Summary
Ganaspis brasiliensis-Drosophila suzukii (세계적인 침습성 과일 작물 해충)의 애벌레 기생충 -이 해충의 생물학적 방제를 위해 유럽과 미국에 도입 될 것으로 승인되었거나 고려되었습니다. 이 기사는이 기생충의 소규모 및 대규모 양육을위한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
동아시아가 원산지인 초파리인 초파리( Drosophila suzukii , Matsumura)(딥테라: 초파리대)는 지난 십 년간 아프리카의 미주, 유럽 및 일부 지역에서 널리 설립되어 침입한 지역에서 다양한 부드러운 껍질을 가진 과일의 파괴적인 해충이 되었습니다. 생물학적 통제, 특히 자기 영속적이고 전문화 된 기생충을 통한 생물학적 통제는이 고도로 이동성이 높은 다식성 해충에 대한 지속 가능한 지역 전체 관리를위한 실행 가능한 옵션이 될 것으로 예상됩니다. 가나피스 브라실리엔시스 Ihering (Hymenoptera : Figitidae)은 동아시아에 널리 분포하는 애벌레 기생충이며, D. suzukii의 가장 효과적인 기생충 중 하나 인 것으로 밝혀졌습니다.
효능 및 잠재적 인 비 표적 위험에 대한 엄격한 사전 도입 평가에 따라,이 종의 숙주 특이적 유전 그룹 중 하나 (G1 G. brasiliensis)는 최근 미국과 이탈리아에서 도입 및 현장 방출을 위해 승인되었습니다. 동아시아에서 D. suzukii를 공격하는 것으로 일반적으로 밝혀진 또 다른 유전 그룹 (G3 G. brasiliensis)은 가까운 장래에 도입 될 것으로 간주 될 수 있습니다. 현재 연구를 위해 G. brasiliensis를 키우거나 D. suzukii에 대한 현장 방출을위한 대량 생산에 엄청난 관심이 있습니다. 이 프로토콜 및 관련 비디오 기사는이 기생충에 대한 효과적인 양육 방법을 연구를위한 소규모 및 대량 생산 및 현장 출시를위한 대규모 모두에 대해 설명합니다. 이러한 방법은이 글로벌 침습성 해충에 대한 유망한 생물학적 방제제로서이 아시아 원주민 기생충의 장기적인 연구 및 사용에 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
동아시아가 원산지인 초파리인 초파리(Drosophila suzukii, Matsumura)(딥테라: 초파리대)는 아메리카 대륙, 유럽 및 아프리카 1,2 일부 지역에서 널리 설립되었습니다. 파리는 매우 다식 성이며, 원산지 및 침입 지역 1,2,3에서 부드럽고 얇은 피부를 가진 다양한 재배 및 야생 과일을 활용할 수 있습니다. 이 해충에 대한 현재의 관리 전략은 감수성이있는 과일이 익을 때 작물 밭에서 성인 파리를 대상으로하는 살충제의 빈번한 사용에 크게 의존합니다. 반복되는 스프레이가 자주 사용되는데, 아마도 비작물 서식지에서 저수지 플라이 개체군이 지속적으로 유출되고 침략 지역(1,4)에 거주하는 효과적인 천적이 부족하기 때문일 수 있다. 생물학적 통제, 특히 자기 영속적 인 특수 기생충을 통한 생물학적 통제는 조경 수준에서 비행 개체군을 억제하는 데 도움이 될 수 있으며이 이동성이 높은 다식성 해충 4,5,6의 지속 가능한 지역 전체 관리에 중요한 역할을 할 수 있습니다.
지난 수십 년 동안 연구자들은 동아시아 7,8,9의 파리의 토착 범위에서 초파리 스즈키의 공동 진화 된 기생충과 미주 및 유럽 4,5,6의 파리의 침략 지역에서 효과적이지만 새로 관련된 기생충을 발견하기위한 노력에 중점을 두었습니다. 파리의 새로 침입 된 지역에서는 Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera : Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.) 및 L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera : Figitidae)와 같이 일반적으로 발생하는 유충 초파리 기생충은 파리의 강한 면역 저항으로 인해 D. suzukii에서 기생 수준이 낮거나 발달 할 수 없습니다10. 북미와 유럽의 Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera : Pteromalidae) 및 Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera : Diapriidae)와 같은 일부 국제 및 일반 번데기 기생충 만이 파리에서 쉽게 발전 할 수 있습니다4. 대조적으로, 동아시아에서의 탐사 는 D. suzukii 4,5,6에서 많은 애벌레 기생충을 발견했습니다. 그 중 Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering, Leptopilina japonica Novković & Kimura는 지배적 인 애벌레 기생충 7,8,9,11입니다. 특히, 두 개의 피규어 (L. japonica 및 G. brasiliensis)는 D. suzukii 및 / 또는 천연 식물 7,8,9에서 다른 밀접하게 관련된 drosophilids에 의해 감염된 신선한 과일에서 주로 발견되는 주요 기생충이었습니다. 이 세 개의 아시아 유충 기생충은 미국과 유럽의 검역 시설로 수입되었으며, 상대적 효율성 12,13,14,15,16,17, 기후 적응성 18, 잠재적 인 상호 특이적 경쟁 상호 작용 19, 그리고 가장 중요한 것은 숙주 특이성 8,20,21에 대해 평가되었습니다. ,22.
