Summary
Ganaspis brasiliensis-a larval parasitoide de Drosophila suzukii (uma praga global de cultura de frutas invasivas)-- foi aprovado ou é considerado para introdução na Europa e nos Estados Unidos para o controle biológico desta praga. Este artigo fornece protocolos para a criação em pequena escala e em larga escala deste parasitoide.
Abstract
Nativa do leste da Ásia, a drosophila de asa manchada, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), estabeleceu-se amplamente nas Américas, Europa e partes da África na última década, tornando-se uma praga devastadora de várias frutas de pele macia em suas regiões invadidas. O controle biológico, especialmente por meio de parasitoides autoperpetuantes e especializados, deverá ser uma opção viável para uma gestão sustentável em toda a área desta praga altamente móvel e polifagosa. Ganaspis brasiliensis Ihering (Hymenoptera: Figitidae) é um parasitoide larval que é amplamente distribuído no leste da Ásia, e foi encontrado como um dos parasitoides mais eficazes de D. suzukii.
Após rigorosas avaliações pré-introdução de sua eficácia e potenciais riscos não-alvo, um dos grupos genéticos mais específicos para hospedeiros desta espécie (G1 G. brasiliensis) foi aprovado recentemente para introdução e liberação de campo nos Estados Unidos e na Itália. Outro grupo genético (G3 G. brasiliensis), que também foi comumente encontrado para atacar D. suzukii no leste da Ásia, pode ser considerado para introdução em um futuro próximo. Atualmente, há um enorme interesse em criar g. brasiliensis para pesquisa ou em produção em massa para lançamento de campo contra D. suzukii. Este protocolo e artigo de vídeo associados descrevem métodos eficazes de criação para este parasitoide, tanto em pequena escala para pesquisa quanto em grande escala para produção em massa e lançamento de campo. Esses métodos podem beneficiar mais pesquisas de longo prazo e o uso deste parasitoide asiático-nativo como um agente de controle biológico promissor para esta praga invasiva global.
Introduction
Nativa do leste da Ásia, a drosophila de asa manchada, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), estabeleceu-se amplamente nas Américas, Europa e partes da África 1,2. A mosca é extremamente polifago, sendo capaz de utilizar diversos frutos cultivados e selvagens com peles macias e finas em suas regiões nativas e invadidas 1,2,3. As estratégias de manejo atuais para esta praga dependem fortemente do uso frequente de inseticidas que visam moscas adultas em campos de cultivo quando frutas suscetíveis estão amadurecendo. Sprays repetidos são frequentemente usados, possivelmente devido ao derramamento consistente de populações de moscas de reservatórios de habitats não-agrícolas e falta de inimigos naturais eficazes residentes nas regiões invadidas 1,4. O controle biológico, especialmente por meio da autoperpetação de parasitoides especializados, pode ajudar a suprimir populações de moscas no nível paisagístico e desempenhar um papel crítico para o manejo sustentável em toda a área desta praga altamente móvel epolifagosa 4,5,6.
Na última década, pesquisadores concentraram esforços para descobrir parasitoides co-evoluídos de Drosophila suzukii nas faixas nativas da mosca no leste da Ásia 7,8,9, bem como parasitoides eficazes, mas recém-associados nas regiões invadidas da mosca nas Américas e europa 4,5,6. Nas regiões recém-invadidas da mosca, comumente ocorrendo parasitoides larvas drosophila, como Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.), e L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae), são incapazes de desenvolver ou têm baixos níveis de parasitismo em D. suzukii devido à forte resistência imune da mosca10. Apenas alguns parasitoides pupais cosmopolitas e generalistas como Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera: Pteromalidae) e Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera: Diapriidae) na América do Norte e Europa, e Trichopria anastrephae Lima na América do Sul pode facilmente desenvolver a partir desta mosca4. Em contraste, explorações no leste da Ásia descobriram uma série de parasitoides larvais de D. suzukii 4,5,6. Entre eles, Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering, e Leptopilina japonica Novković & Kimura são os parasitoides larval dominantes 7,8,9,11. Em particular, as duas figífidas (L. japonica e G. brasiliensis) foram os principais parasitoides predominantemente encontrados em frutas frescas infestadas por D. suzukii e/ou outros drosophilids intimamente relacionados na vegetação natural 7,8,9. Esses três parasitoides larvais asiáticos foram importados para instalações de quarentena nos EUA e europa, e avaliados por sua eficiência relativa 12,13,14,15,16,17, adaptabilidade climática18, potenciais interesações competitivas interespecíficas 19, e, o mais importante, especificidade do hospedeiro 8,20,21 22.
