه.
ملاحظة: قم بإعداد المحاليل مسبقا وتخزينها على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. يجب وضع الوسائط على الجليد قبل جمع الأنسجة. يتم سرد جميع الكواشف المستخدمة في هذه الخطوة في جدول المواد.- قم بإعداد الوسائط المستخدمة لكل من جمع الأنسجة الدهنية وإعداد محلول إنزيمي عن طريق استكمال DMEM / F12 (وسط النسر المعدل من Dulbecco مع 2.50 mM من L-glutamine و 15 mM من مخزن HEPES المؤقت) مع 2.5 ميكروغرام / مل من Amphotericin B و 1x البنسلين / الستربتومايسين (P / S) ، 100 U / mL. يحفظ على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: تظل هذه الوسائط مستقرة لمدة 1 سنة عند تخزينها عند 4 درجات مئوية. - تحضير محلول التعقيم عن طريق تخفيف بيتادين إلى 20٪ (v / v) في 1x PBS (محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات يحتوي على درجة حموضة 7.4 ، بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم أو الفينول الأحمر) مع 2.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B. يخزن في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: الحل مستقر لمدة 2 سنوات عند تخزينه في 4 درجة مئوية. - تحضير محلول إنزيمي عن طريق إذابة الكولاجيناز من النوع الأول (1 ملغم / مل) في DMEM / F12 مع 2.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B و 1x P / S (الخطوة 1.2.1). اصنع محلول كولاجيناز طازج وحافظ عليه على الثلج أثناء التشريح. قبل حوالي 10 دقائق من الاستخدام ، قم بتسخينه مسبقا عن طريق احتضان هذا المحلول عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لبدء نشاطه الإنزيمي.
ملاحظة: هناك حاجة إلى حوالي 1 مل من محلول الكولاجيناز (1 ملغ / مل) لكل 100 ملغ من الأنسجة الدهنية. - قم بإعداد وسائط النمو المستخدمة للطلاء والانتشار عن طريق استكمال وسائط DMEM/F12 ب 1x P/S و 10٪ FBS. يحفظ على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: الحل مستقر لمدة 1 سنة عند تخزينه في 4 درجة مئوية. - تحضير محلول الغسيل عن طريق استكمال 1x PBS مع 2.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B. ضبط الحل على الرقم الهيدروجيني المطلوب 7.4. يحفظ على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: الحل مستقر لمدة 2 سنوات عند تخزينه في 4 درجة مئوية.
- قم بإعداد الوسائط المستخدمة لكل من جمع الأنسجة الدهنية وإعداد محلول إنزيمي عن طريق استكمال DMEM / F12 (وسط النسر المعدل من Dulbecco مع 2.50 mM من L-glutamine و 15 mM من مخزن HEPES المؤقت) مع 2.5 ميكروغرام / مل من Amphotericin B و 1x البنسلين / الستربتومايسين (P / S) ، 100 U / mL. يحفظ على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
2. جمع الأنسجة الدهنية والهضم
- القتل الرحيم للجنين.
- في اليوم الجنيني 16 ، قم بإزالة البيض من الحاضنة. المصدر الرئيسي المحتمل للتلوث الميكروبي هو سطح البويضة. لذلك ، مسحة البيض بشاش معقم غارق في 70 ٪ من الإيثانول قبل تكسيرها. بعد المسح ، ضع البيضة عموديا مع النهاية المدببة لأسفل على كوب صغير (100 مل) مبطن بمناشف ورقية لتخفيف البيضة من الزجاج.
- باستخدام مقبض الملقط ، قم بكسر البيضة عن طريق النقر على الطرف الحاد للبيضة. قم بإزالة قشر البيض بعناية لإنشاء فتحة كبيرة بما يكفي لإزالة الجنين (الخطوة 2.1.3). تمزيق غشاء القشرة البيضاء بلطف لفضح الجنين (الشكل 1A). اخترق السلى بعناية باستخدام ملاقط معقمة (الشكل 1B).
ملاحظة: الكيس الأمنيوسي هو غشاء شفاف مملوء بالسائل الأمنيوسي الذي يحيط بالجنين. - قم بإزالة الجنين من البويضة عن طريق الإمساك بعنق الجنين برفق باستخدام ملقط مستقيم. اقطع كيس الصفار لفصله عن الجنين ، وانقل الجنين إلى طبق بتري 100 مم.
- قطع الرأس على الفور باستخدام المقص الجراحي والملقط.
- إجراء جمع الأنسجة الدهنية.
- مسحة جسم الجنين مع 70٪ من الإيثانول وفرك سطح الجلد بلطف مع شاش معقم لإزالة الريش ، لأنها يمكن أن تتداخل مع الترشيح في خطوات لاحقة بعد الهضم. استخدم مساحات على الطاولة لمنع الجلد والريش من لمس الأنسجة المجمعة.
- قطع الجلد بين الساقين ومنطقة البطن للكشف عن زوج من مستودعات الدهون الفخذية.