검역 평가에 따르면 Ganaspis brasiliensis는 다른 테스트 된 아시아 유충 기생충보다 Drosophila suzukii에 더 특이적이었지만 다양한 숙주 특이성을 가진 다른 생물형 또는 암호 종으로 구성 될 가능성이 높습니다 8,21,22,23,24. Nomano et al.22는 미토콘드리아 시토크롬 옥시다제 I 유전자 단편의 분자 분석을 기반으로 서로 다른 지리적 영역의 Ganaspis 개인을 5 개의 유전 그룹 (G1-G5로 명명)으로 그룹화했습니다. G2 및 G4 그룹은 몇몇 남아시아 열대 지역에서만 보고되고, G5 그룹은 알려지지 않은 숙주(들)로부터 아시아 및 다른 지역(예를 들어, 아르헨티나, 브라질, 하와이 및 멕시코)으로부터 보고되었다(버핑턴, 개인 관찰). 한국7, 중국8 및 일본에서 D. suzukii에 의해 감염된 야생 과일의 현장 컬렉션 9,23,25는 G1 단독 또는 G1 및 G3 그룹을 나타내는 표본의 혼합물을 발견했습니다. 두 그룹은 D. suzukii 및 다른 밀접하게 관련된 숙주 파리가 서식하는 동일한 숙주 식물에 공존하고 공존하는 것처럼 보입니다. 그럼에도 불구하고, G1은 G3보다 D. suzukii에 대해 더 높은 수준의 숙주 또는 숙주 서식지 특이성을 갖는 것으로 보이지만, 둘 다 검역 검사21,22에서 밀접하게 관련된 많은 종을 공격하지만, 두 그룹 사이에 약간의 차이가 관찰되었다. 더 상세한 분자 분석은 특히 G1 및 G3 그룹의 종 상태를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 연구는 G1 G. brasiliensis 및 G3 G. brasiliensis라고 부릅니다. 일부 초기 연구에서는 G1 G. brasiliensis를 G로 명명했습니다. cf. brasiliensis 14,21,22. G1 G. brasiliensis는 최근 미국과 이탈리아의 D. suzukii에 대한 현장 출시를 위해 승인되었으며 (다른 여러 유럽 국가에서도 현재 도입을 고려하고 있음), G3 G. brasiliensis는 가까운 장래에 현장 출시를 위해 고려 될 수 있습니다. 최근 설문 조사에 따르면 캐나다 브리티시 컬럼비아주 26 및 미국 워싱턴 주 (Beers et al., 미공개 데이터)의 L. japonica 및 G1 G. brasiliensis의 출현 인구와 이탈리아 트렌토 주27의 모험적인 L. japonica 인구가 발견되었습니다.
Drosophila suzukii 관리를위한 생물학적 제어 프로그램 개발에 대한 상당한 관심과 Ganaspis brasiliensis의 모험적이고 고의적 인 도입의 실질적인 생물학적 통제 잠재력을 감안할 때, 미래의 장기 연구 및 / 또는 현장 방출을 위해이 애벌레 기생충에 대한 효율적인 양육 방법을 개발할 필요가 있습니다. 이 프로토콜 및 관련 비디오 기사는이 기생충에 대한 두 가지 양육 방법을 설명합니다 : (1) D. 스즈키의 배양을위한 숙주 과일 (블루 베리)과 인공 식단의 혼합물을 사용하여 플라스크에서 소규모 실험실 사육. 이 방법은 원래 중국 쿤밍 (Kunming, China)에서 수집 한 G3 재료를 사용하여 개발되었습니다8. (2) D. 스즈키의 배양을 위해 숙주 과일 (블루 베리)을 사용하여 큰 새장에서 현장 방출을위한 대량 사육. 대규모 사육에 사용 된 유전 그룹은 일본 도쿄에서 시작된 G1 주식 9,22 개였습니다. 두 그룹 모두에 바이알 또는 작은 용기를 사용하는 것과 같은 다른 양육 방법의 다른 스케일도 간략하게 논의됩니다.
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Protocol
1. G3 Ganaspis brasiliensis의 소규모 실험실 사육 방법
- 숙주 식단을 준비하십시오.
- 1,500 mL 유리 용기에 증류수 600 mL를 넣고 핫 플레이트에서 물을 가열하십시오.
- 시판되는 건조 식단 88.6g(한천, 브루어스 효모, 옥수수가루, 메틸 파라벤 및 수크로오스로 제조됨)을 추가하거나 Dalton et al.28 에 의해 공개된 화학식을 사용하여 식단을 준비한다(단계 2.1.2 참조).
- 건조 식단에 증류수 300 mL를 넣고 다이어트 혼합물을 완전히 저어줍니다.
- 혼합물을 끓는 물에 넣으십시오.
- 핫 플레이트의 액체 식단을 10 분 동안 끓이면서 혼합물을 주기적으로 교반하여 타지 않도록하십시오.
