Summary
ショウジョウバエの幼虫寄生生物であるGanaspis brasiliensis(世界的な侵略的な果樹害虫)は、この害虫の生物学的防除のために承認されているか、またはヨーロッパおよび米国への導入が検討されています。この記事では、この寄生生物の小規模および大規模飼育の両方のプロトコルを提供します。
Abstract
東アジア原産のスポッティングされた翼のショウジョウバエ、 ショウジョウバエの鈴木井 (松村)(双翅目:ショウジョウバエ)は、過去10年間にアメリカ大陸、ヨーロッパ、アフリカの一部に広く定着し、侵略地域でさまざまな柔らかい皮の果物の壊滅的な害虫となっています。生物学的防除は、特に自己永続性および特殊な寄生生物による、この非常に移動性の高い多食性害虫の持続可能な地域全体の管理のための実行可能な選択肢であると期待されている。 ガナスピス・ブラジリエンシス Ihering(膜翅目:Figitidae)は、東アジアに広く分布している幼虫寄生生物であり、 D. suzukiiの最も効果的な寄生生物の1つであることがわかっている。
その有効性と潜在的な非標的リスクの厳格な導入前評価の後、この種のより宿主特異的な遺伝子群の1つ(G1 G. brasiliensis)が最近、米国およびイタリアでの導入および野外放出のために承認されました。東アジアでD. suzukiiを攻撃するために一般的に見出された別の遺伝子群(G3 G. brasiliensis)は、近い将来に導入が検討されるかもしれない。現在、G. brasiliensisを研究のために飼育したり、D. suzukiiに対する野外リリースのために大量生産したりすることに大きな関心が寄せられています。このプロトコルと関連するビデオ記事では、研究のための小規模と大量生産とフィールドリリースのための大規模の両方で、この寄生虫の効果的な飼育方法について説明しています。これらの方法は、この世界的な侵略的害虫の有望な生物学的防除剤としてのこのアジア原産の寄生生物のさらなる長期研究および使用に利益をもたらす可能性がある。
Introduction
東アジア原産の、斑点を付けられた翼のショウジョウバエ、ショウジョウバエ鈴木井(松村)(双翅目:ショウジョウバエ科)は、アメリカ大陸、ヨーロッパ、アフリカの一部に広く定着している1,2。ハエは非常に多食性であり、その原産地および侵入地域で柔らかく薄い皮を持つ様々な栽培および野生の果実を利用することができる1,2,3。この害虫の現在の管理戦略は、影響を受けやすい果実が熟しているときに作物畑の成虫のハエを標的とする殺虫剤の頻繁な使用に大きく依存している。繰り返しスプレーがしばしば使用されるが、これはおそらく、非作物生息地からの貯水池ハエ個体群の一貫した波及効果および侵入地域に居住する有効な天敵の欠如によるものである1,4。生物学的防除は、特に自己永続性の特殊な寄生生物による、景観レベルでのハエの個体群を抑制するのに役立ち、この非常に移動性および多食性の害虫の持続可能な地域全体の管理に重要な役割を果たす可能性がある4,5,6。
過去10年間、研究者は、東アジアのハエの原産地7,8,9でショウジョウバエの共進化した寄生生物と、南北アメリカとヨーロッパのハエの侵略地域で効果的だが新しく関連する寄生生物を発見するための努力に焦点を当ててきました4,5,6。ハエの新しく侵入した地域では、アソバラc.f.タビダ(Nees)(膜翅目:Braconidae)、Leptopilina boulardi(Barbotin et al)、L. heterotoma(Thompson)(膜翅目:Figitidae)などの一般的に発生する幼虫ショウジョウバエ寄生生物は、ハエの強い免疫抵抗のためにD. suzukiiから発達したり、寄生レベルが低いりすることができない10。北米およびヨーロッパのパキクレポイデウス・ヴィンデミア(ロンダニ)(膜翅目:Pteromalidae)およびトリコプリア・ショドジョウバエ(パーキンス)(膜翅目:Diapriidae)および南米のトリコプリア・アナストレファエ・リマ(Trichopria anastrephae Lima)のようないくつかのコスモポリタンでジェネラリストの蛹寄生虫のみがこのハエから容易に発達することができる4。対照的に、東アジアの探査では、D. suzukii 4,5,6から多くの幼虫寄生生物が発見されている。その中で、Asobara japonica Belokobylskij、Ganaspis brasiliensis Ihering、およびLeptopilina japonica Novković & Kimuraは、優勢な幼虫寄生虫である7,8,9,11。特に、2つのフィジティッド(L. japonicaとG. brasiliensis)は、D. suzukiiおよび/または他の密接に関連したショウジョウバエが自然植生で寄生する新鮮な果物に主に見られる主要な寄生生物であった7,8,9。これら3種のアジアの幼虫寄生虫を米国と欧州の検疫施設に輸入し、その相対効率12、13、14、15、16、17、気候適応性18、潜在的な種間競合相互作用19、そして最も重要なことに、宿主特異性8,20,21について評価した。、22。