- أمسك الجلد حول الساق باستخدام ملقط منحني بيد واحدة. قم بإزالة الدهون تحت الجلد الفخذية بلطف باليد الأخرى ، باستخدام ملقط منحني لسحب المستودع بلطف بعيدا عن الساق.
ملاحظة: هناك القليل نسبيا من النسيج الضام الذي يلتصق بوسادة الدهون في الساق ، ويجب أن تكون وسادة الدهون بأكملها قابلة للإزالة في قطعة واحدة باستخدام ملقط فقط. يمكن تسهيل ذلك عن طريق تثبيت الملقط للخلف بحيث تقوم الأجزاء المنحنية (بدلا من النهايات) بتثبيت وسادة الدهون لإزالتها.- إذا لزم الأمر ، اقطع وسادة الدهون بعيدا بمقص منحني. كرر ذلك مع وسادة الدهون الأخرى والأجنة الإضافية حسب الحاجة.
ملاحظة: يمكن الحصول على ما مجموعه 80 ملغ من الدهون تحت الجلد من معظم الأجنة في E16 (الشكل 1C). ينتج عن هذا عادة ~ 1 × 106 خلايا ، وهو ما يكفي للوحة قارورة T-25 واحدة. قد يكون من المفيد في هذه الخطوة وزن منصات الدهون من عدد قليل من الأجنة لتقييم كمية المواد الأولية ، حيث يمكن أن تختلف أوزان وسادة الدهون عبر خطوط دجاج التسمين المحددة ، وبسبب عوامل لا يمكن السيطرة عليها ، مثل عمر الدجاجة المربية والنظام الغذائي. تم جمع الدهون تحت الجلد بشكل روتيني من خمس بيضات لضمان إنتاجية كافية من الخلايا للطلاء في قوارير متعددة.
- إذا لزم الأمر ، اقطع وسادة الدهون بعيدا بمقص منحني. كرر ذلك مع وسادة الدهون الأخرى والأجنة الإضافية حسب الحاجة.
- انقل الأنسجة إلى ~ 5 مل من وسائط التجميع في أنبوب 15 مل وكرر تشريح البيض المتبقي.
- شطف لفترة وجيزة منصات الدهون التي تم جمعها عن طريق نقلها إلى طبق بتري 60 ملم يحتوي على محلول التعقيم وتدور الطبق عدة مرات.
- شطف محلول التعقيم عن طريق نقل منصات الدهون إلى طبق بتري 60 ملم يحتوي على 1x PBS. تدور بلطف. كرر هذه الخطوة عن طريق النقل إلى طبق بتري ثان 60 مم يحتوي على 1x PBS.
- قم بإجراء عملية الهضم الأنزيمي وعزل الخلايا الدهنية باتباع الخطوات أدناه.
- انقل الأنسجة الدهنية إلى أنبوب 15 مل يحتوي على ~ 1 مل من محلول إنزيمي تم تسخينه مسبقا لكل 100 ملغ من الأنسجة. اغمر زوجا من المقصات الطويلة والمستقيمة في الأنبوب وقم بفرم الأنسجة الدهنية في المحلول إلى قطع صغيرة قدر الإمكان (~ 1 مم3) (الشكل 2A).
ملاحظة: سيتم تقليل إنتاجية الخلايا إذا لم يتم فرم الأنسجة جيدا. - انقل الأنسجة المفرومة والمحلول الأنزيمي إلى قارورة معقمة سعة 25 مل. لف القارورة بفيلم البارافين. ضعيه على شاكر مداري داخل الحاضنة ورجيه على حرارة 37 درجة مئوية أثناء خطوة الهضم.
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم حمام مائي مهتز. مع أي من النهجين ، يجب أن تكون السرعة كافية لمنع قطع الأنسجة من الاستقرار في قاع القارورة ، ولكن يجب ألا تكون سريعة بحيث يتم دفع القطع إلى أعلى القارورة والالتصاق بالزجاج ، أو أن السائل يتراكم على غطاء فيلم البارافين. - بعد حوالي 30 دقيقة ، اقطع نهاية طرف ماصة 1 مل إلى قطر 3 مم تقريبا. ماصة خليط الأنسجة لأعلى ولأسفل عدة مرات للمساعدة في إطلاق الخلايا من الأنسجة الدهنية. أعد القارورة إلى الحاضنة / الحمام المائي واستأنف الاهتزاز.
- بعد 15 دقيقة إضافية ، تحقق من القارورة للتأكد من اكتمال عملية الهضم. بعد إزالة القارورة من الخلاط ، ستتشكل طبقة من الخلايا البيضاء في الجزء العلوي من طبقة السائل. إذا بقيت شظايا الأنسجة ، فقم بقطع النهاية من طرف ماصة آخر وقم بماصة الخليط بلطف لأعلى ولأسفل ، ثم استمر في الاهتزاز لمدة 15 دقيقة إضافية.