As avaliações de quarentena mostraram que ganaspis brasiliensis era mais hospedeiro específico de Drosophila suzukii do que outros parasitoides larvais asiáticos testados, embora provavelmente consistisse em diferentes biotipos ou espécies enigmáticas com especificidade de hospedeirovariado 8,21,22,23,24. Nomano et al.22 agruparam indivíduos ganaspis de diferentes regiões geográficas em cinco grupos genéticos (nomeados como G1-G5) com base em análises moleculares do fragmento genético mitocondrial citocromo oxidase I. Os grupos G2 e G4 são relatados apenas a partir de algumas localidades tropicais do sul da Ásia, e o grupo G5 foi relatado da Ásia e de outras regiões (por exemplo, Argentina, Brasil, Havaí e México) de hospedeiros desconhecidos (Buffington, observação pessoal). Coleções de campo de frutas silvestres infestadas por D. suzukii na Coreia do Sul7, China8 e Japão 9,23,25 encontraram g1 sozinho ou uma mistura de espécimes representando os grupos G1 e G3. Os dois grupos parecem ser simpátricos e coexistem nas mesmas plantas hospedeiras habitadas por D. suzukii e outras moscas hospedeiras intimamente relacionadas. No entanto, algumas diferenças têm sido observadas entre os dois grupos, com o G1 aparentemente tendo um maior grau de especificidade hospedeiro ou hospedeiro-habitat para D. suzukii do que G3, embora ambos ataquem uma série de espécies intimamente relacionadas nos testes de quarentena21,22. Análises moleculares mais detalhadas podem ajudar a determinar o estado da espécie, especialmente para os grupos G1 e G3. Este estudo refere-se a eles como G1 G. brasiliensis e G3 G. brasiliensis. Alguns estudos iniciais também nomearam o G1 G. brasiliensis como G. cf. brasiliensis 14,21,22. O G1 G. brasiliensis foi recentemente aprovado para liberação de campo contra D. suzukii nos EUA e Itália (vários outros países europeus também estão considerando sua introdução), enquanto o G3 G. brasiliensis pode ser considerado para lançamento em campo em um futuro próximo. Pesquisas recentes também encontraram populações aventureiras tanto de L. japonica quanto do G1 G. brasiliensis na Colúmbia Britânica, Canadá26, e Estado de Washington, EUA (Beers et al., dados inéditos) e populações aventureiras L. japonica na província de Trento, Itália27.
Dado o interesse significativo no desenvolvimento de programas de controle biológico para a gestão de Drosophila suzukii e o substancial potencial de controle biológico de introduções aventureiras e deliberadas do Ganaspis brasiliensis, há a necessidade de desenvolver métodos eficientes de criação para este parasitoide larval para futuras pesquisas de longo prazo e/ou liberação de campo. Este protocolo e artigo de vídeo associados descrevem dois conjuntos de métodos de criação para este parasitoide: (1) criação de laboratório em pequena escala em frascos usando uma mistura de frutas hospedeiras (mirtilo) e dieta artificial para a cultura de D. suzukii. Os métodos foram desenvolvidos utilizando material G3 originalmente coletado de Kunming, China8. (2) Criação em massa para liberação de campo em gaiolas grandes usando frutas hospedeiras (mirtilo) para a cultura de D. suzukii. O grupo genético utilizado para a criação em larga escala foi o estoque do G1 originário de Tóquio, Japão 9,22. Outras escalas de métodos de criação, como o uso de frascos ou pequenos recipientes para ambos os grupos, também são brevemente discutidas.
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Protocol
1. Métodos para criação laboratorial em pequena escala do G3 Ganaspis brasiliensis
- Prepare a dieta do anfitrião.
- Adicione 600 mL de água destilada a um recipiente de vidro de 1.500 mL e aqueça a água em uma placa quente.
- Adicione 88,6 g de dieta seca comercialmente disponível (feita de ágar, levedura de Cervejeiro, farinha de milho, parabeno de metila e sacarose) ou prepare a dieta usando a fórmula publicada por Dalton et al.28 (ver passo 2.1.2).
- Adicione 300 mL de água destilada na dieta seca e mexa bem a mistura dietética.
- Adicione a mistura à água fervente.
- Deixe a dieta líquida na placa quente ferver por 10 minutos enquanto mexe periodicamente a mistura para evitar que queime.
- Deixe a dieta esfriar à temperatura ambiente por 30 minutos enquanto a agita ocasionalmente para distribuir a liberação de calor uniformemente e evitar que a dieta se solidifique na superfície.
- Meça 6,7 mL de 95% EtOH em um recipiente e 3,5 mL de solução de ácido propínico de 1 M em outro recipiente.