検疫評価では、Ganaspis brasiliensisは他の試験済みのアジアの幼虫寄生虫よりもショウジョウバエの鈴木井に宿主特異的であることが示されたが、宿主特異性が異なる異なるバイオタイプまたは謎の種からなる可能性が高い8,21,22,23,24。Nomano et al.22は、ミトコンドリアシトクロムオキシダーゼI遺伝子断片の分子解析に基づいて、異なる地理的領域からのGanaspis個体を5つの遺伝子群(G1-G5と命名)にグループ化した。G2およびG4グループは、南アジアのいくつかの熱帯地域からのみ報告され、G5グループは、未知の宿主(バフィントン、個人観測)からアジアおよび他の地域(例えば、アルゼンチン、ブラジル、ハワイ、メキシコ)から報告された。韓国7、中国8、日本9、23、25でD. suzukiiが寄生した野生の果物の野外コレクションは、G1単独またはグループG1とG3を表す標本の混合物を発見しました。この2つのグループは交感神経のようで、D. suzukiiや他の近縁の宿主ハエが生息する同じ宿主植物に共存している。それにもかかわらず、2つのグループ間ではいくつかの違いが観察されており、G1はG3よりもD. suzukiiに対する宿主または宿主の生息地特異性が高いように見えるが、検疫試験では多くの近縁種を攻撃している21,22。さらに詳細な分子分析は、特にG1およびG3群の種の状態を決定するのに役立つ可能性がある。この研究は、それらをG1 G.ブラジリエンシスおよびG3 G.ブラジリエンシスと呼ぶ。いくつかの初期の研究では、G1 G. brasiliensisをGと名付けた。 ブラジリエンシス14,21,22参照。G1 G. brasiliensisは最近、米国とイタリアでD. suzukiiに対してフィールドリリースが承認されました(他のいくつかのヨーロッパ諸国も現在その導入を検討しています)、G3 G. brasiliensisは近い将来にフィールドリリースが検討される可能性があります。最近の調査では、カナダのブリティッシュコロンビア州(カナダ26)と米国のワシントン州(Beers et al., unpublished data)のL. japonicaとG1 G. brasiliensisの両方の冒険的な集団と、イタリアのトレント州での冒険的なL. japonicaの個体群27も発見されました。
ショウジョウバエの鈴木井管理のための生物学的防除プログラムの開発への大きな関心と、ガナスピス・ブラジリエンシスの冒険的かつ意図的な導入の実質的な生物学的防除の可能性を考えると、将来の長期研究および/または野外放出のために、この幼虫寄生生物の効率的な飼育方法を開発する必要がある。このプロトコルと関連するビデオ記事では、この寄生生物の2つの飼育方法のセットを説明しています:(1)ホストフルーツ(ブルーベリー)とD. suzukiiの培養のための人工食の混合物を使用したフラスコでの小規模実験室飼育。この方法は、もともと昆明、中国8から収集されたG3材料を使用して開発されました。(2)D.すずきの培養に宿主果実(ブルーベリー)を用いた大型ケージでの野外放流のための大量飼育。大規模飼育に使用された遺伝子群は、東京、日本9,22で生まれたG1株でした。両方のグループにバイアルや小さな容器を使用するなど、飼育方法の他のスケールについても簡単に説明します。
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Protocol
1. G3ガナスピス・ブラジリエンシスの小規模実験室飼育方法
- ホストダイエットを準備します。
- 1,500mLのガラス容器に蒸留水600mLを加え、ホットプレートで水を加熱する。
- 市販の乾燥飼料(寒天、ブルワー酵母、コーンミール、メチルパラベン、およびスクロース製)を88.6g加えるか、Daltonらによって公表された式を使用して飼料を準備する28 (ステップ2.1.2を参照)。
- 乾燥飼料に300mLの蒸留水を加え、食事混合物を完全にかき混ぜる。
- 混合物を沸騰水に加える。
- ホットプレートの上の流動食を10分間沸騰させながら、定期的に混合物をかき混ぜて燃焼を防ぎます。
- 食事を室温で30分間冷やしながら、時々かき混ぜて熱の放出を均等に分配し、食事が表面に固まるのを防ぎます。
- 1 つの容器に 6.7 mL の 95% EtOH を、別の容器に 3.5 mL の 1 M プロピオン酸溶液を測定します。
- 食事が冷えたら、EtOHを加え、次にプロピオン酸溶液を加え、各添加後に十分に攪拌する。
- ブルーベリー(地元の市場から購入)を冷水ですすぎ、次亜塩素酸ナトリウム漂白剤溶液(5%に希釈)に入れ、再度冷水で準備します。
- ペーパータオルで果物を乾かし、各果物の皮が壊れて果物のジュースと肉が露出するまで手動でマッシュアップします。
- 25〜30gのマッシュブルーベリーを各250mLフラスコに加える。フラスコの側面をタップして、フラスコの内部の底部がマッシュブルーベリーの均一な層で覆われていることを確認します。
- 準備した食事を各フラスコに注ぎ、マッシュブルーベリーの上部を覆うだけです。