ملاحظة: يشبه خليط الأنسجة / الكولاجيناز المهضوم بالكامل الكيموس اللبني. عادة ، يتم هضم الأنسجة بشكل كاف بعد 1 ساعة من الاهتزاز اللطيف. إذا بقيت العديد من الشظايا في هذه المرحلة ، فقد يشير ذلك إلى وجود مشكلة في إنزيم الكولاجيناز المستخدم. الاهتزاز المستمر يمكن أن يزيد من الغلة. ومع ذلك ، فإن التعرض لفترات طويلة للإنزيم والإجهاد البدني قد يؤدي أيضا إلى تلف الخلايا. - بعد الهضم ، ماصة بلطف لأعلى ولأسفل لتخلط جيدا. قم بالتصفية من خلال مصفاة أنسجة سعة 250 ميكرومتر إلى أنبوب سعة 15 مل عن طريق السحب لإزالة أي أجزاء من الأنسجة والحطام غير المهضوم.
- شطف القارورة مع 4 مل من وسائط النمو عن طريق السحب لإزالة الخلايا التي قد تكون ملتصقة بالزجاج، وتصفية في نفس أنبوب 15 مل. شطف المصفاة مع وسائط نمو إضافية عن طريق السحب لتخفيف أي خلايا محاصرة ، حتى حجم إجمالي من 14 مل.
- قم بتكوير جزء الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق في RT (7 دقائق لأنبوب 50 مل).
ملاحظة: قم دائما بمسح الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل العودة إلى غطاء زراعة الخلية. - شفط السوبرناتانت. احرص على عدم إزاحة حبيبات الخلية. أعد تعليق الكريات بلطف في 1 مل من مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء (انظر جدول المواد) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، واحتضنها لمدة 5 دقائق في RT. سوف يتحول المحلول إلى اللون الأحمر مع تحلل خلايا الدم الحمراء (الشكل 2B).
ملاحظة: ضع المخزن المؤقت لتحلل RBC في RT قبل الاستخدام. يحتوي الدجاج على خلايا دم حمراء نواة9 ، وهي تعلق على أطباق زراعة الأنسجة جنبا إلى جنب مع الخلايا الشحمية. يستخدم المخزن المؤقت لتحلل RBC لتحليل هذه الخلايا لمنع تداخلها مع عدد الخلايا الدقيق. - أضف 5 مل من وسائط النمو إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا لتخفيف المخزن المؤقت للتحلل واخلطه بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. باستخدام ماصة ، قم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر إلى أنبوب جديد سعة 50 مل وشطف المصفاة ب 5 مل إضافية من وسائط النمو.
- خلايا الكريات عن طريق الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 7 دقائق في RT. قم بشفط السوبرناتانت بعناية وإعادة تعليق حبيبات الخلايا المتبقية في 1 مل من وسائط النمو عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
- استخدم مقياس الدم وعداد الخلايا وبقعة تريبان بلو لإحصاء الخلايا وتحديد صلاحية الخلية. خذ 10 ميكرولتر من العينة واخلطها مع 10 ميكرولتر من Trypan Blue عن طريق السحب. قم بتحميل 10 ميكرولتر من الخليط على مقياس الدم وقياس10.
ملاحظة: يمكن زيادة سرعات الطرد المركزي إلى 600 × g إذا لم تكن كريات الخلايا الكافية مرئية بسهولة بعد الدوران الأولي.
- استخدم مقياس الدم وعداد الخلايا وبقعة تريبان بلو لإحصاء الخلايا وتحديد صلاحية الخلية. خذ 10 ميكرولتر من العينة واخلطها مع 10 ميكرولتر من Trypan Blue عن طريق السحب. قم بتحميل 10 ميكرولتر من الخليط على مقياس الدم وقياس10.
- انقل الأنسجة الدهنية إلى أنبوب 15 مل يحتوي على ~ 1 مل من محلول إنزيمي تم تسخينه مسبقا لكل 100 ملغ من الأنسجة. اغمر زوجا من المقصات الطويلة والمستقيمة في الأنبوب وقم بفرم الأنسجة الدهنية في المحلول إلى قطع صغيرة قدر الإمكان (~ 1 مم3) (الشكل 2A).
3. البذر وزراعة الخلايا البدائية
- البذور ~ 1 × 106 خلايا في 4 مل من وسائط النمو قبل الاحترار في قارورة T-25. اتبع نفس كثافة الطلاء عند استخدام أنواع أخرى من أوعية الاستزراع. ضع في حاضنة زراعة الأنسجة واتركها تعلق بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يتم استزراع الخلايا في حاضنة 38 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2. درجة الحرارة المثلى لنمو خلايا الطيور11 هي 38 درجة مئوية ، وتنمو ببطء عند 37 درجة مئوية. - في اليوم التالي ، قم بشفط الوسائط واغسل الخلايا بلطف باستخدام 1x PBS عن طريق السحب لإزالة الخلايا غير المرفقة أو الميتة. استبدل ب 4 مل من وسائط النمو الطازجة. تحقق من الخلايا تحت المجهر. يجب أن تكون الخلايا على شكل مغزل ، مثل الخلايا الليفية (الشكل 2A).