- 가끔씩 교반하면서 실온에서 30 분 동안 식히고식이 요법을 허용하여 열의 방출을 고르게 분배하고 식단이 표면에서 응고되지 않도록하십시오.
- 하나의 용기에서 6.7 mL의 95% EtOH를 측정하고 3.5 mL의 1 M 프로피온산 용액을 다른 용기에서 측정한다.
- 식이가 식으면 EtOH를 첨가 한 다음 프로피온산 용액을 넣고 각 첨가 후 완전히 저어줍니다.
- 블루 베리 (현지 시장에서 구입)를 찬물에 헹구고 차아 염소산 나트륨 표백제 (5 %로 희석)에 넣고 다시 차가운 물로 준비하십시오.
- 종이 타월로 과일을 말리고 각 과일의 피부가 부러지고 과일의 주스와 살이 노출 될 때까지 수동으로 으깬다.
- 으깬 블루베리 25-30g을 각 250mL 플라스크에 넣습니다. 플라스크의 측면을 탭하여 플라스크의 내부 바닥이 으깬 블루 베리의 균일 한 층으로 덮여 있는지 확인하십시오.
- 준비된 식단을 각 플라스크에 붓고 으깬 블루 베리의 꼭대기를 덮으십시오.
- 플라스크의 목에 거품 마개를 넣고 식단이 실온에서 응고되도록 합니다(그림 1).
- 식이 요법이 고형화되면 즉시 사용하거나 최대 3 주 동안 5 °C에서 보관하십시오.
- 리어 호스트 초파리 스즈키.
- 냉장고에서 저장된 식단을 꺼내어 주변 실내 온도와 평형을 유지하거나 갓 만든 식단을 사용하십시오.
- 흡수성 종이 타월 (예 : 5cm x 20cm)을 자르고 중앙에서 비틀어주십시오. 종이 타월의 꼬인 중간 부분을 플라스크에 놓습니다(그림 1).
- 종이 타월과 식단의 표면을 증류수로 적셔 수분을 유지하십시오.
- 성적으로 성숙한 성인 파리를 현재 식민지 파리 플라스크에서 새로운 다이어트 플라스크로 옮기려면 오래된 플라스크의 마개를 조심스럽게 제거하고 플라스크를 빠르게 뒤집고 오래된 플라스크의 개구부를 새 플라스크와 정렬하십시오.
- 파리가 새 플라스크에 떨어지도록 유도하기 위해 오래된 플라스크의 측면을 부드럽게 누릅니다. 새 플라스크에 ~ 25-30 쌍의 D. 스즈키 쌍이 있는지 확인하십시오. 새 플라스크에 충분한 파리가 있으면 신속하게 오래된 플라스크를 똑바로 뒤집고 두 플라스크의 스토퍼를 교체하십시오.
- 오래된 플라스크에 파리가 남지 않을 때까지 파리의 이동을 반복하십시오. 필요한 경우 하나 이상의 오래된 플라스크에서 새 플라스크에 파리를 결합하거나 수집하여 플라스크 당 충분한 파리 (20-30 쌍)가 있는지 확인하십시오.
- 파리 출현을 위해 환경 챔버에서 적절한 조건 (21 °C, 16 L : 8 D 광주기, 60 % -80 % 상대 습도 [RH %])에서 성인 파리에 일주일 동안 노출 된 후 새로운 플라스크를 3 주 동안 보관하십시오.
- 숙주 애벌레를 기생충에 노출시킵니다.
- 플라스크에서 성인 파리와 꼬인 종이 타월을 제거한 후 날아 다니는 달걀과 애벌레가 들어있는 플라스크 (1.2.7 단계 참조)를 가져 가십시오.
- 흡수성 종이 타월 조각을 반으로 접어서 기생 된 애벌레를위한 번식 기질로 플라스크에 넣으십시오.
- G3 G . brasiliensis 의 여섯 여성 및 남성 쌍을 각 플라스크에 흡인시킨다(그림 1). 거품 마개 바닥에 얇은 꿀 층을 줄이십시오.
- 기생충을 플라스크에 5 일 동안 두십시오.
- 5 일간의 노출 후, 기생충을 제거하고 예상되는 말벌이 출현 할 때까지 35 일 동안 환경 챔버에서 위에서 설명한 조건 하에서 플라스크를 유지하십시오.
- 성인 기생충을 수집하고 보관하십시오.
- 잠복기의 두 번째 및 세 번째 주 동안 매주 플라스크에서 조기 숙주 출현을 확인하고 성인 파리를 제거하십시오.
- 성인 기생충이 출현하기 시작하면 일주일에 세 번 흡인하여 초파리 바이알(예: 2.5cm x 9.5cm)에 보관합니다(그림 1).
- 바이알 바닥에 증류수와 함께 축축하지만 포화되지 않은 작은 종이 타월을 놓습니다.
- 각 바이알에 ~ 60 개의 기생충을 넣고 바이알에 출현 날짜에 라벨을 붙입니다. 거품 마개 바닥에 얇은 꿀 층을 일주일에 두 번 줄이십시오. 더 빨리 사용하지 않을 경우 위에서 설명한 조건 하에서 성인 기생충이있는 바이알을 환경 챔버에 최대 한 달 동안 보관하십시오.