- フラスコの首に泡栓を加え、室温で食事が固まるようにします(図1)。
- 食事が固まったら、すぐに使用するか、5°Cで最大3週間保存してください。
- リアホスト ショウジョウバエスズキイ。
- 保存した食事を冷蔵庫から取り出し、周囲の室温に平衡にするか、作りたての食事を使用してください。
- 吸収性ペーパータオル(例:5 cm x 20 cm)を切り取り、中央にひねります。ペーパータオルのねじれた中央部分をフラスコに置きます(図1)。
- ペーパータオルと食事の表面を蒸留水で濡らして水分を保持します。
- 性的に成熟した成体のハエを現在のコロニーフライフラスコから新しいダイエットフラスコに移すには、古いフラスコのストッパーを慎重に取り外し、フラスコを素早く反転させ、古いフラスコの開口部を新しいフラスコに合わせます。
- 古いフラスコの側面を軽く叩いて、ハエが新しいフラスコに落ちるように誘導します。新しいフラスコに D. suzukii の〜25〜30組の交配ペアがあることを確認してください。新しいフラスコに十分なハエが入ったら、すぐに古いフラスコを直立させ、両方のフラスコのストッパーを交換します。
- 古いフラスコにハエが残らなくなるまで、ハエの移動を繰り返します。必要に応じて、複数の古いフラスコから新しいフラスコにハエを結合または収集して、フラスコあたり十分なハエ(20〜30ペア)があることを確認します。
- ハエの出現のために、成虫のハエに1週間さらされた後、新しいフラスコを適切な条件(21°C、16L:8D光周期、60%〜80%相対湿度[RH%])の環境チャンバーに3週間保持する。
- 宿主幼虫を寄生生物にさらす。
- フラスコから成虫のハエとねじれたペーパータオルを取り除いた後、ハエの卵と幼虫が入ったフラスコ(ステップ1.2.7を参照)を取ります。
- 吸収性ペーパータオルを半分に折り、寄生幼虫の蛹化基質としてフラスコに入れます。
- G3 G.ブラジリエンシス の6組の女性と男性のペアを各フラスコに吸引する(図1)。泡栓の底に蜂蜜の薄い層を縞模様にします。
- 寄生虫をフラスコに5日間放置する。
- 5日間の曝露後、寄生虫を除去し、上記の条件下でフラスコを環境チャンバーに保持し、予想されるワタが出現するまで35日間保持する。
- 大人の寄生虫を集めて保管する。
- インキュベーションの第2週目と第3週目の間に、毎週フラスコをチェックして宿主の早期出現を確認し、成体のハエを取り除きます。
- 成虫の寄生生物が出現し始めたら、週に3回吸引し、ショウジョウバエのバイアル(例えば、2.5 cm x 9.5 cm)に保持します(図1)。
- バイアルの底に蒸留水で湿らせたが飽和していないペーパータオルの小さな部分を置きます。
- 各バイアルに〜60個の寄生生物を追加し、出現日でバイアルにラベルを付けます。泡栓の底に蜂蜜の薄い層を週に2回縞模様にします。上記の条件下で成虫寄生虫を含むバイアルを環境室に保管し、早く使用しない場合は最大1ヶ月間保管してください。
- 4〜7日に1回バイアルに紙を湿らせるか、カビの兆候がある場合はペーパータオルを交換してください。
2. G1ガナスピス・ブラジリエンシスの大規模飼育方法
- 宿主ショウジョウバエ・スズキイの大規模飼育を実施する。
- 後部鈴木 D. 鈴木 (D. suzukii ) は、それぞれ 1,500 ~ 2,000 匹の性的に成熟した成虫のハエ (性比 50:50) を含む、編み込まれたメッシュで覆われた大きなケージ (例: 50 cm x 50 cm x 100 cm) の中に収められています(図 2)。
- 標準ショウジョウバエ培地(SDM)を、混合物を定期的に攪拌しながら、すべての成分(細菌学的寒天6g、コーンミール75g、栄養酵母17g、サッカロース15g、大豆粉10g、プロピオン酸10mL)を1Lの蒸留水で10分間沸騰させて調製する28。
- 混合物を5分間冷やし、アスコルビン酸5gを加える。
- 調理したてのSDMを9cmのペトリ皿に注ぎ、プレートを閉じる前に培地を室温で固化させます。
- SDMペトリ皿を積み重ね、アルミホイルで包み、4°Cで最大2週間保存します。
- 各飼育ケージ内に、水に浸した綿のプレートとSDM付きのペトリ皿4~6個を置きます(図2)。
- 週に2回、出没したSDMペトリ皿を新鮮なものと交換してください。
- ふたのないSDMペトリ皿をプラスチックカップ(直径13.3cmまたは800mL)に個別に置き、細かいメッシュ(<0.5mm)のカバーで各カップを閉じ、23°Cおよび75%RHで12〜15日間インキュベートします(図2)。
- 新しく孵化した D.鈴木井 成虫をプラスチックカップから飼育ケージに移す。
- 宿主幼虫を準備する。
- ブルーベリーを冷水で1分間すすぎ、漂白剤溶液(5%に希釈)で満たされた洗面器に果物を3分間浸します。
- 漂白剤溶液を排水し、ブルーベリーをすすぐために冷たい水で洗面器を満たします。少なくとも30秒間手で優しく混ぜる。
- 淡水でステップ2.2.2を少なくとも3回繰り返して、果物に存在する可能性のある漂白剤残渣および他の節足動物(ダニ、アザミウマなど)を除去する。