ملاحظة: عادة ما تعلق الخلايا الدهنية بسرعة إلى حد ما (في غضون ساعات قليلة). يمكن تأكيد نجاح أو فشل عزل الخلايا في هذا الوقت (بعد 24 ساعة). - استبدل ب 4 مل من وسائط النمو الطازجة كل يومين والخلايا الفرعية أو الخلايا المحفوظة بالتبريد عندما تصل إلى التقاء 70٪ -80٪ (الشكل 3C).
4. التزريع الفرعي والحفظ بالتبريد
- استنشاق الوسائط القديمة واغسل الخلايا بلطف باستخدام 4 مل من 1x PBS عن طريق السحب. قم بشفط PBS ، أضف 2 مل من 0.1٪ من التربسين لتغطية سطح الخلية في قارورة T-25 (اضبط الحجم وفقا لذلك لأوعية الاستزراع الأخرى) ، ثم احتضنها لمدة 3-4 دقائق عند 38 درجة مئوية.
ملاحظة: لاحظ ما إذا كانت الخلايا منفصلة عن لوحة الزرع. اضغط على لوحة الثقافة بلطف للمساعدة في انفصال الخلايا. احتضان الخلايا مع التربسين لفترة طويلة جدا سوف يتلف الخلايا. - أضف حجما مكافئا من وسائط النمو التي تم تسخينها مسبقا لمنع تفاعل التربسين. ماصة على سطح الخلية عدة مرات ، وإمالة اللوحة لتخفيف الخلايا المتبقية.
- انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 300 × جم لمدة 5 دقائق عند RT (7 دقائق لأنبوب 50 مل). شفط السوبرناتانت.
- في حالة الزراعة الفرعية ، أعد تعليق الكريات في 1 مل من وسائط النمو عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. عد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.3.9.1 ثم قم بتكرارها باستخدام نفس كثافة الطلاء المستخدمة في البداية في الخطوة 3.1.
- في حالة الحفظ بالتبريد، قم بإعداد 4 مل من وسائط التجميد لقارورة T-25 مع التقاء بنسبة 90٪.
ملاحظة: تتكون وسائط التجميد من 10٪ DMSO و30٪ FBS و60٪ DMEM/F12. - أعد تعليق بيليه الخلية في وسائط التجميد وانقل 1 مل من وسائط التجميد إلى تبريد. قم بتجميد الكريوفيات ببطء إلى -1 درجة مئوية / دقيقة باستخدام حاوية تجميد. ضع الحاوية في ثلاجة -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها ثم انقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: تحافظ الخلايا البدائية المحفوظة بالتجميد بشكل صحيح على بقائها لمدة 3 سنوات على الأقل وعادة ما تعمل مثل الخلايا المعزولة حديثا عند إذابتها وطلائها.
5. التمايز الأديبوجيني
ملاحظة: يمكن استخدام الألواح المطلية بالجيلاتين بنسبة 2٪ لتعزيز التصاق الخلايا.
- تحضير محلول الجيلاتين 2٪ (ث / v) (انظر جدول المواد) في الماء المقطر. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة للتعقيم. سطح ثقافة المعطف مع 5-10 ميكرولتر من محلول الجيلاتين / سم 2 (أي 100-200 ميكروغرام / سم2). قم بالتدوير بلطف لتغطية السطح بالتساوي.
- تحقق من الألواح بحثا عن انتشار محلول الجيلاتين لأن بعض المناطق قد تظل غير مغلفة في البداية. اسمح للصفيحة المطلية بالجيلاتين بالبقاء في RT لمدة 1 ساعة على الأقل. إزالة كامل حجم محلول الجيلاتين من الآبار.
ملاحظة: هذا سيترك معطفا رقيقا من الجيلاتين في أسفل الآبار / الأطباق. يمكن إعادة استخدام محلول الجيلاتين عدة مرات (10 مرات على الأقل) دون تغيير التصاق الخلايا ونموها. اسمح للأطباق المغلفة بالجيلاتين بالبقاء في غطاء محرك الأنسجة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل طلاء الخلايا. - حث الخلايا الشحمية الدجاج على الخضوع للتمايز الشحمي عن طريق استكمال وسائط النمو بالأحماض الدهنية. لإعداد وسائط التمايز الشحمية (ADM) ، قم بتكملة DMEM / F12 مع مصل الدجاج بنسبة 10٪ ، و 1x Linoleic Acid-Oleic Acid-Oleic Acid-Albumin (9.4 ميكروغرام / مل) ، و 1x P / S (انظر جدول المواد). اجعل ADM طازجا ودافئا قبل الاستخدام.