- Uma vez que a dieta tenha esfriado, adicione o EtOH e, em seguida, a solução de ácido propiônico, mexendo completamente após cada adição.
- Prepare mirtilos (comprados no mercado local) enxaguando-as em água fria, em seguida, em uma solução de alvejante de hipoclorito de sódio (diluída para 5%), e água fria novamente.
- Seque a fruta com uma toalha de papel e amasse-as manualmente até que a pele de cada fruta esteja quebrada e os sucos e a carne da fruta sejam expostos.
- Adicione 25-30 g de mirtilos amassados a cada frasco de 250 mL. Toque nas laterais do frasco para garantir que a parte inferior interna do frasco esteja coberta com uma camada uniforme de mirtilos amassados.
- Despeje a dieta preparada em cada frasco para que ele apenas cubra o topo do purê de mirtilos.
- Adicione rolhas de espuma aos pescoços dos frascos e permita que a dieta se solidifique à temperatura ambiente (Figura 1).
- Uma vez que a dieta tenha se solidificado, use-a imediatamente ou armazene a 5 °C por até 3 semanas.
- Hospedeiro traseiro Drosophila suzukii.
- Remova a dieta armazenada da geladeira e permita que ela se equilibre à temperatura ambiente, ou use uma dieta recém-feita.
- Corte um pedaço de papel toalha absorvente (por exemplo, 5 cm x 20 cm) e torça-o no centro. Coloque a parte do meio torcido da toalha de papel no frasco (Figura 1).
- Molhe a toalha de papel e a superfície da dieta com água destilada para reter a umidade.
- Transfira moscas adultas sexualmente maduras da colônia atual voam frascos para um novo frasco de dieta, removendo cuidadosamente a rolha no frasco antigo e rapidamente invertendo o frasco e alinhando a abertura do frasco antigo com o novo frasco.
- Bata suavemente no lado do frasco velho para induzir as moscas a cair no novo frasco. Certifique-se de que há ~25-30 pares de acasalamento de D. suzukii no novo frasco. Uma vez que haja moscas suficientes no novo frasco, gire rapidamente o velho frasco e substitua as rolhas em ambos os frascos.
- Repita as transferências de moscas até que nenhuma mosca seja deixada nos frascos velhos. Se necessário, combine ou colete moscas de mais de um frasco velho em um novo frasco para garantir que haja moscas suficientes (20-30 pares) por frasco.
- Segure os novos frascos após uma semana de exposição a moscas adultas em condições adequadas (21 °C, 16 L: 8 D fotoperiod, 60%-80% de umidade relativa [RH%]) em uma câmara ambiental por 3 semanas para emergência de moscas.
- Exponha larvas hospedeiras a parasitoides.
- Pegue um frasco (ver passo 1.2.7) contendo ovos de mosca e larvas depois de remover quaisquer moscas adultas e a toalha de papel torcida do frasco.
- Dobre um pedaço de papel toalha absorvente ao meio e coloque-o no frasco como um substrato de pupação para larvas parasitas.
- Aspirar seis pares femininos e masculinos de G3 G. brasiliensis em cada frasco (Figura 1). Coloque uma fina camada de mel na parte inferior da rolha de espuma.
- Deixe os parasitoides no frasco por 5 dias.
- Após uma exposição de 5 dias, remova os parasitoides e segure os frascos em condições descritas acima em uma câmara ambiental por 35 dias até o esperado surgimento de vespas.
- Colete e armazene parasitoides adultos.
- Durante a segunda e terceira semanas de incubação, verifique os frascos semanalmente para o surgimento precoce do hospedeiro e remova as moscas adultas.
- Uma vez que os parasitoides adultos comecem a emergir, aspire-os três vezes por semana e segure-os em frascos de drosophila (por exemplo, 2,5 cm x 9,5 cm) (Figura 1).
- Coloque um pequeno pedaço de papel toalha umedecido, mas não saturado, com água destilada no fundo do frasco.
- Adicione ~60 parasitoides a cada frasco e rotule o frasco com as datas de emergência. Listrar uma fina camada de mel na parte inferior da rolha de espuma, duas vezes por semana. Armazene os frascos com parasitoides adultos nas condições descritas acima na câmara ambiental por até um mês se não for usado antes.
- Remoisten o papel no frasco uma vez a cada 4-7 dias ou substitua a toalha de papel se houver sinais de mofo.
2. Métodos para criação em larga escala do G1 Ganaspis brasiliensis
- Implemente uma criação em larga escala do hospedeiro Drosophila suzukii.
- Traseira D. suzukii dentro de grandes gaiolas cobertas de malha (por exemplo, 50 cm x 50 cm x 100 cm) cada uma contendo 1.500-2.000 moscas adultas sexualmente maduras (razão sexual 50:50) (Figura 2).