- 果物を何層かの吸収性ペーパータオルでトレイの上に置き、トレイを前後に慎重に傾け、果実を転がして乾かします。
- いくつかの9cmのペトリ皿(上半分または下半分、上向き)を準備し、それぞれに洗浄されたブルーベリー(果物のサイズに応じてプレートあたり15〜25個の果物)を入れます。
- 午後遅くに、ペトリ皿を宿主飼育ケージ内の性的に成熟した成虫のハエにさらし(ステップ2.1を参照)、一晩放置する。
- 翌朝、ペトリ皿を宿主飼育ケージから取り出し、静かに吹き飛ばしたり叩いたりして果実のハエを取り除き、寄生生物の飼育に寄生した果実を使用します(ステップ2.4を参照)。
- 大規模な寄生育種を実施する。
- 寄生虫を後付けするために2種類のケージを使用してください:1つは寄生用、もう1つはワタの出現用です。
- 寄生ケージが立方体(例えば、各辺45cm)であり、昆虫の活動を観察するための前面に透明なプラスチックパネル、昆虫の追加または除去および食品材料の交換のためのフロントパネルの2つの18cmスリーブ開口部、および換気のための上部および側面に細かいポリエステル網(例えば、96 x 26メッシュ)があることを確認する。
- 出現ケージを小さくし(たとえば、各側面30 cm)、反対側の2つに単一のスリーブ開口部、前面に透明なプラスチックパネルを設置して視認性を高めます(図2)。
- 両方のケージタイプに、1~数個のフィーダーを吊り下げるための天井の下に垂れ下がった細いひもがあることを確認します(図2)。
メモ:フィーダは、飛散した蜂蜜の液滴で覆われた大きな円筒形の泡ストッパー(直径9 cm)で構成され、ケージの床に置くか、ケージの天井から吊り下げることができます(図2)。 - 各ケージ内で、RHに応じて5〜7日ごとにセルロースアセテートプラグ(直径2.5cm)で密封されたまっすぐな壁ショウジョウバエバイアル(2.5 cm x 9.5 cm)に水を供給します。バイアルをケージの天井から逆さまに吊り下げます(図2)。
- 宿主幼虫を寄生生物にさらす。
- ペトリ皿内の宿主が蔓延した果実を、D. 鈴木井の一晩の侵入直後にG1 G. brasiliensisに曝露する(ステップ2.2.7参照)。
- 1,500〜2,000匹のワタを含む寄生ケージに、蔓延した果物の10〜15個のペトリ皿を2〜3日間放置する。
- 底に吸収紙を重ねたプラスチックカップ(直径13.3cmまたは800mL)を使用して、寄生した宿主を含む果実を回収します(図2)。
- 開いたカップをエクロシオンケージに入れ、21°Cおよび65%RHで少なくとも28日間インキュベートします(図2)。
- インキュベーションの第2週目と第3週目の間に、ケージを毎週チェックして早期宿主のエクロシオンを確認し、寄生虫の連続的な収集を容易にするために成体のハエを除去する。
- インキュベーションの第4週の終わりに、フィーダーと水源をケージに追加します。
- 大人の寄生剤を集めて保管する。
- 寄生性の出現が始まったら、成人の一部(10%〜15%)を集めて寄生ケージに戻して、古い非生産的な個人を置き換えます。
- 残りの寄生生物を集めてプラスチックカップ(直径13.3cmまたは800mL)に保管します(図3A)。
- カップの底に、水を満たし、歯科用コットンロール(1 cm x 3.8 cm)で密封したチューブ(2 mL)を置きます(図3A)。
- フィーダー基材として取り外し可能なフォームストッパー(直径3.5cm)と通気用のメッシュで覆われた穴を取り付けた修正された蓋でカップを閉じます(図3B)。
- 各カップに最大700人の成人を加算し(性比50:50)、カップに出現日をラベル付けし、使用するまで、または最大1ヶ月間、環境チャンバー(17°C;65%RH)に保管します(図3B)。
- 大人の寄生生物を出荷する。
- 円錐形のチューブ(50mL)を使用して、成虫の寄生生物を出荷します。
- キャップに通気孔(直径8mm)をあけ、細かいメッシュネットで覆います(図3C)。
- キャップの内側にセルロースアセテート供給リングを追加します(図3C)。
- 蒸留水を使用して飽和スクロース溶液を調製し、給餌リングに数滴を塗布し、液体を吸収させる。
- 扇形の吸収性ペーパータオルをチューブ内に置きます(図3D)。
- 各チューブに約200匹の大人の寄生生物を追加し、チューブをアイスパックと一緒に断熱された輸送コンテナに入れます。
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Representative Results