ملاحظة: عادة ما يتم حث الخلايا الشحمية الدجاج على الخضوع للتمايز الشحمي المنشأ عن طريق استكمال الوسائط بالأحماض الدهنية بدلا من الكوكتيلات الهرمونية المستخدمة عادة للخلايا الشحمية من الأنواع الأخرى12. - حث التمايز عن طريق استبدال وسائط النمو بوسائط التمايز الشحمية عندما تصل الخلايا إلى التقاء ~ 90٪. الحفاظ على الخلايا في هذه الوسائط ، واستبدالها كل 2 أيام. تقييم التمايز بصريا تحت المجهر (20x) على أساس تشكيل قطرات الدهون ، والتي تصبح مرئية بسهولة في غضون 48 ساعة من التمايز المحفز.
6. تقييم تكوين الدهون
- قم بإجراء تلطيخ الزيت الأحمر O باتباع الخطوات أدناه.
- لوحة الخلايا في صفيحة من ستة آبار وحث التمايز الشحمي عند التقاء ~ 90٪.
- قم بإعداد حل عملي من Oil Red O من خلال الجمع بين ستة أجزاء من محلول مخزون Oil Red O مع أربعة أجزاء من الماء المقطر في أنبوب سعة 50 مل. اخلطي بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل واتركيه لمدة 10 دقائق في RT ، ثم قم بالتصفية من خلال ورقة ترشيح من الدرجة 1 (انظر جدول المواد) داخل القمع عن طريق صب المحلول ببطء في أنبوب سعة 50 مل.
ملاحظة: يتم تصنيع محلول مخزون Oil Red O عن طريق إذابة 0.7 جم من Oil Red O (انظر جدول المواد) في 200 مل من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ في زجاجة معقمة. اخلطي جيدا واتركيه لمدة 20 دقيقة. يحفظ على حرارة 4 درجات مئوية ويحفظ بعيدا عن الضوء حتى الاستخدام. هذا مستقر لمدة 1 سنة. يمكن استخدام حل العمل لمدة 3 ساعات ؛ ومع ذلك ، فمن المستحسن استخدامه في غضون 2 ساعة. - قم بإزالة الوسائط واغسل الآبار بلطف مرتين باستخدام 2 مل من 1x PBS المسخن مسبقا باستخدام ماصة. قم بإزالة PBS تماما عن طريق إيقاف السحب. إصلاح الخلايا مع 2 مل من الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10 ٪ ولف اللوحة مع فيلم البارافين. اتركيه في RT لمدة 1 ساعة على الأقل وحتى 2 أيام قبل التلطيخ.
ملاحظة: لصنع 1 لتر من محلول الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ ، امزج 100 مل من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ ، و 4.09 جم من NaH2 PO 4 ، و 6.5 جم من Na2HPO4 (انظر جدول المواد) ، و 900 مل من الماء المقطر. لا تقم بماصة الفورمالين مباشرة على الخلايا. يوزع بلطف على الجدار الجانبي بالقرب من قاع البئر. - إزالة الفورمالين وغسل الآبار بلطف مع 2 مل من الماء المقطر. استبدل ب 2 مل من 60٪ أيزوبروبانول. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة الأيزوبروبانول واترك الآبار تجف تماما لمدة 10 دقائق. نفذ جميع خطوات التلطيخ في RT.
- أضف 1 مل من محلول عمل Oil Red O إلى الخلايا واحتضنه لمدة 10-20 دقيقة في RT. قم بإزالة البقعة عن طريق السحب واغسلها خمس مرات عن طريق الغمس في ماء الصنبور حتى لا تظهر أي بقعة زائدة. بعد الشطف النهائي ، أضف 1 مل من الماء إلى الخلايا قبل تصور التلطيخ وجمع الصور تحت المجهر.
- لتحديد تراكم الدهون في كل طبق ، قم بإزالة الماء واستخراج صبغة Oil Red O من الخلايا عن طريق إضافة 1-2 مل من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ وهو ما يكفي لتغطية الخلايا في بئر من ستة آبار تماما. احتضن مع الهز اللطيف على شاكر الطبق لمدة 10 دقائق في RT.
- نقل 200 ميكرولتر من الاستخراج إلى بئر من لوحة الفحص 96 بئرا. حدد الكمية النسبية للبقع باستخدام قارئ لوحة مقياس الطيف الضوئي لقياس الامتصاص عند 495 نانومتر.
- قم بإجراء فحص تلطيخ قطرات الدهون داخل الخلايا والنواة.
- خلايا الصفائح في ألواح 96 بئرا ذات القاع الأسود وتحفز التمايز الشحمي المنشأ كما هو موضح في الخطوة 5.3.
- لتلطيخ الخلايا ، أضف 200 ميكرولتر من محلول التلطيخ الذي يحتوي على بقعة دهون فلورسنت وبقعة حمض نووي فلورسنت (انظر جدول المواد) في 1x PBS لكل بئر. بعد حساب الحجم الإجمالي للبقعة المطلوبة ، أضف قطرتين من بقعة الحمض النووي و 25 ميكرولتر من بقعة الدهون لكل مل من 1x PBS المسخن مسبقا باستخدام أنبوب ملفوف بالرقائق لحماية المحلول من الضوء. احتضان في RT لمدة 20 دقيقة وحماية من الضوء.