- 4-7 일에 한 번씩 바이알에 종이를 적시거나 곰팡이 흔적이있는 경우 종이 타월을 교체하십시오.
2. G1 Ganaspis brasiliensis의 대규모 사육 방법
- 호스트 Drosophila suzukii의 대규모 양육을 구현하십시오.
- 후면 D. 스즈키 내 크고 뜨개질 된 메쉬 덮인 케이지 (예 : 50cm x 50cm x 100cm)는 각각 1,500-2,000 마리의 성적으로 성숙한 성인 파리 (성비 50 : 50)를 포함합니다 (그림 2).
- 표준 초파리 배지(SDM)를 증류수 1 L에 모든 성분(세균용 한천 6 g, 옥수수 가루 75 g, 영양 효모 17 g, 사카로즈 15 g, 대두가루 10 g, 프로피온산 10 mL)을 증류수 1 L에 끓여서 28 연소를 방지하기 위해 혼합물을 주기적으로 교반하면서10분 동안 준비한다.
- 혼합물을 5 분 동안 식히고 아스 코르 빈산 5g을 첨가하십시오.
- 갓 조리한 SDM을 9cm 페트리 접시에 붓고 접시를 닫기 전에 배지가 실온에서 응고되도록 합니다.
- SDM 페트리 접시를 쌓고, 스택을 알루미늄 호일로 감싸고, 접시를 최대 2주 동안 4°C에 보관하십시오.
- 각 양육 케이지 안에 물에 담근 면과 SDM이 있는 네 개에서 여섯 개의 페트리 접시가 있는 접시를 놓습니다(그림 2).
- 일주일에 두 번, 감염된 SDM 페트리 요리를 신선한 것으로 교체하십시오.
- 뚜껑이 없는 감염된 SDM 페트리 접시를 개별적으로 플라스틱 컵(직경 13.3cm 또는 800mL)에 넣고 미세한 메쉬(<0.5mm)로 덮은 각 컵을 닫은 다음 23°C 및 75% RH에서 12-15일 동안 배양합니다(그림 2).
- 새로 부화 한 D. 스즈키 성인을 플라스틱 컵에서 양육 케이지로 옮깁니다.
- 숙주 애벌레를 준비하십시오.
- 블루 베리를 찬물에 1 분 동안 헹구고 표백제 용액 (5 %로 희석 됨)으로 채워진 분지에 과일을 3 분 동안 담그십시오.
- 표백제 용액을 배수하고 차가운 물로 분지를 채워 블루 베리를 헹구십시오. 적어도 30 초 동안 손으로 부드럽게 섞으십시오.
- 단계 2.2.2를 담수로 적어도 세 번 반복하여 표백제 잔류물 및 과일에 존재할 수 있는 다른 절지동물(예를 들어, 진드기, thrips)을 제거한다.
- 흡수성 종이 타월의 여러 층이있는 트레이에 과일을 놓고 조심스럽게 트레이를 앞뒤로 기울여 열매를 굴려 말립니다.
- 9cm 페트리 접시 (위쪽 또는 아래쪽 절반, 위쪽을 향함)를 여러 개 준비하고 씻은 블루 베리 (과일 크기에 따라 접시 당 15-25 개의 과일)로 각각을 채 웁니다.
- 늦은 오후 시간 동안, 페트리 접시를 숙주 양육 케이지 (2.1 단계 참조) 내의 성적으로 성숙한 성인 파리에 노출시키고 밤새 두십시오.
- 다음날 아침, 과일에 파리를 떼어 내고 기생충을 기르기 위해 감염된 과일을 사용하기 위해 부드럽게 불거나 두드리면서 숙주 양육 케이지에서 페트리 접시를 제거하십시오 (2.4 단계 참조).
- 대규모 기생충 사육을 구현하십시오.
- 기생을 후방하기 위해 두 가지 유형의 새장을 사용하십시오 : 하나는 기생을위한 것이고 다른 하나는 말벌 출현을위한 것입니다.
- 기생충 케이지가 곤충 활동을 관찰하기위한 투명한 플라스틱 패널이있는 입방 (예 : 각 측면 45cm), 곤충의 추가 또는 제거 및 식품 재료의 교체를위한 전면 패널의 두 개의 18cm 슬리브 개구부, 환기를 위해 상단과 측면에 미세한 폴리 에스테르 그물 (예 : 96 x 26 메쉬)이 있는지 확인하십시오.
- 출현 케이지를 더 작게 만들고(예: 각 측면 30cm), 두 개의 반대쪽에 단일 슬리브 개구부가 있고 전면에 투명한 플라스틱 패널을 사용하여 가시성을 확보하십시오(그림 2).
- 두 케이지 유형 모두 천장 아래에 매달려 하나 내지 여러 개의 피더를 일시 중단할 수 있는 얇은 문자열이 있는지 확인합니다(그림 2).