- Prepare o Padrão Drosophila Medium (SDM) fervendo todos os ingredientes (6 g de ágar bacteriológico, 75 g de farinha de milho, 17 g de levedura nutricional, 15 g de sacarose, 10 g de farinha de soja, 10 mL de ácido propício) em 1 L de água destilada por 10 min enquanto mexe periodicamente a mistura para evitar que queime28.
- Deixe a mistura esfriar por 5 minutos e adicione 5 g de ácido ascórbico.
- Despeje o SDM recém-cozido em pratos Petri de 9 cm e deixe o meio solidificar à temperatura ambiente antes de fechar as placas.
- Empilhe as placas de Petri SDM, enrole a pilha com papel alumínio e guarde os pratos a 4 °C por até 2 semanas.
- Dentro de cada gaiola de criação, coloque um prato com algodão encharcado de água e quatro a seis pratos de Petri com SDM (Figura 2).
- Duas vezes por semana, substitua os pratos infestados de SDM Petri por pratos frescos.
- Coloque as placas de Petri infestadas de SDM sem tampas individualmente em copos plásticos (13,3 cm de diâmetro ou 800 mL), feche cada xícara com uma cobertura de malha fina (<0,5 mm) e incubar por 12-15 dias a 23 °C e 75% RH (Figura 2).
- Transfira os recém-eclodidos adultos D. suzukii dos copos de plástico para as gaiolas de criação.
- Prepare larvas hospedeiras.
- Enxágüe as mirtilos em água fria por 1 min, e mergulhe as frutas em uma bacia cheia de uma solução alvejante (diluída a 5%) por 3 min.
- Escorra a solução de alvejante e encha a bacia com água fria para enxaguar as amoras. Misture suavemente à mão por pelo menos 30 s.
- Repita o passo 2.2.2 com água doce pelo menos três vezes para remover resíduos de alvejante e outros artrópodes (por exemplo, ácaros, thrips) que possam estar presentes na fruta.
- Coloque a fruta em uma bandeja com várias camadas de toalhas de papel absorvente e incline cuidadosamente a bandeja para frente e para trás, rolando as frutas ao redor para secá-las.
- Prepare várias placas de Petri de 9 cm (tanto as metades superiores quanto inferiores, de frente para cima) e encha cada uma com as amoras lavadas (15-25 frutas por prato, dependendo do tamanho da fruta).
- Durante o final da tarde, exponha os pratos de Petri a moscas adultas sexualmente maduras dentro das gaiolas de criação do hospedeiro (ver passo 2.1) e deixe-as durante a noite.
- Na manhã seguinte, retire as placas de Petri das gaiolas de criação do hospedeiro soprando suavemente ou batendo nelas para desalojar as moscas das frutas e usar a fruta infestada para a criação de parasitoides (ver passo 2.4).
- Implemente uma criação parasitoide em larga escala.
- Use dois tipos de gaiolas para trás do parasitoide: uma para parasitismo e outra para emergência de vespas.
- Certifique-se de que a gaiola de parasitismo é cúbica (por exemplo, 45 cm de cada lado) com um painel plástico transparente na frente para observação da atividade do inseto, duas aberturas de manga de 18 cm no painel frontal para a adição ou remoção de insetos e a substituição de material alimentar, e redes de poliéster fino (por exemplo, 96 x 26 malha) na parte superior e nas laterais para ventilação.
- Faça a gaiola de emergência menor (por exemplo, 30 cm de cada lado), com uma única manga abrindo em dois lados opostos e um painel plástico transparente na frente para visibilidade (Figura 2).
- Certifique-se de que ambos os tipos de gaiola têm uma corda fina que fica abaixo do teto a partir do qual suspender um para vários alimentadores (Figura 2).
NOTA: Um alimentador consiste em uma grande rolha de espuma cílídrica (9 cm de diâmetro) coberta com gotículas de mel espalhadas, podendo ser colocada no chão da gaiola ou pendurada no teto da gaiola (Figura 2). - Dentro de cada gaiola, forneça água em um frasco de drosophila de parede reta (2,5 cm x 9,5 cm) selado com um plugue de acetato de celulose (2,5 cm de diâmetro) a cada 5-7 dias, dependendo do RH. Pendure o frasco de cabeça para baixo do teto da gaiola (Figura 2).
- Exponha as larvas hospedeiras aos parasitoides.
- Exponha a fruta infestada de host dentro das placas de Petri ao G1 G. brasiliensis imediatamente após a infestação da noite de D. suzukii (ver passo 2.2.7).