- اقرأ التألق باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت (انظر جدول المواد). الكشف عن بقعة الدهون (الإثارة: 485 نانومتر / الانبعاثات: 572 نانومتر) باستخدام مرشح أحمر وبقعة الحمض النووي (الإثارة: 359 نانومتر / الانبعاثات: 450 نانومتر) من خلال مرشح أزرق / سماوي.
ملاحظة: يمكن أيضا تصور التلطيخ والتقاط الصور تحت المجهر الفلورسنت. - تطبيع كثافة بقع الدهون إلى كثافة بقع الحمض النووي لتحديد تراكم الدهون بالنسبة للخلية رقم13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تشبه الخلايا الأولية البدائية من الناحية المورفولوجية الخلايا الليفية ، مع أشكال غير منتظمة تشبه النجوم ونواة مركزية (الشكل 2A-C). تلتصق الخلايا بسهولة بالبلاستيك المزروع بالأنسجة وتبدأ في التكاثر بعد فترة وجيزة من التعلق. فهي تميز بسرعة وتتراكم قطرات الدهون (الشكل 3D) عند تزويدها بالأحماض الدهنية في الوسائط. الجدوى (98 ٪ ، على أساس استبعاد الصبغة) المبلغ عنها في العزلات الممثلة هنا نموذجية. في حين أن الخلايا قوية إلى حد ما ، فإن التعامل العدواني أثناء العزل يؤدي إلى تلف الخلايا (الشكل 3E) ، مما ينتج عنه خلايا تلتصق بشكل سيئ وتفشل في التكاثر. وعلى الرغم من الإجراءات المدرجة لمنع التلوث الميكروبي، يمكن أن يحدث نقل للمواد غير المعقمة (الشكل 3 واو). بسبب معدل نموها السريع ، تستهلك الخلايا الشهية الجنينية في الكتكوت الجلوكوز في الوسائط بمعدلات عالية. يجب تغيير الوسائط كل 48 ساعة للحفاظ على إمداداتها من الطاقة.
توضح النتائج التمثيلية المعروضة هنا الإمكانات الشحمية لخلايا ما قبل الشحم الجنينية. تتراكم هذه الخلايا بسرعة لتطوير قطرات الدهون في ظل الظروف الشحمية المنشأ ، ويتقدم التراكم بمرور الوقت (الشكل 4 والشكل 5). تم تقديم طريقتين يمكن استخدامهما لتصور وقياس درجة تراكم الدهون في هذه الخلايا بشكل أفضل ، وهو انعكاس مباشر لتكوين الدهون. تلطيخ الدهون بالزيت الأحمر O هي طريقة منخفضة التكلفة لتصور وقياس تراكم قطرات الدهون (الشكل 4). يستخدم المجهر الضوئي لجمع الصور ، ويمكن الاحتفاظ بالخلايا الملطخة على سطح الطاولة حتى يتم جمع الصور. يمكن تحديد تراكم الدهون في كل طبق من أطباق الخلايا كما هو موضح عن طريق استخراج البقعة وقراءة الامتصاص عند 495 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. باستخدام مزيج من بقع الدهون والحمض النووي المختارة ، كان من الممكن تحديد تراكم الدهون بالنسبة لعدد الخلايا ، والذي يعوض عن الخلايا غير الشحمية التي قد تستمر في الثقافة (الشكل 5). إذا تم اتخاذ تدابير على مدى عدة نقاط زمنية (الشكل 5B-C) ، فإن هذا المزيج يجعل من الممكن تقييم كل من تكوين الدهون والانتشار ، على سبيل المثال استجابة للهرمونات أو الببتيدات المضافة.