참고: 피더는 흩어져있는 벌꿀 방울로 덮인 대형 원통형 폼 스토퍼 (직경 9cm)로 구성되며 케이지 바닥에 놓거나 케이지 천장에 매달릴 수 있습니다 (그림 2). - 각 케이지 내에서 RH에 따라 5-7 일마다 셀룰로오스 아세테이트 플러그 (직경 2.5cm)로 밀봉 된 직벽 초파리 바이알 (2.5cm x 9.5cm)에 물을 공급하십시오. 바이알을 케이지 천장에서 거꾸로 매달아 놓습니다(그림 2).
- 숙주 애벌레를 기생충에 노출시킵니다.
- 페트리 접시 내의 숙주에 감염된 과일을 D. 스즈키이가 밤새 감염시킨 직후에 G1 G. brasiliensis에 노출시킨다(단계 2.2.7 참조).
- 감염된 과일의 10-15 페트리 접시를 1,500-2,000 마리의 말벌이 들어있는 기생 케이지에 2-3 일 동안 두십시오.
- 바닥에 흡수성 종이 층이 있는 플라스틱 컵(직경 13.3cm 또는 800mL)을 사용하여 기생 숙주가 포함된 과일을 수집합니다(그림 2).
- 열린 컵을 에클로션 케이지에 넣고 21°C 및 65% RH에서 적어도 28일 동안 인큐베이션한다(그림 2).
- 배양의 두 번째 및 세 번째 주 동안, 조기 숙주 폐쇄를 위해 매주 새장을 확인하고 기생충의 연속적인 수집을 용이하게하기 위해 성인 파리를 제거하십시오.
- 배양의 네 번째 주가 끝나면 새장에 피더와 수원을 추가하십시오.
- 성인 기생충을 수집하고 보관하십시오.
- 기생충이 출현하기 시작하면 성인의 일부 (10 % -15 %)를 수집하고 기생 케이지로 다시 옮겨 오래된 비생산적인 개체를 대체하십시오.
- 나머지 기생충을 모아 플라스틱 컵(직경 13.3cm 또는 800mL)에 보관합니다(그림 3A).
- 물로 채워진 튜브(2mL)를 놓고 컵 바닥에 치과용 면봉(1cm x 3.8cm)으로 밀봉합니다(그림 3A).
- 탈착식 폼 스토퍼(직경 3.5cm)가 장착된 수정된 뚜껑을 피더 기판으로 하고 환기를 위한 메쉬로 덮인 구멍으로 컵을 닫습니다(그림 3B).
- 각 컵에 최대 700명의 성인을 추가하고(성비 50:50), 컵에 출현 날짜에 라벨을 붙인 다음, 사용할 때까지 또는 최대 1개월 동안 환경 챔버(17°C; 65% RH)에 보관하십시오(그림 3B).
- 성인 기생충을 배송하십시오.
- 원뿔형 튜브 (50 mL)를 사용하여 성인 기생충을 배송하십시오.
- 뚜껑에 환기 구멍(직경 8mm)을 뚫고 미세한 메쉬 그물로 덮습니다(그림 3C).
- 캡 안쪽에 셀룰로오스 아세테이트 공급 고리를 추가합니다(그림 3C).
- 증류수를 사용하여 포화 자당 용액을 준비하고 먹이 고리에 몇 방울을 떨어 뜨린 다음 액체를 흡수하게하십시오.
- 팬 모양의 흡수성 종이 타월 조각을 튜브 안에 넣습니다(그림 3D).
- 각 튜브에 ~ 200 개의 성인 기생충을 넣고 튜브를 얼음 팩과 함께 절연 된 선적 용기에 넣으십시오.
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Representative Results
그림 4는 USDA-ARS 유익한 곤충 소개 유닛 (뉴어크, 델라웨어)의 검역 시설에서 두 개의 다른 기생충 밀도 (6 또는 10 쌍)와 두 개의 다른 노출 시간 (5 또는 10 일)을 사용하여 G3 Ganaspis brasiliensis의 소규모 실험실 사육의 대표적인 결과를 보여줍니다. 기생충 밀도 및 노출 시간의 각 조합에 대해 14번의 반복실험이 있었다. 총 64 개의 플라스크는 4,018 마리의 말벌 (플라스크 당 71.7 마리± 4.9 마리의 자손)을 생산했으며 49.5 %는 1.9 %± 여성 자손을 낳았습니다. 21 °C에서, 성인 기생충은 산란 후 약 30-35 일 후에 나타났다. 기생충 밀도 및 노출 시간은 복제물(플라스크)당 생산된 총 자손 수(편도 ANOVA, F 3,52 = 0.379, P = 0.769)에 유의한 영향을 미치지 않았으며, 암컷 자손의 백분율에 단지 미미한 영향을 미쳤으며(편도 ANOVA, 데이터는 변이를 안정화시키기 위해 필요에 따라 분석 전에 로짓-형질전환되었고, F3,52 = 2.796, P = 0.049), 비록 일인당 암컷 생산 효율 (편도 ANOVA, F 3,52 = 3.576, P = 0.020)은 높은 기생충 밀도에서 감소하였다. 5일 이상의 노출 시간은 생산성을 증가시키는 것으로 보이지 않았다. 증가된 기생충 밀도는 유사하게 생산성을 증가시키는 것으로 나타나지 않았다. 따라서 여섯 쌍의 조합과 5 일간의 노출 시간은 실험실 양육에 가장 적합한 것으로 보입니다.