- Deixe os 10-15 pratos petri de frutas infestadas na gaiola de parasitização contendo 1.500-2.000 vespas por 2-3 dias.
- Utilize copos plásticos (13,3 cm de diâmetro ou 800 mL) com camadas de papel absorvente na parte inferior para coletar a fruta contendo os hospedeiros parasitas (Figura 2).
- Coloque os copos abertos na gaiola de eclosão e incubar por pelo menos 28 dias a 21 °C e 65% RH (Figura 2).
- Durante a segunda e terceira semanas de incubação, verifique semanalmente a gaiola para o encerramento do hospedeiro precoce e remova as moscas adultas para facilitar a sucessiva coleta de parasitoides.
- No final da quarta semana de incubação, adicione um alimentador e uma fonte de água à gaiola.
- Colete e armazene os parasitoides adultos.
- Uma vez iniciado o surgimento parasitoide, recolham uma parte (10%-15%) dos adultos e transfiram-os de volta para a gaiola do parasitismo para substituir antigos indivíduos improdutivos.
- Colete e armazene os parasitoides restantes em copos plásticos (13,3 cm de diâmetro ou 800 mL) (Figura 3A).
- Coloque um tubo (2 mL) cheio de água e selado com um rolo de algodão dental (1 cm x 3,8 cm) na parte inferior do copo (Figura 3A).
- Feche o copo com uma tampa modificada equipada com uma rolha de espuma removível (3,5 cm de diâmetro) como substrato alimentador e um orifício coberto de malha para ventilação (Figura 3B).
- Adicione 700 adultos a cada xícara (relação sexual 50:50), rotule o copo com a data de emergência e armazene-o em uma câmara ambiental (17 °C; 65% RH) até ser usado, ou por até 1 mês (Figura 3B).
- Envie os parasitoides adultos.
- Use tubos cônicos (50 mL) para enviar os parasitoides adultos.
- Furar um orifício de ventilação (8 mm de diâmetro) na tampa e cobri-lo com uma rede de malha fina (Figura 3C).
- Adicione um anel de alimentação de acetato de celulose no interior da tampa (Figura 3C).
- Prepare uma solução de sacarose saturada usando água destilada, aplique algumas gotas no anel de alimentação e deixe absorver o líquido.
- Coloque um pedaço em forma de ventilador de papel toalha absorvente dentro do tubo (Figura 3D).
- Adicione ~200 parasitoides adultos a cada tubo, e coloque os tubos em um recipiente de transporte isolado junto com sacos de gelo.
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Representative Results
A Figura 4 mostra resultados representativos da criação laboratorial em pequena escala do G3 Ganaspis brasiliensis usando duas densidades parasitoides diferentes (seis ou dez pares) e dois tempos de exposição diferentes (5 ou 10 dias) na instalação de quarentena da Unidade de Introdução de Insetos Benéficos do USDA-ARS (Newark, Delaware). Houve 14 réplicas para cada combinação de densidade parasitoide e tempo de exposição. No total, os 64 frascos produziram 4.018 vespas (71,7 ± 4,9 filhotes por frasco) com 49,5% ± 1,9% da prole feminina. Com 21 °C, os parasitoides adultos emergiram aproximadamente 30-35 dias após a oviposição. A densidade parasitoide e o tempo de exposição não afetaram significativamente o número total de descendentes produzidos por réplica (frasco) (ANOVA unidirecional, F3,52 = 0,379, P = 0,769) e teve apenas um efeito marginal sobre a porcentagem de descendentes femininos (ANOVA unidirecional, os dados foram transformados em logit antes da análise conforme necessário para estabilizar a variação, F3,52 = 2,796, P = 0,049), embora a eficiência de produção per capita feminina (ANOVA unidirecional, F3,52 = 3,576, P = 0,020) tenha diminuído na alta densidade parasitíida. O tempo de exposição de mais de 5 dias não pareceu aumentar a produtividade. O aumento da densidade parasitoide da mesma forma não pareceu aumentar a produtividade. Portanto, a combinação de seis pares e tempos de exposição de 5 dias parece ser mais adequada para a criação de laboratório.