図4は、USDA-ARS有益な昆虫導入ユニット(デラウェア州ニューアーク)の検疫施設で、2つの異なる寄生密度(6または10ペア)と2つの異なる曝露時間(5または10日)を使用して、G3 Ganaspis brasiliensisの小規模実験室飼育の代表的な結果を示しています。寄生生物密度とばく露時間の組み合わせごとに14回の反復があった。合計で、64フラスコは4,018匹のワタ(フラスコあたり71.7±4.9匹の子孫)を産み、49.5%±1.9%の雌の子孫であった。21°Cで、成虫寄生虫は産卵後約30〜35日で出現した。寄生生物密度および曝露時間は、反復(フラスコ)当たりに産生される子孫の総数に有意に影響を及ぼさず(一元配置分散分析、F3,52 = 0.379、P = 0.769)、雌の子孫の割合にわずかな影響しか及ぼさなかった(一元配置分散分析、変動を安定化するために必要に応じて分析前にロジット変換されたデータ、F3,52 = 2.796、 P = 0.049)、一人当たりの女性あたりの生産効率(一元配置分散分析、F3,52 = 3.576、P = 0.020)は寄生性密度が高いと減少したが、 暴露時間が5日を超えることは、生産性を高めるようには見えなかった。寄生生物密度の増加も同様に、生産性を高めるようには見えなかった。したがって、6組と5日間のばく露時間の組み合わせは、実験室での飼育に最も適しているようです。
図5は、2021年にエドモンド・マッハ財団(イタリア、トレント)の検疫施設でG1 Ganaspis brasiliensisを大規模に飼育した場合の6ヶ月間の生産性傾向を示しています。飼育は、スイスのデレモンにあるCABIの検疫研究所での小規模飼育から派生した150匹の生後3日齢の交配メスワタを使用して開始されました。飼育からのより多くのワタが寄生ケージに徐々に追加され、第5週に1,500〜2,000人(性比50:50)に達するまで続いた。寄生ケージの占有率は、その後、大規模な飼育自体で生産された新しいワタを追加することによって同じレベルに維持された。全期間中、寄生ケージには2〜3日ごとに出没したばかりの果物が提供されました。果実(ブルーベリー)は、ショウジョウバエ・スズキイへの一晩暴露の直後にG1 G. brasiliensisに提供された。寄生生物の産生は、最初の宿主曝露の5週間後に開始された(図5A)。8週目から22週目まで、寄生生物の産生は暴露された果実の量に比例し、平均0.44±0.03g /寄生性(平均±SE;図5B)。合計53,736の寄生生物が採取され、平均雌の子孫は45.9%(範囲:32.4%-79.0%)であった。
図1: ショウジョウバエのスズキイ とG3 ガナスピス・ブラジリエンシスの小規模実験室飼育手順のフローチャート。 左側は宿主ハエの飼育手順を示し、右側は寄生生物の飼育サイクルを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: ショウジョウバエのスズキイ とG1 ガナスピス・ブラジリエンシスの大規模飼育手順のフローチャート。 左側は宿主ハエの飼育手順を示し、右側は寄生生物の飼育サイクルを示しています。略語:SDM=標準ショウジョウバエ培地。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:大規模飼育のG1 Ganaspis brasiliensis を保管・出荷するために使用したコンテナとチューブ。 (A)容器内部に水管を示す貯留容器の水平図、(B)換気蓋と泡栓を示す容器の縦図、(C)換気蓋と(D)輸送管用の吸収紙片を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:G3 ガナスピス・ブラジリエンシスの小規模実験室飼育の代表例。 (A)フラスコ当たりに産生される子孫の数、(B)雌のスズメバチ当たりに産生される子孫の数、および(C)2つの異なる寄生性密度および曝露時間の下での雌の子孫の割合。値はSE±平均であり、異なる文字を持つバーは有意に異なります(ANOVAは、Tukey's HSD、 P <0.05)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:大規模飼育の開始から23週目までの生産性傾向 (A)バーは、寄生ケージ内の高齢者(濃い緑色)を置き換え、保管または出荷する(薄緑色)ために、剖検ケージから毎週収集されたG1 Ganaspis brasiliensis 子孫の数を示す。オレンジ色の線は、寄生ケージ内の寄生生物に毎週提供される宿主が寄生する果実(ブルーベリーのkg)の量を示しています。(B)曝露後5週間に産生される寄生性子孫の数に対する宿主寄生果実の重量の週次比(すなわち、単一の成体寄生生物を産生するのに必要な果実のグラム)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
生物学的防除剤の長期研究およびその後のフィールドリリースは、効果的で経済的な飼育技術の利用可能性に依存する。この研究で記載された方法は、 Ganaspis brasiliensisの小規模および大規模飼育の両方のための効率的なプロトコルであることが証明されています。小規模飼育プロトコルは、労働量を最適化し、寄生生物コロニーと宿主コロニーを同時に維持するために必要な特殊機器を減らすために、数年間にわたって開発されました。実験室での研究やバイオアッセイのためのコロニーを維持するのに適しています。同様の方法が、この寄生生物の検疫評価のためにこの寄生剤を後付けするために著者らによって使用されている。大規模な飼育プロトコルは、最近イタリアで行われたように、野外放出のために多数のワタを生産することを可能にする。これらの技術は、近い将来に大規模な飼育のために他の研究所、生産者、または企業に簡単に移転することができ、方法論のさらなる改善の基礎として機能します。