그림 5는 2021년 에드먼드 마하 재단(이탈리아 트렌토)의 검역 시설에서 G1 가나피스 브라실리엔시스를 대규모로 사육한 6개월간의 생산성 추이를 보여준다. 사육은 스위스 델레몬트에있는 CABI의 검역 실험실에서 소규모 사육에서 파생 된 150 마리의 사흘 된 짝짓기 여성 말벌을 사용하여 시작되었습니다. 양육에서 더 많은 말벌이 기생 케이지에 점차적으로 추가되어 5 주에 1,500-2,000 명 (성비 50 : 50)에 도달 할 때까지 기생 케이지에 첨가되었습니다. 기생 케이지의 점유는 그 후 대규모 사육 자체에서 생산 된 새로운 말벌을 추가하여 동일한 수준으로 유지되었습니다. 전체 기간 동안 기생 케이지에는 2-3 일마다 갓 감염된 과일이 제공되었습니다. 과일(블루베리)은 초파리 스즈키에 하룻밤 동안 노출된 직후에 G1 G. brasiliensis에 제공되었다. 기생충 생산은 초기 숙주 노출 후 5주 후에 시작되었다(도 5A). 8 주에서 22 주까지, 기생충 생산량은 노출 된 과일의 양에 비례하여 평균 0.44 ± 0.03 g / 기생충 (평균 ± SE; 도 5B). 총 53,736 개의 기생충이 수집되었으며 평균 여성 자손은 45.9 % (범위 : 32.4 % -79.0 %)입니다.
그림 1: Drosophila suzukii 및 G3 Ganaspis brasiliensis의 소규모 실험실 사육 절차에 대한 흐름도. 왼쪽은 호스트 플라이 사육 절차를 보여 주며 오른쪽은 기생충 사육주기를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Drosophila suzukii 및 G1 Ganaspis brasiliensis의 대규모 사육 절차에 대한 흐름도. 왼쪽은 호스트 플라이 사육 절차를 보여 주며 오른쪽은 기생충 사육주기를 보여줍니다. 약어: SDM = 표준 초파리 배지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대규모 사육에서 G1 Ganaspis brasiliensis 를 저장하고 배송하는 데 사용되는 컨테이너와 튜브. (A) 용기 내부의 물관을 나타내는 저장용기의 수평도, (B) 통기뚜껑 및 발포마개를 나타낸 용기의 수직도, 및 (C) 환기뚜껑 및 (D) 선박용 흡수종이 조각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: G3 Ganaspis brasiliensis의 소규모 실험실 사육에 대한 대표적인 예. (A) 플라스크 당 생산 된 자손의 수, (B) 암컷 말벌 당 생산 된 자손의 수, (C) 두 가지 다른 기생충 밀도 및 노출 시간에 따른 암컷 자손의 비율. 값은 SE± 평균이며 다른 문자를 나타내는 막대는 크게 다릅니다 (ANOVA, Tukey의 HSD, P < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 발병부터 23주째까지 대규모 사육의 생산성 추영 . (A) 막대는 기생 케이지의 오래된 개체(짙은 녹색)를 대체하고 저장 또는 배송(연한 녹색)하기 위해 망토 케이지에서 매주 수집되는 G1 Ganaspis brasiliensis 자손의 수를 나타냅니다. 주황색 선은 기생충 케이지 내의 기생충에 매주 제공되는 숙주에 감염된 과일 (블루 베리 kg)의 양을 나타냅니다. (B) 노출 후 5 주 후에 생성 된 기생충 자손의 수에 대한 숙주에 감염된 과일의 무게의 주간 비율 (즉, 단일 성인 기생충을 생산하는 데 필요한 과일 그램). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생물학적 조절제의 장기간의 연구 및 후속 현장 방출은 효과적이고 경제적인 사육 기술의 가용성에 의존한다. 이 연구에서 설명 된 방법은 Ganaspis brasiliensis의 소규모 및 대규모 양육을위한 효율적인 프로토콜로 입증되었습니다. 소규모 사육 프로토콜은 노동력을 최적화하고 기생충과 숙주 식민지를 동시에 유지하는 데 필요한 특수 장비를 줄이기 위해 수년에 걸쳐 개발되었습니다. 실험실 연구 또는 생물 분석을위한 식민지를 유지하는 데 적합합니다. 비슷한 방법이이 기생충의 격리 평가를 위해이 기생충을 후방하기 위해 저자에 의해 사용되었습니다. 대규모 사육 프로토콜은 최근 이탈리아에서 실시 된 것처럼 현장 방출을 위해 많은 수의 말벌을 생산할 수있게 해줍니다. 이러한 기술은 가까운 장래에 대규모 사육을 위해 다른 실험실, 생산자 또는 회사로 쉽게 이전 될 수있을뿐만 아니라 방법론의 추가 개선을위한 기초가 될 수 있습니다.