A Figura 5 mostra uma tendência de produtividade de 6 meses da criação em larga escala do G1 Ganaspis brasiliensis na instalação de quarentena da Fundação Edmund Mach (Trento, Itália) em 2021. A criação foi iniciada usando 150 vespas fêmeas de três dias de idade, derivadas de uma criação em pequena escala no laboratório de quarentena do CABI em Delémont, Suíça. Mais vespas da criação foram gradualmente adicionadas à gaiola de parasitismo, até atingir 1.500-2.000 indivíduos (razão sexual 50:50) na semana 5. A ocupação da gaiola de parasitismo foi posteriormente mantida no mesmo nível, adicionando novas vespas produzidas na própria criação em larga escala. Durante todo o período, a gaiola de parasitismo foi fornecida com frutas recém-infestadas a cada 2-3 dias. A fruta (mirtilos) foi oferecida ao G1 G. brasiliensis imediatamente após a exposição noturna a Drosophila suzukii. A produção parasitoide começou 5 semanas após a exposição inicial do hospedeiro (Figura 5A). Da semana 8 até a semana 22, a produção parasitoide foi proporcional à quantidade de frutas expostas, com média de 0,44 ± 0,03 g/parasitoide (média ± SE; Figura 5B). Foram coletados 53.736 parasitoides, com uma prole feminina média de 45,9% (intervalo: 32,4%-79,0%).
Figura 1: Um fluxograma para procedimentos laboratoriais de criação laboratorial de pequena escala de Drosophila suzukii e G3 Ganaspis brasiliensis. O lado esquerdo mostra os procedimentos de criação de moscas do host, enquanto o lado direito ilustra o ciclo de criação parasitoide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Um fluxograma para os procedimentos de criação em larga escala de Drosophila suzukii e G1 Ganaspis brasiliensis. O lado esquerdo mostra os procedimentos de criação de moscas do host, enquanto o lado direito ilustra o ciclo de criação parasitoide. Abreviação: SDM = médio Drosophila padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Contêineres e tubos utilizados para armazenar e enviar G1 Ganaspis brasiliensis a partir da criação em larga escala. (A) Uma visão horizontal do recipiente de armazenamento mostrando um tubo de água dentro do recipiente, (B) uma visão vertical do recipiente mostrando uma tampa ventilada e uma rolha de espuma, e (C) uma tampa ventilada e um pedaço de papel absorvente para (D) o tubo de transporte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplo representativo para criação laboratorial em pequena escala do G3 Ganaspis brasiliensis. (A) Número de descendentes produzidos por frasco, (B) número de descendentes produzidos por vespa fêmea, e (C) percentual de descendentes de fêmeas, sob duas densidades parasitoides diferentes e tempos de exposição. Os valores são médios ± SE, e as barras com letras diferentes são significativamente diferentes (ANOVA, HSD de Tukey, P < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Tendência de produtividade da criação em larga escala desde o seu início até a semana 23. (A) As barras indicam os números de descendentes G1 Ganaspis brasiliensis coletados semanalmente das gaiolas de eclosão para substituir indivíduos idosos na gaiola de parasitismo (verde escuro) e a serem armazenados ou enviados (verde claro). A linha laranja indica a quantidade de frutas infestadas de hospedeiros (kg de mirtilos) fornecidas a cada semana aos parasitoides dentro da gaiola de parasitismo. (B) Razão semanal do peso da fruta infestada de hospedeiro para o número de filhotes parasitoides produzidos 5 semanas após a exposição (ou seja, gramas de fruta necessária para produzir um único parasitoide adulto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Pesquisas de longo prazo e liberações de campo subsequentes de um agente de controle biológico dependem da disponibilidade de técnicas eficazes e econômicas de criação. Os métodos descritos neste estudo provaram ser protocolos eficientes tanto para a criação em pequena escala quanto para a criação em larga escala do Ganaspis brasiliensis. O protocolo de criação em pequena escala foi desenvolvido ao longo de vários anos para otimizar a quantidade de mão-de-obra e reduzir os equipamentos especializados necessários para manter simultaneamente as colônias parasitárias e hospedeiras. É adequado para a manutenção de uma colônia para pesquisa laboratorial ou bioensatórios. Métodos semelhantes têm sido utilizados pelos autores para criar este parasitoide para avaliações de quarentena deste parasitoide. O protocolo de criação em larga escala permitirá produzir um grande número de vespas para liberação de campo, como foram recentemente conduzidos na Itália. Essas tecnologias podem ser facilmente transferidas para outros laboratórios, produtores ou empresas para criação em larga escala em um futuro próximo, além de servir de base para melhorias adicionais nas metodologias.