Ganaspis brasiliensisとL. japonicaの両方が宿主生息地の嗜好7,8、宿主段階の嗜好または生殖生物学15、熱性能18、および実験室バイオアッセイ13,15における採餌効率、ならびに宿主関連手がかり12に対する行動応答の点で類似しているため、これらのプロトコルはまた、レプトピリナ・ジャポニカを後発するために使用され得る。 G3 G. brasiliensis20のそれよりも広い宿主範囲を有するようである。両方の寄生生物は、本明細書に記載されるような同様の方法を用いて飼育されている。小規模飼育のために、両方の寄生生物は、典型的には、20匹の若い(1〜2日齢の)ショウジョウバエ鈴木井幼虫を2cmの人工飼料で満たされたショウジョウバエバイアルに移すか、または5〜10匹の若いD.鈴木井幼虫を含む2つの寄生果実をそれぞれ入れ、それらを2〜3日間交配した雌の蜂にさらすことによって、ショウジョウバエバイアルで飼育することもできる。 どちらもバイアルあたり〜10匹の子孫を産む13,15,22。
上で論じたように、このプロトコルで使用されるG1およびG3 Ganaspis brasiliensisは、いくつかの宿主探索挙動および宿主特異性においてわずかに異なる可能性がある21、22。Girod et al.21は、日本のG1 G. brasiliensisはショウジョウバエのスズキイにより厳密に特異的であり、宿主の果実に対するその性能と比較して、バイアル中の純粋な人工食ではうまく機能しないようであったと報告している。Matsuura et al.25はまた、日本のD. suzukiiが蔓延したチェリーから収集されたG1 G. brasiliensis集団がD. suzukiiに特化していることを報告した。当時G1 G.ブラジリエンシスが利用できなかったため、ブルーベリーを混ぜた食事を使った小規模飼育法が開発されました。後に、この方法はG1 G. brasiliensisの飼育にはうまく機能しないことが判明した(Wangらの未発表データ)。
したがって、G1 G. brasiliensisの小規模飼育のためには、(1)ハエをブルーベリー(または他の宿主果実)に直接曝露して果実中の宿主幼虫を採取すること、および(2)寄生生物に曝露するためにフラスコ内の食事に寄生幼虫を含む寄生果実を載せて幼虫が低競争環境で発育するための標準的な ショウジョウバ エ培養培地に移すことによって宿主基質を改変することが示唆される。これにより、寄生した幼虫は、特に高い宿主密度で食事を食べることができ、寄生した宿主の蛹をペーパータオルから収集することができる。あるいは、G1 G. brasiliensisは 、5〜10匹の雌のワタを10〜20匹の寄生ブルーベリーに4〜5日間曝露することによって、プラスチック容器(様々なサイズ)内の果実に直接飼育することができ、宿主密度に応じて容器あたり最大80匹の子孫を産んだ(Wang et al., unpublished data)。この方法では、特に1つの容器にあまりにも多くの果物が置かれている場合、寄生生物があらゆる方向から寄生した果物にアクセスできるように、寄生した果物を隆起した金属メッシュ(「ハードウェア布」)の上に置くことが推奨される。理想的には、この飼育方法のために、蔓延した果実の1つまたは2つの層を各容器に入れるべきである。これらの代替小規模方法は、G3 G. brasiliensisの飼育にも適しているはずです。
飼育方法および鱗屑(バイアル、フラスコ、容器、またはケージ)にかかわらず、適切な温度、湿度を維持し、G1 Ganaspis brasiliensisおよびG3 G. brasiliensisの両方を飼育するための宿主または雌のワタの年齢、密度、および曝露時間を制御することが重要です。ショウジョウバエ鈴木イ幼虫は、通常の実験室条件下(例えば、22±2°C)で約15で発育した。雌のG. brasiliensisは、古い(3〜4日齢の)宿主幼虫よりも若い(1〜2日齢)宿主幼虫を攻撃することを好んだが、宿主幼虫の様々な年齢が攻撃され得る15。22±2°Cで、G. brasiliensis雌は成熟卵の生涯補完物のかなり高い割合(〜50%)で出現し、成熟卵負荷は2〜3日後にピークに達した15。成体雌は、宿主への無制限のアクセスを提供し、出現後2日以内に産卵を開始し、5〜10日以内に産卵のピークに達し、その後徐々に産卵15を減少させると、〜20日間生存した。したがって、若い(生後10日<)雌のワタを飼育に使用する必要がありますが、雌のワタは不足しているときに飼育に再利用することができます。寄生生物は21〜25°Cで容易に発達する可能性があるが、17.2°C未満の温度は通性休眠を引き起こすようであった17。したがって、フライと寄生虫の両方の最適な発達のために21〜25°Cの温度範囲を使用することをお勧めします。