الشكل 1: جمع الأنسجة الدهنية . (أ) عند كسر قشر البيض ، تم الكشف عن غشاء القشرة الأبيض. (ب) ثقب السلى باستخدام ملاقط معقمة. (ج) يمكن الحصول على ما مجموعه ~ 80 ملغ من الدهون تحت الجلد الفخذية من E16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: شظايا الأنسجة للهضم الأنزيمي وبيليه الخلية بعد الهضم. (أ) الأنسجة الدهنية المفرومة في محلول إنزيمي (~ 1 مم3). (ب) تشير الأسهم إلى كريات الخلايا بعد تحلل RBC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنات مورفولوجيا الخلية للخلايا الأولية المعزولة . (أ) الخلايا الدهنية الأولية في 24 ساعة بعد العزل. (ب) الخلايا البدائية عند 48 ساعة بعد العزل. (ج) الخلايا البدائية مع التقاء 80٪ عند 72 ساعة بعد العزل. (د) الخلايا الدهنية بعد 48 ساعة من الحث الشحمي عند الممر 4 ، تكون قطرات الدهون مرئية. يشير Inset إلى الصورة المكبرة لقطرات الدهون. (ه) صورة تمثيلية للخلايا التالفة. (F) يشير السهم إلى نقاط السباحة السوداء في الثقافة الملوثة. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تقييم تراكم الدهون بواسطة تلطيخ الزيت الأحمر O. (أ) صور تمثيلية لتلطيخ الزيت الأحمر O للخلايا الدهنية E16 بعد 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة من التمايز الشحمي خارج الجسم الحي. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر (ب) القياس الكمي لقطرات الدهون المقاسة باستخراج تلطيخ الزيت الأحمر O. يتم التعبير عن القيم كمتوسط ± SD. a و b و c P < 0.05 بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار HSD الخاص ب Tukey اللاحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تقييم تمايز الخلايا الشحمية بواسطة بقعة الدهون / صبغة الحمض النووي. (أ) صور تمثيلية لبقعة الدهون (الحمراء) وتلطيخ الحمض النووي (الأزرق) للخلايا الشهية E16 بعد 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة من التمايز الشحمي خارج الجسم الحي. قضبان المقياس = 150 ميكرومتر (B) تم إجراء تلطيخ الدهون (الإثارة: 485 نانومتر / الانبعاثات: 572 نانومتر) لتقييم تراكم الدهون في الخلايا الشهية المتباينة. (ج) تم إجراء تلطيخ الحمض النووي (الإثارة: 359 نانومتر / الانبعاثات: 450 نانومتر) لتقييم الاختلافات في عدد الخلايا. (د) نسبة الدهون وبقع الحمض النووي. يتم تطبيع تراكم الدهون إلى محتوى الحمض النووي. يتم التعبير عن القيم كمتوسط ± SD. a و b و c P < 0.05 بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار HSD الخاص ب Tukey اللاحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| العمر (ن =) | x106 خلايا / 100 ملغ الأنسجة | الجدوى (٪) |
| اي 12 (4) | 0.97 ± 0.115 أ، ب | 98.5 ± 0.58 أ |
| ه14 (4) | 1.22 ± 0.232 أ، ب | 98.3 ± 0.96 أ ، ب |
| ه١٦ (٢١) | 1.61 ± 1.717 أ | 97.6 ± 1.58 أ |
| اي 17 (4) | 0.81 ± 0.282 أ، ب | 96.8 ± 2.63 أ ، ب |
| اي 18 (7) | 0.72 ± 0.611 أ، ب | 95.9 ± 1.81 أ ، ب |
| E20 (4) | 0.94 ± 0.171 أ، ب | 97.8 ± 0.8 أ ، ب |
| D4 (9) | 0.24 ± 0.164 أ، ب | 93.6 ± 4.28 ب |
| D5 (4) | 0.25 ± 0.073 أ، ب | 98.5 ± 0.71 أ، ب |
| D7 (10) | 0.17 ± 0.162 b | 96.8 ± 3.49 أ ، ب |
| D14 (4) | 0.25 ± 0.051 أ، ب | 99.0 ± 0.00 أ,ب |
الجدول 1: متوسط عدد الخلايا وصلاحية الخلايا المعزولة من الأجنة وكتاكيت ما بعد الفقس.
يتم التعبير عن القيم كمتوسط ± SD. a ، b P < 0.05 بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار HSD الخاص ب Tukey اللاحق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن العديد من البروتوكولات الموصوفة جيدا قد أبلغت عن عزل الخلايا الشهية14،15،16،17 ، فقد تم تحسين عزل الخلايا الشهية الجنينية ، والتي يمكن استخدامها للتحليلات الوظيفية لنمو الدهون في وقت مبكر من الحياة وتطورها في فراخ اللاحم. ينتج عن هذا البروتوكول أسلاف الخلايا الشحمية الجنينية عالية الجدوى مع إمكانات تمايز عالية. علاوة على ذلك ، فإن الإجراء المقدم لعزل الخلايا البدائية لا يقتصر على الأجنة ولكن يمكن استخدامه في فراخ ما بعد الفقس. ومع ذلك ، فقد تم تحسينه للاستخدام مع أجنة E16 ، وكانت الغلة من الكتاكيت بعد الفقس أقل بكثير (الجدول 1) ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى الزيادات في الكمية النسبية من النسيج الضام مع نمو الكتاكيت بسرعة.
يتم تقييم نجاح عزل الخلايا في نهاية المطاف من خلال مراقبة شكل وعدد الخلايا المرفقة (الشكل 3A). يمكن ملاحظة انخفاض عدد الخلايا أو الخلايا التالفة عندما يتم هضم كسور الأنسجة لفترة طويلة جدا ، خاصة عندما يتطور تفكك الأنسجة لأكثر من 1.5 ساعة (الشكل 3E). لذلك ، يوصى بعدم تجاوز 1.5 ساعة من الهضم. من ناحية أخرى ، إذا بقيت شظية الأنسجة بوضوح بعد ساعة من الهضم ، فيجب زيادة وقت الهضم أو الكمية. قد تختلف كمية الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها أيضا اعتمادا على السلالة الوراثية للدجاج. إذا تم استخدام هذا البروتوكول لعزل الخلايا من الأعمار أو الأنواع الأخرى ، فمن المحتمل أن تحتاج كل من كمية الكولاجيناز ووقت الهضم إلى تعديل.