Esses protocolos também podem ser usados para trás Leptopilina japonica, já que tanto Ganaspis brasiliensis quanto L. japonica são semelhantes em termos de sua preferência de habitat hospedeiro 7,8, preferência de palco hospedeiro ou biologia reprodutiva15, desempenho térmico18, e eficiência de forrageamento em bioensatórios laboratoriais 13,15, bem como respostas comportamentais para as pistas associadas ao hospedeiro12, exceto aquela láica. parece ter uma gama de host mais ampla do que a do G3 G. brasiliensis20. Ambos os parasitoides foram criados usando métodos semelhantes como descrito aqui. Para a criação em pequena escala, ambos os parasitoides também podem ser criados em frascos de drosophila, tipicamente transferindo 20 larvas Drosophila suzukii para um frasco de drosophila cheio de 2 cm de dieta artificial, ou colocando duas frutas infestadas, cada uma contendo 5-10 larvas jovens D. suzukii, e expondo-as a duas vespas fêmeas matadas por 2-3 dias, ambos produzindo ~10 descendentes por frasco 13,15,22.
Como discutido acima, o G1 e o G3 Ganaspis brasiliensis utilizados neste protocolo podem diferir ligeiramente em alguns comportamentos de pesquisa de hospedeiros e especificidade do host21,22. Girod et al.21 relatam que o G1 G. brasiliensis japonês era mais estritamente específico para Drosophila suzukii, e não parecia ter um bom desempenho em dieta artificial pura em frascos em comparação com seu desempenho em frutas hospedeiras. Matsuura et al.25 também relataram que as populações G1 G. brasiliensis coletadas de cerejas infestadas de D. suzukii no Japão são especializadas em D. suzukii. O método de criação em pequena escala utilizando dieta misturada com mirtilos foi desenvolvido inicialmente para a criação do G3 G. brasiliensis porque o G1 G. brasiliensis não estava disponível naquele momento. Posteriormente, esse método não funcionou bem para a criação do G1 G. brasiliensis (Wang et al. dados inéditos).
Portanto, para a criação em pequena escala do G1 G. brasiliensis, sugere-se modificar o substrato hospedeiro por (1) expor as moscas diretamente aos mirtilos (ou outras frutas hospedeiras) para coletar larvas hospedeiras na fruta, e (2) transferir frutas expostas para um meio padrão de cultura drosophila para que as larvas se desenvolvam em um ambiente de baixa concorrência, colocando as frutas infestadas contendo as larvas hospedeiras na dieta nos frascos para exposição aos parasitoides. Isso permitirá que as larvas parasitadas se alimentem da dieta, especialmente em altas densidades hospedeiras, e a pupa de host parasita parasitizada seja coletada da toalha de papel. Alternativamente, o G1 G. brasiliensis pode ser criado em frutas diretamente em recipientes plásticos (vários tamanhos) expondo 5-10 vespas fêmeas a 10-20 mirtilos infestados por 4-5 dias, que produziram até 80 filhotes por recipiente, dependendo da densidade do hospedeiro (Wang et al., dados inéditos). Para este método, recomenda-se colocar a fruta infestada em uma malha metálica elevada ("pano de hardware") para permitir que os parasitoides acessem a fruta infestada de todas as direções, especialmente se muitas frutas forem colocadas em um recipiente. Idealmente, uma ou duas camadas de frutas infestadas devem ser colocadas em cada recipiente para este método de criação. Esses métodos alternativos de pequena escala também devem funcionar bem para a criação do G3 G. brasiliensis.
Independentemente dos métodos de criação e balanças (frasco, frasco, recipiente ou gaiola), é fundamental manter temperatura, umidade adequadas, bem como controlar a idade, densidade e tempo de exposição para a criação tanto do G1 Ganaspis brasiliensis quanto do G3 G. brasiliensis. As larvas de Drosophila suzukii desenvolveram-se em cerca de 1 semana em condições normais de laboratório (por exemplo, 22 ± 2 °C) 15. G. brasiliensis fêmeas preferiram atacar larvas mais jovens (1-2 dias de idade) do que larvas hospedeiras mais velhas (3-4 dias) hospedeiras, embora várias idades de larvas hospedeiras pudessem ser atacadas15. Com 22 ± 2 °C, as fêmeas G. brasiliensis emergiram com uma proporção substancialmente alta (~50%) de seu complemento vitalício de ovos maduros, e a carga de ovos maduros atingiu um pico após 2-3 dias15. As fêmeas adultas sobreviveram ~20 dias quando forneceram acesso ilimitado aos hospedeiros e iniciaram a oviposição dentro de 2 dias após o surgimento, atingindo um pico de oviposição dentro de 5-10 dias e, posteriormente, reduzindo gradualmente a oviposição15. Portanto, vespas fêmeas jovens (<10 dias) devem ser usadas na criação, mas as vespas fêmeas poderiam ser reutilizadas para a criação quando estiverem em uma oferta curta. O parasitoide poderia facilmente desenvolver-se a 21-25 °C, mas temperaturas abaixo de 17,2 °C pareciam desencadear uma diapausa facultativa17. Recomenda-se, portanto, usar uma faixa de temperatura de 21-25 °C para o desenvolvimento ideal tanto da mosca quanto do parasitoide.