이러한 프로토콜은 또한 Ganaspis brasiliensis 및 L. japonica가 모두 숙주 서식지 선호도7,8, 숙주 단계 선호도 또는 생식 생물학 15, 열 성능 18 및 실험실 생물 분석13,15에서의 포레이징 효율뿐만 아니라 L. japonica를 제외하고는 숙주 관련 단서12에 대한 행동 반응의 측면에서 유사하기 때문에 Leptopilina japonica를 후방하는 데 사용될 수 있습니다. 심지어 G3 G. brasiliensis20보다 더 넓은 호스트 범위를 가진 것으로 보입니다. 두 기생충 모두 본원에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 사육되었다. 소규모 사육의 경우, 두 기생충 모두 초파리 바이알에서 사육 될 수 있는데, 일반적으로 20 마리의 어린 (1-2 일령) 초파리 스즈키 유충을 2cm의 인공 식단으로 채워진 초파리 바이알로 옮기거나 각각 5-10 마리의 어린 D. 스즈키 유충을 함유 한 두 개의 감염된 과일을 놓고 2-3 일 동안 짝짓기 된 암컷 말벌 2 마리에 노출시켜 둘 수 있습니다. 둘 다 바이알 당 ~ 10 마리의 자손을 생산합니다13,15,22.
위에서 논의된 바와 같이, 이 프로토콜에서 사용되는 G1 및 G3 Ganaspis brasiliensis는 일부 호스트 검색 거동과 숙주 특이성21,22에서 약간 다를 수 있다. Girod et al.21은 일본 G1 G. brasiliensis가 Drosophila suzukii에 더 엄격하게 특이적이었으며 숙주 과일에서의 성능에 비해 바이알의 순수한 인공 식단에서 잘 수행되지 않는 것으로 나타났습니다. Matsuura et al.25는 또한 일본의 D. 스즈키에 감염된 체리에서 수집 된 G1 G. brasiliensis 인구가 D. 스즈키를 전문으로한다고보고했다. 블루베리와 혼합된 식단을 이용한 소규모 사육 방법은 G3 G. brasiliensis를 키우기 위해 초기에 개발되었는데, 그 당시에는 G1 G. brasiliensis를 사용할 수 없었기 때문입니다. 나중에,이 방법은 G1 G. brasiliensis (Wang et al. unpublished data)의 양육에 잘 작동하지 않는 것으로 밝혀졌다.
따라서, G1 G. brasiliensis의 소규모 사육을 위해, (1) 파리를 블루베리 (또는 다른 숙주 과일)에 직접 노출시켜 과일 내의 숙주 유충을 수집하고, (2) 노출된 과일을 표준 초파리 배양 배지로 옮기는 것이 제안된다. 이것은 기생 된 애벌레가 특히 높은 숙주 밀도에서식이 요법을 먹을 수있게하고, 기생 된 숙주 번데기는 종이 타월에서 수집 될 수 있습니다. 또는 G1 G. brasiliensis는 5-10 마리의 암컷 말벌을 4-5 일 동안 10-20 마리의 감염된 블루 베리에 노출시켜 플라스틱 용기 (다양한 크기)의 과일에서 직접 사육 할 수 있으며, 숙주 밀도에 따라 컨테이너 당 최대 80 마리의 자손을 생산했습니다 (Wang et al., 미공개 데이터). 이 방법의 경우, 감염된 과일을 제기 된 금속 메쉬 ( "하드웨어 천")에 올려 놓아 기생충이 모든 방향에서 감염된 과일에 접근 할 수 있도록하는 것이 좋습니다 (특히 너무 많은 과일을 하나의 용기에 넣는 경우). 이상적으로는, 감염된 과일의 하나 또는 두 층이이 사육 방법을 위해 각 용기에 넣어야합니다. 이러한 대안적인 소규모 방법은 G3 G. brasiliensis의 양육에도 효과적이어야합니다.
사육 방법 및 비늘 (바이알, 플라스크, 용기 또는 케이지)에 관계없이 적절한 온도, 습도를 유지하고 G1 Ganaspis brasiliensis 및 G3 G. brasiliensis의 양육을위한 숙주 또는 여성 말벌의 나이, 밀도 및 노출 시간을 제어하는 것이 중요합니다. 초파리 스즈키 유충은 정상적인 실험실 조건 (예를 들어, 22 ± 2 °C) 하에서 약 1 주일 (예를 들어, 22 °C) 15 주일에 발달했다. 암컷 G. brasiliensis는 나이가 많은 (3-4 일) 숙주 유충보다 젊은 (1-2 일령)을 공격하는 것을 선호하지만, 다양한 연령대의 숙주 유충이15 세를 공격 할 수 있습니다. 22 ± 2 °C에서, G. brasiliensis 암컷은 성숙한 난자의 평생 보체의 실질적으로 높은 비율 (~ 50 %)으로 나타 났으며, 성숙한 난자 하중은 2-3 일 후15 일 후에 피크에 도달했습니다. 성인 여성은 숙주에게 무제한으로 접근 할 수 있었을 때 ~ 20 일 동안 생존했으며 출현 후 2 일 이내에 산란을 시작하여 5-10 일 이내에 산란의 절정에 도달하고 그 후 점차적으로 산란15를 감소시켰다. 따라서 젊은 (<10 일령) 암컷 말벌은 사육에 사용되어야하지만 암컷 말벌은 공급이 부족할 때 사육에 재사용 될 수 있습니다. 기생충은 21-25 °C에서 쉽게 발달 할 수 있었지만 17.2 ° C 이하의 온도는 교수성 휴면17을 유발하는 것으로 나타났습니다. 따라서 파리와 기생충의 최적 발달을 위해 21-25 °C의 온도 범위를 사용하는 것이 좋습니다.