أحد القيود الشائعة على زراعة الخلايا الأولية هو أن الخلايا المعزولة تبدأ في فقدان الإمكانات الشحمية بعد عدة مقاطع في الثقافة. وبالتالي ، من المهم الحث على التمايز في غضون أيام قليلة من العزلة لضمان عدم فقدان الخلايا الشهية الجنينية قدرتها الشحمية. تتمايز السلائف الأجنة الأديبوجينية بسهولة إلى خلايا دهنية ناضجة في تركيبة الوسائط الموصوفة أعلاه ، دون الحاجة إلى التقاء أو تحريض هرموني. يتم تمييز الخلايا حتى المرور 4 (10-14 يوما) بسهولة في غضون 48 ساعة من الإغراء (الشكل 3D).
يعد التحكم في تلوث الخلايا في زراعة الخلايا الأولية تحديا آخر ، حيث يكون التلوث الفطري هو الأكثر شيوعا. استخدام الأمفوتريسين B ، كما هو موضح ، فعال بشكل عام في منع نمو الفطريات18,19. يمكن تضمينه بتركيزات منخفضة في وسائط الثقافة دون أي آثار ملحوظة على الجدوى أو الإمكانات الشحمية. وقد لوحظت ملوثات ميكروبية غير معروفة في شكل نقاط سباحة سوداء تظهر بعد أيام قليلة من عزل الخلايا (الشكل 3F). هذه أثرت سلبا على نمو الخلايا وكان من المستحيل إزالتها بمجرد حدوث هذه العدوى20. ومن غير المعروف ما إذا كانت هذه الملوثات من الأنواع الميكروبية غير المعروفة الموجودة في البيض أو عليه أو نشأت من مصدر آخر. يحاول هذا البروتوكول تقليل خطر التلوث عن طريق استخراج الأجنة بشكل معقم من البويضة21. يساعد استخدام معقم الأدوات القائم على الحرارة في غطاء المحرك أثناء التشريح أيضا على تقليل احتمال التلوث ، خاصة عند تشريح أجنة متعددة.
أحد الاعتبارات في هذه العملية هو انخفاض التصاق الخلايا بصفيحة زراعة الأنسجة أثناء التمايز ، الناتج عن التغيرات الفيزيائية مع تشكل الخلايا وتوسيع قطرات الدهون. على الرغم من احتوائها داخل الخلايا ، إلا أن قطرات الدهون تطفو ، وعندما تكون كبيرة ، يبدو أنها تعمل كبالونات تميل إلى تعزيز الخلايا التي ترفع من السطح. وبالتالي ، ينبغي توخي الحذر في التعامل مع الخلايا الدهنية مع تحفيز التمايز ، وخاصة عند تقييم تكوين الدهون. في حين أن البروتوكول المعروض هنا لا يعدل سطح المزرعة ، إلا أنه يمكن تعزيز التصاق الخلايا عند طلاء الخلايا على أطباق مغلفة بالجيلاتين بنسبة 2٪. من المهم أيضا التأكد من أن الرقم الهيدروجيني لمحاليل الغسيل هو 7.4 واستخدام محلول PBS المسخن مسبقا عند غسل الخلايا والخلط مع بقعة الحمض النووي لتقليل الإجهاد البارد.
باستخدام أجنة متعددة ، يمكن عزل أعداد كافية من الخلايا لإنتاج نسخ تجريبية دون الحاجة إلى ممرات متعددة ، والتوسع وخطر فقدان الخلايا لإمكاناتها الشحمية. يمكن عزل الحمض النووي الريبي بسهولة من الخلايا الشحمية لجنين الفرخ قبل ومتمايزة المعزولة باستخدام طرق تجارية قائمة على الفينول أو الغشاء لدراسات التعبير الجيني. يمكن الحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي من بئر واحد من صفيحة من ستة آبار لاستخدامها في تخليق cDNA ومتابعة qPCR أو RNAseq.
باختصار ، فإن إمكانية الوصول إلى المستودعات الدهنية في جنين الفرخ لعزل نموذج الخلية أمر وثيق الصلة بكل من الدواجن والبشر. هذا البروتوكول سهل الأداء نسبيا ، وينتج عنه نسبة عالية من الخلايا القابلة للحياة التي يمكن حثها بسهولة على الخضوع للتمايز الشحمي المنشأ في المختبر. يمكن الحصول على بيض الدجاج المخصب من مصادر تجارية مختلفة بأقل تكلفة ، مما يجعل هذه الخلايا نموذجا متاحا بسهولة للاستخدام العملي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون UT AgResearch وقسم علوم الحيوان على دعم وتحسين هذا البروتوكول. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة وزارة الزراعة الأمريكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022).
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Adipose Tissue Protocols. , Springer. 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).