Além disso, o tempo de exposição de mais de 5 dias provavelmente não aumentará a produtividade do parasitoide. O aumento da densidade parasitoide com base na criação em pequena escala para g3 G. brasiliensis parece não aumentar a produtividade, possivelmente devido à interferência mútua entre as vespas femininas forrageiras. Seis pares masculino-feminino e um tempo de exposição de 5 dias parecem ser uma combinação ideal para a criação em pequena escala de laboratório, embora os métodos de criação possam ser melhorados no futuro, otimizando ainda mais a proporção de hospedeiro para parasitoide. Um grande fator de mortalidade para o parasitoide parece estar relacionado à baixa umidade, já que muitos parasitoides foram observados incapazes de se escoar com condições secas de substrato. Adicionar um pedaço de papel toalha absorvente por baixo da fruta não só absorve sucos à medida que a fruta se degrada, mas também fornece um substrato que pode ser umedecido para aumentar a umidade ou fornecer um substrato de pupação para a mosca.
Para a criação em pequena escala, um frasco pode manter a umidade melhor do que um frasco porque o primeiro tem um pescoço estreito. Também foi encontrado neste estudo que mirtilos frescos revestidos com um pó de levedura seca ativa ajudaram a evitar a formação de mofo e reforçaram a atração da fruta para as moscas. Outros aspectos da criação parasitoide que ainda estão a ser explorados incluem (1) a possibilidade de criar este parasitoide em hospedeiros alternativos ou frutas hospedeiras e como hosts alternativos ou frutas hospedeiras afetariam a eficiência do parasitoide, (2) fatores que afetam a aptidão e relação sexual da prole parasitoide, (3) a capacidade deste parasitoide (tanto G1 quanto G3 ) de se adaptar às condições de dieta artificial, e (4) as alterações genéticas ou comportamentais que podem ocorrer com a adaptação.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Lukas Seehausen e Marc Kenis (CABI, Suíça) por gentilmente fornecerem G1 G. brasiliensis. O financiamento na Itália foi fornecido por Provincia Autonoma di Trento, Trento, Itália, e nos EUA pelo National Institute of Food and Agriculture, prêmio USDA Specialty Crops Research Initiative (#2020-5118-32140), USDA Animal and Plant Health Inspection Service (Farm Bill, fundo 14-8130-0463) e fundos base USDA ARS CRIS (projeto 8010-22000-033-000D). O USDA é um provedor de igualdade de oportunidades e empregador e não endossa os produtos mencionados nesta publicação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA | None | Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies |
| Bacteriological agar | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | A1296 - 5KG | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Bleach solution | Clorox Company, Oakland, CA, USA | None | Used to disinfect flesh fruit |
| Blue stopper | Azer Scientific, Morgantown, PA, USA | ES3837 | Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects |
| Blueberries | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used) |
| BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E3030 | Used for rearing parasitoids (parasitism cage) |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4590 | Used for rearing flies |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4545 | Used for rearing parasitoids (eclosion cage) |
| Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) | Everbilt, OH, USA | 308231EB | Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition |
| Cornmeal | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) | Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy | 35000 | Used for providing water to the parasitoids within the storage container |
| Drosophila diet | Frontier Scientific, Newark, DE, USA | TF1003 | Custom diet used to rear flies |
| Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 75813-160 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 89168-886 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Erlenmeyer flask (250 mL) | Carolina Biological, Burlington, NC, USA | 731029 | Used for rearing flies and parasitoids |
| Falcon-style centrifuge tube (50 mL) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | VWRI525-0611 | Modified to ship adult parasitoids |
| Foam stopper | Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA | L800-C | Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects |
| Honey | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as food for parasitoids |
| Identi-Plug plastic foam stopper | Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US | 14-127-40E | Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container |
| Industrial paper towel | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture |
| Micron mesh fabric (250 mL) | Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA | WN0250-72 | Used to make ventilation lid for insects |
| Nutritional yeast (flakes) | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Paper coaster (10.2 cm) | Hoffmaster, WI, USA | 35NG26 | Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae |
| Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | Unipak 5134 | Modified to store adult parasitoids |
| Plastic lid (Ø 13.3 cm) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | PP 2830 | Modified to store adult parasitoids |
| Propionic acid | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | P1386 - 1L | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Saccharose | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Soup cup with lid (475 mL) | StackMan, Vietnam | DC1648 | Used for parasitized larvae to pupate |
| Soybean flour | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) | Quiklok, Lincoln, NH, US | WFW/.25 x 5 x 20 mm | Used as feeding ring for parasitoids |
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