또한, 5일 초과의 노출 시간은 기생충의 생산성을 증가시키지 않을 것이다. G3 G. brasiliensis 에 대한 소규모 사육에 기초한 기생충 밀도 증가는 먹이를 먹는 암컷 말벌 간의 상호 간섭으로 인해 생산성을 증가시키지 않는 것으로 보입니다. 여섯 명의 남성 - 여성 쌍과 5 일간의 노출 시간은 실험실 소규모 양육에 이상적인 조합 인 것처럼 보이지만 숙주와 기생충의 비율을 더욱 최적화함으로써 양육 방법이 미래에 개선 될 수 있습니다. 기생충에 대한 주요 사망률 인자는 낮은 습도와 관련이있는 것으로 보이며, 많은 기생충이 건조한 기질 상태로 닫을 수없는 것으로 관찰되었습니다. 과일 아래에 흡수성 종이 타월 조각을 추가하면 과일이 분해됨에 따라 주스를 흡수 할뿐만 아니라 습도를 높이거나 파리를위한 번식 기질을 제공하기 위해 습기를 줄일 수있는 기질을 제공합니다.
소규모 사육의 경우, 플라스크는 전자가 목이 좁기 때문에 바이알보다 습도를 더 잘 유지할 수 있습니다. 또한이 연구에서 활성 건조 효모의 분진으로 코팅 된 신선한 블루 베리가 곰팡이 형성을 방지하고 파리에 대한 과일의 매력을 향상시키는 데 도움이된다는 것이 발견되었습니다. 탐구해야 할 기생충 사육의 다른 측면으로는 (1) 대체 숙주 또는 숙주 과일에서이 기생충을 키울 가능성과 대체 숙주 또는 숙주 과일이 기생충의 효율성에 어떻게 영향을 미치는지, (2) 기생충의 자손 적합성과 성비에 영향을 미치는 요인, (3) 인공 식단 조건에 적응하는이 기생충 (G1과 G3 모두)의 능력, (4) 적응과 함께 발생할 수있는 유전 적 또는 행동 적 변화.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 G1 G. brasiliensis를 친절하게 제공 한 Lukas Seehausen과 Marc Kenis (CABI, Switzerland)에게 감사드립니다. 이탈리아의 기금은 Provincia Autonoma di Trento, Trento, Italy, 그리고 미국에서는 National Institute of Food and Agriculture, USDA Specialty Crops Research Initiative Award (#2020-5118-32140), USDA Animal and Plant Health Inspection Service (Farm Bill, fund 14-8130-0463) 및 USDA ARS CRIS 기본 기금 (프로젝트 8010-22000-033-00D)에 의해 제공되었습니다. USDA는 기회 균등 제공자 및 고용주이며이 간행물에 언급 된 제품을 보증하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA | None | Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies |
| Bacteriological agar | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | A1296 - 5KG | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Bleach solution | Clorox Company, Oakland, CA, USA | None | Used to disinfect flesh fruit |
| Blue stopper | Azer Scientific, Morgantown, PA, USA | ES3837 | Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects |
| Blueberries | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used) |
| BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E3030 | Used for rearing parasitoids (parasitism cage) |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4590 | Used for rearing flies |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4545 | Used for rearing parasitoids (eclosion cage) |
| Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) | Everbilt, OH, USA | 308231EB | Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition |
| Cornmeal | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) | Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy | 35000 | Used for providing water to the parasitoids within the storage container |
| Drosophila diet | Frontier Scientific, Newark, DE, USA | TF1003 | Custom diet used to rear flies |
| Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 75813-160 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 89168-886 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Erlenmeyer flask (250 mL) | Carolina Biological, Burlington, NC, USA | 731029 | Used for rearing flies and parasitoids |
| Falcon-style centrifuge tube (50 mL) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | VWRI525-0611 | Modified to ship adult parasitoids |
| Foam stopper | Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA | L800-C | Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects |
| Honey | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as food for parasitoids |
| Identi-Plug plastic foam stopper | Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US | 14-127-40E | Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container |
| Industrial paper towel | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture |
| Micron mesh fabric (250 mL) | Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA | WN0250-72 | Used to make ventilation lid for insects |
| Nutritional yeast (flakes) | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Paper coaster (10.2 cm) | Hoffmaster, WI, USA | 35NG26 | Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae |
| Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | Unipak 5134 | Modified to store adult parasitoids |
| Plastic lid (Ø 13.3 cm) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | PP 2830 | Modified to store adult parasitoids |
| Propionic acid | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | P1386 - 1L | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Saccharose | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Soup cup with lid (475 mL) | StackMan, Vietnam | DC1648 | Used for parasitized larvae to pupate |
| Soybean flour | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) | Quiklok, Lincoln, NH, US | WFW/.25 x 5 x 20 mm | Used as feeding ring for parasitoids |
References
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