また、暴露時間が5日を超えると、寄生生物の生産性が向上しそうにない。G3 G. brasiliensis の小規模飼育に基づく寄生性密度の増加は、おそらく採餌中の雌の蜂間の相互干渉のために、生産性を増加させないようである。6組の雄と雌のペアと5日間のばく露時間は、実験室での小規模飼育には理想的な組み合わせのようですが、宿主と寄生虫の比率をさらに最適化することで、飼育方法は将来改善される可能性があります。寄生生物の主要な死亡率因子は、多くの寄生生物が乾燥基質条件で閉じることができないことが観察されたため、低湿度に関連しているようです。果物の下に吸収性ペーパータオルを追加すると、果物が劣化するにつれてジュースを吸収するだけでなく、湿らせて湿度を高めたり、ハエの蛹化基材を提供したりすることができる基材も提供します。
小規模飼育の場合、フラスコは、前者の首が狭いため、バイアルよりも湿度を良好に維持することができる。この研究では、活性な乾燥酵母の散布でコーティングされた新鮮なブルーベリーが、カビの形成を防ぎ、ハエへの果実の魅力を高めるのに役立つことも判明しました。まだ探求されていない寄生生物飼育の他の側面には、(1)代替宿主または宿主果実でこの寄生生物を飼育する可能性、および代替宿主または宿主果実が寄生生物の効率にどのように影響するか、(2)寄生生物の子孫の適応度および性比に影響を与える要因、(3)この寄生生物(G1およびG3の両方)が人工食条件に適応する能力、 (4)適応によって起こり得る遺伝的または行動的変化。
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Disclosures
著者らは、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、G1 G. brasiliensisを親切に提供してくれたLukas SeehausenとMarc Kenis(スイス、CABI)に感謝します。イタリアでは、イタリアのトレント州Provincia Autonoma di Trentoが、米国では、National Institute of Food and Agriculture、USDA Specialty Crops Research Initiative賞(#2020-5118-32140)、USDA Animal and Plant Health Inspection Service(Farm Bill、fund 14-8130-0463)、およびUSDA ARS CRIS 基本資金(Project 8010-22000-033-00D)によって資金提供されました。USDAは機会均等のプロバイダーおよび雇用主であり、この出版物に記載されている製品を推奨していません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA | None | Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies |
| Bacteriological agar | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | A1296 - 5KG | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Bleach solution | Clorox Company, Oakland, CA, USA | None | Used to disinfect flesh fruit |
| Blue stopper | Azer Scientific, Morgantown, PA, USA | ES3837 | Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects |
| Blueberries | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used) |
| BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E3030 | Used for rearing parasitoids (parasitism cage) |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4590 | Used for rearing flies |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4545 | Used for rearing parasitoids (eclosion cage) |
| Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) | Everbilt, OH, USA | 308231EB | Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition |
| Cornmeal | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) | Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy | 35000 | Used for providing water to the parasitoids within the storage container |
| Drosophila diet | Frontier Scientific, Newark, DE, USA | TF1003 | Custom diet used to rear flies |
| Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 75813-160 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 89168-886 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Erlenmeyer flask (250 mL) | Carolina Biological, Burlington, NC, USA | 731029 | Used for rearing flies and parasitoids |
| Falcon-style centrifuge tube (50 mL) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | VWRI525-0611 | Modified to ship adult parasitoids |
| Foam stopper | Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA | L800-C | Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects |
| Honey | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as food for parasitoids |
| Identi-Plug plastic foam stopper | Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US | 14-127-40E | Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container |
| Industrial paper towel | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture |
| Micron mesh fabric (250 mL) | Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA | WN0250-72 | Used to make ventilation lid for insects |
| Nutritional yeast (flakes) | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Paper coaster (10.2 cm) | Hoffmaster, WI, USA | 35NG26 | Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae |
| Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | Unipak 5134 | Modified to store adult parasitoids |
| Plastic lid (Ø 13.3 cm) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | PP 2830 | Modified to store adult parasitoids |
| Propionic acid | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | P1386 - 1L | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Saccharose | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Soup cup with lid (475 mL) | StackMan, Vietnam | DC1648 | Used for parasitized larvae to pupate |
| Soybean flour | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) | Quiklok, Lincoln, NH, US | WFW/.25 x 5 x 20 mm | Used as feeding ring for parasitoids |
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